专利名称：以微粒为媒介的大豆植物和品系的转化的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物及其相关物质的基因工程的一般领域，具体的是涉及通过以微粒为媒介的转化方法，将基因物质以物理方法引进到大豆植物的可再生的组织中而将外源基因物质转化到大豆植物品系的种系中。
关于植物品种的基因转化，目前人们已作了很多努力及研究，人们相信，可将外来基因转化到植物种系中的有效的方法的发展将得到试图扩大的商业上重要的作物品种的多种基因原种，并可得到一些可选择性地引入作物品种中的特别令人感兴趣的功能基因。有关于人们对植物品种的转化或基因工程的努力和研究迄今为止已成功地得到了结果，它们根据植物的品种而显著地变化。
在此以前已经应用的将外源基因引入植物的主要机理是采用单个植物细胞，如原生质体或在一未分化的组织群中，已知的如在胼胝中开始转化的。在植物细胞中起作用的嵌合基因已通过电处理(electroporation)和微量注射引入到单细胞植物的原生质体中。但是，迄今为止应用最广泛的转化技术已经利用了植物病原菌根癌土壤杆菌的自然特性，它具有将一部分包含在Ti(肿瘤诱导)质粒中的部分DNA转移到受感染的植物细胞中的遗传能力。通过将外来基因插入到带有某些Ti质粒顺序的土壤杆菌的质粒中，细菌的转化特性可用于将外来基因输送到受感染的植物细胞的基因组中。已发现，以土壤杆菌为媒介的植物细胞转化作用在很多类型的作物品种，如烟草，牵牛花和胡萝卜中可以进行得相当好，但是，它受到几个显著的限制。第一个限制是转化只能在组织培养水平上进行，较典型的是采用体细胞组织进行，然后，必须将它人为地再生成整株植物。这就限制了以土壤杆菌为媒介的基因转化到一些作物品种的适用范围，而这些作物可以容易地从一些可被土壤杆菌感染的典型的组织中再生。这个限制可能使以土壤杆菌为媒介的转化成为一个费力的过程，因为一些植物的再生尽管是可能的，但可能是一个需要很多操作和一些通常的已有技术的费力的、精细的过程。第二个限制是土壤杆菌的自然宿主范围只包括双子叶植物和有限量的百合科(Liliaceae)的单子叶品种。因此，以土壤杆菌为媒介的转化不被认为是商业上感兴趣的单子叶品种，如谷类作物的有效的“工具”。用以土壤杆菌为媒介的转化的另一个困难是在组织培养基的植物组织中会自发地产生一些克隆变异体，这样，就使转化体的鉴别变得复杂化了。
业已发现，至少一些嵌合基因结构对于在很多普通作物的植物细胞中的外来基因的表达是有效的。这些嵌合基因在单子叶及双子叶中的功能已经通过诸如电处理这样的技术，在培养基中进行玉米和大豆原生质体的转化而得到了演示，如Christou等，《Proc.Natl.Acad.SciUSA》843962-3966(1987)中揭示的。但是，尚未有从相应的原生质体中再生完整的大豆植物或其它几个重要作物品种的整株能生育的植物方法存在。例如，非整株的、完整的转化大豆植物已知可从原生质体中再生了。但是，大豆品系其它作物品种的基因转化是一个所期望的目标，因为普通作物植物的农业价值和改善它们的价值和产率的能力是所希望的。
实质上，大多数指导植物系的基因工程的策略都包括通常可以考虑的两个互补过程。第一个过程包括一个或多个具有特定性质类型的植物细胞的基因转化。转化过程通常定义为将一外来基因，通常为一嵌合基因引入单个植物细胞的基因组中，如较典型的发生于以土壤杆菌为媒介的转化中。第二个过程包括将转化后的植物细胞再生或培养为完整有性的感受态植物。整个策略的每一方面都不可能100%，或接近100%地成功，但是在每一方面均须具有相当的可靠度和再现性以致可以回收到一定数量的转化植物株。
上述两种过程，转化和再生必须是互补的。很明显，它们可以将一些现有技术尚不能再生的组织或细胞类转化到整株植物中。例如，使用电处理(electroporation)技术在具有外来基因体外转化大豆原生质体细胞是很容易的和可能的。但是，大豆原生质体不能再生。将现有技术尚不能成功地、遗传地转化的一定量不同组织和细胞类进行植物组织再生也是可能的。然而，整个过程的两个分开过程的互补性一定是这样的通过转化过程可成功地、遗传地转化的组织一定是同一种类型和同一种性状的，而且必须是足够健康的、能感受的和有活力的。因此，它们可以成功地再生进能生育的整株植物中或可用于成功地产生胚芽系原生质，从而能产生含有外表基因的整株完整的能生育的植物。
先前曾有人努力使人们可以在使用根癌病土壤杆菌的培养基中直接进行大豆细胞的基因转化。例如，在Owens等，《PlantPhysiology》77，87～94(1985)中报导了大豆细胞对于根癌土壤杆菌感染的影响，而在Facciotti等，《Bio/Technology》3∶241-246(1985)中报导了用根癌病土杆菌转化的大豆根癌培养物中嵌合基因的表达。其它一些类似的报导认为可以用致癌的根癌病土壤杆菌转化大豆组织，尽管通常人们公认这样的组织被认为是无再生能力的。
大量的成就指导了从各种组织类型中进行大豆植物的再生。用于植物，如大豆的再生技术使用各种组织或细胞类型作为起始物质。尤其对于大豆来说，再生过程已经发展到采用一些分化的组织类型，如分生组织[(Cartha等，《Can.J.Bot.》591671-1679(1981)]、胚轴部分[(Cameya等，《PlantScienceLetters》21289-294(1981)]和茎节切片[Saka等，《PlantScienceLetters》19193-201(1980)和Cheng等，《PlantScienceLetters》，1991-99(1980)]开始。Ranch等，《InVitroCellular&DevelopmentalBiology》2111，653～658(1985)中也报导了从未成熟大豆胚芽的外植体中产生的体细胞胚使整株有性成熟大豆植物的再生。最近的一些报导也描述了通过器官发生和胚胎发生从细胞培养中进行成熟大豆植物的再生，如Barwale等，《Planta》167，473-481(1986)和Wright等，《PlantCellReports》5，150-154(1986)。
有一个报导是关于通过一弹枪加速DNA覆盖的钨弹以得到在完整的Alliumcepa(洋葱)的表皮细胞中外来DNA的瞬时表达，但该方法中没有报导植物工程，见Klein等，《Nature》32770-73(1987)。
本发明可概括为一种制备可遗传转化的大豆植物的方法，它包括如下步骤制备包括编码区和可在大豆细胞中有效地表达编码区的侧翼调节顺序的外来基因的拷贝;将外来基因拷贝与生物惰性的载体颗粒相结合;将可再生的大豆细胞放置于“靶”表面上，用物理方法加速在“靶”表面上携带有外来基因拷贝的微粒，以这种方式即有一些微粒可以贮留于至少是一部分的大豆组织的细胞的内部;将处理后的细胞再生成整株有性成熟大豆植物;和验证在再生植物组织中存在外来基因。
本发明也可概括为在它们的基因组中携带有大豆植物细胞中能表达外来基因的大豆植物和它们的种子的获得。
因此，本发明的目的是提供一种将大豆植物及其品系进行遗传工程的有效的和可重复的方法。
本发明的一个实质方面是广范围的大豆组织类型可用于该方法中以成功地获得转化的大豆植物。
本发明的其它一些目的、优点和实质将从下列详细说明中变得更明显。
图1是适用于本发明的微粒加速器的一个具体例的部件剖面分解图。
图2是适用于本发明的微粒加速器另一个具体例的部分剖面分解图。
图3是图2所示的加速器的发射室的顶端平面图。
图4是可用于图1和图2所示的微粒加速器的电子发射线路的电路图。
图5是用于构造植物表达载体pCMC1208的质粒操纵系列的流程图。
图6是用于构造植物表达载体pCMC1022的质粒操纵的附加系列的流程图。
图7是用于构造植物表达载体pAMVFF所必须的质粒操纵的流程图。
图8是用于构造植物表达载体pCMC1100所必须的(质粒)操纵的流程图。
在按本发明实施例的植物基因转化的实践中，DNA以物理方式引入到分生组织或者大豆细胞胚胎的内部，DNA被带入到单个细胞中，而既不毁坏细胞的组织，也不使细胞失去能力。业已发现，以这一种方式引入到大豆细胞中的DNA可以稳定在并入到所得到的植物和植物系的基因遗传物中。
有几种因素可以影响这种方式成功地实施大豆细胞的转化。使基因插入的组织必须是能够被再生成整个性成熟植物。把DNA带入到细胞中的方式是通过将其装载在微粒上，以仔细安排的方式使微粒加速，以致载有DNA的单个微粒均具有合适的动量和速度，并且均处于较均匀的形式中，以致以接触植物组织时，微粒深入至大量活细胞的内部，并没有在生物学上使它们失去能力。因此，微粒上的DNA应当能使大豆细胞转化和表达植物细胞中的所要求的特征。此外，DNA本身可含有一种可供选择或者可筛选的标记物，该标记物可在已推定转化了的植物组织、种子或者植物苗中被测到，以便证明该特定植物组织已发生遗传转化。如果转化频率足够高，那么这种可选择的标记物就不需要采用，因为存在的引入DNA通常可由生物化学分析法测得。
可以预见到的加速生物学上惰性的小载体微粒的机械系统有多种类型，可能的装置可包括微粒的弹道式爆炸加速、微粒的离心加速、微粒的静电加速或者能够给小惰性微粒提供动量和速度的任何其他类似的系统。图1和图2-3以图解方式说明了申请人采用的两种新的机械装置。其中每种装置均采用高压放电产生的冲击波。在图1中且通常以10表示的是用所说的方法加速惰性微粒用的加速器。图2-3中所示的是第二种加速器，以110表示。在每幅图中，以22表示的是带靶细胞的靶子表面。
加速器10是由几部分组成。火花放电室12设有一对伸入到其内部的电极14，火花放电室12的几何形状是圆筒状的。申请人发现，以内径为13毫米的聚氯乙烯塑料管的一段用作火花放电区12是满意的。电极14以相对的两侧延伸到管的内部，设置在低于火花室12的顶部大约5毫米处。电极14本身由带螺纹的螺栓构成，延伸到在火花室12壁本身的内侧壁表面中形成的合适的螺纹中。构成电极14的带螺纹的螺栓的端部均用高压继电器上断开的触点的耐电弧合金保护，其尺寸为大约2毫米×2毫米×3毫米，并且焊接在带螺纹的螺栓的端部。通过适当地把螺栓旋进或旋出火花室12，可调整电极14之间的间隙。电极端部之间的放电电压大约为15千伏时的最佳间隙为1～1.5毫米。电极14本身的制作和安装的方法显然有多种方式，尽管优先采用的电极是相当耐用的，电极之间的放电间隙的距离要易于调整。
火花室12上面设有间隔圈16。间隔圈16可以由与火花室12相同的PVC管构成。最好切割成垂直长度为6毫米。在用于单一作物品种转化的固定装置中，间隔圈16应当仅被构成火花放电室12的垂直延伸部分，虽然可移动的和可替换的间隔圈16可调节火花放电到承载板的可变动的距离，使微粒的加速力可以按条件或者处理的品种来加以改变。如果采用大的承载板18，则可以使间隔圈16在顶上开口，但也可以方便地通过适当的密封以部分地限制顶部的开口以形成一个大约9毫米×13毫米的长方形孔。在间隔圈16顶上放置的是承载板18。承载板是一块具有合适尺寸的轻的平板，放置在间隔圈16的顶上。承载板18是由柔韧的生物学上惰性的薄片材料构成，能够在其上装载生物学上惰性的微粒。承载板18的作用是把由火花放电发生的冲击波的力传递到加速的载体微粒上。业已发现，承载板18是由1密尔或0.5密尔涂复浸铝的聚酯薄膜的米粒(聚酯薄膜)构成，最好采用0.5毫米板，因为在实践中这种板具有较好的使微粒透入植物细胞内的性能。根据通常的实践，承载板18的实际表面积越小，载体微粒进入植物细胞的穿透性越好。关于穿透性的这种看法由需要具有的承载板的尺寸来权衡，所说的板要易于处理且在足够大的范围内提供能够冲击待处理组织中的大量植物细胞的冲击形式。业已发现，18×18毫米的承载板是一种较好的尺寸，它能以微粒在植物组织靶上的要求的冲击形式提供良好的穿透性。
承载板的作用还在于安排微粒的图式，当它们接触靶子表面时。为了保证靶子上的许多细胞尽可能地被冲击，对微粒的图式的均匀性要求就相当高，以便使转化体的收率达到最大。未转化的细胞可以与可由被载体微粒造成部分地变弱的转化体一起处于竞争的有利地位。故而，要求尽可能以接近100%穿透靶子细胞，而承载板18上微粒的均匀层和图式有助于这个目的。
至于载体微粒本身，任何生物学上惰性的高密度材料均可用作本发明范围内的DNA载体微粒。最好采用金属材料，例如钨和金，其比重为19。铱也可优先采用，其比重为22，但申请人尚未用过，因为通常它只易买到较粗的粉末。与金相比，钨也可能较金为差，因为它在具有极低温度的空气中就会氧化。载体微粒上的这种氧化层会使微粒结合在一起，当微粒聚集在一起时会引起平均粒度显著增大。以不规则聚集成块的颗粒对实施本发明是不适宜的，因为这种聚集将使其质量和大小有很大的意义，因此难以获得有规律的重演性的结果。其他高密度非金属材料也可用作微粒。业已发现，金是用作本发明的微粒的一种最佳材料，因为它具有高的比重，对生物物质和氧化均是较惰性的，并且对实施本发明特别适合的尺寸，即具有1-3微米直径的球状体也容易从市场上买到。可以把合适的DNA顺序施加到金微粒上，再把金微粒以将在下文详细讨论的方式施加到承载板上。
放在承载板18上面的是保持筛20。保持筛20是一种100目不锈钢筛，以物理方式设置在位于间隔圈16上面大约20毫米的塑料支架中。保持筛20的作用是把载体板18限制到它不能打到靶子上。
靶子表面22是一块平板，能够悬浮可再生的大豆组织的靶子，例如其上的胚轴、分割的分生组织、未成熟胚中的子叶或子叶节、或者上胚轴片段。实践中业已发现，易于采用的靶子是一种陪替氏培养皿，尺寸为60毫米×15毫米，倒置在固定保持筛的组合件的顶上。从保持筛20到靶子表面22上的靶细胞的间距最好为大约5-10毫米。在下述的电压和压力的条件下，间距大于15毫米会降低载体微粒进入植物细胞的深入性能，而间隙小于5毫米，会导致压碎细胞，结果使保持筛20在冲击波的力作用下变形。
图2-3中所示的为微粒加速器110的另一种经改进的具体装置。在加速器110中，有一个放电室112，两根电极114延伸到其中。电极114为带单螺纹的钢质螺栓，端部无合金，电极之间的间隙为约2毫米，其中跨接一滴大约6微升的水滴124。然而，放电室112本身在几何尺寸上与放电室12明显不同。放电室112由隔板113分隔成两个小室115和117。电极114在其中延伸的小室115是实际产生电火花放电的地方。小室115有一个可移动的通道盖119和一个包括许多梯级121的底表面以及一个与垂直方向成大约20°角且向小室117偏斜的偏斜表面。小室117的顶系由承载板18盖住，它与图1的实施例中所述的一样，并且具有一个偏斜底表面125，与垂直方向成45°角，形成许多它的底表面。加速器110底部的螺纹孔127可由带螺纹的螺栓129使其固定在安装板131上。保持筛20和靶子表面22与图1的加速器10中所用的一样，小室117的顶部和筛20之间的最佳间隙约为20毫米，而筛20距靶子22约为5-10毫米。近来，试验揭示了梯级121和偏斜表面125可能是不必要的，放电室112内部为简单盒状结构。
加速器110以与加速器10相似的方式工作。加速器110意在使对欲转化的植物组织的冲击的冲击波减至最小。由电极114放电产生的冲击波在惯性上受通道盖119限制和反射。隔板113把承载板18和靶子22与直接的冲击波隔开或者把冲击波与火花放电隔开。而由放电产生的冲击波以与偏斜表面125成45°角向上反射到承载板18，从而以垂直冲击板18，使其与直接冲击波隔开。小室117的顶部到保持筛20的最佳间隙约为20毫米，承载板18有机会充分地加速。
图4中所示的为加速器10或者110用于建立放电所用的电路。接交流电源24的是可调变压器26的一只线圈。可调变压器的输出端接在升压高压变压器28的输入端。变压器28的高压输出端通过高压硅整流器30施加直流电压到被接在高压的2微法电容器32上。电压表34被接在电容器的两端，以监控其电压。开关36通过电极14接在电容器32的输出端。利用可调变压器26使电容器32上所积聚的直流电压按要求调整，以改变电极14或者114之间的爆炸力。
当将可再生的大豆组织(包括胚轴、切碎的或完整的分生组织、子叶节、腋芽、上胚轴片段、或者相似的组织)用作靶细胞时，组织必须用物理方法固定在靶子上，靶子可以颠倒放置，使能保持组织并使组织能保持成活的方式被固定在靶子上。业已发现，在靶子表面上有其有8%苍耳烷胶的琼脂培养基可以有效地固定欲受转化的靶组织。
对于经处理后的大豆组织，将其迅速地转换到再生介质上，在靶子表面上可以用单纯的1%-5%水-琼脂介质。在小的陪替氏培养皿的底部可以涂敷琼脂制剂，然后使其硬化。欲转化的组织可以放在琼脂制剂上，它将作为靶子表面。
微粒加速器10或110和靶表面22的整个组合件可以被部分地抽成真空，以防大气的阻碍而使微粒和(或)承载板18减速。真空应当仅仅是部分真空，因为高真空会使靶植物组织干燥，从而使它们不能存活。业已发现，足够且有利的真空度约为500mmHg。把氦气引入到真空室中也是有利的，因为氦气是低密度的，它在很大程度上不带由放电产生的冲击波，这样减少了冲击波危及植物组织或者靶子。由于微粒加速器10或110在大气中组装，然后抽真空充氦气，所以空气将在放电室12或112中存在，把由放电产生的冲击波有效地带到承载体18，而氦气将存在于真空室。在承载板下放置一层水膜有助于使其附着在室上，以致使空气保持在放电室12或112中。
最简单地说明图1装置的操作，使加速器10或110点火的方法以在电极14或114之间放置一滴蒸馏水或者无离子水24或124开始。水量必须加以选择，不使在电极之间出现的电弧减弱，但还是要有足够的水量，以便在出现放电时在火花室12或112的内部形成冲击波。业已发现，优先采用的水量约为2-6微升，加速器110中优先采用的约为6微升。水量可用移液管使其悬挂在电极14或114的端部之间来施加。水滴24将跨接在电极之间的间隙中并保持在位置中。业已发现，在施加水滴24之前，使在电极的尖端涂一层轻质油，有助于减少电极的剥蚀和提高放电的效率。
然后，把承载板18放置在间隔圈16的顶上或者在小室115的顶上。保持筛20设置在承载板18上面大约20毫米处，由倒置陪替氏培养皿组成的靶表面22放置在安装保持筛20的上面。然后，把这套装置抽真空到大约500mmHg。
交流电源电压接在图4的电路中，在电容器32上产生直流高电压。电压可以略有变化，由可调变压器24，根据组织类型和所采用间隙进行调节。这种电压的可变性要考虑放电的力，即施加于承载板18上的力要按靶组织的品种和组织类型的要求调整或者调准。10，000～30，000伏的电压证明使用图1-3中的装置最成功。故而，微法电容器32上施加了高的直流电压。然后，通过转换开关36，把电容器32上的高压电施加在电极14或114之间。
当施加电压时，放电电弧在两根电极14或114之间跳跃。电弧立刻使在电极之间延伸的小水滴24或124汽化。来自水滴的爆炸式汽化的冲击波经整个火花室12或112的内部传播。当冲击波到达承载板18时，承载板18被垂直升起脱离加速器并加速地朝向保持筛20。当承载板18打到保持筛20时，承载板18被约束在原位上，在承载板18上所带的微粒离开承载板，自由地飞越一段距离到达并停留在靶表面22的细胞上。如果该装置结构和调整合适且工艺合理，则有很大百分比的载体微粒将以正确的速度达到靶子，深入到靶表面22上所带的细胞，而不破坏大量的细胞。故而，该方法的这部分得出经分化的可复制的植物组织，其中许多组织细胞业已被插入其内带有外来种DNA的至少一个微粒。
然后，必须把该组织再生成整株植物。如果转化方法中用未成熟的切除的胚组织作靶子，则通过胚胎发生或者器官发生可以实现再生成整株植物。实施这两种方法的技术已在现有技术中公开Barwhale等人，《Planta》，67473-481(1986);Wright等人，《PlantCellReports》，5∶150-154(1986)。切除的分生组织也可容易地通过器官发生采用相同的技术再生。如果把上述的琼脂制剂用于靶表面，该组织可以被转化成单独培养的平板，再生方法始于含有适量激素的琼脂制剂。业已发现，特别有利的靶组织是自成熟的或未熟的与种子离异的切除胚轴。在有或者没有其上保持一部分子叶组织的情况下，只要分生组织作为靶子暴露，可以采用整个完整的胚轴。由这种轴来的经培养的分生组织可以被培养，以得出一些或部分可以部分或者完全被转化的多苗。
然而，如果目的在于把异种基因引入到植物系中，则再生的整个性成熟的植物将不以此方法为终止。以这种方式再生的植物将是典型的嵌合。而这里说明将使异种基因经历至少一些性成熟植物的后代，因为由以这种方式生成的再生植物来的仅一部分嵌合的后代，将带有转化体DNA。因此，再生植物的后代可能需要筛选或者选择外来DNA遗传。可以通过DNA杂交验定、表达产物的生化验定或者存在的引入了基因的表达产物的植物表型特性的筛选来筛选外来DNA。然后，带有外来基因的后代将通过正常的孟德尔式遗传把该特性遗传给它们的后代。最初的试验指出，引入基因的稳定整合将以比具有要求外来基因表达的稳定整合高得多的频率出现。通常还达到外来基因的暂时的或短期的表达。故而，即使基因结构可易在大豆中表达，但可要求达到稳定整合的许多次再生达到将把整合基因传给其后代的一种稳定表达植物。
在本发明的最佳方法中，把DNA顺序施加于微粒的方法、把微粒作为一层敷设在承载板上的方法以及制备植物转化用的DNA的方法都可要求特别注意。这些细节将一一进行讨论。
DNA顺序包括以适合于植物转化的形式制备的外来基因，可简单地在裸露金或者钨丸上干燥。其他的金属材料或它们的合金也可应用。可以高达(或超过)每毫克金小球含有30微克DNA的任何比例把DNA涂载在微粒上。必须将100微克DNA和30毫克1-3微米金球，连续地加至5微升10mMNa2HPO4中，然后是5微升10mMCaCl2，当溶液干燥时形成细的CaHPO4沉淀物，。该淀沉物把与它一起的DNA带到小球上。业已发现，在一些情况下，把EDTA加入悬浮液中是有利的，但其原因尚未完全弄清。一旦小球和磷酸盐和氯化钙的溶液与DNA混合，则悬浮液在氮气流中不断搅拌下干燥。一旦干燥，片状沉淀物立刻再悬浮在100%乙醇中，作为把微粒放置在承载板上的方法。
在把微粒施加到承载板中时，作为这种工艺的成功的操作，最好是在承载板上形成均匀且可再现的载体微粒层。为此，微粒不能简单地撒在承载板上，因为它们会聚集，从而以不可再现的方式不均匀地分布在板上。具体地说，板上水份或者水份含量将破坏微粒应用到板上并导致不希望的聚集。把含有DNA链沉淀涂层的载体微粒悬浮在100%乙醇中，再施加到承载板上。以合适的均匀和可再现的方式成功地把乙醇与载体微粒的经充分搅拌的悬浮液移液到聚酯薄膜板上。然后，使这种悬浮液的吸移部分安置在封闭的陪替氏培养皿中至少30秒钟。陪替氏培养皿必须密闭，以防室内空气流和从快速蒸发而引起的涡流，这种涡流可能会引起微粒过分偏移，致使微粒在板上呈不均匀分布。在放置期之后，无液而被破坏，排除多余的乙醇。在局部打开的陪替氏培养皿中蒸发去除残存的乙醇。
这种方法旨在把含有DNA链的沉淀涂覆的载体微粒放置在聚酯薄膜承载板上。本发明中成功地发现，正好中间的速度约为在每平方厘米承载板施加0.1毫克带沉淀DNA的载体微粒。承载板上用这种密度的载体微粒可使得处理组织很好地存活，还可使加速微粒具有高的组织细胞的穿透性。微粒对细胞的实际加速和穿透力二者将随欲处理的组织而变化，显然可以改变载体微粒数目，按需要给靶细胞的每个横截面积多少微粒。
在本发明中所用的DNA通常被构成一个适合表达大豆的或者本发明中用的其他植物的细胞中的外生或异种基因产物的载体之中。在由来自不同机体的DNA顺序构成的意义上，DNA顺序可以是嵌合的，但也可以采用来自其他植物种或相同种系的完全完整的非嵌合基因。适合于植物中表达的载体，除所要求的外生或异种基因的编码顺序之外，一般来说必须包括合适的侧翼调节顺序，例如能够促进在植物细胞内的转录和表达的合适的启动子，能够使转录末端发出转录终止区的信号。以及如果要求蛋白合成时适合于终止信使翻译的翻译终止区。蛋白质合成并非是始终要调节植物中的表型变化的条件。详见McCormick等人的EPO.Appl.022399。上面业已说明，在典型的种中能够引起编码顺序转录和表达的一般植物基因启动子在大多数植物中也是有效的。Fromm等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》，825824-5828，1985年9月。这种启动子包括来自植物病原体根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的蓝曙红合成酶启动子和由花椰菜镶嵌病毒顺序衍生的CaMV35s启动子。植物中起作用的合适的终止顺序是来自根癌土壤杆菌蓝曙红合成酶基因的多腺苷酸顺序。植物表达载体也可含有在植物细胞中起作用的用于选择转化突变型植物的可选择标记物。可选择的标记物可以决定可作生化上测定的特征或者可在后代植物中可以观察到的表型特征。显然，如果本发明采用来自相同或者别的植物且具有侧翼调节顺序的非嵌合整体基因，则嵌合启动子或者控制顺序并非必要而可用具有其天然顺序的基因。
因为并非所有的植物细胞均有插入它们中的载体微粒，还因为并非所有的植物细胞或者后代细胞均将吸收DNA进入它们的基因组中，故而必需在某些阶段筛选后代植物，以选择转化突变型。如果要求把特定的外来基因转入一种植物中，则可把该基因插入嵌合的表达载体中。然后，应把嵌合的表达载体与可选择的标记物质粒一起转入植物细胞中，例如下文所述的pCMC1022。两种载体(外来基因和可选择的标记物)连接在一起制成一个质粒，或者可以分别克隆两种载体，然后一起施加于相同的载体微粒上。在上述任何一种情况下，产生的后代均要按标记物筛选，以选择已转化的后代。虽然在某些情况下应用这种可选择的标记物是需要的，但如果有一种可用于合适的形态鉴别或生化试验，筛选已转化的后代，则可以省略。形态学筛选试验可在后代中的重要表观特性中检查，合适的生化筛选试验应是一种所谓“Southern”斑点杂交法，用于探测后代植物的基因组中转化DNA本身的存在。如果植物转化的频率是足够高，如本文所揭示的那样，检验可以转化的组织中存在外来基因实际上可以通过这种生化分析，或者通过一种用于探测基因本身存在的探针来完成，而不需要可选择的或者可筛选的标记物。
检验植物转化和表达的有用的典型模型基因包括作为氨基糖苷-3-磷酸转移酶Ⅱ(APH3′II)(还被称之新霉素磷酸转移酶)的基因和来自E.col.的大肠杆菌β-葡糖苷酸酶(gus)基因。APH3′Ⅱ基因决定了诸如卡那霉素的氨基糖苷抗生素抗性。gus基因为酶编码，在一种组织-分解特性中，这样的名称的酶将转为一底物，靛蓝一葡糖苷酸或者5-溴代-4-氯代-3-吲哚基葡糖苷酸，在植物组织原位中呈蓝色。
大豆的许多转化实验已证明，可以以大大高于稳定表达转化的频率的一频率达到非表达稳定转化。因为结果尚未表明实际的抗生素抗性选择技术在大豆中证明是有效的，生化检验，例如酶分析或者Southern斑点法，可以被要求来检验表达和转化。由于所要求的一些情况可能是低频率的并且校正这些情况的检验可能是较麻烦的，故而就要研究一些极大地提高在经转化的植物中的表达频率的技术。本文中所用的一种技术首先在于建立经稳定转化的大豆原生质体，它们或者通过电处理(electroporation)或者通过微粒加速转化。采用APH3′Ⅱ基因可以较迅速地完成，因为大量原生质体可被筛选以及因为可以以卡那霉素抗性选择经转化的大豆原生质体，但尚没有一种技术表明在经分化的组织中是有效的。然后，可以使经稳定转化和表达大豆的原生质体形成愈伤组织培养而成多个它们的组织体。尔后，可提取、消化自这种胼胝质中的DNA以及把它转化成可再生的大豆组织。这种技术已导致完整的经稳定转化的和表达成熟的多产的大豆植物。
实例1载体的构造A.耐抗生素性合适的植物表达载体的构造在图5和图6的流程中已列举了。图5以流程的形式列举了植物表达载体pCMC1208的构造，而图6则列举了载体pCMC1022的构造。质粒pCMC1208的构造是采用限制性核酸内切酶TaqⅠ消化质粒pBR325[Bolivar，F.《Gene》4121-136(1978)]而开始的。质粒pBR325含有编码耐抗生素基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的顺序，它从被TaqⅠ消化后的质粒残余物中被切出。在pBR325被消化后，片段在琼脂糖凝胶上电泳而分离，含有CAT基因的片段被切出。然后将CAT片断连接到已经用限制酶AccⅠ消化过的质粒pUC9中[Viera&Messing，《Gene》19259-268(1982)]。在该情况下由TaqⅠ和AccⅠ产生的片段的末端是互补的，所以，链可以直接地连接。所得到的质粒在图5中指定为pUC-CAT，它含有位于pUC9聚合衔接物的一部分侧翼的CAT编码顺序。用PstⅠ和BamHⅠ消化该质粒后，通过凝胶电泳将两个片段中较小的一个分离出来。然后将该片段连接到事先已经用PstⅠ和BamHⅠ消化过了的中间植物表达载体pCMC66中，形成CAT表达质粒pCMC1205。质粒pCMC66含有根癌病土壤杆菌的蓝曙红合成酶启动区(NosPr)和同样的生物体中的蓝曙红合成酶多聚腺苷酸顺序(PolyA)，后者包括6个单一性质粒限制位点。质粒pCMC66还含有在细菌中表达耐受抗生素氨苄青霉素性的β-内酰胺酶基因(bla)的译本，因此，耐氨苄青霉素性可用作在大肠杆菌中进行以后的重组时的选择性标记。
用StuⅠ消化质粒pCaMV10[Gardner等，《Nucl.Acids.Res.》92871-2888(1981)]，含有花椰菜嵌合体病毒35启动区(CaMV35s)的片段被结合到合成的XhoⅠ寡核苷酸衔接物中。然后，用HphⅠ消化该片段，用DNA聚合酶处理它而产生饨端，然后，联接到合成HindⅢ寡聚核苷酸衔接物中。用XhoⅠ和HindⅢ消化该片断得到一个含有CaMV35s启动区和其钝端被加入的限制位点顺序修饰的转录起始位点的片段。
通过用XhoⅠ和HindⅢ消化质粒而从pCMC1205中切出蓝曙红合成酶启动区。用CaMV35s启动区片段连接所得到的两个片断中大的一个而得到pCMC1208，它是一个依次具有CaMV35s启动区、CAT编码顺序和蓝曙红合成酶多聚腺苷酸顺序的植物表达载体。CaMV35s启动区和蓝曙红合成酶多聚腺苷酸顺序可作为CAT编码顺序的侧翼调节顺序。
质粒pCMC1205和pCMC1208通过电处理到原生质体中而在玉米和大豆中进行活性检验，然后测定CAT活性。两种构造在玉米细胞中都确证表示出活性，但pCMC1208所表示出的活性水平明显地较高，因此，它被选用于植物转化试验。但是，已经确定可选择的标记APH3′Ⅱ提供了更有前途的转化突变型选择，因此，pCMC1208不用于大豆细胞转化。
质粒pCMC1021含有蓝曙红合成酶启动区和位于编码酶-氨基糖苷-3-磷酸转移酶Ⅱ(APH3′Ⅱ)的区域侧翼的蓝曙红合成酶多腺苷酸顺序，APH3′Ⅱ决定了它可耐氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素。因为电处理实验显示出在植物细胞中CaMV35s要比NosPr(蓝曙红合成酶启动区)有效得多，所以决定将CaMV35s启动区转移到pCMC1021中。如图3所列举的从pCMC1208中得到的CaMV35s通过XhoⅠ和HinⅢ消化而被分离，分离是通过电泳进行的。质粒pCMC1021也用XhoⅠ和HindⅢ消化，分离出较大的片段，并将它与CaMV35s片段相连接而得到pCMC1022。在质粒pCMC1022中，APH3′Ⅱ编码顺序位于调节CaMV35s和蓝曙红合成酶多聚腺苷酸顺序的侧翼。
通过电处理转化和蛋白质分析表明质粒pCMC1022对于在各种植物品种的单个细胞中的转化和表达是有效的。在具有APH3′Ⅱ的培养基中转化的植物细胞已显示出可用于几个品种，包括大豆中耐卡那霉素的品种。
A.虫荧光素酶标记在生物样品中虫荧光素酶的存在可以通过它的反应产物是发光的特征来检验。编码荧火虫荧光素酶的基因是非常有效的，这里它被用作pDO432的检测物，如Ow等，《Science》234856-859(1986)中描述的。该质粒是含有由花椰菜镶嵌体病毒的35s启动区的5′到3′顺序所组成的可表达植物的嵌合基因、编码未转译荧光虫荧光素酶mRNA片段的约85个碱基对顺序、荧火虫荧光素酶的氨基酸编码区、编码3′未转译mRNA的荧光虫基因组DNA区、荧火虫荧光素酶基因的多聚腺苷酸顺序、编码羧基末端的DNA顺序和蓝曙红合成酶基因的多聚腺苷酸区的质粒载体pUC19的构造物。
在图7所列举的方法中所使用的制备荧光素表达质粒pAMVFF的另一个质粒是质粒pAMVBTS。质粒pAMVBTS在ATCC的保藏号为53637，它含有包括(顺序的5′到3′)35s花椰菜镶嵌体病毒启动区、编码苜蓿花叶病毒(AMV)被膜蛋白质mRNA5′未转译区的合成DNA片段、编码苏云金杆菌Δ-内毒素的氨基末端部分的DNA片段和编码根癌土壤杆菌菌株A208的蓝曙红合成酶基因的多腺苷酸区的片段的可表达植物的嵌合基因。
质粒pAMVFF是由三个DNA片段所组成的结构(1)从pAMVBTS得到的无毒素编码区的载体，(2)与荧火虫荧光素酶基因的氨基末端相对应的合成寡核苷酸，和(3)从pDO432中得到的虫荧光素酶编码区的主要部分。
用限制酶NcoⅠ和XcyⅠ消化质粒pAMVBTS而从载体中分离BT编码区。NcoⅠ在这个质粒上，在苜蓿花叶病毒5′顶端和在NcoⅠ识别顺序内的启动密码子(ATG)之间切割一次。XcyⅠ在与位于BT毒素编码区的末端和多聚腺苷酸区的连接位置上的SmaⅠ相同的识别位点上切开，该位点也是该质粒上的唯一的位点。消化后的DNA采用琼脂糖凝胶电泳分离。从用溴化3，8，-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓染色的1.8kb(千碱基对)BT毒素编区中纯化得到2.5kb的载体，切出染色的载体带，并电洗脱。结果是一个具有NcoⅠ和XcyⅠ粘性末端的纯化的AMV载体。
质粒pDO432中，在荧火虫荧光素酶多腺苷酸区的后面有一个XcyⅠ(或SmaⅠ)位点，该位点适用于分离编码区的3′末端。但是，启动顺序不易受NcoⅠ消化的影响，因此用XcyⅠ和XbaⅠ消化的质粒pDO432就从编码区的氨基末端切出48个核苷酸。1761个碱基对的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离出来，切割并电洗脱。
编码区漏失的碱基对可由具有NcoⅠ和XbaⅠ粘性末端的合成寡核苷酸提供。合成的双链寡核苷酸如下NcoⅠXbaⅠ5′-CATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCT-3′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′′3′-CTTCTGCGGTTTTTGTATTTCTTTCCGGGCCGCGGTAAGATAGGAGATC-5′密码子1234567891011121314151617将三种片段等摩尔量结合并连接。连接混合物转化到大肠杆菌菌株MM294中并用氨苄青霉素选择。用限制酶图解小型制备的DNA并使合成的寡核苷酸顺序化证实了预见的顺序的秩序。
最终的pAMVFF是一种在大肠杆菌中可以复制的耐氨苄青霉素质粒，它含有包括(依照从5′到3′的顺序)CaMV的35s单位的转录启动区、编码AMV5′未转译顶端顺序的合成DNA、从荧火虫荧光素酶中得到的完全编码区和多腺苷酸区和土壤杆菌中的蓝曙红合成酶基因的多腺苷酸区的可表达植物的基因。
C.葡糖苷酸酶(Gus)基因质粒pCMC1100被构造以在植物细胞中指导β-葡糖苷酸酶(或称gus)的表达。如上所述，植物表达质粒pCMC1100系从植物表达载体pAMVBts和载体pRAJ275中构成。gus基因可广泛地获得，并由Dr.RichardJefferson以质粒pRAJ275的形式提供。质粒含有一个被修饰以在启动密码子(ATG)处提供一个NcoⅠ位点(即CCATGG)的gus编码顺序，并包括在gus编码区的下游的一个单一的EcoⅠ位点。
为了从pRAJ275中制备pCMC1100，如图8中所列举的，可用EcoRⅠ消化质粒pRAJ275，然后，在所有四种dNTP′s存在下，通过用T4DNA聚合酶将EcoRⅠ粘性末端进行末端钝化。然后，将合成PstⅠ衔接物连接到DNA的钝端。而后用PstⅠ和NcoⅠ消化所得到的分子至完全，含有gus编码区的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离。
通过NcoⅠ和PstⅠ消化而制备质粒pAMVBts，片段在琼脂糖凝胶上电泳分离以纯化较大的片断。然后，在T4DNA连接酶存在下用gus编码区片段将该片段连接起来，得到pCMC1100。所得到的质粒被转化到大肠杆菌中，通过限制性基因定位证实了修正质粒的结构。通过瞬时表达实验检测了在大豆和烟草原生质体中嵌合gus表达基因的活性。质粒pCMC1100的样品已保藏于ATCC中，保藏号为67641。
通过比色法和荧光法分析可分析出gus基因的存在。进行比色分色分析时，组织或细胞首先用戊二醛固定，然后在含有1mM X-葡聚糖(Clontech实验室)、0.1M NaHPO4(PH-7.0)、0.5mM氰亚铁酸钾的溶液中浸渍。然后将组织在37℃培养24小时，在乳酸苯酚脂中沸腾净化并检验靛蓝沉淀物。
实例2原生质体的转化从暖房里生长的Williams82、MandarinOttawa和Hardin品种的大豆植物中切出4-8毫米合子的胚胎。
为了制备原生质体，将胚切碎并进行质壁分离，然后于室温下在纤维素酶混合物中培养4-5小时。将混合物通过54微米钢丝筛网过筛，筛出物被清洗和重新悬浮。
在图1所示设备中，用装载pCMC1022的金球“轰击”组织。70微克pCMC1022(在蒸馏水中为1mg/ml)被悬浮于3.5mg1-5微米的金球中(Alfa化学公司)并在N2气流中干燥。干燥的涂覆的小球重新悬浮于100%的乙醇中。162微升金/DNA悬浮液铺展在18mm×18mm涂覆镀铝聚酯薄膜的1/2密耳厚的莎纶上。最终的金密度为0.05-0.1mg/cm2。间隔圈16的高度为15mm，在它上方5mm处固定一个筛网20。“靶子”是在1%水琼脂Petri培养皿中的胚胎组，培养皿倒置于筛网的上方。在放电前，装置抽真空至500mm汞柱。
胚被“轰击”，然后在一些复制物中原生质体化，胚被部分原生质体化，然后在其它复制物中被“轰击”。在两种情况下，对所得到的原生质体均进行金微粒存在的检验，并将其铺在卡那霉素选择培养基(50mg/l卡那霉素)平板上。2-3星期出现最初的耐卡那霉素菌落，6-8星期时继续出现。组织被放大至足够进行酶和基因杂交分析。
在所有菌落中都证实了酶活性和外来基因(APH3′Ⅱ)的存在，尽管酶表达的水平变化大于5倍。对被“猛烈轰击”的部分原生质体化的组织中得到的原生质体进行显微镜检测，发现10个原生质体中约有一个含有金球。被“轰击”的组织作为胚，然后原生质体化，每一千个原生质体中有5个含有一个或多个金微粒。而用两者中任何一个方法转化的原生质体中，10个原生质体中约1个产生了稳定的转化的耐卡那霉素胼胝。
实例3转化合子胚胎一定量用作为载体微粒的1-3微米的金球通过在0.02%多聚赖氨酸中漂洗并空气干燥而预覆盖多聚赖氨酸。将225微克经PvuⅠ消化而线性化的pCMC1022DNA置于已加入有35mg已涂覆的金球的水溶液中，然后连续加入22微升10mM Na2HPO4和22微升10mM CaCl2，在溶液中所形成的微细沉淀物在氮气流中干燥。经干燥的沉淀物涂覆小球而后重新悬浮于100%的乙醇中，并沉积到2.0密耳的塑料涂覆镀铝聚酯薄膜板上，沉积层约9-11mm。在聚酯薄膜载体片上经涂覆的金球的最终密度为0.2mg/cm2。
携有经涂覆的小球的载体板被安装于图2的设备的间隔圈16上。从MandarinOttawa、Williams和Hardin种系分离的合子胚胎的大豆组织从授粉后15-25天的未成熟大豆荚中切出。60mmPetri培养皿的底部填入1%水琼脂的配方。对胚进行表面消毒并铺展于Petri培养皿的琼脂的上面。在图2的设备中，Petri培养皿被用作为“靶子”的表面22。
向装配设备提供500mmHg的真空度。通过电极114从2微法电容器中释放出24KV的放电量，它可加速在“靶子”表面22上的大豆胚中的经涂覆的微粒。
制备小球和胚胎以及“引爆”图2的设备的过程重复数次，直到累积了足量的处理的胚为止。从琼脂表面移出胚并置于平板上进行器官发生的操作。所用的技术是如Barwhale等，《Planta》176473-481(1986)中所描述的。未选择所用压力。
将这种方法所得到的小植株分成四组，每组25株植物，其中二组植物进行APH-3′Ⅱ活性分析。牺牲该二组中每一组的植物，所有的植物组织集中起来以得到足够的分析用的组织。要集中后的样品的两组中均检测到弱的APH-3′Ⅱ阳性信号，这表明至少有一部分小植株转化了和表达了引入DNA。
一个月后，对从该两组小植株中分离出来的DNA的pCMC1022顺序的存在进行了分析，采用Southern杂交技术。Southern，《J.Mol.Bio》98503-577(1975)。从对照的及测试的大豆组织的样品中分离DNA并通过Taylor和Powell，《Focus》4∶4～6(1982)的鲸蜡基-三甲基溴化铵过程微修饰。每一DNA样品中的10微克用限制酶AvaⅠ消化，在琼酯糖凝胶上电泳分离，转移到尼龙薄膜上，用一个与APH-3′Ⅱ编码区的非编码链相应的32P-标记探针与之杂交。洗涤过滤物后，通过放射性自显影肉眼可看见杂交的DNA片段。两组植物中的植物显示出携带pCMC1022DNA。两组小植株均呈现出表示出相似大小片断的Southern斑点带，尽管带的强度在两组之间有所不同。而未经历微粒加速的对照组织显示出无APH-3′Ⅱ活性且无相应的Southern斑点带。
实施例4采用胚胎发生进行再生采用由PvuⅠ线性化的APH-3′Ⅱ表达的质粒pCMC1022和环荧光素酶表达的质粒pAMVFF重复上述过程。为了进行重复，将所切出的合子胚胎在转化过程之前先在由Ranch等，《InVitroCellularandDevelopmentalBiology》2111，653-658(1985)描述的体细胞胚胎发生培养基中预培养。加速器110在13KV的放电电压下使用。每毫克金上载有的DNA量分别为10微克、0.1微克和0.0001微克。1密耳厚的载体每平方厘米上负载0.5毫克小球(带有DNA)。植物通过胚胎发生和器官发生而再生。DNA从用pCM1022转化的最终的完整的植物中抽提出来，并用Southern斑点法分析，结果发现外来DNA存在并并入到植物基因组。
实施例5采用荧光素酶的转化从合子胚胎中解剖50个胚轴并采用荧光素酶表达质粒pAMVFF，以实例2中描述的方法进行以微粒为媒介的转化。小植株通过器官发生而再生，并进行荧光素酶的分解代射分析。荧光素酶的活性可采用光度计在转化的组织中进行检测。
实例6胚分生组织的转化栽培的Williams82的大豆外植体是从未成熟种子的胚轴中切出的分生组织中得到的。将初生叶移出，外植体铺展于含有1%水琼脂的靶平板上。
如实例3所述的，将pCMC1100DNA的1.0～0.001微克的量载于每毫克小球上而进行外植体转化。微粒加速器被在13-16KV下充电。每平方厘米的载体上载有0.05～0.40毫克负荷小球。较佳的载量水平为每平方厘米0.2毫克。
然后将外植体在黑暗中平铺于采用Barwhale等，《Planta》167，473-481(1981)中所修饰的MS基础培养基上，该培养基具有较高水平的细胞激动素苄氨基嘌呤，即13.3微摩尔。然后在黑暗中培养1～2周，组织被转移到较低细胞激动素水平(1.7微摩尔)的同样的培养基上以促进芽伸长。所得到的芽高度为0.5～1cm。在2～4个月内，每株外植体上回收3～8株芽。
转化所拟的方案的相应的成功可以通过在每一阶段中固定转化的外植体以测定gus活性而得到证实。在DNA微粒注射后两天，在每一外植体中可检测到典型的12个gus活性细胞。但是，很多gus表达细胞不能分割或将其特性赋予子细胞。6～8星期时，植物中可以进行芽中的gus活性分析。100株植物中约有一株分析为阳性，它至少有一个表明gus活性的蓝色条纹。具有蓝色条纹(即gus)的组织以及其他未转化或未表达的组织的部份的大多数植物是嵌合的。
实例7胚分生组织的转化Williams82品种在大豆外植体通过从未成熟种子中移出未成熟胚胎而产生。胚轴被铺展并通过颗粒加速器，以上述实例6的方法，使用质粒pAcX1100进行转化。
质粒pAcX1100是首先用XhoⅠ和Sal消化pCMC1100至完全并分离出含有嵌合的gus表达基因的片段而构成的。然后，将该片段连接到pAC3上的XhoⅠ位点。质粒pAc3是由N.Federoff提供的Ac转座子的独立分离体，它被假定与由Federoff等《Cell》35235-242(1983)中描述的质粒pAc9相同。质粒pAc3包括一个从玉米中分离出来的活性Ac元素的完整拷贝，在大肠杆菌载体中，它可进行耐四环素的特性选择。在pAc3中的XhoⅠ位点是在Ac元素内部的。通过T4-DNA连接酶催化反应可将gus基因结构连接到pAc3中。所得到的指定为pAc×1100的质粒的活性通过以微粒为媒介转化到玉米和大豆胼胝中，随后分析gus活性而证实。
在该转化实验中，质粒pAc3和pAc×1100两者的DNA以0.01μg/mg的密度载于金球上。0.1微克的每一种质粒加入到10mg金球中，然后在N2干燥前，加入2微升0.2MEDTA。然后，将干燥的小球重新悬浮于乙醇中，并加速射到分生组织铺展的胚中。从所得的分生组织中生出的早期芽铺展于高细胞激动素培养基中并经破坏以分析gus活性。这样的20株芽中，一株是完全蓝色的，表明在所有它的组织中的gus表达。因此，这株芽被视为完全转化并不是嵌合的。
实例8成熟幼苗的转化将Williams品种的大豆种子在加有羧苄青霉素(0.4g/l)、氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)(0.1g/l)、Bravo(0.1g/l)、Benomyl(0.1g/l)、(Maneb(0.1g/l)和Captan(0.1g/l)的无菌蒸馏水中浸泡24小时。然后移去种子外壳和一个子叶以暴露胚轴，胚轴是与保留下来的子叶相连接的。解剖暴露的叶舌和初生叶并移去大部分保留下来的子叶(约75%)。然后，将组织置于“靶子”平板上，分生组织面向上，蒸馏水中采用8%苍耳烷胶。
然后，通过将pCMC1100以1微克DNA/10毫克球的比率载于金球上，且涂覆后的球以0.1mg/cm2的量载于载体上的微粒加速而进行组织转化。
然后，进行微粒注射，解剖出来的幼苗在无菌条件下出芽3天，然后，种植到暖房里。微粒注射后24天，对幼苗进行gus活性分析。
在植物的部分细胞中发现靛蓝色表明几株幼苗具有gus表达区。观察到最多的是在每一末节终止的茎上的结节之间的区，但也发现了表达叶子区。所有表达的植物被观察到均是嵌合的，所指的用于植物的“嵌合”意味在同一株植物中一些细胞和组织通常不同于另外的细胞和组织，如外来基因表达时所表明的。
这个实例表明在成熟幼苗中转化的分生组织细胞可用作为转化“靶子”，因此，已经过分生组织这样转化的幼苗可以由通常的植物配偶载培为成熟植物，尽管它是嵌合的。
实例9分生组织的转化和传递给后代Mandarin品种转化的和表达大豆原生质体是以实例2所述的方法，使用pCMC1022而得到的。从卡那霉素上衍生得具有一定量APH-3′Ⅱ表达组织的胼胝培养物，将组织破坏，并从胼胝细胞回收DNA。
从六个不同的稳定转化的胼胝培养物的每一个中可得到约10微克DNA。用BamHⅠ完全消化每一胼胝品系的总的基因DNA以确定DNA块的大小。完全消化由微型凝胶验证。因为在pCMC1022中无BamHⅠ位点，所以可选择限制酶BamHⅠ。然后用苯酚氯仿抽提样品，并用乙酸铵和乙醇将样品沉淀(二次)，在0.8%琼脂糖电泳凝胶上划分大小。然后根据由控制线所决定的大小将溴化3.8二氨基-5-乙基-6苯基菲啶鎓染色的凝胶切成块。将3.5～10千碱基对和10～23千碱基对的两部分收集，通过电洗脱将DNA从凝胶中洗脱出来。然后通过有机抽提以除去琼脂糖而对每一样品纯化。在用乙酸铵和乙醇进行二次沉淀后，制得可用于以微粒为媒介转化的DNA。
大豆分生组织外植体被得到并以实例7的方法，通过DNA涂覆的微粒加速被转化。在转化前先将分生组织在高细胞激动素含量的培养基(Barwhale等，supra)中预培养。并除去子叶。
被认定为转化的分生组织铺展于高细胞激动素的基础培养基中，于黑暗中维持1～2周。然后，将它们转移到低细胞激动素培养基中并在光照(16小时光周期)下培养。结果从每一分生组织中得到多枝芽。没有进行耐卡那霉素的选择。
当芽长到0.5～1.0cm高时，将它们嫁接到出芽约10天龄的大豆幼苗的根部。在嫁接前，它们先在1/2MS培养基上锻炼1周。一旦建立足够的植物组织，组织马上进行APH-3′Ⅱ活性的分解分析。五十株植物中有二株显示出APH-3′Ⅱ活性。Southern斑点分析表明拷贝数小于一个基因/一个细胞。故认为两个植物均是嵌合的。
其组织经APH-3′Ⅱ分析呈阳性的一株植物成功地生长到成熟。自身授花粉的植物和37颗种子被回收。从这些种子衍生的十株幼苗中有三株具有APH-3′Ⅱ活性。从这些种子所产生的幼苗中有两株不能成长为植物。一株形态正常的后代植物被产生。它的叶子组织仍然对APH-3′Ⅱ的分析呈阳性。Southern斑点分析表明了在植物的基因组中的APH-3′Ⅱ编码区的几个拷贝。
上述结果证实了通过以微粒为介质的分生组织可以稳定地转化和成功地获得表达大豆植物。再生的植物是嵌合的这个事实不阻碍获得植物种系的转化，与植物一样长的种系是能育的且它的自授花粉的后代中可预先筛选到引入的外源基因的存在。当然，非嵌合性的再生植物也期望能产生基因突变的后代。
实例10胚分生组织的转化Williams 82品种的大豆外植体是通过从未成熟种子中再一次切出未成熟胚而分离出来的。胚轴再被铺展并通过实例8中所述的微粒加速而转化，但这次使用质粒pTVGus。为进行该实验，在用N2干燥前，采用2微升EDTA和1微升50%甘油将DNA以0.1微克DNA对10毫克金球的比例与之相结合。
质粒pTVGus是通过用XhoⅠ消化质粒PCMC1100使之首先线性化而制备的。然后，将完全线性的质粒连接到质粒pTV4的XhoⅠ位点，pTV4是用于以土壤杆菌为媒介的植物转化的嵌合植物表达载体，且包括一个固定于合成土壤杆菌T-DNA左边缘和右边缘区之间的嵌合的APH-3′Ⅱ基因结构。从该连接中所得到的质粒定为pTVGus，它包括表达APH-3′Ⅱ和gus的基因结构。
50株芽被回收，如实例8所述的方法嫁接，并长成正常形态的成熟的植物的大小。所有50株植物进行APH-3′Ⅱ和gus活性的分析。有一株植物分析呈阳性。植物的叶盘分析显示了在植物中表达和非表达组织中，表明了所希望的嵌合。植物进行自花授精，回收种子，它们中有一些有希望长成转化的植物。
实例11具有其他基因的pCMC1022的使用为了转化插入到大豆或其他植物中的其他基因，可以几种方法中的任何一种使用质粒pCMC1022。APH-3′Ⅱ编码顺序可以通过用HindⅢ和BamHⅠ消化pCMC1022而缺失，其它的用于制备合适末端的插入基因顺序可以在它的位置上连接。如果插入的基因可合适地选择或通过普通的分析检测，则质粒可直接用于转化。如果插入的基因被制备成具有合适的调节顺序，且需要一个可检测的标记，则具有调节顺序的插入基因可以插入于pCMC1022的CAMV35s的聚合衔接物上游的任意位置。使用pCMC1022可检测标记的另一个选择是在pCMC1022或在任何其他的植物表达载体上制备插入的基因，将涂覆的pCMC1022和基因表达载体一起置于微粒载体上，如本文所揭示的，以转化进植物细胞。
如此制备的DNA可以直接用于切出的分生组织的转化，或可以通过首先转化到原生质体中并从中回收而得以制备。然后，DNA可以采用上面所揭示的方法，通过微粒加速而插入分生组织。完全成熟的，有性成熟的植物(尽管可能是嵌合的)可以通过转化的分生组织而生长。或者进行成熟的分生组织或幼苗的栽培或者通过切下的分生组织的再生。在任何情况下，从转化中产生的可能嵌合的植物随后可自授花粉以产生能够承受Mendellian遗传的外来基因的外源特性的基因突变的非嵌合后代。如所列举的，该方法是不依赖于特殊的外来基因和栽培品种的，因此，要克服一些存在于以土壤杆菌为媒介的植物转化中的问题。
在任何转化实验中，一个可检测的标记可转化到具有感兴趣的基因的植物中。如这里所揭示的，用于表达APH-3′Ⅱ的基因结构、荧火虫荧光素酶和gus均能表达并在基因突变大豆植物细胞中起作用。如此通过构造一个具有一个这样的可检测标记，或者多个可检测的标记的感兴趣的新基因的衔接结构，则稳定转化的植物和后代的存在的检测可以通过标记的检测而达到。因为转化频率表现为足够高，所以实际使用一个这种可检测的标记筛选对于检测转化突变型是可能的，可选择的标记，尽管可能是所希望的，但对于获得转化植物是不需要的。
下面的质粒在美国典型培养物中心(12301ParklawnDrive，Rockville，MD.U.S.A)和塞特斯控制培养物中心(Emeryville，CA)两处保藏，为如下保藏号ATCCATCCCMCC质粒保藏号保藏日期保藏号pCMC1022672691986，11，142902pAMVFF674511987，7，243157pCMC1100676411988，3，13290pAcX1100上述保藏物是根据ATCC和塞特斯公司(为本发明的转让权人的合伙人)之间的协议而进行的。与ATCC的协议对公众提供了这些细胞品系的永久有效性，根据描述和表达该保藏的美国专利的发行或公开或对于任何美国或外国的专利申请的公开文本来说，它是第一次出现，而且它对于由美国专利和商标的专员所决定的细胞品系的后代也是有效的，并根据35USC122章和专员规则所建议的(包括37CFR1.14章，它对于886O.G.638可列为特殊参考)为其命名。本发明申请的转让人已同意如果在合适的条件下栽培时，保藏后的细胞品系死亡或丢失或遭破坏，他们将马上根据通知替换一株同样的细胞品系的活体培养物。
本发明并不局限于微生物保藏的范围，因为保藏的实施例仅作为本发明的一个方面的一个例子，任何起同样作用的微生物也在本发明的范围内。除这里所显示的和描述的之外的本发明的多种修改对于本技术领域的那些技术人员来说，根据先前的描述将变得很明显，但它们将落入所附加的权项的范围内。
也可以理解，所有核苷酸的碱基对的大小是近似的，可用于描述的目的。
权利要求
1.一种制备可遗传的转化大豆植物的方法，其特征在于它包括如下步骤制备包括编码区和可在大豆细胞中有效地表达编码区的侧翼调节顺序的外来基因的拷贝；将外来基因的拷贝与生物惰性的载体相结合；将可再生的大豆组织放置于“靶子”表面上；用物理方法加速在“靶子”表面上携带嵌合基因拷贝的微粒，以这种方式，一些微粒可贮留在至少一部分大豆组织的细胞的内部；将处理后的组织再生成整株有性的成熟大豆植物；和验证外来基因在再生后的植物的组织中存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物惰性的微粒是金属的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述金属微粒是金球。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆组织是一个切出的合子胚。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述合子胚通过胚胎发生而再生。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述合子胚通过器官发生而再生。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述外来基因被制成一个可寄宿于细菌中的质粒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述质粒是ATCC保藏号为67269的pCMC1022。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述质粒是ATCC保藏号为67451的pAMVFF。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述质粒是ATCC保藏号为67641的pCMC1100。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆组织是切出的分生组织。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于处理后的分生组织通过器官发生而再生。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆细胞通过将这样的切出的组织铺展在琼脂培养基的层上而放于“靶子”表面上。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述验证外来基因存在是通过杂交分析外来DNA本身的存在而进行。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述验证外来基因的存在是通过分析外来基因的表达产品而进行的。
16.一种大豆植物，其特征在于它通过权利要求1的方法而生产。
17.一种种子，其特征在于它从权利要求1所述的方法所生产的大豆植物产生。
18.一种制备大豆植物的可遗传的转化品系的方法，其特征在于它包括如下步骤制备包括编码区和可在大豆细胞中有效地表达编码区的侧翼调节顺序的外来基因的拷贝;将外来基因的拷贝与基本上是生物惰性的载体相结合;将分生组织的大豆组织放置于“靶子”表面上;用物理方法加速在靶子表面上携带外来基因拷贝的微粒，以这种方式，一些微粒可贮留于至少一部分大豆组织的细胞的内部;将处理后的分生组织的大豆组织培养成完整的有性的成熟大豆植物;从有性成熟的再生植物中获取自授花粉的种子;从种子长成后代植物;和验证外来基因在至少一部分后代植物的组织中存在。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述生物惰性的微粒是金属的。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述金属微粒是金。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述分生组织的大豆组织是一个切出的合子胚。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于所述合子胚通过胚胎发生而再生。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于所述合子胚通过器官发生而再生。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述可再生的大豆组织是一种切出的分生组织。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于所述处理后的分生组织通过器官发生而再生。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述分生组织是大豆幼苗的分生组织。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于所述的分生组织的大豆组织通过将这样的切出的组织铺展在琼脂培养基层上而放于“靶子”表面上。
28.如权利要求18所述的方法，其特征在于验证外来基因的存在是通过杂交分析外来基因DNA本身的存在而进行的。
29.如权利要求18所述的方法，其特征在于验证外来基因的存在是通过分析外来基因的表达产品而进行的。
30.一种大豆植物，其特征在于它由权利要求18的方法生产。
31.一种种子，其特征在于它由权利要求18的方法所生产的大豆植物所产生。
32.一种大豆植物，其特征在于在它的基因组中包括一个外来基因的构造以引起在至少一部分大豆植物的细胞中外源基因产品的表达。
33.如权利要求32所述的大豆植物，其特征在于所述外来基因产品是一种蛋白质。
34.一种能经培养成大豆植物的大豆种子，其特征在于在它的基因组中包括一个可有效地引起大豆植物的细胞中外来基因产品表达的外来基因。
35.如权利要求34所述的大豆植物，其特征在于所述外来基因产品是蛋白质。
36.一种大豆植物，其特征在于在它的基因组中，包括一个在大豆植物的细胞中可表达的，且通过分析可检测到的标记基因产品的外源基因结构。
37.如权利要求36所述的大豆植物，其特征在于所述可检测的标记物是一种催化反应的酶，它可以通过荧光或比色分析而检测到。
38.一种种子，其特征在于它由权利要求36所述的植物所生产。
39.一种可以再生的大豆组织，其特征在于它包括大豆细胞，在所述大豆细胞的基因组中包括一个外源基因。
40.如权利要求39所述的可以再生的大豆组织，其特征在于至少有一些大豆细胞携带被用于将外来基因携带入细胞的生物惰性材料的微粒。
41.如权利要求39所述的可再生的大豆组织，其特征在于所述的外源基因是可检测的标记。
42.一种制备可遗传的转化的植物品系的方法，其特征在于它包括如下步骤制备包括编码区和可在植物细胞中有效地表达编码区的侧翼调节顺序的外来基因的拷贝;将外来基因的拷贝与惰性载体微粒相结合;将植物的分生组织放置于“靶子”表面上;以物理方法在靶子表面上加速携带外来基因拷贝的微粒，以这种方式，一些微粒可贮留在至少一部分分生组织的细胞的内部;将分生组织培养成完整的有性成熟植物;从成熟植物中获取自授花粉的种子;从种子中栽培出后代植物;和分析后代植物中外来基因的存在。
全文摘要
本发明揭示了通过以微粒为媒介的转化而遗传地转化大豆植物和植物品系的方法和设备。外来基因是通过被涂覆于载体微粒并被用物理方法加速进入植物组织而引入至可再生的大豆组织中。然后，将处理后的植物组织回收并再生为完整的有性成熟植物。后代从由这些植物产生的种子中回收，且一部分这种后代，在它们的基因的组中含有外来基因。该工艺可用于生产新的遗传工程的大豆植物及其品系。
文档编号C12N15/09GK1030940SQ8810476
公开日1989年2月8日 申请日期1988年7月29日 优先权日1987年7月29日
发明者保罗·克里斯托, 丹尼斯·麦凯布, 威廉F·斯温, 肯尼思A·巴顿 申请人:阿格拉塞特斯公司