专利名称：在甲基营养细菌中表达外源dna的启动子，制造它的方法及该启动子的应用的制作方法
众所周知在甲基营养细菌中用不同的载体系统及转录信号都能完成外源DNA的表达。以此为目的的转录信号既是来源于抗性基因，又是对应经常用于在大肠杆菌基因充分表达的启动子，如tac，lac，trp或噬菌体启动子。Windass等人，在“自然”287期，396页(1980)曾叙述过在甲基营养菌中克隆和表达大肠杆菌谷氨酸脱氢酶;Hemnam等人在“自然”279期，80页(1982)和DeMayer等人在美国科学院学报79卷4256页(1982)都探讨过在甲基营养细菌中表达卵清蛋白和α1-干扰素，仅举了些例子。
欧洲专利申请98，967叙述了为克拉拉甲基单胞菌(Methylomonasclara)所用载体系统的进展。甲基营养细菌的天然质粒用作制备杂交质粒，该质粒在克拉拉甲基单胞菌及大肠杆菌中均能稳定复制。德国专利申请3，635，583建议用天然甲单胞菌质粒片段制备这种杂交质粒。
然而，对克拉拉甲基单胞菌天然质粒还不太清楚，即对它们的生物学功能还未确定。然而令人吃惊的是在这些质粒上都能确定其高转录活性区。
本发明有关1.用克拉拉甲基单胞菌天然质粒的启动子区域来表达大肠杆菌和甲基营养细菌的基因。
2.含有1所述启动子区域的杂交载体。
3.用2所定义的杂交载体在大肠杆菌和甲基营养细菌中制备多肽。
下面将详述本发明，特别是在所选实施例中详述。本发明也在权利要求中被定义。
可以用Southern和Northern吸印法测定克拉拉甲基单胞菌质粒的特定区域是否可转录。这将需要与该微生物天然质粒杂交的克拉拉甲基单胞菌完整的RNA。
欲得到本发明的启动子，最好从克拉拉甲基单胞菌DSM2397的质粒pBE3开始，该质粒在欧洲专利申请98，969中已叙述。用限制酶，最好是EcoRⅠ，AvaⅠ和HincⅡ切pBE3。将每个片段吸印并与放射标记的完整RNA杂交，结果看出EcoRⅠ片段3，AvaⅠ片段2和HincⅡ片段1具有高转录活性。其余的pBE3DNA片段虽然与DSM2397RNA探针杂交，但比上述片段弱的多。
用同样方法可测出这些片段与来自大肠杆菌完整RNA的强杂交，该大肠杆菌含有克隆在pBR322中的质粒pBE3。
利用容易检测特性编码的寻找一启动子质粒，特别为大肠杆菌组成的这种质粒，有可能在PEB3上或最好用BalⅠ和MboⅠ适当酶解后，在PBE3上述片断上检测到启动子区域。可选用pkk232-8作为寻找启动子质粒，它具有使氯霉素失活的氯霉素乙酰转移酶(CAT)的少启动子结构基因。也可在pBE3或它的片段连接在pkk232-8上后，转化感受态的大肠杆菌菌株，最好用大肠杆菌HB101，从而在含氯霉素的营养培养基鉴定所需的克隆。用各种限制酶水解抗氯霉素克隆的质粒DNA来鉴定其特性。如克隆MboⅠ片段时可用MboⅠ，鉴定克隆BalⅠ片段可用EcoRⅠ和BamHⅠ。含有pBE3的杂交质粒，利用EcoRⅠ和BamHⅠ可鉴定出4个片段，而用MboⅠ可鉴定3个片段，每个片段都表达以前静止的不含启动子的CAT基因。
当用BalⅠ或MboⅠ水解EcoRⅠ片段3时，用CAT质粒pkk232-8，能鉴别出一个约430bp的片段，它与在完整pBE3DNA的霰弹枪克隆上发现的一个片段相同。测定其顺序，发现它是用霰弹枪法克隆MboⅠ片段后得到的约340bp的片段。可用市售计算机程序定位这个启动子区。在这两种情况有启动子重叠区，就是说该右边的PR启动子顺序与左边的RL启动子顺序相重叠。该顺序在表1说明。
所谓这些启动子的交感序列本质上不同于已知大肠杆菌启动子的交感序列，如a)对其-35区为TTGGTT或TTGCGT或TTGGCT或TTGTTCb)对其-10区为TATGTT或TAAAAT或TATGAT在-35区和-10区之间有任意所需数目的碱基对(bp)，最好是15到19个，主要由G和T组成。在-10区和转录起始区碱基数目也是任意的，最好为7个碱基对左右。每种情况都出现Shine-Delgarno序列。
无论在大肠杆菌还是在甲基营养细菌，最好是在克拉拉甲基单胞菌(特别是DSM2397)中，这些启动子序列都导致下游基因的转录，并可克隆到大肠杆菌/克拉拉甲基单胞菌穿梭载体中，从而使外源基因表达。表1所示BalⅠ或MboⅠ片段启动子序列是用于表达外源基因最佳的启动子。
下面的例子将进一步解释本发明，除特别说明外，百分数均为重量百分数。表达载体的组建在
图1说明。
例1分离完整RNA根据Zuber和Losick(见cell 35，275页(1983))方法分离完整RNA。为得到染色体DNA，将1升OD600为0.6-0.8或0.8-1.0的培养悬液在4℃下离心。再用100毫升缓冲液(含0.15M NaCl;0.1M EDTA，pH8.0)彻底洗该细菌片状沉淀物，否则由于培养基中含Mohr′s盐(NH4)2Fe(SO4)2在以后的研究工作中会形成深红色Fe(SCN)3络合物，从而干扰试验。为抑制由于细胞内源或外源核糖核酸酶分解不稳定的mRNA，所有分离步骤均要在4℃进行。这也是细菌片状沉淀物要再悬浮在40毫升硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的原因，因为它们强烈抑制核糖核酸酶。制备步骤如下(见Maniatis等人“分子克隆实验室手册”CSH，1982);将100克硫氰酸胍与100毫升水，10.6毫升1MTris-HCl(pH7.6)及10.6毫升0.2MEDTA混合(pH8.0)，加热到70℃连续搅拌使其溶解。冷却至室温，加21.2毫升肌酸溶液和2.1毫升β-巯基乙醇，再加水使其总体积为212毫升。将以该方式制备好的该溶液置棕色玻璃瓶中，于4℃下贮存。
为使溶菌酶在溶液中不再活动，(它会使核酸变性和降低核酸含量)，必须用细胞破碎器(Frenchpress)使重悬细胞破碎。为使全部细胞破碎，在1400Psi下连续破碎三次(破碎器杆和钢容器必须予冷到4℃)。然后立即用苯酚处理完全均匀的溶菌液两次，将水相与等体积4M氯化锂溶液混合，4℃下静置1小时。从而使RNA沉淀出来，肉眼可见为白色沉淀，将其在3000rpm(bench离心机)离心40分钟，取出沉淀置于10mMEDTA(pH7.0)缓冲液中。用苯酚处理若干次，用常规乙醇沉淀法(-20℃)来沉淀RNA，并以70%乙醇悬液在-20℃贮存。
所用的全部水溶液予先用0.1%焦碳酸二乙酯溶液保温48小时，然后高压灭菌至少60分钟。尽可能只用灭菌过的塑料器皿(试管，塑料滴管等)，因为玻璃皿高压灭菌后仍可含有活性的核糖核酸酶。
例2分级分离RNA用含甲醛和乙二醛0.8%～1.2%琼脂糖的凝胶为RNA作电泳。乙二醛凝胶与甲醛凝胶不同，它不使RNA变性，因此要先用乙二醛处理使RNA变性。用缓冲液再循环补偿电泳过程的pH梯度升高。
一制备甲醛凝胶为制备琼脂糖/甲醛凝胶，称适量的琼脂糖，加入水中，在微波炉中沸腾使其溶解。将其冷却至60℃后，以1∶10比例(体积)加入10×凝胶缓冲液(含100mMMOPS，pH7.0;50mMNaAc;10mMEDTA，pH8.0)和37%甲醛溶液，使其终浓度为2.2M(见Lehrach等人，Biochmisty16，4273(1977);Goldberg，Proc.Natl.Acad.Sci.77，6794(1980))。制凝胶的液体对粘膜刺激很强，因而必须在罩下倾倒。将溶在水中或冷冻干燥的RNA样品与20μl加热的缓冲液(含1×凝胶缓冲液;50%甲酰胺;2.2M甲醛)混合，并在60℃水浴中加热25分钟。将样品与负载缓冲液(含50%甘油;1mMEDTA，pH8.0;0.4%溴酚兰)混合后，(将其置入水平凝胶上，在流动缓冲液再循环情况下于80伏电泳分离。
一制备乙二醛凝胶当用乙二醛凝胶时，在下列混合液中于50℃加热样品RNA60分钟使其变性，(见McMaster和Carmichael，Proc.Natl.Acad.Sci.74，48，4835(1977))6M乙二醛2.7μlDMSO8.0μl0.1M磷酸二氢钠(pH7.0)1.6μlRNA(多达20μg)3.7μl在10mM磷酸二氢钠溶液中(pH7.0)加入合适量琼脂糖，加热使其溶解。凝胶上的流动缓冲液是10mM磷酸二氢钠溶液。然后在流动缓冲液连续再循环条件下于80伏电泳。
如果RNA凝胶需要染色，则在完成电泳后进行。为此目的，凝胶或在溴化乙锭溶液(3μg/ml)或在吖啶橙溶液(30μg/ml)中振荡15分钟。
例3
用限制性内切酶酶切质粒DNA用合适的酶在10～30μl质粒DNA溶液中于37℃进行单酶水解。为纯化质粒DNA，加1～3单位/μgDNA的酶通常保温1～3小时。所用缓冲液为Maniatis(1982)推荐的高，中等和低盐缓冲液。制造商推荐的该缓冲液用于SalⅠ酶解。在双酶解时，一些合适的酶要同时加入DNA。用少量反应混液在一个微型琼脂糖粒胶上电泳来检查酶解完全与否。
如果要水解快速破碎细胞得到的质粒DNA，为稀释干扰因子就需将反应液体积增至40～50μl。这时温育时间最多为1.5小时。
例4体外32P标记DNA用缺口转译法，在有其它非放射标记核苷酸存在下加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅰ和放射性的α-32P-dCTP使双链DNA32P-标记。(见P.W.Rigby等人，J.Mol.Biol.113，237(1977))一般在乙醇/水混合液中或在浓缩10倍的水溶液中用30～50ci的α-P-dCTP标记质粒DNA。
含乙醇的α-32P-dCTP在室温下完全冷冻干燥，而水溶液形式的则可直接利用。将下列混液用加液器取50μl(或45μl)转移到已冷冻干燥的α-32P-dCTP或转移到5μl置于冰上的α-32P-dCTP水溶液中5μ110×切口转译混液(700mMTris-Cl;100mMMgCl;10mMDTT;200μMdTTP;200μMdGTP，200μMdATP，pH7.4)，200pg水溶液形式的DNaseⅠ，约10个单位的来自大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ。
混合后在16℃温育60分钟。在冰上加5μl200mMEDTA(pH8.0)，中止反应。然后立即在葡聚糖凝胶G50细柱上将未掺入的核苷酸与质粒DNA分离，该质粒DNA大部分已被标记。为此目的。将一个灭菌的巴斯德吸管下端用高压灭菌的家用布松松地塞住，然后向吸管内装入已用TE缓冲液(含10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)平衡过的葡聚糖G50细粒。然后用5ml TE洗柱，再装入放射性反应混液。用TE缓冲液洗柱得到100ml洗脱液，收集在艾本道夫试管(Eppendorf)中。用手动监测器确定含放射标记DNA的部分。用相同的柱体积和同样大小的质粒重复，取第7～9部分，将这些部分结合到一起，取出1μl与15ml闪烁液(来自Zinser的Quickzint)混合，在闪烁计数器中测定放射标记物的水平，通常为每μgDNA含2～5×107cpm。为核查从未掺入α-32P-dCTP的核苷酸中除去标记质粒DNA，用TCA沉淀，再进行闪烁测定，其中只有质粒DNA被沉淀而核苷酸未被沉淀。如果将沉淀部分与非沉淀部分分别闪烁计数，可以从其cpm值不同看出分离的量。
例5Northern法转移RNA基本上如例10所述用于DNA那样，可将RNA转到硝酸纤维滤纸上。不用经过进一步处理，甲醛和乙二醛凝胶均可直接用20×SSC缓冲液(3MNaCl;300mM柠檬酸钠)吸印。转移需36～48小时。由于用溴化乙锭或吖啶橙处理凝胶时，转移RNA效率均大大降低，所以只有未染色的琼脂糖凝胶用Northern吸印法转移。如果DNA标志(marker)也被杂交，电泳后含该标志的有关带，如Southern吸印转移所述要切掉，然后变性，中和，再插入凝胶中及进行吸印。
例6DNA与RNA杂交将酵母tRNA或小牛胸腺DNA先在沸水浴中加热变形，再在冷水中冷却，然后浓缩到400μg/ml，加入到新鲜的杂交混液中。最多将5条硝酸纤维滤纸在80℃下烘干，再用6×SSC(1×SSC＝0.15MNaCl;0.015M柠檬酸钠)湿润，然后用杂交混液(每平方厘米约用0.1～0.2ml)漫过滤纸，最后用透明聚乙烯膜盖住以避免有气泡。为饱和滤纸上所有非特异性即未被DNA探针覆盖的结合点，在42℃水浴中温育至少12小时，(予杂交)，然后除去全部液体，再将放射性探针导入杂交混液(每平方厘米滤纸加30～50μl)。该探针要予先在杂交混液中煮沸使其变性，然后在冰水中冷却。再漫过滤纸，(避免产生气泡)，再如上述在42℃温育至少12小时但不得超过24小时。用2×SSC/0.1%SDS洗两次，每次15分钟，从而将非特异放射性物质从滤纸除去。含放射活性溶液的杂交混液可贮存在4℃，并用几次。室温下在Whatman3MM滤纸上干燥后，进行放射自显影。
例7放射自显影用小粘条胶纸将杂交后滤纸固定到Whatman3MM纸上，再盖上感光胶片。用合适的X光片(kodakX-omatAR;FujiRx)在绝对屏蔽暗盒中于-80℃曝光。当探针放射标记充分完成和高度杂交时，在室温曝光也可得到清晰的杂交带。
例8DNA分级分离用4～12毫米厚水平琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA和分级分离DNA限制片段。根据欲鉴定的DNA大小选择琼脂糖浓度在0.4%～1.2之间。先将合适重量的琼脂糖加入乙酸缓冲液，用微波炉加热至沸，然后冷却到60℃，再加溴化乙锭(10mg/ml水溶液)使其终浓度为0.5μg/ml。电泳在20～50伏，15～30毫安下进行。若凝胶本身不含溴化乙锭，则需在电泳后用3μg/ml的溴化乙锭液染色。在254nM紫外光照射下，可肉眼观察到DNA带，用Polaroid胶片(107型)照相。
例9Southern吸印法转移DNA用Souther吸印法(见J.Mol.Biol.98，503(1975))从琼脂糖凝胶转移DNA首先将琼脂糖凝胶在变性缓冲液中(含1.5MNaCl;0.5MNaOH)振荡1小时。再在中合缓冲液中(含0.5MTris-HCl，pH5.5;0.9MNaCl)振荡2小时。这时中和液及凝胶的pH不能高于7.5。将几张Whatman3MM纸条挂在塑料架上，从而当浸入在含20×SSC的槽内时可吸入液体。在架上放一张用2×SSC浸湿的与琼脂糖凝胶同样大小的Whatman3MM纸，其上以倒转位置放凝胶，从而使下面成为了上面。再在凝胶上铺放与凝胶大小一样予先在6×SSC中浸泡过的硝酸纤维滤纸，其上再放几张同样大小的Whatman3MM纸。必须加压使每层中气泡除去。最后再堆放若干张纸巾，从而使其能通过凝胶向上吸入20×SSC缓冲液，同时将DNA转入硝酸纤维滤纸。滤纸边缘可用约3厘米宽的塑料条覆盖从而防止SSC缓冲液在槽和纸巾间短路循环。用玻璃板在上面加压，它使更多缓冲液通过凝胶向上渗透。1小时后，其上可再放一个约1千克重的玻璃板。
根据凝胶大小及要吸印的DNA量放15～24小时可完成转移。这时凝胶已皱缩，DNA已转入滤纸，从而DNA负载点可通过用软笔在凝胶的每个载样槽对应滤纸的位置作标记。然后将滤纸在6×SSC缓冲液中振荡5分钟，再于室温下在Whatman3MM纸上干燥之，再在80℃烘干2～4小时，从而使其固定DNA。
例10磷酸酯酶反应将溶于TE缓冲液(含10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)的线性载体加入12.5μl的20×RAP缓冲液(800mM Tris-HCl;100mM MgCl2，2mM ZnCl2，pH8.0)和水及50个单位CIP(小牛肠道磷酸酯酶)使其总体积为250μl。在37℃下温育3小时，再加5μl 10% SDS，然后将混合液在68℃再加热15分钟。三次苯酚处理后，用乙醇沉淀，再溶于TE中。
例11用放射性磷酸酯5′-标记RNA为标记RNA，将例1提取的已冷冻干燥的5μg RNA重新悬浮在10μl缓冲液中(50mM Tris-HCl，5mM甘氨酸，10mM亚精胺×3HCl，10mM EDTA，pH9.5)。然后在90℃加热10分钟将RNA切成5′游离的片段，然后置于冰中。再加下列溶液10μl的5×激酶缓冲液(125mM Tris-HCl，50mM MgCl2，10mM DTT，pH9.5)，17μl的水，3μl的T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim or Biolabs产品)，10μl的γ-32P-ATP(10μCi/μl，Amersham)，在37℃温育1小时后，通过葡聚糖G50柱层析将放射标准记的RNA与γ-32P-ATP分开。每μg RNA平均为107cpm。所有标记RNA均用于杂交。
例12克隆来自克拉拉甲基单胞菌的启动子片段为了得到来自克拉拉甲基单胞菌启动子片段的克隆，如例3所述用限制酶SmaⅠ或BamHⅠ完全酶解寻找-启动子质粒pkk232-8(Brosius，Gene，27(1984)151-160)。当用BamHⅠ酶解pkk232-8时，随后用碳性磷酸酶处理。酶解克拉拉甲基单胞菌质粒pBE3得到的限制片段连接到适当予先处理的载体上。用BalⅠ和MboⅠ酶水解这些质粒，每种酶进行单酶解并完全降解。如例13所述将每种混合物连接后，取10μl连接混液，根据Cohen等人方法(Proc.Natl.Acad.Sci.69，2110(1976))用这些样品转化大肠杆菌HB101株的感受态细胞。在含100μg/ml氯霉素的L-肉汤培养基上进行筛选(载体pkk232-8含完整抗氯霉素基因，但由于其缺少启动子，故不能表达)。取出具有抗性菌落用微溶菌测定质粒DNA含量。含质粒的菌落逐渐变大，将其取出，用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶解(当克隆到pkk232-8的SmaⅠ切点时)或仅用MboⅠ酶解(当克隆到pkk232-8的BamHⅠ切点时)，然后在8%PAA聚丙烯酰胺)凝胶电泳测定是否出现新的限制酶切割片段。
例13连接酶反应根据Maniatis(1982)推荐的条件，将分离的DNA片段和质粒载体连接。反应在合适的连接酶缓冲液中进行，用10～20μl浓度为200～400μg/ml的DNA。加入200～400个单位T4连接酶(1个单位相当20μl 50%的用HindⅢ酶解的DNA片段在16℃下连接30分钟所需该酶的量)。在14～16℃温育至少24小时。然后检查连接结果，取出1/10连接酶混液，在0.4%琼脂糖凝胶上与贮存在4℃加T4连接酶前的反应混液比较。
例14在克拉拉甲基单胞细菌/大肠杆菌穿梭载体中克隆启动子片段通过用PstⅠ和PvuⅠ双重酶解既含感兴趣的启动子又含一部分载体pkk232-8的DNA片段，将具有启动子活性的片段克隆到寻找启动子质粒pkk232-8中。用PstⅠ/PvuⅠ双酶解克拉拉甲基单胞菌/大肠杆菌杂交载体PSE-1(如德国专利申请P3，635，583所述)，删去可被来源于pkk232-8的携带启动子DNA片段取代的一个小片段。再用PuvⅠ和PstⅠ双酶解含有来自克拉拉甲基单胞菌，具有启动子活性的各种DNA片段的一系列pkk232-8衍生体。为防止起始质粒在随后的连接酶反应中再连接，再用PvuⅡ酶解这些衍生体。为此，所有这三种酶都同时加入缓冲液中，加入有关DNA(含50mMTris-HCl，10mMNaCl，10mMMgCl，10mMDTT，pH7.6)，在37℃温育1小时。与此平行，如上述用PvuⅠ和PstⅠ完全酶解载体pSE-1。反应后，用琼脂糖凝胶电泳检验混合液的每份样品反应是否完全。然后如例13所述，混合液的各种样品合在一起，进行连接反应。连接完成后，用该连接酶混液转化大肠杆菌HB101感受态细胞，筛选四环素抗性菌落。通过微型落菌和用PstⅠ/PvuⅠ酶解分离的质粒DNA，筛选出含有将所需pkk232-8片段克隆到载体pSE-1中的克隆。
例15在具有克拉拉甲基单胞菌启动子的穿梭载体中克隆引物酶基因具有来自克拉拉甲基单胞菌启动子的pSE-1质粒衍生体含有唯一的PstⅠ切点，其转录是从这里开始的。但当一个结构基因克隆到pSE-1衍生体这单一PstⅠ切点时，则从克隆的启动子开始转录该结构基因3。所用无启动子结构基因的来源是质粒pWP101n(见Furste等人，Gene，48，119(1986))通过PstⅠ酶解，可从该质粒得到一个含引物酶结构基因而没有启动子的DNA片段。在PWP101n质粒中含来源于连接质粒R751和引物酶基因的PstⅠ片段可直接利用其卡那霉素抗性筛选。这个PstⅠ片段可根据例3和13所述步骤先克隆到大肠杆菌载体PBR322的单一PstⅠ酶切点。连接后，用其转化感受态大肠杆菌HB101细胞，筛选四环素抗性克隆，通过试验其氨苄青霉素抗性发现结合的克隆，用微型溶胞及限制酶酶解证实来源于PWP101n的PstⅠ片段的存在。所得具有以两种可能途经来源于pWP101n的PstⅠ片段的克隆作为携带引物酶基因的PstⅠ片段的材料来源。从这些质粒开始，就可能将具有引物酶不含启动子的结构基因的PstⅠ片段转移到具有来源于克拉拉甲基单胞菌各种不同启动子的pSE-Ⅰ衍生体中。为此，依据例3，用限制酶PstⅠ完全酶解这些pSE-Ⅰ衍生体，得到线性化的这些质粒。与此平行，用PstⅠ完全酶解来自大肠杆菌载体pBR322，萃取引物酶的无启动子结构基因。此外，为防止在随后的连接酶反应中载体pBR322的再环化，将SalⅠ也加入到同样的混液中。将这两种混液的样品合起来，如例13步骤连接到一起。如图1所示，也可以用PstⅠ切pSE-1衍生物和PSP101n，然后直接连接在一起。温育后，将连接酶混液用于转化感受态大肠杆菌HB101细胞。筛选抗四环素菌落，微型落菌后，检验质粒DNA是否含所需的DNA部分。含有克隆在pSE-1中无启动子引物酶基因的PstⅠ片段的菌落，可用PstⅠ酶解有关质粒DNA来鉴定。具有与该载体有关的引物酶基因的PstⅠ片段的方向，与用EcoRⅠ酶水解的载体相对应。可能以这种方式发现在这种方向含有引物酶基因的克隆，即由于上游有来自克拉拉甲基单胞菌的启动子，所以它可以被转录。
例16在pUC12中亚克隆如例3所述用限制酶AccⅠ，SmaⅠ，BamHⅠ和EcoRⅠ完全酶解大肠杆菌序列分析载体pUC12，再用如例10所述碱性磷酸酶处理。用限制酶MspⅠ，TaqⅠ，Sau3A，RsaⅠ，HaeⅢ和NotⅠ酶解欲作序列分析的DNA片段。将酶解形成的小DNA片段在1%琼脂糖凝胶上电泳分级分离，其缓冲液为TAE(含40mMTris-乙酸，5mM乙酸钠，1mMEDTA，pH8.0)，将分离出的每个片段结合到滤膜上(Schleicher和Schull，NA-45DEAE)条件如生产者所述(见Schlei.Cher和Schull，序列分析，最新应用364)。对NotⅠ片段，根据Maniatis等人(1982)方法，在有4种核苷酸存在下用DNA聚合酶(Klenow)温育，将其突出末端填平。
用有关限制性内切酶酶解产生一些片段，将其分离，再在连接酶混液中与酶切的载体pUC12结合，从而使其粘性末端间或平钝末端间相互吻合。如例13所述用T4DNA连接酶保温连接每种混液，用连接混液转化大肠杆菌JM83感受态细胞。在含50μg/mlAp和50μg/mlX-gal的LB琼脂平板上分离无兰色出现的抗氨苄青霉素菌落。微型溶菌，再用琼脂糖凝胶电泳检验所需片段是否已结合进去。
例17序列分析如贝林格-曼海姆发表的方法(见“快速简便的质粒序列分析”1986)在PUC12中进行各种片段的序列分析。
例18S1酶解图如Maniatis等人(207-209页)和Favaloro等人(“酶学方法”65，(1980)，718页)方法为转录起点定位，根据S1酶解后DNA-RNA杂交的差异在序列分析凝胶上进行。
权利要求
1.来源于克拉拉甲基单胞菌天然质粒，在大肠杆菌和甲基营养细菌中表达外源基因的启动子区。
2.如权利要求1中的启动子区，它具有下面一个或多个特点a)该启动子-35区有下列核苷酸顺序TTGGTT或TTGCGT或TTGGCT或TTGTTC，b)-10区具有下列核苷酸顺序TATGTT或TAAAAT或TATGATc)在-35区和-10区间有一个15～19个碱基对的间隔区。
3.如权利要求1或2的启动子区，它来自克拉拉甲基单胞菌DSM2397的质粒pBE3。
4.如权利要求1-3的一个启动子区，它含有下列顺序
5.含有权利要求1～4中任一项或几项所述启动子的杂交载体。
6.含有权利要求5所述杂交载体的大肠杆菌或甲基营养细菌。
7.由权利要求6所述大肠杆菌或甲基营养细菌表达的多肽。
全文摘要
本发明涉及在甲基营养细菌中表达外源DNA所用的启动子，制造它的方法及该启动子的应用。可以从克拉拉甲基单胞菌的天然质粒分离在大肠杆菌和甲基营养细菌中表达外源基因的启动子，该启动子有惊人地高度灵活性。
文档编号C12N15/09GK1030939SQ8810377
公开日1989年2月8日 申请日期1988年6月22日 优先权日1987年6月24日
发明者厄斯特·路德维格·维恩克, 汤姆斯·曼特尔, 鲁迪格·玛克特, 波尔·普维 申请人:赫彻斯特股份公司