专利名称：：玉米赤霉烯酮的液体发酵及提炼的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能够促进牛羊生长的物质-玉米赤霉烯酮(zearale-none)的生物合成及其提炼工艺，它是由镰刀菌属的玉米赤霉菌(Gibberellazeae)经发酵培养生成的。以前在利用药物增加牛羊的体重方面，只是将抗生素及激素掺入饲料中，或注入动物体内，使之增重，但并没有注意到所增加的蛋白质与脂肪的比例，以及人畜共用抗生素易造成大量抗药性病源微生物的富集，同时由于激素类药物的毒性及其在食物链中造成的副作用太大，所以这类促进生长的物质已逐渐被淘汰，禁用。1962年，美国在发霉的玉米上分离得到了能够合成玉米赤霉烯酮的玉米赤霉菌，并且通过发酵培养得到了玉米赤霉烯酮的结晶品，证明它是由玉米赤霉菌合成的一种次生代谢物质，它的化学结构式为由此结构可以看出，它没有性激素的典型类固醇核结构，联合国世界卫生组织(WHO)把它分类为非类固醇的代谢同化物质。它可以显著促进牛羊的蛋白质同化作用，使之增重，而且增加的是蛋白质而不是脂肪，同时，还可提高饲料转化率。之后，他们对原始菌株进行了诱变，得到了几株能够在固体或液体培养基中大量合成玉米赤霉烯酮的菌株，并对其生物合成条件及提炼工艺申请了美国专利，很快进入了工业化生产阶段，六十年代末推出玉米赤霉醇(zearalanol商品名称为Ralgro)-一种玉米赤霉烯酮的还原产物，经美国药物食品管理局(FDA)认可，用作牛羊增重药物，通过许多欧美国家大面积的推广使用，证明它是一种新型的、无副作用的、效果显著的促进牛羊生长增重的物质。本发明是通过对国内分离到的玉米赤霉菌野生菌株进行诱变、选育，获得一株能够在液体培养基中合成玉米赤霉烯酮的菌株，菌株编号D4-21。本发明填补了我国在生产及提炼玉米赤霉烯酮方面的空白。本发明特点D4-21菌株在改良察氏(Czapek)培养基(配方见表Ⅰ)上生长迅速，22°～25℃培养五天，菌落直径可达9厘米。菌落白色，呈绒毛状，产生紫红色可溶性色素，在此固体培养基上不产生孢子，在此液体培养基中(不加琼脂)可产生少量镰刀形孢子。表Ⅰ改良察氏(Czapek)培养基配方<tablesid="table1"num="001"><tablealign="center">种类百分含量(%)蔗糖3硝酸钠0.3磷酸氢二钾0.1硫酸镁0.05氯化钾0.05酵母浸出膏0.1琼脂1.5</table></tables>将D4-21菌株从冷藏斜面转接到改良察氏培养基斜面上活化，22°～25℃培养4-5天，挑取少量菌丝接种到液体改良察氏培养基中，上摇床培养2-3天(培养温度同上)，制成种子液。再将种子液接种到发酵培养基中(配方见表Ⅱ)在三角瓶或发酵罐中，22°-25℃培养基15-18天，即可合成大量的玉米赤霉烯酮。表Ⅱ发酵培养基配方<tablesid="table2"num="002"><tablealign="center">种类百分含量(%)葡萄糖18尿素0.27酵母浸出膏0.1磷酸氢二钾0.05硫酸镁0.025氯化钾0.25</table></tables>将经15-18天发酵所得的发酵液过滤，取其菌丝滤饼，加0.25%NaOH溶液浸泡1-2小时，再过滤，取其滤液，滤液用稀盐酸调PH到2-3，再加入乙酸乙酯萃取，萃取后的乙酸乙酯经浓缩得到玉米赤霉烯酮粗结晶，将此粗结晶脱色，再反复重结晶，即可得到玉米赤霉烯酮纯结晶。玉米赤霉烯酮为纯白色结晶，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂和碱性水溶液中，微溶于己烷、石油醚等溶剂，不溶于中性或偏酸性水溶液。溶点为164°-165℃。紫外吸收光谱中，最高吸收峰在236、274和313纳米处，此外，在253纳米的紫外光照射下，呈现兰绿色的荧光。玉米赤霉烯酮再经过加氢还原，将其还原产物α-玉米赤霉醇(Zearalanol)制成高3毫米直径2.5毫米的弹丸(每弹丸含量12mg)放入注射枪，即可埋植使用。牛的使用量为36毫克，毛重增重比对照高15%-20%;羊的使用量为12毫克，毛重增重比对照高5%-10%。并在牛羊的饲养过程中，使饲料转化率提高10%。本发明的生产实例从玉米赤霉菌D4-21菌株的冷藏斜面上取少量菌丝，接种于改良察氏培养基斜面上活化，22°-25℃培养4-5天，再取活化斜面上的少量菌丝接种于装有液体改良察氏培养基的三角瓶中，装量为三角瓶容积的五分之一，上摇床培养2-3天，培养温度同上，至此，制得种子液。将种子液接种于装有发酵培养基的三角瓶中，接种量1%-5%，放于转速为180转/分的摇床上培养15-18天(培养温度同上)，发酵过程结束。如将种子液接种于发酵罐中，发酵培养基和培养温度同上，搅拌速度为200转/分，通气量在发酵过程中在1∶0.3(vvm)和1∶0.8(vvm)之间调节，培养15-18天，终止发酵。玉米赤霉烯酮的提炼过程取1升发酵液过滤，所得菌丝滤饼用1000毫升0.25%NaOH溶液浸泡1-2小时后再过滤，所得滤液用稀盐酸调酸，终止PH为2-3，玉米赤霉烯酮即可沉淀下来，然后加入等体积的乙酸乙酯萃取;也可将发酵液过滤后的滤饼直接用乙酸乙酯或无水乙醇浸泡萃取。将萃取所得乙酸乙酯浓缩，可得到1.8克玉米赤霉烯酮粗结晶，将此粗结晶再溶于乙酸乙酯或无水乙醇中，脱色后重结晶2-3次，可得到1.6克玉米赤霉烯酮纯结晶。权利要求1.一种利用玉米赤霉菌(Gibberellazeae)D4--21菌株进行液体发酵生产玉米赤霉烯酮的工艺，该工艺包括D4--21菌株的种子培养工艺、发酵培养工艺以及玉米赤霉烯酮的提炼工艺。2.按权利要求1所述的种子培养工艺，其特点是D4-21菌株经活化，接种于含有3%蔗糖、0.3%硝酸钠、0.1%酵母浸出膏、0.1%磷酸氢二钾、0.05%硫酸镁、0.05%氯化钾的种子培养基内，22°-25℃，摇床培养2-3天。3.按权利要求1所述的发酵培养工艺，其特点是将种子液接种于含有18%葡萄糖、0.27%尿素、0.1%酵母浸出膏、0.05%磷酸氢二钾，0.025%硫酸镁、0.025%氯化钾的发酵培养基内，22°-25℃，摇瓶或发酵罐培养15-18天。4.按权利要求1所述的提炼工艺，其特点是将发酵培养所得的菌丝用0.25%氢氧化钠溶液浸泡，将过滤所得的滤液用稀盐酸调节PH到2-3，再用乙酸乙酯萃取，将萃取所得的乙酸乙酯浓缩，得粗结晶。5.按权利要求1和4所述的提炼工艺，其特点是将菌丝滤饼用乙酸乙酯或无水乙醇直接浸泡，将过滤所得溶媒浓缩，得粗结晶。全文摘要本发明提供了玉米赤霉烯酮的液体发酵及其提蟓生产工艺。玉米赤霉菌D4-21经活化、种子制备、发酵培养等过程，可产生大量的玉米赤霉烯酮。然后将发酵所得菌丝经碱溶解、酸沉淀、溶媒萃取或直接浸泡、浓缩、结晶等过程，最终可得到纯品。该物质具有促进牛羊蛋白质合成，并有提高饲料转化率的能力。文档编号C12P17/08GK1057860SQ90103159公开日1992年1月15日申请日期1990年7月4日优先权日1990年7月4日发明者李季伦,王秋旗,许春兰,王学燕,王滨申请人:北京农业大学农业生物学院