专利名称：：具有草甘膦耐性的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶的制作方法基因工程的最新进展已经为转化植物使其含有外源基因提供了必不可少的工具。现在已有可能产生具有独特的农学重要特性的植物。当然，这种优越特性之一就是除草剂耐性。除草剂耐性植物可以降低在耕作中对控制杂草的要求，因而可有效地降低农业成本。作为这方面的许多研究的对象的一种除草剂即是N-膦酸甲基甘氨酸。这种除草剂是一种非选择性的、广谱的发芽后除草剂，注册登记应用于五十多种作物。该分子是一种酸，它在水溶液中解离形成对植物有毒的阴离子。已经知道一些阴离子的形式。名词“草甘膦”在这里用来指该酸及其阴离子。草甘膦抑制为合成芳香族氨基酸提供前体的莽草酸代谢途径。具体地说，草甘膦通过抑制5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶来阻断磷酸烯醇丙酮酸及3-磷酸莽草酸到5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的转化。据报导，可以通过在植物的基因组中插入产生较高水平EPSP合酶的能力来产生草甘膦耐性植物。本发明提供一种通过产生突变型EPSP合酶而增强草甘膦耐性植物有效性的方法，这种突变酶在保持其催化活性的同时对草甘膦具有较低的亲合力。图1示来自大肠杆菌(E.Coli)11303和大肠杆菌11303SM-1的EPSP合酶的氨基酸顺序。图2示来自各种植物、细菌和真菌种属的EPSP合酶的氨基酸顺序。图3示共整合植物转化载体pMON316的质粒图谱。图4示用于本文所述载体的CaMV35S启动子、合成多连接子和NOS3′转录终止区/多聚腺苷酸化信号的顺序。图5示双元植物转化载体pMON505的质粒图谱。图6示双元植物转化载体pMON530的质粒图谱。图7示蕃茄EPSP合酶的雌蕊及花药。cDNA克隆的图示。图8示矮牵牛及拟南芥的EPSP合酶的基因组克隆的图示比较。图9示制备质粒pMON851所用的步骤。图10示制备质粒pMON857所用的步骤。图11示草甘膦耐性EPSP合酶相对于野生型EPSP合酶的代表性抑制数据。图12说明本发明的突变型玉米EPSP合酶相对于野生型玉米EPSP合酶的草甘膦耐性。本发明提供新型EPSP合酶，它表现对草甘膦除草剂较高的耐性。如后所述，本发明的目的酶具有一个丙氨酸对甘氨酸的置换。本发明部分地是由于发现一种大肠杆菌中携带一个改变的EPSP合酶基因所导致，该生物以下列方法获得。将大肠杆菌ATCC11303细胞转移到培养基A中并于37℃培养。培养基A10×MOPS1介质50ml50%葡萄糖溶液(50g/100ml)2ml100mM膦酸氨甲基酯(钠盐)10ml硫胺素(5mg/ml)，pH7.41ml100mM草甘膦(钠盐)10ml加去离子水至500ml10×MOPS介质每500ml1MMOPS(209.3g/l，pH7.4)200ml1MN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(89.6g/l，pH7.4)20ml0.01MFeSO4·7H2O(278.01mg/100ml)5ml1.9MNH4Cl(50.18g/500ml)25ml0.276MK2SO4(4.81g/100ml)5ml0.5mMCaCl2·2H2O(7.35mg/100ml)5ml0.528MMgCl2(10.73g/100ml)5ml5MNaCl(292.2g/l)50ml0.5%L-甲硫氨酸(500mg/100ml)5ml微量养分＊＊微量养分(于25ml水中)ZnSO4(2.88mg/ml)25μlMnCl2(1.58mg/ml)250μlCuSO4(1.6mg/ml)25μlCoCl2(7.14mg/ml)25μlH3BO3(2.47mg/ml)250μlNH4MO7O24(3.71mg/ml)25μl1MOPS-3-N-吗啉代丙磺酸一周后，获得可在高浓度草甘膦存在下在生长培养基中(10mM或更高)快速生长的培养物。分析此培养物的提取液中EPSP合酶的活性，并将其草甘膦敏感性与野生型大肠杆菌ATCC11303作比较，揭示该突变体具有一种改变的EPSP合酶。突变细胞的EPSP合酶的草甘膦敏感性与野生型细胞有明显的差异，该突变细菌被命名为大肠杆菌11303SM-1。该突变细菌中编码EPSP合酶的AroA基因如下述进行分离。该细菌中的DNA用Marmur(1961)的方法分离。用大肠杆菌K-12aroA基因(Rogers等，1983)作为探针进行Southern杂交，证实突变细菌中aroA基因位于3.5Kb的BglⅡ-HindⅢ片段上。将此片段克隆到载体pKC7中(Rao，R.N.和Rogers，1979)，生成的质粒用来转化大肠杆菌。筛选能在草甘膦存在下(培养基A)生长的转化菌落，通过与大肠杆菌K-12aroA基因杂交表明这些菌落含有3.5Kb的BglⅡ-HindⅢ插入片段。此克隆被命名为pMON9538。用Sanger(1977)的方法测定突变型大肠杆菌EPSP合酶aroA基因的核苷酸顺序，并由此推测所编码的EPSP合酶相应的氨基酸顺序。本说明书和权利要求书中所给出的所有肽结构都以常规形式表示，其中N末端的氨基写在左边，C末端羧基写在右边。同样，存在于蛋白质中的天然存在的氨基酸命名如下丙氨酸(Ala;A)，天门冬酰胺(Asn;N)，天门冬氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘氨酸(Gly;G)，组氨酸(His;H)，异亮氨酸(Ile;I)，亮氨酸(Leu;L)，赖氨酸(Lys;K)，甲硫氨酸(Met;M)，苯丙氨酸(Phe;F)，脯氨酸(Pro;P)，丝氨酸(Ser;S)，苏氨酸(Thr;T)，色氨酸(Trp;W)，酪氨酸(Tyr;Y)，缬氨酸(Val;V)。上述突变型及野生型大肠杆菌EPSP合酶的氨基酸及核苷酸顺序示于图1。突变型大肠杆菌EPSP合酶顺序的第96位上有一个丙氨酸置换了甘氨酸。图2示各种植物、细菌和真菌种属的EPSP合酶的氨基酸顺序。对这些顺序的观察及为尽可能增加顺序相似性而作的线性组合，揭示在大肠杆菌EPSP合酶突变型发生甘氨酸被丙氨酸置换的区域内有一个高度保守的氨基酸残基区(用方框图标明)。的确，文献上及本说明书中报导的所有EPSP合酶均揭示出在此高度保守区的这一位置上有一个甘氨酸。具体地说，在本发明的草甘膦耐性EPSP合酶的制备过程中，甘氨酸残基被丙氨酸残基取代是发生在构巢曲霉(Aspergillusnidulans)(Charles等，1966)EPSP合酶的97位;矮牵牛EPSP合酶的101位;蕃茄EPSP合酶的101位;拟南芥(Arabidopsisthaliana)EPSP合酶的101位上;BrassicanapusEPSP合酶的104位;大肠杆菌K-12(Duncan等，1984)EPSP合酶的96位;鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(Stalker等，1985)EPSP合酶的96位。业已发现丙氨酸对甘氨酸的置换可被引入其它野生型EPSP合酶的上述高度保守区，产生草甘膦耐性EPSP合酶。图11示本发明的草甘膦耐性EPSP合酶相对于野生型EPSP合酶的具代表性的抑制数据。因此，一方面，本发明提供草甘膦耐性EPSP合酶及一种产生这类酶的方法，该方法包括在具有顺序-L-G-N-A-G-T-A-的高度保守区内，用丙氨酸残基置换第二个甘氨酸残基，此顺序位于成熟的野生型EPSP合酶氨基酸顺序的第80至120位之间。在多数情况下，上述顺序位于成熟EPSP合酶的第90至110位之间。在一个实施方案中，草甘膦耐性EPSP合酶编码顺序可用于进一步增强草甘膦耐性基因转移植物的功效。0218571号欧洲专利局公告及1986年7月7日提交的、申请号为879，814、题为“草甘膦抗性植物”的、共同转让的美国专利申请，公开了转化植物使其具有草甘膦耐性的方法，这些公开内容特别地列入本文参考文献中。可以用这种方式，通过分离植物或其它EPSP合酶编码顺序，并在编码EPSP合酶的DNA顺序中引入必要的改变来产生上面提到的在所翻译的EPSP合酶中由丙氨酸置换甘氨酸，从而使本发明得到应用。另一方面，本发明提供一种转化的植物细胞及由其所再生的植株，该植株含有一个编码草甘膦耐性EPSP合酶的植物基因，该酶具有位于成熟EPSP合酶氨基酸顺序的第80至120位之间的顺序-L-G-N-A-A-T-A-。在多数情况下，上述顺序将位于成熟EPSP合酶的90至110位之间。该基因还含有一个连在成熟EPSP合酶编码顺序N-末端上的编码叶绿体转运肽的DNA顺序，该转运肽适于促使EPSP合酶进入植物细胞的叶绿体。因此，本发明的再一方面还提供含有一个植物基因的植物转化或表达载体，该基因编码一种草甘膦耐性EPSP合酶，该酶具有下列位于成熟EPSP合酶氨基酸顺序80-120位之间的顺序-L-G-N-A-A-T-A-本发明的再一方面提供一种方法，该方法包括，种植这样一种植物，此外，用繁殖体如外植体、插条和种子来繁殖这种植物，或使该植物与另一种植物杂交，产生仍表现草甘膦除草剂抗性的子代。表2所示的EPSP合酶顺序代表了EPSP合酶的很宽进化范围的来源材料。这些资料证实了细菌、真菌和植物材料的EPSP合酶多肽含有上述保守区(-L-G-N-A-G-T-A-)。但是，本领域专业人员将会认识到，特定的EPSP合酶可由另一种来源材料产生并分离得到，该材料可以含有略有不同的保守区顺序。实际上，业已发现，可在矮牵牛EPSP合酶的保守区中插入丙氨酸代替第一个甘氨酸，而不造成草甘膦敏感性的改变。因此，就本发明的目的而言，可用丙氨酸置换与位于80-120位之间的(-L-G-N-A-G-T-A-)同源的顺序中的第二个甘氨酸，从而产生草甘膦耐性EPSP合酶多肽，这样一些多肽被认为是本发明的等价物，因而在本发明的范围内。草甘膦耐性EPSP合酶植物基因编码一种含有叶绿体转运肽(CTP)的多肽，CTP可使EPSP合酶多肽(或其活性部分)转运至植物细胞内的叶绿体。EPSP合酶基因在细胞核中转录为mRNA，该mRNA在细胞质中翻译成前体多肽(CTP/成熟EPSP合酶)。该前体多肽(或其一部分)被转运至叶绿体。适用于本发明的CTP可从各种来源获得。CTP最好是从哪康闹参锏哪谠葱訣PSP合酶基因得到。另外，也可使用来自另一植物EPSP合酶基因的CTP。虽然在EPSP合酶基因和ssRUBISCO基因的CTP顺序之间几乎没有同源性(参见，例如Broglie，1983)，但可以发现非同源性CTP可在特定的实施方案中发挥作用。如后面的实例18所述，通过检测叶绿体对含有目的CTP的EPSP合酶多肽的吸收，易于测定适用于本发明的CTP顺序。适于实施本发明的植物包括(但不限于)大豆、棉花、苜蓿、油菜、亚麻、蕃茄、甜菜、向日葵、马铃薯、烟草、玉米、小麦、稻和莴苣。本发明可应用已知的或已发现的，可促使EPSP合酶基因在植物细胞中转录的启动子。这样一些启动子可由植物或病毒得到，包括(但不必限于)花椰菜花叶病毒的35S和19S启动子，从植物基因如EPSP合酶、ssRUBISCO基因中分离的启动子，以及由根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA基因得到的启动子，如胭脂碱(nopaline)和甘露碱(mannopine)合酶。所选用的特定启动子应能引起足量的表达而导致有效量的EPSP合酶多肽的产生，从而使植物细胞和由其再生的植株基本上具有草甘膦抗性。本领域专业人员将认识到，诱导耐性所需的EPSP合酶多肽的量可以随着植物的类型而变化。用于本发明EPSP合酶基因的启动子如果需要改变其表达特性可进一步进行修饰。例如，可将CaMV35S启动子与ssRUBISCO基因中在无光照时可阻遏ssRUBISCO表达的那一部分连接，产生一个在叶片中有活性而在根中无活性的启动子。所得的嵌合启动子可如本文所述加以应用。本文所用的“CaMV35S”启动子这一词组，包括CaMV35S启动子的各种变化，例如通过与操纵子区连接、随机的或控制的突变、加入或倍增增强子顺序等方法得到的启动子。本发明的突变型EPSP合酶多肽可通过多肽合成来制备，也可通过分离并诱变EPSP合酶基因产生上述草甘膦耐性分子而制备。由于可以预见本发明的最大应用在于草甘膦耐性植物的制备，所以编码草甘膦耐性EPSP合酶的核苷酸顺序(或者是cDNA顺序，或者是基因组顺序)易于用下列方法制备。cDNA编码顺序总RNA可从包括(但不必限于)细菌、真菌和植物组织在内的来源材料分离得到。用寡聚dT纤维素层析选择出多聚A-mRNA。然后用多聚A-mRNA制备cDNA文库。然后用预先克隆的EPSP合酶顺序或合适的寡核苷酸探针筛选cDNA文库。合适的寡核苷酸探针包括以具有氨基酸顺序(L-G-N-A-G-T-A)的保守区为基础的探针，或以EPSP合酶分子其它部分的氨基酸顺序为基础的探针。然后测定由杂交选择出的cDNA片段的顺序，以进一步证实该片段编码EPSP合酶，并测定编码上述保守氨基酸顺序的DNA顺序及相邻的DNA顺序。接着，通过寡核苷酸诱变改变EPSP合酶克隆，插入在保守氨基酸顺序(L-G-N-A-G-T-A)中用丙氨酸置换甘氨酸所需的DNA置换。上述步骤产生一个cDNA顺序，该顺序以所选用的来源材料的野生型EPSP合酶为基础，编码本发明的草甘膦耐性EPSP合酶。在用此处所述方法制备转化的植物细胞及其所再生的植株的过程中，可将上述结构性编码顺序插入功能性嵌合基因构建体中，并插入到所要采用的合适的植物转化载体中。基因组EPSP合酶克隆一般来说，来自欲转化的植物种属的植物组织，最好也用作本发明的草甘膦耐性EPSP合酶DNA编码顺序的来源材料。用这种方式易于从欲转化的植物中得到叶绿体转运肽编码顺序。在一些情况下，利用某种基因组克隆可能是有利的，这一克隆来自含有通常见于内源性EPSP合酶基因的内含子的植物。也可应用上述一般方法，不同的是，用探针来筛选由所选用的植物组织构建的基因组DNA文库。下面提供的详细实例较好地阐述了本发明的cDNA和基因组DNA草甘膦耐性EPSP合酶构建体的制备。EPSP合酶植物转化载体的制备I.矮牵牛EPSP合酶A.MP4-G细胞系的产生起始细胞系命名为MP4系，得自Mitchell二倍体矮牵牛(参见，例如Ausubel，1980)。将MP4细胞悬浮于Murashige和Skoog(MS)培养基中(GIBCO，GrandIsland，N.Y.)。所有的转移都是将10ml悬浮培养物置于50ml新鲜培养基中。到下次转移为止，培养时间在10-14天的范围内，根据的悄坎獾呐嘌锎锉ズ偷募Ｏ蟆将约10ml饱和悬浮培养物(含约5×106个细胞)转移至50ml含0.5mM草甘膦的MS培养基中。本文所述的所有实验都用草甘膦的钠盐。有很大一部分细胞不能在草甘膦存在下繁殖。存活的细胞(估计少于起始群体的1%)在0.5mM草甘膦中进行培养，每隔10-14天转移至含草甘膦的新鲜培养基中。两次转移后，将存活的细胞转移至含1.0mM草甘膦的新鲜培养基中。在含1.0mM草甘膦的培养基中转移两次后，将存活细胞依次转移至2.5mM草甘膦、5.0mM草甘膦、10mM草甘膦中。如上述制备的MP4-G细胞经Southern吸印分析(Southern，1975)真实地显示出具有约15-20个EPSP合酶基因的拷贝，这是由一个称为“基因扩增”的遗传过程而产生的(参见，例如Schimke，1982)。虽然在任何细胞的复制过程中都可能产生自发突变，但没有任何迹象表明在基因扩增过程中EPSP合酶基因发生了任何突变或其它修饰。MP4和MP4-G细胞之间已知的区别仅仅在于，MP4-G细胞在细胞的染色体上含有多个EPSP合酶基因的拷贝，并可能含有位于该基因附近的其它一些基因。B.EPSP合酶的纯化和顺序测定通过真空过滤收集来自MP4-G细胞系的矮牵牛细胞，在液氮中冷冻，用韦林氏搅切器研成粉末。将该粉末悬浮于含有1mMEDTA和7.5%W/V聚乙烯-聚吡咯烷酮的0.2MTris-HCl，pH7.8中。将该悬浮液以约20，000xg离心10分钟除去细胞碎片。在上清液中加入0.1倍体积的1.4%鱼精蛋白硫酸盐沉淀出核酸并弃去。用五个依次的步骤纯化粗制的蛋白悬浮液(参见Mousdale，1984和Steinrucken，1985)，这些步骤包括(1)硫酸铵沉淀;(2)二乙氨乙基纤维素离子交换层析;(3)羟磷灰石层析;(4)在苯基琼脂糖凝胶上进行疏水层析;(5)在SephacrylS-200凝胶上进行筛析(Sizing)。用Hunkapiller(1983a)所述的方法，利用470A型蛋白顺序仪(AppliedBiosystemsInc.，FosterCity，CA)进行Edman降解，将纯化的EPSP合酶多肽降解成一系列单个的氨基酸。如Hunkapiller(1983b)所述，用具有22，000以上理论塔板的氰丙基柱(IBMInstruments，WallingfordCT)进行反相高效液相层析，分析各氨基酸衍生物。矮牵牛EPSP合酶的部分氨基酸顺序示于表1。表1矮牵牛EPSP合酶顺序8910111213氨基酸GlnProIleLysGluIlemRNA链5′-CAPCCNAUUGAPCAPAUUCCAA互补DNA链3′-GTQGGNTAATTQCTQTAAGGUU合成的DNA探针EPSP13′-GTQGGPTAPTTQCTQTAEPSP23′-GTQGGQTAPTTQCTQTAEPSP33′-GTQGGNTATTTQCTQTA确切的mRNA顺序5′-CAACCCAUUAAAGAGAUUC.探针的合成应用遗传密码，用表1给出的氨基酸顺序确定能够编码所给出的各氨基酸的可能的DNA密码子。用这一信息制成三个不同的探针混合物，命名为EPSP-1、EPSP-2和EPSP-3，如表1所示。在此表中，A、T、U、C、G分别代表下列核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。字母P、Q和N为变量;N代表任一碱基;P代表嘌呤(A或G);Q代表嘧啶(U、T或C)。所有的寡核苷酸都用Adams(1983)的方法合成。每到达一个不确定的核苷酸位置(P、Q或N)，就在反应混合物中加入适当核苷酸的混合物。在临近使用时，用100μCiγ-〔32P〕-ATP(Amersham)和10单位多聚核苷酸激酶，在50mMTris-HCl，pH7.5;10mMMgCl2、5mMDTT、0.1mMEDTA、0.1mM亚精胺中，标记20pmol探针。于37℃保温1小时后，探针在20%丙烯酰胺、8M尿素凝胶上进行再纯化，也可以使探针通过一个含有0.1MNaCl、10mMTris-HCl，pH7.5、1mMEDTA的5mlSephadexG25柱而进行再纯化。D.mRNA的制备和探针的预先测试(a)多聚AmRNA如Goldberg(1981)所述，从MP4(对草甘膦敏感)和MP4-G(对草甘膦有抗性)细胞系中分离总RNA。如Depicker(1982)所述使总RNA通过一个CsCl垫进一步沉降。用寡聚dT纤维素层析选择出多聚AmRNA。多聚ARNA的产率为每克MP4细胞1.1μg及每克MP4-G细胞2.5μg。(b)RNA的凝胶处理将10μg来自MP4或MP4-G细胞系的多聚ARNA用乙醇沉淀并再悬浮于含50%甲酰胺和2.2M甲醛的1×MOPS缓冲液中(20mMMOPS，pH7.0、5mM乙酸钠和1mMEDTA，pH8.0)。于65℃加热10分钟使RNA变性。然后加入五分之一体积的含有50%甘油、1mMEDTA、0.4%溴酚蓝和0.4%二甲苯苯胺(XyleneCyanol)的上样缓冲液。RNA在含有1.1M甲醛的1.3%琼脂糖凝胶上进行分级分离，直至溴酚蓝靠近凝胶底部。HaeⅢ消化的φX174DNA(用32P标记)作为分子量标准一起进行电泳。DNA标记物标明RNA条带的大致分子量。(c)RNA转移至硝酸纤维素用20×SSC(1×SSC为0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)作转移缓冲液，通过过夜吸印凝胶将RNA转移至硝酸纤维素(＊BA85，Schleicher和Schuell，Keene，NH)。转移后，滤膜在空气中干燥并在真空烘箱中于80℃烘2-3小时。(d)与放射性探针进行预杂交将滤膜放在6×SSC、10×Denhardt溶液(1×Denhardt溶液为0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清清蛋白)、0.5%NP-40、200μg/ml大肠杆菌转移RNA中，于50℃预杂交4小时。于32℃，在含有2×106cpm/mlEPSP-1或EPSP-2探针的新鲜溶液中杂交48小时。未测试EPSP-3探针是因为它含有一个极少存在于矮牵牛基因组中的密码子(ATA)。每种情况下所采用的杂交温度(32℃)均比对混合物中具有最低GC含量的寡核苷酸所计算的解离温度(Td)低10℃。探针的Td由下式估算2℃×(A+T)+4℃×(G+C)。(e)滤膜洗涤滤膜于室温下用6×SSC在15-20分钟内洗涤两次，然后在轻微振荡下于37℃洗涤5分钟。然后将滤膜包在塑料胶片中，加两个增感屏于-70℃自显影12-14小时。然后将滤膜于42℃在轻微振荡下再洗涤5分钟。滤膜再自显影12-14小时。放射自显影结果表明，在含有来自MP4-G细胞系的多聚ARNA的泳道中，探针EPSP-1与约1.9Kb的RNA产生了杂交。在含有来自MP4细胞系的多聚ARNA的泳道中，没有检测到此RNA的杂交。出现这一结果是由于MP4-G细胞系过量生成EPSP合酶mRNA。探针EPSP-2(与EPSP-1只有一个核苷酸不同)几乎检测不到与MP4-G细胞系的1.9KbmRNA的杂交，但与这两个细胞系的1.0KbmRNA产生强杂交。然而，1.0KbDNA不足以编码一个50，000道尔顿的多肽，因此认为有一个EPSP-2探针顺序与文库中一个完全不同的顺序杂交。这些结果表明，简并探针混合物EPSP-1含有正确的EPSP合酶顺序。在后续的所有简并探针杂交实验中都采用这个混合物。E.λgt10cDNA文库的制备(a)所用的材料AMV反转录酶购自SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，Florida;DNA聚合酶I大片段(Klenow聚合酶)来自NewEnglandNuclear，Boston，MA;S1核酸酶和tRNA来自Sigma公司;AcA34柱床树脂来自LKB，Gaithersburg，MD;EcoRI、EcoRI甲基化酶和EcoRI连接子来自NewEnglandBiolabs，BeverlyMA;RNAsin(核糖核酸酶抑制剂)来自PromegaBiotech，Madison，Wisc.，所有放射性化合物都来自Amersham，Arlington，Hts.，IL。λgt10载体(ATCCNO.40179)及有关的大肠杆菌细胞系由斯坦福大学医学院的ThanhHuynh和RonaldDavis提供(见Huynh，1985)。该载体具有三个重要特性(1)它具有一个独特的EcoRI插入位点，这样在插入新的DNA之前，就不需要从噬菌体DNA中除去中间部分的DNA;(2)可用此载体克隆大小在0-约8，000碱基范围内的DNA;(3)可用大肠杆菌MA150细胞(ATCCNO.53104)对某个文库进行处理，以除去不具有DNA插入片段的克隆。(b)cDNA第一条链的合成如前面D.(a)部分所述制备多聚AmRNA，并再悬浮于50mMTris(pH8.5)、10mMMgCl2、4mMDTT、40mMKCl、500μMd(AGCT)TP、10μg/mldT12-18引物、27.5单位/mlRNAsin中。在120μl的反应体积中，每5μg多聚ARNA加入70单位反转录酶。一支反应管中含有γ-32P-dCTP(5μCi/120μl反应液)，以便检测cDNA的大小和产率，并提供第一条链标记以监测后续的反应。为破坏mRNA的二级结构，将H2O中的mRNA于70℃保温3分钟，然后将反应管置冰上冷却。加入反转录酶，于42℃进行cDNA合成60分钟。加EDTA至50mM终止反应。分别在反应开始时和反应60分钟后取样，用TCA沉淀检查cDNA的产率。cDNA合成后，cDNA以cDNA-RNA杂交分子存在。在沸水浴中将该混合物加热1.5分钟使cDNA-RNA杂交分子变性，然后在冰上冷却。(c)第二条DNA链的合成使单链cDNA以自身为引物进行第二条链的合成。用Klenow聚合酶和反转录酶将单链cDNA转变为双链cDNA。首先应用Klenow聚合酶，因为据信其3′-5′核酸外切酶修复功能能够消化由自身引发而产生的不平整DNA末端，并能以其聚合酶活性延长这些平整末端。除Klenow聚合酶外，应用反转录酶，因为据信反转录酶一旦结合在模板链上就不太可能过早地停止作用。Klenow聚合酶反应在终体积为100μl的体积(不包括酶)中进行。该反应混合物含有50mMHEPES(pH6.9)、10mMMgCl2、50mMKCl、每种dNTP各500μM、以及cDNA。加入20-40单位Klenow聚合酶(通常少于5μl)启动反应，将反应管于15℃保温5小时。加入EDTA至50mM终止反应。反应混合物用苯酚萃取，沉淀出核酸，离心后干燥。进行反转录酶反应进一步延长反互补DNA链，反应如对最初合成cDNA的反应所述进行，不同的是不加dT10-18引物和RNAsin，并且在120μl反应液中用了32单位反转录酶。加EDTA至50mM终止反应。反应混合物用等体积的苯酚萃取，沉淀出核酸，离心后干燥。(d)S1核酸酶处理将200μl2×S1缓冲液(1×S1缓冲液为30mM乙酸钠(pH4.4)、250mMNaCl、1mMZnCl2)、175μlH2O和525单位S1核酸酶加入含有125μl第二条链合成反应产物的反应管中。将这些管于37℃保温30分钟，加入EDTA至50mM终止反应。反应混合物用等体积的苯酚/氯仿(1∶1)萃取。水相用乙醚萃取除去残存的苯酚。用乙醇沉淀出DNA并在空气中干燥。(e)EcoRI甲基化反应由于双链cDNA是从许多种mRNA复制而来，所以许多双链cDNA都可能含有内部的EcoRI限制位点。需要保护这些酶切位点不被EcoRI切割，以便能够使用平末端EcoRI连接子，随后用EcoRI切割这些连接子，在末端产生粘性伸出顺序。为了防止内部EcoRI位点发生所不期望的切割，用EcoRI甲基化酶使双链cDNA甲基化。将DNA沉淀溶于40μl50mMTris(pH7.5)、1mMEDTA、5mMDTT中。加入4μl100μMS-腺苷基-L-甲硫氨酸和1μl(80单位)EcoRI甲基化酶。将反应管于37℃保温15分钟，然后于70℃保温10分钟使甲基化酶失活。后来发现，下述甲基化反应不能有效地防止EPSP合酶编码区内的内部EcoRI位点被切割，这显然是由于甲基化酶试剂失活。如下所述，内部EcoRI位点的断裂需要某些另外的步骤来分离全长的cDNA。为了避免这些另外的步骤，在对cDNA进行消化之前，应在cDNA和对照DNA片段上同时应用甲基化试剂和反应条件，并且应通过EcoRI消化进一步证实对照片段得到了保护。(f)DNA聚合酶I填充反应在含有45μlcDNA(如上述制备)的管中，加入5μl0.1MMgCl2、5μl0.2mMd(ACGT)TP和10单位DNA聚合酶I。将该管于室温下保温10分钟。加入EDTA至25mM终止反应。加入1μg未切断的λgt10DNA作载体，混合物用苯酚/氯仿(1∶1)萃取。用乙醇沉淀出混合物中的核酸，离心后干燥。(g)EcoRI连接子与甲基化双链cDNA的连接将约400pmolEcoRI连接子(5′-CGGAATTCCG-3′)溶于9μl含50μCiγ-32P-ATP(5000Ci/mmole)和2单位T4多聚核苷酸激酶的20mMTris(pH8.0)、10mMMgCl2、10mMDTT中。将寡核苷酸于37℃保温30分钟，使它们彼此退火，生成双链平末端连接子。加入2单位T4多聚核苷酸激酶和1μl10mMATP，于37℃再保温30分钟。将这些连接子贮存于-20℃。将甲基化DNA沉淀重新悬浮于装有400pmol经激酶处理的连接子的管中。加入1μlT4连接酶，将反应混合物于12-14℃保温2天，使EcoRI连接子与甲基化DNA连接。(h)用EcoRI消化产生粘性末端在11μl前面1.E.(g)部分的反应产物中，加入10μl含50mMTris(pH7.5)、10mMMgSO4、200mMNaCl的溶液。于70℃保温10分钟使T4DNA连接酶热失活。加入40单位EcoRI，于37℃保温3小时。加入EDTA至50mM终止反应。通过离心使样品澄清，加至AcA34柱上。(i)AcA34柱层析从连有连接子的双链cDNA中除去游离的连接子(即未与双链cDNA连接的连接子)，以防它们干扰所需的双链cDNA对克隆载体的插入。在一个用玻璃棉塞住的1ml塑料注射器中，加入预先用2mM柠檬酸缓冲液和0.04%叠氮钠水溶液溶胀的AcA34树脂(一种丙烯酰胺和琼脂糖珠的混合物，通常用来做筛析)至1ml刻度处。该柱用10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、400mMNaCl平衡。将连有连接子的双链cDNA和游离连接子的混合物(～45μl)调至400mMNaCl。加入1μl0.5%溴酚蓝染料(BPB)，将该样品上柱，于室温下在平衡缓冲液中进行层析。以200μl为一管收集10个组分。BPB染料通常在第六管或更后一些从柱中洗脱出。将第1管和第2管合并，用作进行克隆的双链cDNA来源。(j)λgt10克隆的组装将双链cDNA与1μg经EcoRI切割的λgt10DNA混合，用乙醇沉淀后离心。沉淀用70%乙醇洗涤一次，然后使DNA沉淀在空气中干燥，并重新悬浮于4.5μl10mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、50mMNaCl中。将混合物于70℃加热3分钟，然后于50℃加热15分钟，使cDNA插入片段与λgt10DNA的左臂和右臂退火并连接。将混合物置冰上冷却，加入10mMATP、0.1MDTT各0.5μl，以及足以保证反应完成至少90%的T4DNA连接酶。反应液于14℃保温过夜，使双链cDNA插入λgt10DNA的EcoRI位点。利用Scherer(1981)所述方法，将所得DNA体外包装入噬菌体颗粒中。(k)除去不带插入片段的噬菌体cDNA插入λgt10的EcoRI位点导致C1基因失活。带有失活的C1基因(即带有插入片段)的λgt10噬菌体通常可在大肠杆菌MA150细胞中复制。相反，不带有插入片段的λgt10噬菌体不能在大肠杆菌MA150菌株中复制。这就提供了一个除去不具有插入片段的λgt10克隆的方法。首先使文库中的噬菌体在大肠杆菌C600(M+R-)细胞中复制，这使λgt10DNA得到修饰，保护它免受大肠杆菌MA150限制系统的作用。将相对少量的大肠杆菌C600细胞用过量20倍的MA150(M+R+)细胞感染并铺平板。M+R-细胞即发生初次感染，其中所有的噬菌体都能生长，但MA150细胞中连续发生的几次复制阻止了不带插入片段的噬菌体的复制。从平板中收集扩增的噬菌体文库，离心除去琼脂和其它污染物后，重组噬菌体即可用于筛选实验。F.cDNA文库的筛选;pMON9531的选择将约600个噬菌体(每个平板)铺在含0.7%琼脂糖的10cm×10cm固体NZY琼脂方形平板上(Maniatis，1982)。这些平板上生长着大肠杆菌MA150细胞的半透明菌苔。称为“噬菌斑”的清彻区域表明噬菌体感染并杀死大肠杆菌细胞的区域，这些噬菌斑可在平板经37℃过夜培养后在菌苔上见到。用此方法制备6个平板。将事先剪好的硝酸纤维素滤膜压在噬菌斑上约30分钟。这样形成噬菌斑的对称影印膜。为了印上噬菌体DNA，将滤膜用0.5MNaOH和2.5MNaCl处理5分钟。然后将滤膜依次用含有2.5MNaCl的1.0MTris-HCl(pH7.5)和0.5MTris-HCl(pH7.5)处理，以中和NaOH。用氯仿冲洗这些滤膜以除去细菌碎片，然后在空气中干燥，并于80℃真空烘2小时，然后使其冷却至室温。然后如前面1.D(e)部分所述，将这些滤膜与32P标记的EPSP-1探针杂交(2×106cpm/滤膜)。杂交48小时后，将滤膜于室温下用6×SSC洗涤二次，20分钟，然后于37℃洗涤5分钟。这几步洗涤除去了非特异性结合的探针分子，而具有确切的相应顺序(这一顺序此时尚属未知)的探针分子仍与滤膜上的噬菌体DNA结合。最后一次洗涤后，通过放射自显影对滤膜进行分析。进行第一个筛选步骤后，放射自显影照片上出现七个代表阳性杂交信号的黑点。从平板中取出这些噬菌斑，以100-200噬菌斑/平板的密度重新接种在新鲜平板上，用上述方法筛选这些平板。选择出四个阳性杂交噬菌体。分别从这四个克隆中分离DNA，用EcoRI消化以测定cDNA插入片段的大小。选择出含有最大的cDNA插入片段(约330bp)的克隆，命名为λE3。将来自λE3的cDNA插入片段插入质粒pUC9(Vieira，1981)，所得质粒命名为pMON9531。为进一步证实pMON9531克隆含有所需的EPSP合酶顺序，通过用EcoRI消化将该片段从pMON9531克隆中除去。然后用Maxam(1977)的化学降解法测定此DNA片段的顺序。从该核苷酸顺序推测出的氨基酸顺序与表1所示的EPSP合酶部分氨基酸顺序相一致。G.λF7基因组DNA克隆的产生为获得完整EPSP合酶基因，用BamHI消化来自MP4-G细胞系的染色体DNA，并克隆到噬菌体载体中产生一个文库，用pMON9531的部分EPSP合酶顺序作探针进行筛选。(a)MP4-G染色体DNA片段的制备在液氮存在下冷冻MP4-G细胞并用碎玻璃在研钵中研碎。将细胞粉末与含有8.0M尿素、0.35MNaCl、0.05MTris-HCl(pH7.5)、0.02MEDTA、2%Sarkosyl和5%苯酚的冷的溶解缓冲液混合，混合比例为8ml/g。用玻璃棒搅拌该混合物以打碎大的团块。加入等体积的含5%异戊醇的苯酚和氯仿(3∶1)的混合物。加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5%。于室温下将该混合物在旋转台上旋转10-15分钟。以6，000xg离心15分钟分离出各相。重复进行苯酚/氯仿萃取。在水相中加入乙酸钠至终浓度为0.15M，用乙醇沉淀出DNA。离心收集DNA，将其溶于1×TE(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，在CsCl-溴乙锭梯度中形成条带。用16号针头在管的侧壁上穿孔收集DNA。用CsCl饱和的异丙醇萃取溴乙锭，将DNA用1×TE彻底透析。从12g细胞中分离出约400μgDNA。用30单位BamHI将MP4-G染色体DNA(10μg)消化至完全，消化反应于37℃在含有10mMTris(pH7.8)、1mMDTT、10mMMgCl2、50mMNaCl的缓冲液进行2小时。用苯酚然后用氯仿萃取DNA，并用乙醇沉淀。将DNA片段以0.5μg/μl的浓度悬浮于1×TE中。(b)MP4-G染色体DNA片段在λMG14中的克隆用Maniatis(1982)所述方法从噬菌体λMG14(得自华盛顿大学医学院(St.Louis，Missouri)的MaynardOlson博士)制备DNA。在含有10mMTris-HCl(pH7.8)、1mMDTT、10mMMgCl2、50mMNaCl的缓冲液中，用BamHI将150μgDNA消化至完全。用0.5%琼脂糖凝胶进行电泳检查消化是否完全。然后用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)萃取噬菌体DNA两次，用乙醇沉淀。以150μg/ml的浓度将DNA重新悬浮于1×TE中。加入MgCl2至10mM并于42℃保温1小时，使λDNA的粘性末端重新退火。用琼脂糖凝胶电泳检查是否发生了退火。退火后，将DNA铺在BeckmanSW27超离心管中的38ml(10-40%，W/V)蔗糖梯度上。梯度溶液是在含有1MNaCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、5mMEDTA的缓冲液中制备的。每个梯度上加75μgDNA。将这些样品于15℃在BeckmanSW27转子中以26，000rpm离心24小时。从离心管的顶部收集各组分(0.5ml)，利用凝胶电泳分析DNA的存在。将含有λDNA已退火的左臂和右臂的组分合并在一起，用TE透析后用乙醇沉淀。沉淀物用70%乙醇洗涤并干燥。将DNA以500μg/ml的浓度溶于TE中。将纯化的载体DNA臂和MP4-GDNA的BamHI片段以4∶1和2∶1的摩尔比混合，用T4DNA连接酶在含有66mMTris-HCl(pH7.5)、5mMMgCl2、5mMDTT和1mMATP的连接酶缓冲液中进行连接。于15℃进行连接反应过夜。用琼脂糖凝胶电泳检查是否发生了连接。将连接后的带有MP4-GDNA插入片段的噬菌体DNA利用市售包装提取物(PromegaBiotech，Madison，WI)体外包装入噬菌体衣壳中。利用大肠杆菌C600细胞，以每个平板约6000个噬菌斑的密度，将包装后的噬菌体接种在含0.7%琼脂糖的10cm×10cm方形NZY琼脂平板中。于37℃过夜培养后，即已形成噬菌斑。从培养箱中取出这些平板，于4℃冷却至少1小时。如前所述，用硝酸纤维素滤膜压这些琼脂平板30分钟，将噬菌体转移到滤膜上，从而将噬菌体DNA印在滤膜上。利用Maniatis(1982)所述方法，使每片滤膜与约1.0×106cpm/滤膜的分离自pMON9531克隆的330bpcDNA插入片段(已进行缺刻翻译)于42℃杂交40小时。该探针的比活为2-3×108cpm/μgDNA。进行杂交的溶液中含有50%甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、200μg/mltRNA和0.1%SDS。滤膜用1×SSC、0.2%SDS于50℃洗涤后进行放射自显影。观察到几个阳性信号，与相应平板上的噬菌斑相配。挖出所选择的噬菌斑，悬浮在SM缓冲液中并接种NZY琼脂。以较低的密度重复进行同样的平板筛选过程，直至平板上的所有噬菌斑都显示出阳性信号。选择一个分离物进行进一步的分析，并将此分离物命名为λF7噬菌体克隆。H.pMON9543和pMON9556的制备分别用BamHI、BglⅡ、EcoRI和HindⅢ消化λF7DNA。在Southern吸印实验中，该DNA与一个缺刻翻译的来自pMON9531的EPSP合酶顺序杂交。这表明λF7中的互补顺序是在4.8kbBglⅡ片段上。将此片段插入质粒pUC9中(Vieira，1982)，使其复制，缺刻翻译，并用来探测矮牵牛cDNA文库。探测时应用106cpm/滤膜及1.(G)部分所述的杂交条件。鉴定出一个cDNA克隆，称为pMON9543，该克隆带有一个与λF7顺序结合的顺序。DNA顺序分析(Maxam，1977)表明，pMON9543不含EPSP合酶基因的终止密码子或3′非翻译区。因此，从pMON9543中移出EPSP合酶顺序，进行缺刻翻译后用作探针再对cDNA文库进行筛选。鉴定出一个与EPSP合酶顺序杂交的克隆，命名为pMON9556。DNA顺序分析表明，此克隆中的插入片段含有完整的EPSP合酶基因3′区，包括一个多聚腺苷酸化的尾巴。此插入片段的5′EcoRI末端与pMON9531中的EPSP合酶插入片段的3′EcoRI端配对。将来自pMON9531和pMON9556的EPSP合酶插入片段连接起来，产生一个完整的EPSP合酶编码顺序。I.带有CaMV35S/EPSP合酶基因的pMON546载体的制备利用M13载体(Messing，1981和1982)通过位点定向诱变(Zoller等，1983)修饰pMON9531中的EPSP合酶插入片段，在EPSP合酶基因的5′非翻译区中产生一个BglⅡ位点。通过EcoRI和BglⅡ消化分离修饰的EPSP合酶顺序，将其插入载体pMON530而得到pMON536。pMON530是一种用于以农杆菌为基础的植物转化的双元载体。然后将pMON9556的1.62kbEcoRI-EcoRI片段插入pMON536，得到pMON546。由于pMON530已含有位于BglⅡ位点之后的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，所以上述操作产生了一个位于pMON546中的嵌合CaMV35S/EPSP合酶基因。pMON530是一种携有35S-NOS盒(cassette)的pMON505的衍生物，它是用下述方法制备的从CM4-184的pOS-1克隆中分离CaMV35S启动子，分离出一个AluI(n7143)-EcoRI＊(n7517)片段，先将该片段插入经BamHI酶切、DNA聚合酶Klenow片段处理、然后又经EcoRI酶切的pBR322中。用BamHI和EcoRI从pBR322中切下启动子片段，用Klenow聚合酶处理，插入M13mp8的SmaI位点，使mp8多连接子的EcoRI位点位于启动子片段的5′端。核苷酸编号参考CM1841的顺序(Gardner等，1981)。然后利用位点定向诱变在核苷酸7464处引入一个G，产生BglⅡ位点。然后从M13中切下CaMV35S启动子片段，为一个330bpEcoRI-BglⅡ片段，它含有CaMV35S启动子、转录起始位点和30个核苷酸的5′-非翻译前导顺序，但不含有任何CaMV翻译起始区，也不含有位于转录起始点下游180个核苷酸处的CaMV35S转录本多聚腺苷酸化信号(Covey等，1981;Guilley等，1982)。将CaMV35S启动子片段与合成多连接子和NOS3′非翻译区连接，并插入pMON200(Fraley等，1985;Rogers等，1986)，得到pMON316，见图3。质粒pMON316含有位于5′前导顺序和NOS多聚腺苷酸化信号之间的BglⅡ、ClaⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ和EcoRI独特酶切位点。质粒pMON316保留了pMON200的所有性质。CaMV35S启动子、多连接子和NOS3′片段的完整顺序示于图4。此顺序起始于XmnI位点，该位点是通过Klenow聚合酶处理除去位于CaMV35S启动子片段5′端的EcoRI位点而产生的。质粒pMON530(见图6)是一个通过将pMON316的2.3kb-StuⅠ-HindⅢ片段移入pMON526而制得的pMON505的衍生物。质粒pMON526是pMON505的一种简单衍生物，其中，通过用XmaⅠ消化、用Klenow聚合酶处理并进行连接，除去了SmaⅠ位点。质粒pMON530保留了pMON505和CoMV35S-NOS表达盒的所有性质，现在它含有一个位于启动子和多聚腺苷酸化信号之间的独特的SmaⅠ酶切位点。双元载体pMON505是pMON200的一种衍生物，其中Ti质粒同源区L1H已被微型RK2质粒pTJS75(Schmidhauser和Helinski，1985)的3.8kbHindⅢ-SmaⅠ片段代替。该片段含有RK2复制起点oriV及转移起点oriT，适于利用三亲本杂交法(Horsch和Klee，1986)接合入农杆菌中。参见图5，质粒pMON505保留了pMON200的所有重要特点，包括适于插入所需DNA片段的合成多连接子;对大肠杆菌和根瘤农杆菌的选择起决定作用的嵌合NOS-NPTⅡ′-NOS卡那霉素抗性基因;一个有利于标示转化体和子代遗传性的完整的胭脂碱合酶基因;以及一个便于在大肠杆菌中制备大量载体的pBR322复制起点。质粒pMON505含有一个得自pTiT37胭脂碱型T-DNA右端的单个T-DNA边界。Southern分析已显示出质粒pMON505和它所携带的任何DNA都整合在植物基因组中，即，完整质粒是插入植物基因组中的T-DNA。整合DNA的一端位于右边界顺序和胭脂碱合酶基因之间，另一端位于边界顺序和pBR322顺序之间。质粒pMON546含有(1)CaMV35S/EPSP合酶基因;(2)一个可选择的卡那霉素抗性(KanR)标记基因;(3)一个作为可标示的标记物的胭脂碱合酶(NOS)基因;(4)一个T-DNA右边界，它有效地促使完整质粒作为“转移DNA”(T-DNA)区接受根瘤农杆菌细胞的处理。将此质粒插入含有辅助质粒pGV3111-SE的根瘤农杆菌细胞中。该辅助质粒编码某些促使pMON546DNA插入植物细胞染色体所必需的酶。它还含有一个可在细菌中起作用的卡那霉素抗性基因。含有pMON546和pGV3111-SE的根瘤农杆菌培养物贮藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指定的ATCC保藏号为53213。如果需要，可以利用标准方法从这个细胞培养物中分离这些质粒中的任一个。例如，这些细胞可与含有流动质粒(mobilizationplasmid)如pRK2013(Ditta，1980)的大肠杆菌细胞一起培养。变为Spc/StrR、KanS的细胞应含有pMON546，而变为KanR、Spc/StrR的细胞应含有pGV3111-SE。草甘膦耐性矮牵牛植株从经过表面消毒的矮牵牛叶片上取直径为6mm(1/4英寸)的叶圆片。在MS104琼脂培养基上培养这些叶圆片2天，以促使在伤口表面形成部分细胞壁。然后将叶圆片浸入含有pMON546和GV3111-SE，并已于28℃在Luria液体培养基中培养过夜的根瘤农杆菌培养物中，并轻轻振荡。从细菌悬浮液中取出细胞，吸干，如Horsch(1980)所述，将细胞倒置于放在烟草细胞“滋养”培养物上的滤纸上。2或3天后，将叶圆片转移至含有MS培养基的培养皿中，培养基中含有500μg/ml羧苄青霉素和0、0.1、0.25、或0.5mM草甘膦(钠盐)，没有滋养培养物。用含有辅助质粒pGV3111-SE和一种不同的植物转化载体pMON505的根瘤农杆菌细胞制备出对照组织，pMON505含有一个带有NOS/NPTⅡ/NOS卡那霉素抗性基因的T-DNA区和一个与pMON546相同的NOS可选择标记基因，但不带有CaMV35S/EPSP合酶基因。在转移至含有草甘膦的培养基后10天内，在不含草甘膦的对照平板上，所有叶圆片的周边都出现旺盛生长的愈伤组织。在含0.1mM草甘膦的培养基上，在对照叶圆片和转化组织之间，几乎察觉不出什么差别。在含有0.25mM草甘膦的培养基上，对照叶圆片极少长出愈伤组织，而转化的组织生长显著。在含0.5mM草甘膦的培养基上，对照叶圆片未长出愈伤组织，而转化的叶圆片长出大量的愈伤组织。这进一步证实了CaMV35S/EPSP合酶基因赋予了转化细胞草甘膦抗性。利用Horsch等人(1985)所述的方法，从上述转化叶圆片再生出转化的矮牵牛植株。所获得的转化植株含有上述的pMON546载体，该载体含有与野生型矮牵牛EPSP合酶基因融合的CaMV35S启动子。选择4个单独的具代表性的基因转移籽苗，与4个单独的未转化的(野生型)矮牵牛籽苗一起种植，并用下述测试方法进行测试。于26℃，将植株种植在生长室中的生长基质中，每天照光12小时。每周以可溶性肥料给植株施肥，并根据需要浇水。用自动轨迹喷雾器，以均匀而可重复的喷洒速度给植株喷洒除草剂。所用的草甘膦溶液以每英亩草甘膦酸等同物的重量(磅)计量，将草甘膦以草甘膦异丙胺盐的形式与离子型表面活性剂混合。选择4个单独的野生型(未转化的)矮牵牛植株用作对照植株。如Horsch等人(1985)所述，利用卡那霉素抗性选择出4个单独的含有pMON546载体的转化植株。用草甘膦的异丙胺盐以下面表2所列的施用水平喷洒对照植株和转化植株;所得的实验结果也总结于表2。表2植物对喷洒草甘膦的反应植物类型草甘膦剂量＊目测外观对照10.8＃/英亩完全死亡，植物表现出很快枯黄、黄化、萎焉、死亡。嵌合EPSP0.8＃/英亩生长良好，新叶稍有枯合酶黄但以正常形态生长，植物外观健康，开始开花。＊酸等同物1野生型植株或带有对照载体(pMON505)的转化植株。如表2所示，当喷洒0.8磅/英亩草甘膦时，对照植株被杀死。相反，转化的矮牵牛植株在以0.8磅/英亩喷洒后，仍健康成活。转化植株比未转化的对照植株对草甘膦接触更具有抗性。草甘膦耐性矮牵牛EPSP合酶用下列方法制备携有草甘膦耐性矮牵牛EPSP合酶突变基因的植物转化载体。质粒pMON342携带由成对的噬菌体λpL启动子表达的“成熟的”野生型矮牵牛EPSP合酶编码顺序(不带叶绿体转运肽)。此质粒得自pMON9544和pMON9556。为了在刚好位于成熟蛋白编码顺序之外的野生型矮牵牛EPSP合酶cDNA中引入一个独特的NcoⅠ位点和ATG翻译起始信号，同时除去叶绿体转运肽编码顺序，利用Zoller和Smith(1983)的方法及下列诱变引物，使M8017(300bpEcoRIcDNA片段的M13mp9克隆)进行位点定向诱变。5′-ATCTCAGAAGGCTCCATGGTGCTGTAGCCA-3′分离出一个含有NcoⅠ位点的突变型噬菌体克隆。利用顺序分析进一步证实上述突变的存在。此M13mp9克隆命名为M8019。质粒pMON6001是携有由两个合成噬菌体λpL启动子的串联拷贝表达的大肠杆菌K12EPSP合酶编码顺序的pBR327衍生物(Soberon等人，1980)。用下列方法构建质粒pMON6001。首先，用ClaⅠ消化pMON4(Rogers等，1983)，将2.5kb片段插入也已用ClaⅠ切割的pBR327中。所得质粒pMON8含有与pBR327的β-内酰胺酶基因在同一方向上阅读的EPSP合酶编码顺序。采用下列步骤构建pMON25。pMON25是带有相邻于大肠杆菌EPSP合酶编码顺序的独特限制性核酸内切酶位点的pMON8衍生物。利用BstEⅡ切割并进行再连接，制备pMON4的缺失衍生物。所得质粒pMON7缺少pMON4的2kbBstEⅡ片段。接着，用NdeⅠ和HinfⅠ消化pMON7，在丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后进行电洗脱，然后分离出编码EPSP合酶开放读码5′端的150bpHinfI-NdeI片段。将此片段加入纯化的pMON8的4.5kbBamHI-NdeI片段中。pMON8含有EPSP合酶编码顺序的3′部分及一个具有如下顺序的合成连接子。5′-GATCCAGATCTGTTGTAAGGAGTCTAGACCATGG-3′3′-GTCTAGACAACATTCCTCAGATCTGGTACCTTA-5′所得质粒pMON25含有EPSP合酶编码顺序，该顺序的前面是独特的BamHI和BglⅡ位点、一个合成的核糖体结合位点、以及独特的XbaⅠ和NcoⅠ位点，后者含有该编码顺序的ATG翻译起始信号。为构建pMON6001，用BamHI消化pMON25，并与含有部分噬菌体λpL顺序(含有BamHI粘性末端)的合成DNA片段(Adams和Galluppi，1986)混合。5′-GATCCTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCG-3′3′-GATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGCCTAG-5′所得质粒pMON6001携有两个合成噬菌体λpL启动子片段的拷贝，这两个片段是在pMON25的BamHI位点中的直接重复，并处于促进EPSP合酶编码顺序转录的正确取向。用NcoⅠ和EcoRI切割质粒pMON6001，用琼脂糖凝胶分离出3kb片段。将此片段与从M8019中纯化的小的100bpNcoI-EcoRI片段混合。进行连接和转化后，鉴定出一个克隆，它含有相应于“成熟”矮牵牛EPSP合酶5′端的小的100bpNcoI-EcoRI片段。此构建体命名为pMON9544。用EcoRI消化质粒pMON9544，并用碱性磷酸酯酶处理。将pMON9544的EcoRI片段与已用EcoRI切割而释放出编码矮牵牛EPSP合酶编码顺序3′部分的1.4kb片段的pMON9556DNA混合。进行连接和转化后，鉴定出一个克隆，它可以补充大肠杆菌aroA突变，并带有pMON9556的1.4kb片段。此质粒命名为pMON342。用一个ClaI位点代替pMON342中EPSP合酶3′端的EcoRI位点，以利于进行构建。这是通过用EcoRI进行部分消化，然后用绿豆核酸酶消化而使末端钝化而完成的。通过用T4DNA连接酶进行连接，将ClaI连接子(5′-CATCGATG-3′，NewEnglandBiolabs)加到平末端上。用ClaI消化该混合物产生粘性末端，用琼脂糖凝胶分离出5kbEcoRI部分消化产物，用T4DNA连接酶进行连接。该质粒命名为pMON9563。用自动DNA合成仪(AppliedBiosystems，Inc.)合成一个具有下列顺序的29核苷酸诱变脱氧寡核苷酸，5′-GCCGCATTGCTGTAGCTGCATTTCCAAGG-3′以便在101位引入丙氨酸对甘氨酸的置换。用制备聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化这个脱氧寡核苷酸。将pMON9563的770bpEcoRI-HindⅢ片段亚克隆到经EcoRI-HindⅢ消化的M13mp10噬菌体载体(NewEnglandBiolabs)中。按Amersham公司(ArlingtonHeights，IL.)的M13克隆和顺序测定手册所述，从亚克隆中制备单链模板DNA。如Zoller和Smith(1983)所述进行寡核苷酸诱变反应。将含有pMON9563克隆的770bpEcoRI-HindⅢ片段的单链M13mp10模板DNA(0.5pmole)与20pmole上述29聚体脱氧寡核苷酸及1μl10xDTT缓冲液(pH7.5)混合，总体积为10μl。将该混合物于70℃加热5分钟，置于室温下(23℃)20分钟，然后置冰上20分钟。在进行退火反应时，通过加入下列成分制备酶/核苷酸溶液1μl10x缓冲液B(0.2MTris-HCl、0.1MMgCl2、0.1MDTT，pH7.5)、每种10mMdNTP各1μl、1μl10mMrATP、3单位T4DNA连接酶、2单位DNA聚合酶I大片段，加水至总体积为10μl。此溶液于冰上保存备用。在冰上保温20分钟后，将10μl酶/核苷酸溶液加入退火的DNA中，混合后保持15℃过夜。再加入3单位T4DNA连接酶以确保延伸反应完全而产生闭环DNA分子。此构建体命名为M9551。将M9551的770bpEcoRI-HindⅢ片段插入pMON9563的EcoRI和HindⅢ位点之间，代替相应的野生型片段。此质粒命名为pMON9566。用BglⅡ和ClaⅠ消化质粒pMON530DNA，向其中加入pMON536的330bpBglⅡ-EcoRIEPSP合酶3′片段和纯化的pMON9566的1.4kbEcoRI-ClaIEPSP合酶5′片段，然后用T4DNA连接酶处理。转化后，分离出一个质粒，它携有完整的突变型矮牵牛EPSP合酶编码顺序(带有叶绿体转运肽编码顺序)，与CaMV35S启动子相邻。此质粒命名为pMON567。将质粒pMON567插入含有辅助质粒pGV3111-SE的根瘤农杆菌细胞中。如Horsch(1985)所述，使含有pMON567/pGV3111-SE的根瘤农杆菌细胞的培养物与取自烟草植株(NicotianatobacamCVH425)的叶圆片接触。农杆菌细胞将突变型EPSP合酶基因插入植物细胞染色体中。利用Horsch(1985)的方法，选择具有卡那霉素抗性的植物细胞，再生出分化的植株。繁殖出这些植株的子代，并使其在约4周龄时生长至玫瑰形直径约为10cm。用草甘膦以相应于2.0和3.6磅酸等同物/英亩的水平喷洒这些植株。在7和14天时，评价草甘膦对转化植株的作用效果。将这一效果变换成0-10的数值标度，其中0代表全部杀死，10为未洒药的正常植株。下面的数据证明，用草甘膦耐性矮牵牛EPSP合酶基因转化的烟草植株即使对这些高水平的草甘膦也具有显著耐性。这些数值代表了野生型EPSP合酶和草甘膦耐性EPSP合酶基因的最佳转化体。表3草甘膦的相对效果1天磅/英亩0.42.03.6GT2WT3GTWTGTWT78.06.08.05.05.05.0148.07.08.31.87.41.7289.09.07.00.87.00.810代表全部杀死，10代表无作用。2草甘膦耐性矮牵牛EPSP合酶。3野生型EPSP合酶。Ⅱ.蕃茄EPSP合酶利用改变的Huynh等人(1985)和Gubler等人(1983)的方法，由分离自成熟蕃茄雌蕊或花药的多聚A加RNA，制备互补DNA(cDNA)文库如下第一条链合成下面给出了制备成熟雌蕊cDNA文库所用的各个量值，以类似的方法制备花药cDNA文库。将每个反应管置于Savant真空干燥器中，使50%乙醇中的10μl400μg/ml放线菌素D(Sigma化学公司)干燥。在该管中加入下列试剂(以给定的次序加试剂)体积物质终浓度/量62μl高压灭菌水加至终体积为100μl10μl10x第一条链见下缓冲液10μl5mMdNTPA、C、G、T1各500μM10μl100μg/ml寡聚d(pT)1μg22μlRNAsin(30U/μl)60U32μlRNA～1.5μg3μl反转录酶40单位42μl32P-dATP200Ci/mMole51SigmaChemical，St.Louis，MO.2CollaborativeResearch，Lexington，MA.3PromegaBiotech，Madison，WI.4LifeSciences，St.Petersburg，FL.5Amersham，ArlingtonHeights，IL.反应混合物于42℃保温60分钟。在干冰上冷冻反应混合物并贮存于-20℃。10x第一条链缓冲液500mMTris-HClpH8.3300mMKCl100mMMgCl24mM二硫苏糖醇，DTT通过用三氯乙酸沉淀部分反应翰⒔猩了讣剖舛ㄋ铣傻腸DNA的量为～1.31μg。第一条链的纯化用预先在10mMTris-HCl/1mMEDTA，pH8.0(TE)中溶胀的BiogelP60(100-200目，BioRad，Richmond，CA)灌柱，该柱为一个用硅烷化的玻璃棉塞住的硅烷化的巴氏吸管(床体积＝1ml)。该柱用几倍体积的1mMTrispH7.6/0.01mMEDTA洗涤。使90μl同样溶液加10μl柱标记缓冲液(见下)过柱使柱平衡。用含有蓝色染料的组分测定外水体积。柱中再加一些缓冲液洗脱出红色染料。将第一条链反应液用等体积的苯酚萃取两次。在cDNA中加入0.5μl2%溴酚蓝，将其上柱，收集外水体积。柱标记缓冲液5%蓝色葡聚糖(2M道尔顿，Sigma)0.05%酚红(或0.1%溴酚蓝)溶于20mMTrispH7-8/1mMEDTA第二条链合成和甲基化在Savant真空干燥器中将第一条链干燥至约10μl。体积物质第一条链浓度/量3.8μlcDNA～500ng第一条链10μl10x第二条链缓冲液1x0.8μl5mMdNTP各40μM81.5μl水加至终体积100μl2μlDNA聚合酶Ⅰ(NEB)20U0.4μl大肠杆菌DNA2U连接酶(NEB)0.5μlRNA酶H(BRL)1U3μl32PdCTP30μCi1μlBSA(BRL以1∶10稀释)50μg/mlNEB＝NewEnglandBiolabs，Beverly，MABRL＝BethesdaResearchLabs，Gaithersberg，MD反应液于14℃保温60分钟，然后于室温保温60分钟。加入下列试剂0.5μl5mMdNTP1μlT4DNA聚合酶(NEB)反应液于室温保温30分钟。加入下列试剂1.2μl1mMS-腺苷酰L-甲硫氨酸(Sigma)12μM1.0μlEcoRI甲基化酶(NEB)20U2.4μl0.5MEDTA12mM从梅从σ褐腥〕μl加至260ng野生型λDNA(NEB)中作为甲基化反应的对照。反应液于37℃保温45分钟。主要反应液及试验反应液都加热至68℃10分钟，使酶失活。测定三氯乙酸不溶物的计数，结果表明，该反应产生了～500ng双链cDNA。10x第二条链缓冲液200mMTris-HClpH7.4-7.51M贮液50mMMgCl21M贮液1.0MKCl4M贮液100mM硫酸铵1M贮液1.5mMβ-NAD150mM贮液分析甲基化的完全性在经热处理的试验甲基化反应液中加入下列试剂2μl100mMTris-HClpH7.6/100mMMgCl2/1.0MNaCl12μl水1μlEcoRI(20单位BRL)0.5μlpUC19(0.5μg，NEB)反应液于37℃保温1小时。产物在琼脂糖微凝胶上进行电泳，用未消化的pUC19及用EcoRI和HindⅢ消化的λ作分子量标记。反应液中的pUC19消化至完全，表明EcoRI的作用是有效的;λDNA完全未消化，显示它已通过甲基化反应而得到了保护。这表明，甲基化酶有效地阻止了cDNA中的EcoRI位点的消化。清除双链cDNA将第二条链反应混合液用等体积的苯酚萃取两次，如上述使其通过P-60柱并收集外水体积，在Savant真空干燥器中冷冻干燥。将cDNA溶于3μl1mMTris-HClpH7.5/0.01mMEDTA中。连接子与cDNA连接在小离心管中混合下列试剂3μl双链cDNA(500ng)2.5μl磷酸化的EcoRI连接子(NEB，250ng)1μl10x连接缓冲液1μl10mMATP1.5μl水(使终体积为10μl)1μlT4DNA连接酶(～400单位NEB)反应液于14℃保温12小时。10x连接缓冲液300mMTris-HClpH7.6100mMMgCl250mMDTT除去连接子加入下列试剂2μl100mMTris-HClpH7.6/100mMMgCl2/1.0MNaCl6μl水反应液加热至68℃10分钟使连接酶失活。加入以下试剂2μlEcoRI(40单位，NEB)反应液于37℃保温2.5小时。将反应液加热至68℃10分钟使EcoRI失活。按大小分离切断的DNA并与连接子分离在已消化的cDNA/EcoRI连接子反应液中加入5μl上样缓冲液。在含有0.3μg/ml溴化乙锭的0.8%SeaPlaque琼脂糖(FMC公司，Rockland，MD)/TEA(40mMTris-乙酸pH8.2/1.6mMEDTA)微凝胶上对样品进行电泳。使凝胶以4V/cm进行电泳，直至溴酚蓝染料迁移4cm。用经HindⅢ和EcoRI消化的λDNA作分子量标记。利用紫外萤光观察标记物，切下含有大小在～600bp至大于10kb范围的cDNA的凝胶片。上样缓冲液250mMEDTApH70.2%溴酚蓝50%甘油纯化、连接及包装通过称重并假定其密度为1.0g/ml，确定凝胶片的体积为～500μl。在凝胶片中加入140μl20mMTris-HCl(pH7.5)/200mMNaCl/1.0mMEDTA，及20μl5MNaCl。将该混合物加热至68℃15分钟。用500μl苯酚萃取两次。按厂家说明在EluTipDD柱(Schleicher和Schuell，Keen，NH)上进行层析，从污染物中纯化出DNA。终体积为450μl。取一个等份试样进行闪烁计数测定样品中放射性的量。经测定，洗脱体积中含有70ngcDNA。在cDNA中加入2μl(2μg)λgt10臂(VectorCloningSystems，SanDiego，CA)，然后加入2倍体积的冷乙醇。将样品冷却至-80℃15分钟，在小离心机中使沉淀物沉降15分钟。排出管中液体，用200μl-20℃70%乙醇小心冲洗，不要搅动沉淀物。使沉淀物在空气中干燥30分钟。加入以下试剂7.2μl水1μl10x连接缓冲液1μlATP0.8μlT4DNA连接酶反应液于14℃保温20小时。10x连接缓冲液200mMTris-HClpH7.6100mMMgCl250mM二硫苏糖醇(DTT)利用Gigapack包装提取物(StratageneCloningSystems，SanDiego，CA)，按厂家说明将四分之一(2.5μl)连接反应液体外包装入噬菌体中。接下来进行的噬菌体接种表明，该反应液含有106重组噬菌斑形成单位(PFU)。因此整个连接混合液的包装将产生4×106PFU。剩下的连接混合液于-20℃贮存备用。用32P标记的含有矮牵牛EPSP合酶完整编码顺序的pMON6145片段筛选来自两个文库的噬菌斑挖出物。pMON6145是由上面列为参考文献的S.N.879，814申请所述的质粒pGEM2(PromegaBiotech，Madison，WI)的一种衍生物，它携有一个全长的矮牵牛EPSP合酶cDNA克隆。从每个文库中分离出两个杂交噬菌斑。这些噬菌体的插入片段的图谱示于图7。将两个雌蕊克隆(P1和P2)的大的EcoRI片段亚克隆到pUC19(NewEnglandBiolabs)中，而将小的EcoRI片段克隆到pUC119中，分别形成质粒9591、9589、9595和9596。用下列方法构建pUC119分离出噬菌体M13的476bpHgiAI/DraI片段，并用T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)使该片段的末端钝化。然后将该片段插入已用NdeI消化并用KlenowDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)填平的pUC19(Yanisch-Perron等人，1985)中。如果携有所得质粒(pUC119)的细胞可被缺陷型噬菌体如R408(StratageneCloningSystems)感染，则可用该质粒产生单链DNA。为了在预计为成熟酶在大肠杆菌中体外表达的起始位点处引入一个NcoI位点和一个ATG翻译起始密码子，将pMON9591的1.6kbEcoRI/HindⅢ片段克隆至经EcoRI/HindⅢ消化的M13mp18(NewEnglandBiolabs)中，产生一个命名为M9568的噬菌体。此克隆如前所述用下列寡核苷酸进行诱变5′-AGCACAATCTCATGGGGTTCCATGGTCTGCAGTAGCC-3′顺序测定的结果证实了诱变是成功的，所得噬菌体命名为M9575。将此噬菌体的1.6kbEcoRI/HindⅢ片段插入经EcoRI/HindⅢ消化的pMON6140。此质粒命名为pMON9717。质粒pMON6140是pGEM1(PromegaBiotech，Madison，WI)的一种衍生物，它携有与前面对pMON6145所述相同的矮牵牛EPSP合酶全长cDNA克隆。pMON9717的体外转录和翻译未能产生有活性的酶。随后对制备该克隆所用的cDNA(pMON9591)进行顺序测定，揭示出在该编码顺序中有一个单核苷酸缺失，这将导致该编码顺序的移码。将含有该缺失的区域用pMON9589的相应区域来代替，这是通过使pMON9717的900bpBamHI/HindⅢ片段与pMON9589的相应片段交换而实现的。此质粒命名为pMON9718。pMON9718的体外分析表明，它编码有活性的蕃茄EPSP合酶。构建一个适于在大肠杆菌中进行高水平表达的载体，以进一步鉴定蕃茄EPSP合酶。将含有蕃茄EPSP合酶编码顺序的pMON9718的NcoI/HindⅢ片段插入经NcoI/HindⅢ消化的pMON5521中。这样就把蕃茄EPSP合酶编码顺序置于大肠杆菌RecA启动子的控制之下(Horii等人，1980;Sancar等人，1980)。此质粒命名为pMON9719。质粒pMON9719能够补充大肠杆菌aroA突变型(SR481)的EPSP合酶缺陷，证明该质粒能够合成有活性的EPSP合酶。为了在成熟蕃茄EPSP合酶的101位引入丙氨酸对甘氨酸的置换，如前述利用Zoller和Smith(1983)的方法用下列寡核苷酸诱变噬菌体M9568中的野生型EPSP合酶编码顺序。5′-GCCGCATTGCTGTAGCTGCATTTCCAAGG-3′该噬菌体再如前述用下列寡核苷酸进行诱变，5′-AGCACAATCTCATGGGGTTCCATGGTCTGCAGTAGCC-3′引入一个NcoI位点和翻译起始密码子。所得构建体命名为M9580。将含有已诱变区域的M9580的EcoRI-BamHI片段插入已用EcoRI和BamHI消化的pMON9718中。此质粒命名为pMON9728。为在大肠杆菌中进行表达，将pMON9728的NcoI/HindⅢ片段插入经NcoI/HindⅢ消化的pMON5521(见上述)中，产生一个命名为pMON9729的质粒。因此，质粒pMON9719和pMON9729是类似的质粒，其中蕃茄的野生型EPSP合酶和草甘膦耐性EPSP合酶(gly(101)-ala)处在大肠杆菌recA启动子的控制之下。在诱导RecA启动子表达的条件下培养携有pMON9719或pMON9729的大肠杆菌SR481细胞。将细胞溶解，分析提取液的EPSP合酶活性。具体地说，将细菌细胞膏状物用0.9%盐水洗涤两次，悬浮于缓冲液中(100mMTris-HCl、5mM二硫苏糖醇、1mMEDTA、10%甘油和1mM苄脒盐酸盐)，使其通过1000磅/英寸2的法式压力室两次。通过于5℃以15，000xg离心10分钟将细胞提取液与细胞分开。提取液用SephadexG-50(Pharmacia，Piscataway，NewJersey)脱盐。如下所述测定脱盐后的提取液的EPSP合酶活性将10μl提取液加至分析混合液(40μl)中，于25℃保温2小时。分析混合液中含有莽草酸3-磷酸(2mM)、14C-磷酸烯醇丙酮酸(1mM，1.2mCi/mmol)、钼酸铵(0.1mM)、氟化钾(5mM)(在50mMHEPES-KOH，pH7中)。加入50μl90%乙醇/0.1M乙酸，pH4.5停止反应。将70μl反应混合液加到SynchroPakAX100HPLC柱上(0.4×25cm)，用0.5M磷酸钾，pH5.5以1ml/分的流速洗脱层析柱。用RadiomaticFlo-OneBetaInstrument(Radiomatics，Florida)监测洗脱液的放射性。通过测定14C-PEP至14C-EPSP的转化测定EPSP合酶活性，14C-PEP和14C-EPSP都在上述层析条件下进行分离。提取液的蛋白含量用Bradford(BioradLabs，California)的方法测定。提取液的比活以每分钟所形成的EPSP的毫微摩尔数/mg蛋白表示。测定结果表明，含有pMON9719的细胞的EPSP合酶活性约为1600nmoleEPSP/分钟/mg蛋白。但此酶对草甘膦非常敏感，其I50为12μM草甘膦。尽管含pMON9729(gly(101)-ala)的细胞的EPSP合酶活性只有390nmole/分/mg蛋白，但此酶具有高度的草甘膦耐性，其I50值为32mM草甘膦。按以下方法构建一个能在基因转移植物中产生草甘膦抗性形式的蕃茄EPSP合酶的植物转化载体。通过对pMON9596进行位点定向诱变，在蕃茄前EPSP合酶的ATG翻译起始密码子的上游建立一个BglⅡ位点。诱变是利用Kunkel(1985)的方法用下列寡聚脱氧核苷酸进行的5′-GCCATTTCTTGTGAAAAAGATCTTTCAGTTTTTC-3′通过完全如上述进行位点定向诱变，在M9658编码顺序中建立丙氨酸对甘氨酸的置换。然后将所得噬菌体的700bpEcoRI/BamHI片段转移入经EcoRI/BamHI消化的pMON9718中，代替相应的野生型片段。接着，将改变的pMON9596的70bpBglⅡ/EcoRI片段与M9718衍生物的1.6kbEcoRI/HindⅢ片段一起，并入经BglⅡ/HindⅢ消化的pMON550中。pMON550是pUC19的一种衍生物(Yanisch-Perron等人，1985)，它是通过将下列合成DNA片段插入用HindⅢ和KpnⅠ消化的pUC19中而产生的。5′-AGCTTTCTAGAAGATCTCCATGGAGGCCTGGTAC-3′3′-AAGATCTTCTAGAGGTACCTCCGGAC-5′这就重新构成了一个完整的含有丙氨酸对甘氨酸置换的蕃茄EPSP合酶前体基因。为便于插入植物转化载体，通过用HindⅢ消化、使末端钝化并插入一个ClaⅠ连接子(NewEnglandBiolabs)，在编码顺序的3′端建立一个方便的位点。然后将此质粒的1.7kbBglⅡ/ClaⅠ片段插入经BglⅡ/ClaⅠ消化的植物转化载体如pMON316中。所得质粒具有处于CaMV35S启动子控制下的蕃茄EPSP合酶前体编码顺序，并且在成熟EPSP合酶顺序的101位具有丙氨酸对甘氨酸的置换。用此载体转化植物如蕃茄，可导致高水平草甘膦耐性酶的产生，从而产生草甘膦耐性植株。Ⅲ.拟南芥属EPSP合酶通过将经过筛析分级分离的(15-20kb)MboⅠ部分消化的DNA克隆入经BamHI和EcoRI消化的λEMBL3(StrategeneCloningSystems，SanDiego，CA)，制备拟南芥基因组文库(genomicbank)。用32P标记的矮牵牛EPSP合酶探针(前述pMDON9566)筛选来自此文库的约10，000个噬菌斑。纯化出一个强杂交噬菌斑，命名为E1。EPSP合酶探针对噬菌体DNA的Southern吸印鉴定出两个杂交很强的片段。第一个片段是一个1.0kbHindⅢ片段，另一个是700bpBamHI片段。将这两个片段亚克隆到质粒pUC119中，分别命名为pMON574和pMON578。接着，用Sanger(1977)的方法测定这两个插入片段的DNA顺序。顺序数据与矮牵牛EPSP合酶顺序有很强的同源性，表明该噬菌体确实含有拟南芥的EPSP合酶基因。用700bpBamHI片段作噬菌体和拟南芥基因组DNA的杂交探针，鉴定适于克隆完整EPSP合酶基因的限制性片段。在E1噬菌体克隆中鉴定出两个分别为6.0kb和3.2kb的杂交BglⅡ片段。将这些片段分别亚克隆到pMON550中，产生分别命名为pMON582和pMON583的DNA用于进一步的实验。从pMON582和pMON583克隆制备另外两个亚克隆。质粒pMON584是含有pUC118中的拟南芥EPSP合酶基因5′端的1.8kbEcoRI-BamHI片段，而pUC118是由pUC18制得的，制备方法与从pUC19制备pUC119的方法类似。质粒pMON589是含有pUC119中的拟南芥EPSP合酶基因3′端的2.8kbBamHI-BglⅡ片段。从pMON584的BamHI位点及从pMON589的BamHI位点进行的顺序测定，得到了完整的基因编码区顺序，见图8。对该编码顺序进行修饰，使所表达的拟南芥EPSP合酶在成熟酶的101位含有丙氨酸对甘氨酸的置换。利用Kunkel(1985)的方法，用下列寡核苷酸诱变质粒pMON578。5′-CTTTACCTCGGTAATGCAGCTACAGCAATGCG-3′测定所得质粒pMON594的一部分顺序，以证实突变的发生。在紧靠翻译起始位点上游处，需要一个ClaI位点以将拟南芥EPSP合酶基因插入植物转化/表达载体中。将含有翻译起始位点及65bp5′非翻译区的pMON584的370bpSnaBI/BamHI片段克隆至经EcoRV/BamHI消化的BluescriptKS(StratageneCloningSystems，SanDiego，California)中，形成pMON9734。现在可用ClaI和BamHI从pMON9734中除去此片段。如下所述重新构建完整的拟南芥基因用于植物转化实验从pMON583中切下含有该基因的3′一半的3.0kbBamHI-BglⅡ片段，将其插入pMON9734的独特BamHI位点。此质粒pMON588在该基因的中部具有一个独特BamHI位点。然后将pMON594的800bpBamHI片段插入pMON588的独特BamHI位点。所得的这个质粒pMON598含有完整的EPSP合酶基因，并且在成熟蛋白的101位具有丙氨酸对甘氨酸的置换。从pMON598中切下完整基因成为一个3.5kbClaI-EcoRI片段，将其克隆到经ClaI/EcoRI切割的pMON857中。这个新质粒pMON600含有受到CaMV35S启动子转录控制的完整拟南芥基因，并包括胭脂碱合酶基因的3′端。接着将该质粒引入含有无致瘤力(disarmed)Ti质粒pTiT37SE的农杆菌A208ASE中。如下所述制备质粒pMON857。从质粒pLG62(Gritz和Davies，1984)中切下IV型庆大霉素-3-N-乙酰转移酶(AAC(3)-IV)的DNA编码顺序。这个AAC(3)-IV酶的DNA顺序已有文献报导(Brau等人，1984)。用下列方法制备质粒pMON825，它包括一段含有AAC(3)-IV酶开放读码(ORF)的DNA。从pLG62中切下跨过AAC(3)-IV基因ORF的氨基端部分的143碱基对(bp)TaqI片段，将其克隆到质粒pUC8(Vieira等人，1982)的AccI位点中，生成pMON823。下一步，将含有该ORF其余部分的pLG62的1316bpSacI-PstI片段克隆到预先用SacI和PstI核酸内切酶切割的pMON823中。此质粒命名为pMON824。质粒pMON824含有重新构建的IV型庆大霉素-3-N-乙酰转移酶的编码顺序，并且在紧靠ORF起点上游处有一个EcoRI位点。然后从pMON824中切下含有完整ORF的1300bpEcoRI片段，并将其克隆到pMON530的EcoRI位点中。此质粒命名为pMON825。质粒pMON825在紧靠NOS3′转录终止区/多聚腺苷酸化信号上游处含有完整的AAC(3)-IVORF。参见图9，用核酸内切酶SmaI和BglⅡ切割质粒pMON825。通过用Klenow聚合酶和四种三磷酸核苷处理，填平由BglⅡ切割产生的伸出顺序。通过用DNA连续酶处理连接平整末端，所得质粒命名为pMON840。用核酸内切酶EcoRI切割质粒pMON840。通过用Klenow聚合酶和四种三磷酸核苷处理填平伸出顺序。通过用DNA连接酶处理连接平整末端，所得质粒命名为pMON841。上述步骤从嵌合CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS基因中除去了BglⅡ、SmaⅠ和EcoRI限制性位点。用下列方法进行位点定向诱变除去其它限制性位点。将pMON841的2170bpPstI片段引入经PstI切割的pUC119中，产生一个命名为pMON843的构建体。通过用下列寡核苷酸进行位点定向诱变(Zoller，1983)，5′-TTACGTCAGTGGAAGTATCACATCAATCCA-3′除去CaMV35S启动子顺序中的EcoRV位点，产生质粒pMON844。顺序测定结果进一步证实了pMON844含有上述EcoRV缺失。通过用StuⅠ和HindⅢ切割pMON505除去pMON505中的NOS/NPTⅡ/NOS基因，代之以含有CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS基因的pMON844的2220bpEcoRI(Klenow填平的)HindⅢ片段。此质粒命名为pMON845Ｋ婧缶承蚍治鋈范薖MON845中的CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS嵌合基因，含有携自pMON825的NOS启动子的、处在CaMV35S启动子顺序起点上游的外源顺序。利用下列寡核苷酸进行位点定向诱变，5′-TGTAGGATCGGGAAGCTTCCCCGGATCATG-3′将位于pMON844的CaMV35S启动子起点处的XmaI位点变为HindⅢ，产生质粒pMON849。用携带同一嵌合基因的pMON849的较小的1900bpEcoRI/HindⅢ片段代替pMON845的EcoRI/HindⅢ片段(含有CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS基因)。此质粒命名为pMON851。用来自三个质粒的片段构建一个多用途克隆载体，该载体采用CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS基因作可选择标记，并含有一个CaMV35S/NOS3′盒。参见图10，由pMON849和pMON530制备CaMV35S/NOS3′盒。具体说来，用BamHI切割pMON849，除去AAC(3)-IV/NOS顺序，留下CaMV35S顺序。将含有多连接子和NOS3′的pMON530的294bpBglⅡ/BamHI片段连接入经BamHI切割的pMON849中，产生pMON853。从pMON120中获得Tn7Spc/Str抗性基因。将含有Spc/Str基因的pMON120的1600bpEcoRI/AraI片段克隆入经EcoRI和XmaI切割的pUC9中，产生质粒pMON854。通过连接下列三个片段制备质粒pMON856片段＊1pMON851的7770bpEcoRI-BclI片段，含有CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS可选择标记基因、RK2复制子、pBR322复制起点、以及来自根瘤农杆菌质粒pTiT37的右边界顺序。片段＊2pMON853的630bpHindⅢ-BamHI片段，含有CaMV35S/NOS3′盒和多连接子。片段＊3pMON854的1630bpHindⅢ-BamHI片段，含有Spc/Str抗性基因。用下列方法从pMON856中除去可选择标记基因和Spc/Str基因之间的外源顺序和限制性位点。用StuI和XbaI切割质粒pMON856。通过用Klenow聚合酶和四种三磷酸核苷处理填平XbaI位点。随后进行连接产生质粒pMON857，它是一种有用的植物转化载体，含有CaMV35S/AAC(3)-IV/NOS可选择标记基因。用携有pMON600质粒的农杆菌转化Brassicanapus的外植体。得到三个庆大霉素抗性愈伤组织。发现这三个愈伤组织都能够在0.5mM草甘膦上生长，这是一个可杀死野生型愈伤组织的浓度。从这些愈伤组织样品中提取蛋白质，并测定EPSP合酶活性。这三个愈伤组织都含有对0.5mM草甘膦具有抗性的EPSP合酶活性。这些结果证明，用pMON600转化的愈伤组织含有草甘膦抗性形式的EPSP合酶。通过测定草甘膦抗性的大小进一步鉴定提取液中的EPSP合酶。测得该酶的I50为7.5mM，这比任何野生型植物EPSP合酶都要高出几个数量级。如果考虑测定条件的差异(仍含有内源性(野生型)EPSP合酶的植物提取液与来自过量生产的大肠杆菌的提取液)，此I50值与对带有同样的丙氨酸对甘氨酸置换的矮牵牛和蕃茄酶所测得的值(分别为16和32mM)没有明显差异。用质粒pMON600转化的植株的产生，是通过转化茎外植体，并在有利于形成枝条而不利于形成愈伤组织的选择性条件下进行培养。所得植株将含有草甘膦耐性型的拟南芥EPSP合酶，并且将表现出对草甘膦除草剂较高的耐性。Ⅳ.BrassicanapusEPSP合酶由分离自B.napus根尖的RNA构建一个文库，由此文库分离出B.napus的EPSP合酶cDNA。用市售AmershamcDNA合成药盒(AmershamCorp.，ArlingtonHts.，IL)及得自VectorCloningSystems(SanDiego，CA)的λgt10构建该文库。用pMON578的一个含有部分拟南芥EPSP合酶基因的插入片段筛选该文库，分离出杂交噬菌斑，并将其插入片段亚克隆至Bluescript质粒(VectorCloningSystems，SanDiego，CA)和单链噬菌体中。测定其中一个cDNA克隆(pMON9752，含有一个1600bpcDNA)的部分顺序。参见图2，由这个核苷酸顺序推测出的蛋白质在相应于成熟蛋白的区域中，与矮牵牛顺序有很强的同源性。值得注意的是，矮牵牛酶的氨基酸94-107与成熟B.napus酶的氨基酸97-110相同(编号的不同是由于，在氨基末端附近，B.napus相对于矮牵牛具有三个氨基酸的插入，见图2)。利用下列寡核苷酸，5′-AAAGGACGCATTGCACTGGCAGCATTTCCAA-3′按照Kunkel(1985)的方法进行位点定向诱变，从而改变B.napus酶，使104位的甘氨酸(相应于矮牵牛的Gly101)变为丙氨酸。所分离的原始cDNA克隆不含有B.napusEPSP合酶的氨基末端叶绿体转运肽的完整顺序。其余顺序的分离，是通过筛选cDNA文库直至得到一个含有此区域的克隆，或通过与B.napuscDNA克隆杂交而从B.napus基因组DNA文库中分离出一个克隆。为了在植物中进行表达，如在矮牵牛和蕃茄顺序中所做的那样，在紧靠正常翻译起始密码子上游处，建立一个BglⅡ位点或其它方便的位点。然后将该区域与经过诱变而含有丙氨酸对甘氨酸置换的cDNA在一个共有的HindⅢ位点处合并。然后将改变后的基因插入植物转化载体如pMON530中，这样将该编码顺序置于CaMV35S启动子的控制之下。用所得载体来产生基因转移植物，该植物表现出增强的对草甘膦除草剂的耐性。草甘膦耐性玉米EPSP合酶基因及草甘膦耐性玉米细胞的制备草甘膦耐性玉米基因的构建将玉米种子在水中吸胀12小时。从种子上切下含有盾片的胚，用Rochester等人(1986)的方法从该材料中纯化RNA。通过在寡聚dT纤维素上进行层析，由此RNA分离出多聚A-mRNA，并如前所述将其用来构建一个cDNA文库。用32P标记的RNA探针筛选该文库，这个RNA探针是由已用HindⅢ线性化的pMON9717在体外合成的。用T7RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)按照厂家说明合成该探针。分离出杂交噬菌斑，进行再接种，用同一探针筛选这些平皿的硝酸纤维素影印膜。分离出代表与蕃茄探针强烈杂交的单个克隆的噬菌斑，繁殖后用于制备DNA。发现λ-z1d克隆含有1.8kbEcoRI插入片段。将该噬菌体的插入片段亚克隆到BluescriptKS+(Strategene，SanDiego，CA)的EcoRI位点中，形成pMON9935。测定该cDNA克隆的完整顺序，结果示于图2。为便于以后的构建，用下列寡核苷酸，5′-TACCAACCATCGGCGTCTAGAGGCAATGGCGGC-3′利用Kunkel的方法进行寡核苷酸介导的诱变，从而在紧靠该克隆的第一个ATG起始密码子上游处建立一个XbaI位点，产生质粒pMON9950。用XbaI消化pMON9950并进行再连接，除去cDNA5′端的126bpXbaI片段，形成pMON9951。为了产生草甘膦耐性型玉米EPSP合酶的编码顺序，用下列寡核苷酸，5′-CTTCTTGGGGAATGCTGCTACTGCAATGCGGC-3′利用Kunkel的方法使pMON9951突变，产生pMON9960。这一突变将把一个GGA密码子变为一个GCT密码子，从而在所得蛋白中将保守顺序-L-G-N-A-G-T-A-中的第二个甘氨酸残基变为丙氨酸。该甘氨酸残基是预想的玉米前EPSP合酶的氨基酸163。这将对应于成熟蛋白的氨基酸95-105，取决于尚未确定的精确的转运肽酶酶切位点。为了证明这一改变产生了草甘膦耐性型的玉米EPSP合酶，如下所述，通过用T7RNA聚合酶进行体外转录，然后进行体外翻译，从pMON9951和pMON9960产生蛋白质。用EcoRI使含有全长EPSP合酶cDNA的质粒DNA(pMON9951和pMON9960)线性化。基本上如Krieg等人(1984)所述，用T7聚合酶使线性化的质粒DNA进行体外转录。标准反应缓冲液含有40mMTris-HCl(pH7.9)、6mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、2mM亚精胺、80U核糖核酸酶抑制剂、ATP、GTP、CTP和UTP各0.5mM，最终的反应体积为100μl。将最终的RNA沉淀重新悬浮于20μl无菌水中，贮存于-80℃。标准翻译反应液含有100μl经过核酸酶处理的兔网织红细胞溶胞产物、5.7μl19种氨基酸的混合物(无甲硫氨酸)，每个氨基酸的浓度为1mM、5.7μlRNA(得自0.63μg质粒DNA的总RNA转录本)、16μl(20U/μl)核糖核酸酶抑制剂、58.3μl〔35S〕甲硫氨酸(14-15mCi/ml)。体外翻译产物于-80℃冰冻贮存。接着，如本文所述测定体外翻译产物的EPSP合酶活性。参见图12，pMON9951的产物在没有草甘膦存在下表现出易于检测的EPSP合酶活性。当在1.0mM草甘膦存在下重复测定时，未检测到活性。相反，pMON9960的突变型前酶产物对草甘膦表现出高水平的耐性，在1mM草甘膦中只略微受到抑制，在10mM草甘膦中抑制25%，在100mM草甘膦中仍表现出可检测的活性。为在玉米细胞中进行表达，从pMON9960中切下草甘膦耐性突变型玉米前EPSP合酶的编码顺序，将其插在一种已知可在玉米细胞中起作用的启动子(如CaMV35S启动子)和胭脂碱合酶基因的多聚A添加位点之间。此外，可在可增强嵌合基因表达的表达单位的5′-非翻译区中引入一个内含子，如玉米ADH1基因的第一个内含子(Callis等人，1987)。接着，将这个表达单位插入一种载体中，该载体含有处在CaMV35S启动子控制下的新霉素磷酸转移酶基因;或将这个表达单位插入具有标记基因的类似载体中，可借助该标记基因来选择转化的玉米细胞。然后如下列实例所述，将如本申请的实例所述构建的、利用任何其它草甘膦抗性编码顺序的质粒或类似质粒引入玉米细胞。玉米原生质体的制备如Fromm等人(1985和1986)所述，从BlackMexicanSweet(BMS)玉米悬液素BMSI(ATCC54022)制备原生质体。将BMSI悬浮细胞培养在BMS培养基中，该培养基含有MS盐、20g/1蔗糖、2mg/1(2，4-二氯苯氧)乙酸、200mg/1肌醇、130mg/1天门冬酰胺、1.3mg/1烟酸、0.25mg/1硫胺、0.25mg/1吡哆醇、0.25mg/1泛酸钙，pH5.8。将125个锥形瓶中的40ml培养物于26℃下以150rpm振荡。该培养物每3天用等体积的新鲜培养基稀释。加入新鲜培养基1-2天后，从旺盛生长的细胞中分离出原生质体。为分离原生质体，将细胞在水平转头台式离心机(Swingingbuckettabletopcentrifuge)中以200xg沉降。保留上清液作培养原生质体的条件培养基。将6ml压紧的细胞重新悬浮于40ml0.2M甘露醇/50mMCaCl2/10mM乙酸钠中，其中含有1%纤维素酶、0.5%半纤维素酶和0.02%果胶酶。于26℃保温2小时后，用60μm尼龙网筛过滤分离原生质体，以200xg离心，用不含酶的同一溶液洗涤一次。用电穿孔技术转化玉米原生质体通过用一种溶液洗涤制备用于电穿孔的原生质体，溶液中含有2mM磷酸钠pH7.1、4mM氯化钙、140mM氯化钠和0.2M甘露醇。洗涤后，以每ml4×10E6个原生质体的浓度将原生质体重新悬浮于同一溶液中。将1.5ml含原生质体的溶液与0.5ml含50μg超螺旋质粒载体DNA的同一溶液混合，并置于1ml电穿孔杯中。如Fromm等人(1986)所述进行电穿孔。如所述，用充电至200V的122或245微法拉电容器释放电脉冲。于4℃10分钟及室温下10分钟后，用8ml培养基稀释原生质体，培养基中含有MS盐、0.3M甘露醇、2%蔗糖、2mg/l2，4-D、20%条件BMS培养基(见上)和0.1%低熔琼脂糖。于26℃暗中2周后，加入不含甘露醇而含有卡那霉素的培养基，得到卡那霉素终浓度为100mg/1。再过2周后，从该液体中取出微愈伤组织，置于滤膜片上，滤膜片置于经琼脂糖固化的含100mg/1卡那霉素的培养基上。1-2周后出现由转化的玉米细胞组成的卡那霉素抗性愈伤组织。草甘膦耐性玉米细胞如Fromm等人(1986)所述，可对转化的玉米细胞进行选择，即在用DNA载体进行电穿孔后在含卡那霉素的培养基上进行培养，该DNA载体含有由CaMV35S启动子、NPTⅡ编码区和NOS3′端组成的嵌合卡那霉素抗性基因。这些细胞还将产生草甘膦耐性型的EPSP合酶，并能忍受较高水平的草甘膦。另一些将质粒引入玉米或其它单子叶细胞的方法应包括(但不限于)Klein等人(1987)的高速显微投影法，或delaPena等人(1987)的注射法。提供上述实施方案是为了更好地阐述本发明的实施。应当理解，提供这些实施方案仅仅为了说明的目的，并不欲限制本发明的范围。参考文献Adams，S.P.andGalluppi，G.R.(1986)MedicinalResearchReviews6∶135-170.Adams，S.P.，etal.，(1983)J.Amer.Chem.Soc.105∶661.Ausubel，F.，etal.，(1980)PlantMol.Bio.Newsletter1∶26-32.Brau，etal.，Mol.Gen.Genet.193∶179-187(1984).Broglie，R.etal.，(1983)Bio/Technology1∶55-61.Callis，J.，Fromm，M.andWalbot，V.(1987)GenesandDevelop.1∶1183-1200.Charles，G.Keyte，J.W.，Brammer，W.J.，Smith，M.andHawkins，A.R.(1986)NucleicAcidsRes.14∶2201-2213.Covey，S.，Lomonosoff，G.andHill，R.，(1981)NucleicAcidsRes.9∶6735.delaPena，A.，Lorz，H.andSchell，J.(1987)Nature325∶274-276.DePickerA.，etal.，(1982)J.Mol.Appl.Gen.1∶561.Ditta，G.，etal.，(1980)Pro.Natl.Acad.Sci.USA77∶7347.Duncan，K.，Lewendon，A.andCoggins，J.R.(1984)FEBSLett.170∶59-63.Fraley，R.，Rogers，S.，Eichholtz，D.，Flick，J.，Fink，C.，Hoffman，N.andSanders，P.，(1985)Bio/Technology3∶629.Fromm，M.，Taylor，L.P.andWalbot，V.(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82∶5824-5828.Fromm，M.，Taylor，L.P.andWalbot，V.(1986)Nature319∶791-793.Gardner，R.，Howarth，A.，Hahn，P.，Brown-Luedi，M.，Shepherd，R.andMessing，J.，(1981)NucleicAcidsRes.9∶2871.GritzandDavies，Gene25∶179-188(1984).Guilley，H.，Dudley，R.，Jonard，G.，Balax，E.andRichards，K.(1982)Cell30∶763.Goldberg，R.B.，etal.，(1981)Devel.Bio.83∶201-217.Gubler，U.，andHoffman，B.H.(1983)Gene25∶263-269.Horsch，R.andKlee，H.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USAvol.83，4428-4432.Horsch，R.B.，andJones，G.E.(1980)InVitro16∶103-108.Horii，T.，etal.(1980)P.N.A.S.USA77∶313.Hunkapiller，M.W.，etal.(1983b)MethodsEnzymol.91∶486-493.Huynh，T.V.Young，R.A.andDavis，R.W.(1985)DNACloningTechniquesAPracticalApproach，D.Glovered.，IRLPress，Oxford.Klein，T.M.，Wolf，E.D.，Wu，R.andSanford，J.C.(1987)Nature327∶70-73.Krieg，P.A.andMelton，D.A.(1984)NucleicAcidsRes.12∶7057-7070.Kunkel(1985)P.N.A.S.USA82∶488-492.Lemke，G.andAxel，R.(1985)Cell40∶501-508.Maniatis，T.，etal.(1982)MolecularCloningALaboratoryManua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