本发明属于发酵和食品加工
技术领域：
，具体涉及一种高含量纳豆激酶的纳豆冻干粉的发酵方法。
背景技术：
：纳豆，起源于中国古代，自秦汉(公元前221年-公元220年)以来开始制作，由黄豆通过纳豆菌(枯草杆菌)发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素k2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，最早由科学家由纳豆芽孢杆菌的分泌物中提取并鉴定功效。血栓导致的心血管疾病威胁着人类健康，数据显示全世界每年大概有1700多万人死于这些疾病。血栓形成的主要原因是血液中纤维蛋白过多，阻塞血管中血液的流动。纳豆激酶具有较强的纤溶活性，因而具有预防和治疗血栓相关疾病的能力。纳豆激酶有助于改善血液循环，降低血粘度，改善血液循环。纳豆激酶在血液中可保留超过3小时，比其他纤溶酶(如尿激酶)具有更强的溶栓活性，可降低血栓形成的风险。同时纳豆激酶不易被胃酸分解，因而可以口服给药，具有很强的应用价值。纳豆激酶及其衍生物已广泛用作人类健康食品，医药和其他高附加值领域。纳豆激酶在传统上是由多种微生物发酵产生的，其中以纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的效果最为突出。纳豆芽孢杆菌是从纳豆发酵过程中分离出来的一种好氧的产芽孢杆菌，隶属于枯草芽孢杆菌。纳豆芽孢杆菌生长周期短，环境友好，对人类与动物没有危害。纳豆芽孢杆菌可以天然分泌纳豆激酶，是一类广泛应用于食品、药物、保健品等行业的益生菌，利用纳豆芽孢杆菌生产纳豆激酶在工业上具有优良的应用前景和生产潜力。纳豆中含有染料木素和染料木甙,类似枯草溶血素的脂肽,还含有丰富的植物雌激素和一种叫infrabin的类黄酮色素形成成分,这些物质有强烈的裂解功能,抑制肿瘤细胞的增殖。大豆异黄酮是黄酮类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此大豆异黄酮又称植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。大豆异黄酮(soyisoflavone)主要来源于豆科植物的荚豆类，大豆中的含量较高，为0.1％-0.5％。目前存在的主要问题是，利用传统发酵方法生产的纳豆存在纳豆激酶及大豆异黄酮含量不高的缺陷。因此，有必要设计一种高含量纳豆激酶的纳豆冻干粉的发酵方法，以获得相对产量较高纳豆激酶和异黄酮类的纳豆冻干产品。技术实现要素：本发明是为了解决上述不足，提供了一种高含量纳豆激酶的纳豆冻干粉的发酵方法，能够获得相对产量较高纳豆激酶和异黄酮类。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：本发明一方面涉及一种纳豆冻干粉的发酵方法，其包括：(1)大豆预处理：大豆清洗和浸泡；(2)制备固体发酵培养基，所述固体发酵培养基包括以大豆干重为100wt％，加入硫酸软骨素0.5-2wt％；(3)蒸煮；(4)配制斜面培养基；(5)制备纳豆菌种子液；(6)接种发酵；(7)后熟；(8)冷冻干燥：所得后熟发酵物经过真空冷冻干燥得到纳豆冻干粉。在本发明的一个优选实施方式中，所述固体发酵培养基中还包括以大豆干重为100wt％，加入2-氨基半乳糖醛酸0.4-0.6wt％。在本发明的一个优选实施方式中，所述纳豆冻干粉中大豆异黄酮的含量为900mg/100g以上；优选为920mg/100g以上。在本发明的一个优选实施方式中，所述大豆预处理包括：大豆清洗，在20-25℃浸泡8-10小时。在本发明的一个优选实施方式中，所述固体发酵培养基还包括葡萄糖，硫酸镁和氯化钙，ph值为7.0-7.4。在本发明的一个优选实施方式中，所述蒸煮包括：蒸汽蒸煮30-40min，蒸煮后冷却至45℃以下；在本发明的一个优选实施方式中，所述斜面培养基包括：琼脂16g/l、蛋白胨8g/l、牛肉粉3g/l、氯化钠2.5g/l，121℃灭菌20分钟；种子液培养基配制：蛋白胨8g/l、牛肉膏6g/l、氯化钠2.5g/l、葡萄糖12g/l、酵母膏6g/l，121℃灭菌20分钟。在本发明的一个优选实施方式中，所述制备纳豆菌种子液包括：在无菌环境下，将纳豆枯草杆菌(bacillussubtil-islnatto)菌种用接种环挑取1环接种到斜面培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化的纳豆芽孢杆菌在在无菌环境下挑取1-2环到种子液培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16小时制备发酵种子液。在本发明的一个优选实施方式中，所述接种发酵包括：按照4-8％的比例加入发酵种子液，36-40℃发酵24-30h。在本发明的一个优选实施方式中，所述后熟是指发酵之后在温度为0-8℃下后熟16-28h。有益效果本发明所述发酵方法，在发酵时添加了硫酸软骨素，有效地提高了纳豆冻干粉中纳豆激酶以及大豆异黄酮的含量。在发酵时，硫酸软骨素再配合2-氨基半乳糖醛酸可以进一步提高纳豆冻干粉中纳豆激酶以及大豆异黄酮的含量。具体实施方式为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1：(1)大豆预处理：大豆清洗，在20-25℃浸泡8-10小时；(2)制备固体发酵培养基为：以大豆干重为100wt％，加入葡萄糖3wt％、硫酸软骨素1wt％，硫酸镁2wt％、氯化钙2wt％，ph值为7.2；(3)蒸煮：蒸汽蒸煮30-40min，蒸煮后冷却至45℃以下；(4)配制斜面培养基：琼脂16g/l、蛋白胨8g/l、牛肉粉3g/l、氯化钠2.5g/l，121℃灭菌20分钟；种子液培养基配制：蛋白胨8g/l、牛肉膏6g/l、氯化钠2.5g/l、葡萄糖12g/l、酵母膏6g/l，121℃灭菌20分钟；(5)制备纳豆菌种子液：在无菌环境下，将纳豆枯草杆菌(bacillussubtil-islnatto)菌种用接种环挑取1环接种到斜面培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化的纳豆芽孢杆菌在在无菌环境下挑取1-2环到种子液培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16小时制备发酵种子液；(6)接种发酵：按照6％的比例加入发酵种子液，36-40℃发酵26h；(7)后熟：发酵之后在温度为4℃下后熟20h；(8)冷冻干燥：所得后熟发酵物经过真空冷冻干燥得到纳豆冻干粉。实施例2实施例2与实施例1基本相同，其区别在于步骤(2)制备固体发酵培养基为：以大豆干重为100wt％，加入葡萄糖3wt％、硫酸软骨素1wt％、2-氨基半乳糖醛酸0.5wt％、硫酸镁2wt％、氯化钙2wt％，ph值为7.2。比较例1：比较例1与实施例1基本相同，其区别在于步骤(2)制备固体发酵培养基为：以大豆干重为100wt％，加入葡萄糖3wt％、硫酸镁2wt％、氯化钙2wt％，ph值为7.2。比较例2：比较例2与实施例1基本相同，其区别在于步骤(2)制备固体发酵培养基为：以大豆干重为100wt％，加入葡萄糖3wt％、2-氨基半乳糖醛酸0.5wt％、硫酸镁2wt％、氯化钙2wt％，ph值为7.2。测试试验将刚制得的取纳豆冻干粉样品按质量比1∶6混于生理盐水中，混匀，4℃静置4h，离心后取上清液，得纳豆激酶粗提液，精密量取适量，生理盐水稀释5倍，即得供试品溶液。纳豆激酶总活力测定方法为纤维蛋白平板法，即配置含有凝血酶的纤维蛋白原平板；发酵液以10000rpm离心10min后吸取10微升发酵液，分别点在平板的指定位置；静置观察并在10min时记录光圈直径，重复3次。同时，测定纳豆冻干粉的大豆异黄酮含量。实验结果如表1所示。表1：实施例和比较例纳豆激酶活力测定编号光圈直径(mm)大豆异黄酮(mg/100g)实施例17.5±1.5920±38实施例29.6±1.8993±45比较例14.5±0.9654±23比较例24.9±1.1660±35本发明所述发酵方法，在发酵时添加了硫酸软骨素，有效的提高了纳豆冻干粉中纳豆激酶以及大豆异黄酮的含量。在发酵时，硫酸软骨素再配合2-氨基半乳糖醛酸可以进一步提高纳豆冻干粉中纳豆激酶以及大豆异黄酮的含量。以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。当前第1页12