专利名称：克鲁维酵母属作为宿主菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备和用克鲁维酵母生产有兴趣的多肽，该多肽可分泌到生长培养基中。作为本发明的例子是用于在克鲁维酵母中生成凝乳酶及其前体，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)和人血清清蛋白(HSA)的序列。
在微生物中生产肽的光明前途由于某些因素而变得暗淡。很多情况下，产生了肽却留在胞质中，内含残留物使得需要蛋白变性，再复性。然而仅部分成功或有时失败。另一些情况，产生的肽遭受降解，不仅使产率降低，而且得到的是难以分离的混合物。为有效地解决这些困难，已研究将所需肽分泌到营养基质中去的可能性。然而这种分泌成功有限，原因是，不是所有蛋白都能在所用的宿主中分泌。既使能分泌，肽的生成过程会导致产生与所需肽的组分和/或构型不同的产物。因此，人们的兴趣在于发展在一定条件下有效而经济地生产活性肽的系统，这种条件允许在各种环境中，体内或体外用这种肽。
欧洲专利申请(EPA)0096430揭示了用克鲁维酵母属作为宿主克隆和表达外源基因。然而没提及将蛋白分泌到生长基质的可能性。
Boyle等人在EMBOJ.(1984)31581-1585中和Innis等人在Science(1985)22821-26中叙述了曲霉菌(Aspergillus)淀粉葡糖苷酶的前导序列。Bruenig等人叙述了乳糖酶启动子(NucleicAcids.Res.(1984)122327-2341)。在欧洲专利申请0123544和Smith等人(Science1985，229∶1219)叙述了在酵母中使用与偶配型α-因子有关的信号肽，及用转化酶和酸性磷酸酶指导异源蛋白的分泌。
Mellor等人(Gene，(1983)，24∶1-14)研究了在酵母中生产前凝乳酶原，凝乳酶原和凝乳酶。当在酵母中细胞内生产凝乳酶原时，仅有少量凝乳酶原是可激活的。Moir等人在DeuelopmentsinIndustrialBiology，(1985)，26∶75-85;Mellor等人，基因(1983)24∶1-14;Kingsman等人在BiotechnologyandGeneticEngineeringRiviewVol。3(1985)376-418中所述。由酵母产生的凝聚的凝乳酶原需要复杂的变性和复性方法以稳定酶原。(见WO83/04418和EP-A-0114506)。
提供的生产肽系统包括克鲁维酵母宿主株，含用于克鲁维酵母有效转录起始和终止区的表达暗盒，和一个在调节区的转录转译调节下任选的含分泌信号序列的基因。表达暗盒引入克鲁维酵母宿主菌株，引入条件是所得转化体稳定保持表达暗盒。天然存在的DNA和合成的基因均可用于生产感兴趣的肽。
图1是质粒pGBTe418图解;
图2图解了质粒pGB901;
图3叙述了从淀粉葡糖苷酶信号顺序合成连接信号顺序的寡核苷酸。
图4描述一个合成信号顺序。即用于合成前导区和推断前导区蛋白质序列的合成的寡核苷酸。
图5是表示由乳酸克鲁维酵母(K.lactis)AG前导序列分泌的凝乳酶原的免疫吸印谱。该实验用实施例5所述方法进行。用酸(pH2)处理用pGB905乳酸克鲁维酵母转化的培养物上清液2或6小时。
泳道1未处理;
泳道2处理2小时;
泳道3处理6小时。
图6是来自pDM100PC的整个BamHI插入序列，包括酿酒酵母α因子和凝乳酶原融合肽以及转录调节区;
图7是质粒pKS105限制酶图。
图8表示设计用于鉴定K.lactisα-因子DNA的寡核苷酸探针的方案。
图9是为K.lactisα-因子编码的DNA片段完整顺序;
图10描述了由于表达α-因子信号序列和凝乳酶原结构基因融合的一些质粒。
图11是α因子前导序列/凝乳酶原融合结合点周围的序列。
图12是pAB309的BamHI/salI插入序列。
图13代表使乳酸克鲁维酵母α-因子前导DNA突变的引物序列。
1号引物间隔区缺失;
2号引物间隔区缺失+BSSHII位点。
图14图解质粒pUCG418。
图15图解质粒pGBtPA1。
图16表示用血纤维蛋白溶酶原/纤维蛋白-琼脂糖凝胶覆盖的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析被乳酸克鲁维酵母分泌的人t-PA。
泳道120ng由黑素瘤细胞产生的t-PA(kabi-vitrum);
泳道2从CBS2360培养物上清液中制得的样品;
泳道3从用pGBtPA1转化的CBS2360培养物上清液中制得的样品。
图17图解质粒pGBtPA2;
图18图解质粒pGBHSA3;
图19表示在10%聚丙烯酰胺凝胶上分析乳酸克鲁维酵母分泌的HSA。按照Leammli的方法，在10%聚丙烯酰胺凝胶上分析用pGBHSA3转化的CBS2360和CBS2360培养物上清液。泳道1含有标记蛋白(示出分子量)，泳道2和3的样品来自对照菌株CBS2360的上清液，泳道4的样品来自转化体之一的上清液。
根据本发明，克鲁维酵母细胞可提供有效而经济地生产多肽的表达暗盒。表达暗盒有在克鲁维酵母宿主细胞中有功能的转录和转译调节序列和在该调节区的转录转译控制下为所需多肽编码的开放读码。开放该码也可以包括一个由能将多肽分泌到生长培养基中的克鲁维酵母识别的前导顺序。所用克鲁维酵母细胞可是实验室菌株，也可是工业菌株。
表达暗合包括5′-3′方向转录，转录和转译起始调节区，编码所需肽的开放码，还需有为克鲁维酵母识别的分泌信号序列和一个转译终止区。表达暗盒还包括一个转录终止调节区。起始和终止调节区在克鲁维酵母中都是有功能的，能使所需肽有效表达，又不影响宿主本身活力和繁殖。
转录和转译起始调节区可对克鲁维酵母是同源或异源的。特别有趣的是转录起始区是来自出现在克鲁维酵母和其它酵母中的基因，其它酵母诸如酿酒酵母，Schiao酵母，Candida等，或其它真菌如丝状真菌，曲霉菌、脉孢菌、青霉菌等。转录起始调节区可从糖酵解途径的基因如乙醇脱氢酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，磷酸葡糖歧化酶，磷酸甘油酸激酶等中得到或取自可调节的基因如酸性磷酸酶，乳糖酶，淀粉葡糖苷酶等。
在特定情况下优选的在一个调节区序列取决于是否需要基本的或诱导的转录，与所需开放读码结合的启动子的特殊效率，与来自转诱导转录不同启动子并具有控制区的强启动子结合的能力，容易构建，等因素。这些调节区可在文献中找到足够的先例。见如EP-A-0164566。
在遗传学修饰了的微生物中分泌异源蛋白可通过下面两个方法之一完成。首先，前导序列与该蛋白是同源的;其次，前导序列与宿主是同源的。本发明中为在克鲁维酵母中分泌异源蛋白其它有趣的补充包括用与克鲁维酵母和所需肽异源的前导序列，或用专门设计的合成前导序列。为前一个前导序列编码的DNA可经分离或人工合成得到。因此，开放该码通常包括野生型或突变基因，在这些基因中信号顺序常与剩余的编码序列;一个杂交或嵌合开放该码，其中信号顺序通常不与公开读码的剩余部分相连;或一个合成序列，其中信号序列和开放读码合成为优选的密码子;合适的限制酶点，新氨基酸序列等等，或它们的组合。可用的信号序列可得自下列基因如α-因子，转化酶，淀粉葡糖苷酶，存在于结构基因中的天然或野生型信号顺序，它们可被克鲁维酵母，酵母，其它真菌如脉孢菌，曲酶菌和其它真菌细胞所识别。
特别令人感兴趣的是所用信号顺序能将所需肽分泌到培养基中而不是分泌到细胞质周围的空间。大部分情况下，信号序列是开放读码的5′末端。然而在某些情况下，需要在开放读码内有信号序列。分泌用读码内信号序列见美国专利01774，338，397和Perara及Lingappa，J.CellBiology(1985)101∶2292-2301。插入开放读码的基因包括高表达的基本基因，如为糖酵解途径的酶编码的基因，及乳糖酶，淀粉葡糖苷酶等高表达可调基因，等等。
在酶母和动物细胞中，为达到最优基因表达，发现转录起始码ATG周围的核苷酸序列是重要的如，M.Kozak，Microbial.Revs.(1983)47∶1-45广泛研究了在COS细胞中这些区对表达胰岛素的影响。同样，在高表达酵母蛋白时比在其它情况下更常发现一些特定核苷酸，这说明这些核苷酸对表达这些基因的重要作用。
为外源基因最优表达，修饰在起始ATG周围的核苷酸序列里很重要的。这可通过直接位点诱变或将外源基因融合到内源克鲁维酵母基因，特别是融入如乳糖酶基因的高表达基因的码中来完成。
正常情况下，在分泌过程中将信号前导序列从所需肽切下而不是在分泌过程后切下。当然两种情况均会发生。通常，所用加工信号是具有信号序列的天然加工信号或来自天然的修饰的加工信号，而它仍能有效使所需肽信号水解为信号肽和加工信号肽。很多加工信号已被进行顺序分析和确认，如α-因子(见美国专利4，546，082见参考资料)，淀粉葡糖苷酶，α-淀粉酶等。某些情况下，可用其它肽酶识别序列，但需要酶解以分离所需肽。这些序列包括二元肽，如KR，(D4)K和EA，它们可分别被KEX2，牛肠激酶，和一种酵母膜肽酶酶解。
所需肽可是宿主固有的或异源的，来源于原核或真核生物，真核生物包括真菌，原生动物，脊椎动物，非脊椎动物等等。肽产品可包括酶如乳糖酶，α-淀粉酶，β-淀粉酶，淀粉葡糖苷酶，凝乳酶等;哺乳动物肽如激素，白细胞介素，细胞激动素，cachexin;生长因子如血小板衍生的，表皮的，骨骼的等生长因子;生长激素;促滤胞激素;干扰素(α-，β-和γ-);血因子如第五，六，七，八(VW或C)，九，十，十一或十二因子，血纤维蛋白溶酶激活因子(组织或尿的);血清蛋白如人血清清蛋白;集落生长因子(如GM)，红血球生成素。thaumatin，胰岛素等。
这些结构基因可以各种方法得到。当其氨基取序列已知时，可全长或部分人工合成，特别是需用酵母优选的密码子。因此，全部和部分开放读码均可用克鲁维酵母优选的密码子合成。优选的码可通过在克鲁维酵母宿主大量生产的蛋白中测定，如糖酵解酶。合成顺序的方法及得到的序列均可在文献中查到。当合成公开读码一部分时及这一部分是天然衍生的时，合成部分可作为两个天然部分间的桥，或可提供3′末端或5′末端。特别是当信号序列和为某肽编码的公开读码从不同基因得来时，通常需用合成连接物。另一些情况，可用连接子，这时可在不同限制点插入不同片段或在连接子处取代一个序列。
大多情况下，部分或全部开放读码来自天然来源。鉴定所需序列的方法已广泛记载，当然在各种情况下会迁到不同程度的困难。这些技术包括用探针，这时用至少一部分已知天然氨基酸序列，通过基因组或cDNA文库寻找互补序列。此外，可诱导所需基因或细胞来自同一宿主不同分化部分时可通过比较产生的mRNA来探测不同的转录。其它的技术也有人举例。
末端区可来自得到起始区的基因3′端区，或来自不同的基因。大多数末断区是已知的，并发现可满足来自相同或不同属种的各种宿主。末端区通常根据其方便而不是根据其特殊性质而选择的。它最好来自酵母基因，特别是酿酒酵母和克鲁维酵母。
为开发表达暗盒，将包含调节区和开放读码的各种片段置于不同加工条件进行，如连接，限制，再接，体外诱变，引物修补，用连接子或连接物等等。因此，核苷酸转换，颠换，插入，缺失等均可用于调节区或/和开放读码的DNA。
在构建表达暗盒时，不同DNA片段通常将克隆到合适克隆载体上，该载体可繁殖DNA，修饰DNA或通过连接，删去一些序列，连接子等等。正常情况下，该载体至少能以相对高拷贝数在大肠杆菌中复制。克隆所用载体数是容易得到的载体有pBR322，pACYC184，pUC7-19，M13，Chron4A等等。
克隆载体的特点在于在大肠杆菌中有功能性的高效复制系统。克鲁维载体还至少有一个单一的限制点，通常有多样性的单一限制酶点，还可能包括多限制点，特别是为取代用的两个同样限制点。此外，克隆载体还有一个或多个用于选择转化体的标志，标志通常为抗细胞毒剂如抗生素，重金属，毒素等，还可能提供营养缺陷型宿主的补充或对噬菌体的免疫性等。通过载体和暗盒的适当的限制，所谓适当即通过吃掉一个单链或添补单臂修饰末端;或加连接子，加尾提供平端;提供连接用互补端，将载体与表达暗盒或其一部分连接。
在开发暗盒时，每次DNA操作后，就需根据需要克隆和提取质粒，分析特定暗盒成分的顺序，以保证得到合适的序列。根据操作的性质，从质粒上剪下所需序列，引入不同载体或将质粒限制酶解和根据需要对表达暗盒修饰。
某些情况下需用穿梭载体，这时该载体可在需不同复制系统的不同宿主中复制。这可能需要或不需要在两种宿主中有功能的附加标志。当需要这些标志时，将其包括在载体中，这时含有暗盒，两个复制系统，标志的质粒可根据需要从一个宿主转到另一个宿主。这种情况下，第二复制系统是一个在克鲁维酵母中有功能的复制系统。可用的复制系统来自质粒，如果蝇克鲁维酵母的pKD1质粒，病毒或克鲁维酵母或其它种的(如酿酒酵母)染色体。这样，该复制系统包括在酵母中发现的2微米质粒的复制系统和一个自我复制序列(ARS)基因如可用于中心体序列连接的序列等等。如果需要，可用同源区使表达暗盒整合到克鲁维酵母宿主的基因组中。
特别令人或兴趣的是本发明的组建物是来自克鲁维酵母DNA染色体的序列，称为KARS，它提供高的转化率。通过筛选高转化效率的克鲁维维酵母DNA片段的文库得到KARS基因。以此方式，可得到含KARS序列的片段，再用限制，再接，引物修补等进一步修饰片段得到约200bp及不大于5000bp的片段，通常是200-2000bp，从而加强了转化效率。KARS基因的存在使K.lactis营养缺陷型种以至少103/μgDNA，通常为104/μg DNA或更多的频率转化为原养型。
本发明用不同克隆DNA组建物(质粒和病毒)转化大肠杆菌的方式是不受限制的。连接，转导，转染或转化如氯化钙或磷酸盐介导的转化均可应用。相反，对酵母，大多的先有技术都是用钙离子和2000-8000(通常是4000-7000)道尔顿的聚乙二醇结合使用来转化原养型的。
转化的其它方法包括在标准酵母培养基中培养克鲁维酵母使密度达1-25，最好为4-10OD610。然后收获克鲁维酵母细胞，洗涤，用离液序列高的离子，特别是碱金属离子预处理，如锂，锶或鉫离子，优选的是其氧化物或硫酸盐，最好为锂盐，常以2mM到1M浓度，最好为约0.1M。
将细胞与离液序列高的离子一起温育，加入DNA，在适当温度下一般为20℃-35℃)再温育少许，(约5-60分钟)。再加聚乙二醇，浓度最好为25～50%，其中加入等体积的聚乙二醇浓缩液将整个培养基稀释到所需的终浓度。聚乙二醇是2000-8000道尔顿的，最好为4000-7000道尔顿的。温育时间较短，一般为5～60分钟，温育培养基一般要在35-45℃，最好约42℃下热处理1-10分钟。
可用任何常用标志供筛选。然而用于克鲁维酵母的标志比用于普通酵母的要窄。最好是抗卡那霉素和氨基葡糖苷G418，也可用色氨取代谢途径中的基因补充物，如TRPI或在乳糖代谢途径中的基因补充物如LAC4。
虽然选择标志操作方便，但也叙述了其它筛选转化细胞的步骤。见例如G.Reipen等人的CurrentGenetics(1982)5189-193。除了用诸如β-内酰胺酶等指示酶外，还可通过它们的特定产物筛选转化细胞。如对凝乳酶，可通过免疫学或酶方法来测定产物的合成。
所用载体可以是能在克鲁维酵母染色体外保存的，或整合到其基因中。发现来自酿酒酵母的2微米质粒复制系统在克鲁维酵母中染色体外保存。此外，可用中心体组合，如酿酒酵母的CEN3和高频转化序列如ARS或KARS。如果提供了筛选维持性，如补充物或克鲁维酵母敏感的抗生素抗性，ARS等顺序通常是以在染色体外维持。
在大规模发酵中，即使克隆质粒稳定性的少量损失都将极大地影响所需蛋白的最终产量。为增加重组分子在宿主细胞(如克鲁维酵母)中的稳定性，可用整合到宿主染色体的重组分子。
在需要整合时，就需要一个与宿主染色体同源的序列，从而可发生同源重组。当然随机整合也会发生，所以同源序列是优选的。当用同源序列时，至少需200bp同源序列，1000bp或更多则更好。此外，涉及整合时，需要结构基因的扩增。通过在选择培养随机提供一个有利筛选宿主的基因与所需结构基因一道，则可达到扩增的目的。因此，可用表达二氢叶酸还原酶，金属硫因(metallothioneins)，胸腺嘧啶酶等的基因已用于各种宿主中，以实现扩增，这时这些基因保护基免受诸如氨甲蝶呤等毒素及如铜，汞等重金属的毒害。
稳定复制所需载体包括来源于K.lactis的KARS载体，如pKARS12和pKARS2，其中质粒包括含在酿酒酵母质粒YRp7中的KARS12或KARS2的K.lactisDNA片段。用于整合的载体如pL4，一个携带质粒YRp7的杂交质粒，携带LAC4基因的K.lactisXhoIDNA片段。(见EP-A0096430)。
所需质粒包括含2微米质粒复制系统，LAC4基因，Tn601和Tn5卡那霉素抗性基因的质粒，它们都在克鲁维酵母中有抗生素G418抗性。(Jimenez和Davis，Nature(1980)287∶869-871)。这个质粒在克鲁维酵母中自我复制，在含葡糖，山梨醇和0.2μg/mlG418而不太高的KCl浓度的再生平板培养基上可通过抗G418筛选之。伏选的质粒包括TRR1基因，特别是来自酿酒酵母的该基因;及LAC4基因，特别是来自K.lactis的该基因;及来自Tn5的抗G418的Kan基因等等。
将上述载体及组建物引入合适宿主，克隆和表达所需结构基因。转化后，5-6天内在再生培养基上出现菌落。用抗生素筛选时，先要筛选出不会自发突变为抗性株的菌落。用本发明的质粒及方法，发现约有5%抗性菌落含组建质粒，它们以至少4个转化体/μg质粒DNA的转化率转化。当基于LAC4基因筛选时，用乳糖作唯一碳源，0.6MKCl作为渗透压稳定剂，所有残留菌落均为转化体，没有自发回复突变。在适当温度如30℃下约4-5天得到20个转化体。
作为宿主，克鲁维酵母是特别适于生产异源蛋白的，如生产和萃取凝乳酶和它的前体前凝乳酶原，拟凝乳酶和凝乳酶原，生产人血清清蛋白(HSA)，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)和thaumatin及其前体。虽然其它菌株如酿酒酵母也以可观量产生凝乳酶原，但产生的凝乳酶原不能以活性或可激活形式提取出来。我们吃惊地发现，用克鲁维酵母生产的总量在90%以上的凝乳酶原可根据非常简单的标准技术提取出有活性的该物质。
可用克鲁维酵母任何种，无论是实验室的还是工业菌株，最好用工业菌株。为得到工业菌株，可从天然源分离，也可从保藏单位得到，或用突变等方法修饰菌株。工业菌株的特点在于可抵抗遗传交换，是原养的，或通过引入单个基因到宿主株制成原养的，通常筛选用于改进肽的生产。在克鲁维酵母属的各种中可用的有乳酸克鲁维酵母(K.laetis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)，耐温克鲁维酵母(K.thermotolerans)，马克斯克鲁维酵母(K.marxiaus)等。克鲁维酵母各种已列在GRAS上(GenerallyRecogniaedAssafe)。将它们用于体内生产一些产品及食用一般都不必特殊的政府批准。
野生型和突变型的克鲁维酵母，特别是乳酸克鲁维酵母或脆壁克鲁维酵母常用作宿主。最令人感兴趣的是乳酸克鲁维酵母SD11lac4trpl和乳酸克鲁维酵母SD69lac4和野生型菌株CBS2360(见EP-A-0096430)。
为保持含质粒的转化体的选择压力，要用筛选培养基，如酵母含氮培养基，对K.lactisSD69lac4(PTY75-LAC4)和SD69lac4(PL4)需用2%乳糖代替葡萄糖，对乳酸克鲁维酵母SD11lac4trpl(pKARS12)需用酵母含氮培养基(Difco)加2%葡萄糖(见EP-A0096430转化体。与此相似，对含有抗生素抗性如抗G418质粒的菌株，可培养在含该抗生素的培养基中。
当用杂交质粒大量生产所需蛋白时，从杂交质粒至少基本上除去全部细菌DNA序列是有用的。
根据所需结构基因的性质，表达产物可能残留在宿主细胞质内或被分泌出来。发现不管是留在细胞内还是分泌出来的均为可溶的。当表达产物留在宿主细胞中时，一般可需有诱导转录起始区，从而直到转化体达高密度时，很少或没有所需产物表达。待形成表达产物足够时间后，才可用常规方法分离细胞，如离心，溶胞和提取所需产物。根据产物性质和用途，用不同方法纯化溶胞物，如层析，电泳，溶剂萃取，结晶等等。纯度从50%～90%或更高不等。最高可达基本和非基本转录起始区，这取决于生产所需蛋白或多肽所用的发酵方法。表达产物可分泌到培养基中，当培养可部分取出，用亲和层析萃取所需产物时，生产可连续进行。重加基本成分，除去消耗的基质以再循环生产。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都表示了本领域普通专业人员的水平。所有出版物和专利申请均包括在参考资料日录中。
下面的例子是为说明本发明，不构成对其的限制。
实验部分实施例1含有长乳糖酶启动子序列的凝乳酶表达质粒的构建A.pUCla56的构建从乳酸克鲁维酵母菌株CBS2360分离出染色体DNA(DasandHollenberg，CurrentGenetics(1982)5∶123-128)，用XhoⅠ裂解，并按照在蔗糖梯度下的大小分离之。在硝化纤维素滤纸上准确地定出DNA的位置后，用得自质粒pK16的LAC4探针检测出含有乳糖酶基因的部分(见欧州专利申请0096430，实施例16，C2)。将含有LAC4基因的DNA克隆到质粒pPA153-215的SsaⅠ位点上(Andreoli，Mol.Gen.Genet.(1985)199∶372-380)，得到质粒pPA31。含有乳糖酶基因的pPA31的XbaⅠ片段再克隆于pUC19的XbaⅠ位点中(Yanisch-Perronetal.Gene(1985)33∶103-119)，可得到质粒pUCla56。
B.在乳糖基因的终止区引入G418抗性基因从质粒pGBTeG418中得到含有G418抗性标记的终止片段。含有pGBTeG418的大肠杆菌已于1987年2月26日贮存在CBS，贮存号为CBS184.87并已于1988年8月3日贮存在CCTCC，贮存号为M88084。质粒pGBTeG418(见图1)由如上所述的pPA153-215和包括3.7KbBamHⅠ乳酸克鲁维酵母乳糖酶终止片段(Breuningetal.，Nucl.AcidRes.(1984)12∶2327-2341)和Tn5基因(Reissetal.，EMBOJ.(1984)3∶3317)在内的5.6Kb片段所组成，在酵母启动子醇脱氢酶(ADH)的指导下赋予对G418的抗性，这与Bennetzen和Hall在J.Biol.Chem.(1982)257∶3018-3025中所述相似。
C.含有G418抗性基因和编码凝乳酶原DNA的质粒pGB900之构建在用SalⅠ和XbaⅠ切开的pUC19中使来自含有G418抗性基因的质粒pGBTeG418的3.6KbHindⅢ-XbaⅠ片段(见实施例1B)和含有来自pGB123的凝胶酶原基因的SalⅠ-HindⅢ片段连接起来，得到质粒pGB900。
D.质粒pGB901的构建(见图2)通过连接下面四个片段构建质粒pGB901(1)含有乳糖酶启动子的3.6KbXbaⅠ-HaeⅡ片断连接到从pUCla56分离出的乳糖酶ATG起始密码子的大约-90位上，(2)从上述HaeⅡ位点延伸到SalⅠ位点的HaeⅡ-SalⅠ片段，用与在欧洲专利申请0096430的实施例16.C2中所述的方法类似的Bal31实验使该片段连接到-26位上。但在该实验中只使用了一个SalⅠ连接子。该片段的序列如下5′TTAACACTTGAAATTTAGGAAAGAGCAGAATTTGGCAAAAAAAATAAAAAAAAAATAAACACG3′3′CGCGAATTGTGAACTTTAAATCCTTTCTCGTCTTAAACCGTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTGTGCAGCT5′(3)含有凝乳酶原和来自pGB900的G418(见实施例1C)的5.1KbSalⅠ-XbaⅠ片段，(4)用XbaⅠ切开的pUC19。
在构建质粒期间，HaeⅡ位点的CG序列由于疏忽而除去，因而在该位置上建立一个HindⅢ位点。
编码凝乳酶原的DNA存在于质粒pGB901中。分别用来自pGB131，122或124的SalⅠ-BglⅡ片段可容易地转化为带有前凝乳酶原，拟凝乳酶或凝乳酶DNA的质粒(见欧洲专利申请0096430)。
实施例2从乳酸克鲁维酵母转化体分泌凝乳酶原为了引导凝乳酶原在克鲁维酵母中合成，使用质粒pGB901转化乳酸克鲁维酵母菌株SD11和CBS2360，结果相似。转化基本上按照欧洲专利申请0096430的实施例4和14所述方法进行，使用完整的质粒DNA或用限制性内切核酸酶切割的质粒DNA。在后一种情况下，使用了限制性内切核酸酶，该酶在启动子区切割，例如，在SacⅡ，NdeⅠ，SnaBⅠ或SpeⅠ点;或在终止区切割，如，在EcoRV点;或即在启动子区又在终止区切割。
使乳酸克鲁维酵母菌株CBS2360在100mlYEPD培养基(1%酵母膏，2%胨，2%葡萄糖)中生长至OD610大约7为止，培养基中含有2.5ml6.7%酵母氮碱(Difco)溶液。通过离心从10ml培养物中收集细胞，用TE缓冲液(10mMTris-HClpH7.5，0.1mMEDTA)洗涤并再悬浮于1mlTE缓冲液中。加入等体积的0.2M乙酸锂并于30℃下在震荡水浴中温育混合物1小时。在乳糖酶启动子的唯一SacⅡ位点切开质粒pGB901(15μg)，用乙醇沉淀并再悬浮于15μlTE缓冲液中。将该DNA制剂加入到100μl预先温育过的细胞中，温育过程延长30分钟。然后加入等体积的70%PEG4000并在同样温度下温育混合物1小时，然后在42℃下热震荡5分钟。然后加入1mlYEPD培养基并在30℃的震荡水浴中温育细胞1.5小时。最后离心收集细胞，再悬浮于300μlYEPD中，涂在含有15mlYEPD琼脂和300μg/mlG418的琼脂平板上，在使用前1小时用15ml不含G418的YEPD-琼脂覆盖细胞。使这些菌落在30℃下生长3天。用类似的方法使乳酸克鲁维酵母菌株SD11转化，只是使G418在选择平板上的浓度降低到150μg/ml。
在一项实验中，使CBS2360转化体于30℃下在含有2%半乳糖的YEP培养基中生长。60小时后，通过离心使细胞与培养基分离。通过用玻璃珠处理破坏细胞。在测定凝乳酶活性之前在pH2条件下处理培养基和细胞提取物(见Foltman，MethodsinEnzymology(1970)19∶421-426)。
通过离心从培养物中除去细胞，加入1M H2SO4使所得上清液酸化至pH2并在室温下温育2小时。然后加入2M Tris碱将该溶液中和至pH6。将50μl合适的稀释液加入到12%无脂肪奶粉于10mM Ca Cl2中的悬浮液中并在37℃下温育直到形成凝块。凝乳酶活性单位的定义为在10分钟内产生凝块所需活性凝乳酶的量。在这些条件下，虽然使蛋白质分泌的信号序列没有加入到凝乳酶原中，但由于乳酸克鲁维酵母转化体产生并分泌出凝乳酶原，所以上清液具有凝乳活性。用上述凝胶检测法测得在培养基中有大约30-60%所产生的总凝乳酶原。用乳酸克鲁维酵母菌株SD11得到了相似的结果。
实施例3增强凝乳酶产量的乳糖酶-凝乳酶融合蛋白利用不同的SnaBⅠ-SalⅠ片段(来自与在欧洲专利申请0096430的实施例16.C2中所述类似的Bal31实验，但仅使用一个SalⅠ连接子)，得到了含有乳糖酶和凝乳酶蛋白之间融合的pGB901变异体(表1)。用酸处理可将由乳糖酶DNA和连接子序列提供的额外氨基酸与凝乳酶原的前序到一起除去。观察到含有4个来自乳糖酶编码序列(pGB902)的氨基酸的融合使得凝乳酶的产量提高。
表1在pGB901和pGB902中乳糖酶启动子与凝乳酶原之间连接处的核苷酸序列pGB901
pGB902
蛋白质合成开始于框中的ATG密码子。
实施例4前凝乳酶原通过克鲁维酵母转化体的表达为方便起见从pGB902的多连接子中除去SalⅠ位点(见实施例3)。用SalⅠ部分消化pGB902，然后与Bal31(Boehringer)一起短暂温育。从琼脂糖凝胶中分离出线性片段，连接并转化到大肠杆菌中，得到正确的质粒，pGB903。限制性分析表明该质粒也具有从多连接子中除去的XbaⅠ和HindⅢ位点。
为了构建含有并表达前凝乳酶原的质粒，用限制性内切核酸酶Sal和BglⅡ消化质粒pGB903。通过电泳洗涤从琼脂糖凝胶中分离出11KbDNA片段。类似地，消化含有前凝乳酶原基因的质粒pGB124(见欧洲专利申请0096430，实施例16)并分离出含有前凝乳酶原N-末端部分的0.3KbSalⅠ-BglⅡ片段。
将11Kb和0.3KbDNA片段混合，用DNA连接酶连接并转化到大肠杆菌中。分离出质粒pGB904，该质粒含有与小部分乳糖酶基因融合的前凝乳酶原基因(表2)
表2在pGB904中乳糖酶启动子与前凝乳酶原之间连接处的核苷酸序列pGB904
蛋白质合成开始于框中的密码子。
用pGB904转化乳酸克鲁维酵母CBS2360细胞，pGB904已用SacⅡ线性化。用实施例2所述方法选择转化体，使之生长并测定凝乳酶活性。在下面的表3中，比较了从用pGB902(见实施例3)和用pGB904转化的乳酸克鲁维酵母CBS2360细胞中分泌的凝乳酶原。在OD610为200条件下以每ml细胞的任意单位表示凝乳酶(原)的产量。
表3由用pGB902和pGB904转化的乳酸克鲁维酵母细胞分泌凝乳酶原pGB902pGB904转化体上清液沉淀物上清液沉淀物13.2＜0.422.41.721.3＜0.433.33.037.11.428.02.344.40.6653.85.8实施例5用异源前导序列由克鲁维酵母分泌凝乳酶原A.淀粉葡糖苷酶前导序列的化学合成和含有所述前导序列的质粒的构建Innis等人在Science(1985)228∶21～26中公开了来自泡盛曲霉的淀粉葡糖苷酶前导序列。根据蛋白质序列，得到了寡核苷酸使前导序列插入到凝乳酶原基因的前面(见图3)。
用AppliedBiosystems的DNA合成仪合成了寡核苷酸。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化寡核苷酸，然后从凝胶中电泳洗脱下来。
在唯一的Sal位点切开质粒pGB903(见实施例4)。在65℃，50℃和37℃下使寡核苷酸在2×SSC中杂交各1小时。寡核苷酸在5′-端没有磷酸酯可防止多体形成。用T4多核苷酸连接酶将DNA连接到Sal Ⅰ位点中。将连接混合物转化到大肠杆菌H B101中。培养24个菌落并分离出质粒DNA。质粒之一，pGB905，通过限制性酶分析显示出具有正确的核苷酸方位。将质粒pG B905转化到乳酸克鲁维C B S2360中。按照在实施例2中所述程序分析凝乳酶(原)产量。凝乳酶(原)产量以在OD610为200时每ml细胞的任意单位表示，结果示于下面表4中。
表4由用pGB902和pGB905转化的乳酸克鲁维酵母细胞分泌的凝乳酶原pGB902pGB905转化体上清液沉淀物上清液沉淀物13.2＜0.460.6＜0.421.3＜0.456.4＜0.437.11.456.7＜0.444.40.6657.6＜0.4B.新的合成前导序列的化学合成到含有新的合成前导序列的质粒的构建制备一种合成前导序列，它具有不同于任何已知前导序列的序列。用该前导序列，由克鲁维酵母分泌出合成的全部凝乳酶原，如下所示。
利用在信号序列切点的-6位到+2位经常出现的氨基酸设计该合成前导序列(VonHeyne，Eur.J.Biochem.(1983)13317-21)。也使用了经常出现的酵母密码子并将额外的核苷酸掺入到ATG序列的前面弥补在pGB902中26个核苷酸的缺失。所用的寡核苷酸和所得的前导序列示于表5中。
用AppliedBiosystems的DNA合成仪合成出合成前导序列DNA。使所得的寡核苷酸在40cm长，1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上通过，凝胶中含有TBE缓冲液(50mMTris，50mM硼酸盐，1mMEDTA，pH8.3)和7M尿素，直到溴酚蓝标记移过2/3的凝胶长度为止。使DNA显色，从凝胶中洗脱下来并用乙醇沉淀，同样从pGB901制得一种在SalⅠ位点附近具有缺失的衍生物，该缺失是pUC19的多连接子造成的。用来自pGB901的相应片段代替来自pGB903的0.5KbSnaBⅠ-BglⅡ片段制得该衍生物。在唯一的SalⅠ位点切开所得质粒。在65℃，50℃和37℃下使寡核苷酸在2×SSC中杂交各1小时。用T4多核苷酸连接酶将DNA连接到SalⅠ位点中。然后将质粒转化到大肠杆菌HB101中。在所得到的菌落中，培养24个并分离出质粒DNA。通过限制性酶解看出质粒之一，pGB906具有正确方位的寡核苷酸。用pGB906转化的乳酸克鲁维酵母CBS2360分泌出95%以上所产生的凝乳酶(原)。
C.分析由用pGB905转化的乳酸克鲁维酵母产生的凝乳酶蛋白质使乳酸克鲁维酵母CBS2360(pGB905)转化体于30℃生长3天并从培养物上清液中收集样品。按照Laemmli的方法(Nature(1970)227680-685)将蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶上电泳。按照Towbin等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)764350-4354)使蛋白吸印到硝化纤维素滤纸上。将滤纸与抗凝乳酶的多克隆抗血清(Chr.Hansen)一起温育检测凝乳酶蛋白，然后将驴抗兔抗体偶联到过氧化物酶(Amersham)上，最后在含有40%甲醇的缓冲液(50mMTris-HClpH7.5，0.9%NaCl)中具有0.6mg/ml4-氯萘酚和0.015%过氧化氢。由AG信号序列分泌出的凝乳酶原在用该测定法所证明的pH2处理后正确地裂解下来(图5)。用乳酸克鲁维酵母CBS2360(pGB906)转化体得到了相似的结果。
实施例6由于高效分泌的含有酿酒酵母α因子序列的质粒的构建A.酵母α-因子表达质粒1.质粒的构建pDM100-PC起始材料为质粒pGB163(见欧洲专利申请0096430，实施例16.C1)。用BamHⅠ消化质粒pGB163，并连接到XbaⅠ-BamHⅠ，α-因子前导序列-凝乳酶原连接物上。然后用PstⅠ处理所得混合物并分离出编码具有凝乳酶原位点和N-末端区的前-α-因子的96bp片段。在用PstⅠ和SalⅠ消化后从质粒pJS111中分离出编码牛凝乳酶原的1900bp片段。质粒pJS111是在ADH-2启动子和甘油醛-3-磷酸(GAPDH)终止区的调控下含有pGB163的凝乳酶原基因的pBR322衍生物。酵母GAPDH49基因启动子和转录终止区基本上如Travis在J.Biol.Chem.(1985)2604384-4389中所述。
用XbaⅠ和SalⅠ消化质粒pDM100，该质粒含有GAPDH启动子，酿酒酵母α-因子前导区，和人的合成基因与干扰素的融合区，其两侧是XbaⅠ和SalⅠ位点和α-因子终止区，用碱性磷酸酶处理，然后连接到上述96bp和1900bp片段上。α-因子前导区和终止区基本上如Brake在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)814642-4646中所述。分离所得质粒pDM100-PC，该质粒含有GAPDH启动子，α-因子前导区和凝乳酶原基因的融合区。BamHⅠ插入体的完整序列示于图6。
为了选择酵母转化体，构建了质粒pKS100和pAB300。
pKS100将来自含有酿酒酵母URA3基因的YEp24的1170bpHindⅢ片段插入到pDM100-PC中构建质粒pKS100。
pAB300将来自含有乳酸克鲁维酵母LAC4基因3′区和G418抗性标记的3500bpHindⅢ-SalⅠ片段插入到pDM100-PC中构建质粒pAB300。图6说明了GAPDH/α-因子/凝乳酶原BamⅠ插入pDM100-PC中。
2.乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母的转化在凝乳酶原编码区的BglⅡ位点消化质粒pKS100并用来转化乳酸克鲁维酵母菌株KRN201-6。该菌株是2UV21菌株的衍生物(alac4trplura3[Kil°])，其中lac4基因已被来自pGB901的LAC4启动子-凝乳酶原基因融合区所取代。因此可将pKS100的整合定向到整合的凝乳酶原编码区。也可用质粒pKS100转化酿酒酵母菌株(αUra3Leu2his4pep4-3[Cir°])，假使这样的话可定向到GAPDH基因3′区的SalⅡ位点。
在液体YEPD培养基中使所得转化体生长至饱和状态，在pH2下活化后检测培养物上清液和细胞溶解物的凝乳酶活性。由下面表5归纳的结果可看出，乳酸克鲁维酵母将凝乳酶原高效分泌到培养基中，而酿酒酵母转化体只分泌出一小部分所产生的凝乳酶原。
表5在乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母转化体中凝乳酶原的产量凝乳酶活性(相对单位/ml培养物)菌株细胞提取物培养物上清液AB110＜0.25＜1.0AB110pKB10015.52.3KRN201-6＜0.25＜1.0KRN206-6pKS10012.0333.0用质粒pAB300将乳酸克鲁维酵母2UV21菌株转化为G418抗性，定向整合到LAC4基因3′区的EcoRV位点。这些转化体也高效地将凝乳酶原分泌到培养基中，结果如下表6所示。
表6从α-因子/凝乳酶原融盒体分泌的凝乳酶原宿主菌株转化质粒分泌的凝乳酶活性(相对单位/ml培养物)2UV21-＜2KRN201-6-＜2KRN201-6pKS1003852UV21pKS300294
B.LAC4启动子/α-因子前导序列/凝乳酶原融合体的构建为了产生该融合体，构建了两个中间体质粒。用PstⅠ部分消化质粒pDM100-PC，连接到SalⅠ-PstⅠ连接物上，该连接物编码部分α-因子前导序列和26bp的LAC4基因5′区，然后用HindⅢ消化该质粒。从该混合物中分离出1500bp片段，然后克隆到用HindⅢ和SalⅠ消化过的pUC18中得到pKS102。
将合成的大肠杆菌乳糖操纵子连接到pKS102α-因子前导编码序列5′端SalⅠ位点上得到质粒pKS103。这样做的原因是LAC4启动子/α-因子前导序列/凝乳酶原融合体对大肠杆菌可能是有毒性的。
分离pKS103的409bpSalⅠ-BglⅡ片段并连接到SalⅠ-BglⅡ消化的pJD15R上。通过填补在pUC19多连接子中SalⅠ位点的缺失从pGB901衍生出质粒pJD15R，从而得到pJD15，然后以相反的方向再克隆8800bpXbaⅠ片段。从这个反应中分离出质粒pKS105。这些质粒示于图7中。
然后用质粒pKS105转化乳酸克鲁维酵母菌株CBS2360成为G418抗性，用LAC45′区中的SacⅡ位点作为整合转化的靶位。以在OD610为200时每ml细胞的单位数表示凝乳酶的产量(表7)。
表7由用pKS105转化的乳酸克鲁维酵母细胞分泌的凝乳酶原＊
转化体上清液沉淀物11113.321474.531243.741253.0＊以每ml培养物的相对单位数表示凝乳酶活性。
实施例7A.乳酸克鲁维酵母α-因子信号序列的分离和应用用酿酒酵母Matasst2-3RC687菌株作为试验菌株按Julius等人在Cell(1983)328-39中所述的方法进行培养物上清液的生物测定。使乳酸克鲁维酵母菌株CBS141(α)生长于含有0.5%葡萄糖，0.17%没有硫酸铵的酵母氮碱(Difco)，和0.002%硫酸铵的培养基中。离心除去细胞后，将乙酸加入到培养物上清液中至0.1M浓度，使上清液通过一个Bio-Rex70柱(Biorad)。用0.1M乙酸洗柱，然后用80%乙醇/10mMHCl洗脱α-因子。将洗脱液蒸发至干，然后溶于0.1%三氟乙酸(TFA)/20%乙腈中并加到反相HPLC保护柱上。用含有0.1%TFA和20%，40%，60%和80%乙腈的溶液逐步洗柱。然后将含有α-因子活性的60%级分加到分析C-18HPLC柱上并用溶于0.1%TFA的20%到80%乙腈进行梯度洗脱。收集各级分并测定α-因子活性。使含有α-因子活性的级分干燥并进行氨基酸顺序分析。
B.质粒库的杂交筛选用
-[32P]-ATP和T4多核苷酸激酶标记寡核苷酸库。用这些寡核苷酸探针于42℃在下列杂交液中探测Southern吸印或细菌菌落4×SSC，50m MKH2 PO4 PH7，1%肌氨酰(Sarkosyl)，10%硫酸葡聚糖，200μg/ml声处理的，变性鲑鱼精子DNA。于42℃用2×SSC，0.1% SDS洗涤滤器。
以每80mm的含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板含500-2000个菌落的密度平板培养大肠杆菌HB101菌株的转化体，用这些探针筛选载体pJS109中的质粒库，该质粒库含有由乳酸克鲁维酵母SD11菌株的基因组DNA(trpllac4)的有限Sau3AI消化液产生的插入体，分级分离为纯化片段的大小＞5000bp。将DNA从菌落中转移到硝化纤维素滤纸上并如上所述使这些滤纸杂交。挑选出相应于滤纸上的杂交信号区的原平板上的区域，然后再进行平板培养并用杂交法再次试验，以分离出带有含杂交序列质粒的信号菌落。通过Southern吸印分析从少量培养物中纯化的DNA，进一步检测阳性菌落。
用各种限制性酶消化从杂交阳性菌落中纯化的质粒，为了鉴定适合于DNA序列分析的限制性片段的大小，采用相同的杂交探针，以Sou-thern吸印分析法分析了所得的片段。通过琼脂糖凝胶电泳使鉴定出的片段纯化并克隆到合适的MP18和MP19载体中。然后进行DNA序列分析。
C.克鲁维酵母α-因子的分离乳酸克鲁维酵母α-因子的头10个氨基酸显示出与来自酿酒酵母的头10个氨基酸明显的同源性，即具有6个相同的氨基酸残基。该序列如下所示Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln用此蛋白质序列设计一组寡核苷酸，据推断其与图8所示的相应结构基因是互补的。将包含α-因子肽段所有可能的密码子的寡核苷酸合成为96个和48个不同分子组成的两个库。
用y-[32-P]-ATP和T4多核苷酸激酶放射性标记这两个库，分别用这两个库探查乳酸克鲁维酵母DNA限制性酶解物的Southern吸印情况。在几种不同的酶解物中，第2号库与单一的片段牢固地杂交并与第二个片段杂交得弱得多。因此选用第2号库筛选乳酸克鲁维酵母基因组DNA的质粒库。
使用这些探针筛选质粒库使得许多杂交的克隆分离。这些克隆之一，αfh18b的DNA序列分析表明它编码一条α-因子相关肽，该肽与酿酒酵母α-因子肽有强烈的相似处。将杂交部分定位于大约为1000bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上。该片段的序列示于图9中。乳酸克鲁维酵母只含有加入N-连接的糖链的两个位点。此外，乳酸克鲁维酵母重复的间隔区要比酿酒酵母重复的间隔区长，并显示出更不同的序列，该序列具有X-Ala/Pro型式的序列而不是在酿酒酵母中所看到的Glu/Ala-Pro序列。DNA序列的比较表明了在整个编码区同源的强烈程度。
D.质粒的构建为了提供乳酸克鲁维酵母α-因子前导区与在强有力的启动子的转录控制下表达的凝乳酶原的融合体，构建了一系列质粒(见图10)。
pAB307用klenow酶填充EcoRⅠ悬臂并将BglⅡ连接子加入到钝端修饰了来自αfk18b的673bpSspⅠ-EcoRⅠ片段(图9)。然后将该片段插入到把酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)的启动子和终止区连接起来的BglⅡ位点中。在pUC18中将这个暗盒克隆为BamHⅠ片段，得到pAB307。
pAB309然后使编码α-前导区和牛凝乳酶原的序列融合。首先用NcoⅠ消化pAB307并通过用绿豆核酸酶处理使粘性末端变为平钝末端。然后用SalⅠ消化所得产物。将含有编码凝乳酶原和酿酒酵母转录终止区序列的2000bpEcoRV-SalⅠ片段连接到上述产物上。该片段得自质粒pJS111，其中已将XbaⅠ-BamHⅠ连接物加到了含有与酿酒酵母GAPDH转录终止区融合的凝乳酶原cDNA之片段的5′端。用该连接混合物转化大肠肝菌HB101菌株并分离出携带质粒pAB309的转化体。在该融合体连接处附近的序列示于图11中并且pAB309的整个BamHⅠ-SalⅠ插入体的序列示于图12中。
pAB312a为了获得乳酸克鲁维酵母菌株的转化，将得自pGB901的3560bpHindⅢ片段插入到pAB309产生质粒pAB312中。HindⅢ片段包含乳酸克鲁维酵母LAC4基因的3′区和酿酒酵母ADH1启动子与细菌G418抗性结构基因的融合体。
pAB313和pAB314从pAB309中分离出1900bpSacⅠ-HindⅢ并克隆到MP19中(Yanisch-Perronetal，Gene(1985)33103)。制备单链噬菌体DNA并用作模板，用图13所示的两种寡核苷酸引物之一进行体外诱变。分别用1号引物和2号引物制备M13噬菌体MP19/αk11.5和MP19/αK12.2。
由这些噬菌体制备双链RFDNA，并从每种噬菌体中分离出SacⅠ-StuⅠ片段。将这些片段与来自pAB312a的7100bpSacⅠ-StuⅠ片段连接。氛离出的质粒pAB313和pAB314具有图13所示的序列改变。
E.克鲁维酵母的转化用EcoRV消化质粒pAB312(定向整合到乳酸克鲁维酵母基因组的LAC4区中)，然后用它使乳酸克鲁维酵母2uv21菌株(ura3trpllac4[Kil°])转化成G418抗性。用质粒pAB313和pAB314使2uv21菌株转化为G418抗性。使转化体2uv21pAB312，2uv21pAB313和2uv21pAB314的培养物生长并如上测定培养物上清液的凝乳酶活性。
使许多这些转化体及未转化的对照菌株在1ml培养基中生长36小时，培养基组成为1%的酵母膏，2%胨，2%葡萄糖，0.17%酵母氮碱，50μg/ml色氨酸和50μg/ml尿嘧啶。然后在酸活化后测定培养物上清液的凝乳酶活性。发现所有转化体都分泌可活化的凝乳酶。结果示于下面表8中。
表8凝乳酶原在克鲁维酵母中的分泌菌株宿主质粒凝乳酶活性(相对单位/ml培养物)2UV212UV21-＜2KRN303-12UV21pAB312256KRN304-42UV21pAB313175KRN305-22UV21pAB314206用三氯乙酸沉淀的培养物上清液的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定发现每种转化体均分泌单一的凝乳酶原相关种类。由pAB312转化体分泌的凝乳酶原相关蛋白通过电泳迁移测定出的分子量比由pAB313和pAB314转化体所分泌的凝乳酶原相关蛋白的分子量略高。
通过制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化由KRN303-1和KRN304-4分泌的大多数蛋白并进行气相氨基酸序列分析。这些蛋白的N-末端顺序如下所示
KRN301-11510Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-15Ile-Thr-Arg-Ile-ProKRN304-415Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile这些结果表明由KRN301-1所分泌的凝乳酶相关蛋白没有氨基末端间隔区序列，而由KRN304-4所分泌的蛋白具有真正成熟的凝乳酶原氨基末端。
实施例8用淀粉葡糖苷酶信号肽由乳酸克鲁维酵母分泌t-PAA.组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂cDNA的克隆用与Pennica等人所述相似的方法(Nature(1983)301214)得到为组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂编码的cDNA。DNA序列分析和限制酶图谱证实了t-PAcDNA的真实性。为了研究表达，使用了2.0KbBglⅡ片段(见Pennica等人的方法)，该片段几乎含有成熟蛋白的整个编码区和3′端非编码区。
B.在pUC19中引入G418抗性标记将含有Tn5基因的DNA片段(Reisset.al.，EMBOJ.(1984)33317)插入到pUC19的SmaⅠ位点中(Yanisch-Perronetal.，Gene(1985)33103)，该片段在酿酒酵母醇脱氢酶Ⅰ(ADH1)启动子指导下具有对G418的抗性，这与Bennetzen和Hall在J.Biol.Chem.(1982)2573018中所述类似。得到的质粒pUCG418示于图14中。含有pUCG418的大肠杆菌已于1987年12月4日贮存在CBS，贮存号为CBS872.87。
C.pGBtPAl的构建用几个克隆步骤构建pGStPA1(见图15和表9)，其含有下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切开的pUCG418(见上);
(2)来自pGB901，含有乳糖酶启动子的XbaⅠ-SalⅠ片段;
(3)编码来自泡盛曲霉的淀粉葡糖苷酶信号序列的合成DNA(Inniset-al.，Science(1985)22821)。选择在起始密码子之前的序列除去位于乳糖酶启动子片段末端的SalⅠ位点，该序列还含有部分乳糖酶基因的5′端非编码区;
(4)来自t-PAcDNA的2.0KbBg1Ⅱ片段(见上述);
(5)含有部分乳糖酶基因的3′端非编码区的合成DNA。
表9质粒pGBtPA1的图示
蛋白质合成开始于划线的ATG密码子。
D.乳酸克鲁维酵母的转化和转化体的分析用实施例2所述方法转化具有pG Bt PA1的乳酸克鲁维酵母CB S2360菌株。在YEPD培养基中于30℃培养转化体和对照菌株CB S2360大约64小时。通过离心从培养转化体和对照菌株C B S2360大约64小时。通过离心从培养基中分离出细胞。将细胞重新悬浮于生理盐水中，OD610为300，以最大速度在涡流振荡器中加玻璃珠振摇3分钟破坏细胞。离心除去细胞碎片。
在微滴板中按照Wallen等人的方法(Biochem.Biophys.Acta(1982)719318)进行溶解凝块测定。制得一种含有15mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)，内含0.2CU/ml血纤维蛋白溶酶原，1.5mg/ml纤维蛋白原和0.04%明胶。在微滴板的各孔中使10μl凝血酶(13.9NIH单位/ml)，25μl样品和65μl血纤维蛋白溶酶原.纤维蛋白原溶液混合。反应完成后每30分钟测定一次OD450。在每个微滴板中，用来自黑素瘤细胞的t-PA(KabiVitrum)制得一条校正曲线。
表10表明10个转化体的典型分析结果。在用pGBtPA1转化的乳酸克鲁维酵母培养基中发现了t-PA。
表10来自CBS2360的培养物和来自用pGBtPA1转化的CBS2360培养物的溶解凝块测定转化体上清液中t-PA的活性140μg/l26μg/l3＜3μg/l4＜3μg/l525μg/l63μg/l73μg/l8＜3μg/l93μg/l10＜3μg/lCBS23601°)＜3μg/lCBS23602°)＜3μg/lCBS23603°)＜3μg/lCBS23604°)＜3μg/lCBS23605°)＜3μg/l
在某些细胞萃取物中t-PA的活性较低(≤3μg/l)。
在用血纤维蛋白溶酶原/纤维蛋白-琼脂糖凝胶覆盖的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，按照Granelli-Piperno和Reich的方法(J.Exp.Med(1978)也进行了分析。用乙醇使200μlCBS2360或用pGBtPA1转化的CBS2360培养物上清液沉淀并重新悬浮于20μl样品缓冲液(62.5mMTris-HCl，pH6.8，2%十二烷基硫酸钠，10%甘油，溴酚蓝)中。样品不用煮沸就可铺到凝胶上。结果(见图16)表明乳酸克鲁维酵母分泌出人t-PA。此外，可清楚地看到大多数所分泌的物质是糖基化的。
t-PA的分泌也用酶联免疫吸附法(ELISA)，用抗人t-PA的单克隆抗体(ESP5，购自Biopool)和通过产色活性测定(来自KabiVitrum的商业试验)得到了证实。
实施例9用来自人血清清蛋白的信号序列，由乳酸克鲁维酵母分泌t-PAA.pGBtPA2的构建用几个克隆步骤构建pGBtPA2(见图17和表11)，其含有下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切开的pUCG418;
(2)来自pGB901，含有乳糖酶启动子的XbaⅠ-SalⅠ片段;
(3)编码前人血清清蛋白原的合成DNA;
(4)来自t-PAcDNA的2.0KbBglⅡ片段(见实施例8);
(5)含有部分乳糖酶基因3′端非编码区的合成DNA。
表11质粒pGBtPA2的图示XbaⅠⅤ
蛋白质合成开始于划线的密码子。
B.乳酸克鲁维酵母的转化和转化体的分析如例8所述用pGBtpA2转化CBS2360。如前面例中所述步骤培养并处理转化体和对照菌株。溶解凝块测定的结果总结在表12。
表12用pGBtPA2转化的CBS2360和CBS2360培养物的溶解凝块测定转化体上清液中t-PA的活性125μg/l225μg/l3＜3μg/l4＜3μg/l56μg/l612μg/l7＜3μg/l8＜3μg/l9＜3μg/l10＜3μg/lCBS23601°)＜3μg/lCBS23602°)＜3μg/lCBS23603°)＜3μg/lCBS23604°)＜3μg/lCBS23605°)＜3μg/l在一些细胞萃取物中发现有少许t-PA活性(3＜μg/l)。
实施例10乳酸克鲁维酵母分泌人血清清蛋白A.HSA互补DNA的合成和克隆根据Okayama和Berg的方法(见Mol.Cell.Biol.(1982)2161)用人肝mRNA制备为人血清清蛋白编码的cDNA。将cDNA克隆到从pBR322衍生的载体中，并转化大肠杆菌。根据Lawn等人测得的HSAcDNA克隆的序列(见NucleicAcidsRes.(1981)96103)，用寡脱氧核糖核苷酸筛选转化体。测定所选cDNA克隆的部分顺序，将其与Lawn等人测定的序列比较。揭示出前HSA原编码区的头五个核苷取没有了，但编码区第9-15核苷酸的BstEⅡ点仍存在。这个在3′非编码区的BstEⅡ点和HindⅡ点(见Lawn等人，如上所述)用于在表达载体中再克隆。
B.构建pGBHSAl用几步克隆步骤即可构建pGBHSAl，其包括下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切开的pVCG418(见例8)。
(2)来自pGB901的XBaⅠ-SalⅠ片段(见实施例1);
(3)合成DNA(SalⅠ-HindⅢ片段)，包括乳糖酶基因3′端非编码区部分。这个片段的序列在表13给出。
表13pGBHSAl的SalⅠ-HindⅢ片段的序列
C.pGBHSA2的构建用SalⅠ和EcoRV切pGBHSA1，再插入一个合成DNA
下面划线的ATG码表示最终的表达构建物(pGBHSA3，见下面)中的起始码。
所得质粒被命名为pGBHSA2。
D.构建pGBHSA3用HindⅢ切HSAcDNA克隆，用KlenowDNA聚合酶Ⅰ将粘性端填平。再用BstEⅡ切DNA，纯化含几乎完整HSA编码区的BstEⅡ-HindⅢ(已填平)片段。用XhoⅠ酶解pGBHSA2，用KlenowDNA聚合酶Ⅰ填平粘性端，再用BstEⅡ酶解。在所得载体中。HSA编码片段CBStEⅡ-HindⅢ(已填平))被插入。得到的pGBHSA3质粒示在图18。
E.转化乳酸克鲁维酵母并分析转化体如实施例2所述用pGBHSA3转化乳酸克鲁维酵母菌爪2360。将转化株和对照株CBS2360于30℃，在YEPD培养基中培养64小时。离心，从培养基中分离细胞。从上清液取30μl样品，根据Laemmli方法(Natrue227，680(1970))在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析。图19所示结果说明HSA被用pGBHSA3转化的乳酸克鲁维酵母细胞分泌到培养基中了。还说明在产生HSA细胞中分泌的其它蛋白质量降低了。
上述结果说明在克鲁维酵母菌株中可获得外源基因高效，简便的表达。此外，凝乳酶原的结果表明克鲁维酵母菌株特别适用于提供各种蛋白质的高效表达和加工。提供的组建体和载体可在克鲁维酵母有效启动子的调控下引入外源基因并如上所述，连接到提供外源基因转移，特别是分泌的信号序列上。因此，发酵系统可商业化生产多种活性或可活性形式的外源蛋白。
下列微生物已于1987年6月30日贮存于美国典型培养物保藏中心并于1988年7月22日贮存于中国典型培养物保藏中心2UV21，ATCC登记号为20855，CCTCC号为M88068;KRN201-6，ATCC登记号为20854，CCTCC号为M88067;HB101pAB307，ATCC登记号为67484，CCTCC号为M88069;HB101pAB312，ATCC登记号为67484，CCTCC号为M88070。
虽然为清楚地理解上述发明已通过说明和实施例较详尽地作了描述，但在所附权利要求范围内显然可实行某些改变和修饰。
权利要求
1.在克鲁维酵母宿主中产生所需肽的方法，该方法包括将为所需肽编码的DNA序列引入该宿主细胞和在培养基中培养含有所述DNA的该宿主细胞，从而所需多肽或其部分分泌到培养基中。
2.根据权利要求1的方法，所述DNA序列构成DNA构建物的部分，它被引入宿主细胞，在转录方向包含在该宿主有功能的转录起始调节区;为所需多肽编码的所述DNA序列;和在该宿主细胞有功能的转录终止调节区。
3.根据权利要求1或2的方法，其中与所述宿主或所需多肽异源的，或对所述宿主和所需多肽均异源的信号序列，在读码顺序中连接于该DNA序列的5′端，从而该宿主细胞分泌所述多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项方法，其中所需多肽是一种酶。
5.根据权利要求4的方法，其中的酶是凝乳酶或其前体。
6.根据权利要求4的方法，其中所述酶是组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(t-PA)或其突变形式。
7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所需多肽是人血清清蛋白(HSA)。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述宿主细胞是克鲁维酵母的工业菌株。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或脆壁克鲁维酵母。
10.根据权利要求2的方法，其中所述DNA构建物进而包括至少一种选择标记，所述DNA序列的自主复制系统或一个转化效率加强序列。
11.根据权利要求10的方法，其中所述复制系统是自主复制系统(ARS)。
12.根据权利要求11的方法，其中所述自主复制序列是克鲁维酵母自主复制序列(KARS)。
13.根据权利要求10的方法，其中所述选择标记是抗G418的。
14.用克鲁维酵母作为宿主转化并表达外源基因，分泌该基因编码的多肽或分泌该多肽的一部分。
15.含有一个表达暗盒的转化的克鲁维酵母宿主细胞，该暗盒在转录方向含有该宿主中有功能的转录起始调节区，在读码顺序与编码所需肽的DNA序列连接的在宿主中有功能的信号序列，和在该宿主细胞中有功能的转录终止调节区。
16.根据权利要求15的细胞，其中所述信号肽是对该宿主细胞或所需多肽异源的，或对该宿主细胞和所需多肽都是异源的。
17.根据权利要求16的细胞，其中所述信号序列是酿酒酵母的α-因子信号序列。
18.根据权利要求16的细胞，其中所述信号序列是来自泡盛曲霉的淀粉葡萄糖苷酶信号序列。
19.根据权利要求15-18中任一项的细胞，其中所需的多肽是凝乳酶或其前体，tPA或HSA。
20.根据权利要求15-16中任一项的细胞，其中连接到所述表达暗盒上的是至少一个选择标记，一个该DNA序列的自主复制系统或转化效率加强序列。
21.根据权利要求20的细胞，其中所述的复制系统是自主复制序列(ARS)。
22.根据权利要求21的细胞，其中所述的自主复制系统是克鲁维酵母自主复制序列(KARS)。
23.根据权利要求20-22中任一项的细胞，其中所说选择标记对G418具有抗性。
24.克鲁维酵母宿主细胞所用的DNA构建物，包括在转录方向上，有一个在该宿主中有功能的转录起始调节区;在读码区与编码所需多肽的DNA序列连接的在该宿主中有功能的信号序列;在该宿主中有功能的转录终止调节区。
25.根据权利要求24的DNA构建物，其中所述信号序列是对所需肽或该宿主细胞异源的，或对该宿主细胞和所需肽都是异源的。
26.根据权利要求24或25的DNA构建物，进而包括至少一种选择标记，一个所述DNA构建物的自主复制系统或一个转化效率加强序列。
27.根据权利要求24-26中任一项的DNA构建物，其中的为信号序列和所需多肽编码的DNA序列在读码区与在克鲁维酵母中表达的一个基因融合。
28.根据权利要求27的DNA构建物，其中所述DNA序列在乳糖酶基团N端的至少四个氨基酸处与第二DNA序列融合。
29.质粒pKS105，pGB901，pGBTPA1和pGBHSA3。
30.根据权利要求1-13任一项的方法，其中所需肽或该肽一部分是从培养基中分离的。
全文摘要
克鲁维酵母宿主和用在该宿主的DNA表达暗盒用于转录内源和/或外源DNA，生产多肽，提高内源产物的产量或生产外源产物。克鲁维酵母宿主被发现有分泌所需多肽产品的特殊用途，其中信号序列可是该肽固有的，或来自内源或外源的信号序列，包括合成序列，它们在克鲁维酵母中都是有功能的。还提供了高效转化克鲁维酵母的转化步骤。
文档编号C12N9/34GK1040052SQ8810467
公开日1990年2月28日 申请日期1988年7月28日 优先权日1987年7月28日
发明者约翰尼斯·安·范·丹博格, 埃尔伯特·吉·范·欧扬, 克瑞恩雷特·弗尔德 申请人:吉斯特布罗卡德斯股份有限公司