在发酵过程中由红曲霉属直接生产结晶色素的方法

专利名称：在发酵过程中由红曲霉属直接生产结晶色素的方法
《食品工艺》第49页(1986年7月)指出“消费者是首先以颜色来判断食品的质量的。”尽管应批评消费者这种更优先考虑直观感觉而不是考虑味觉及营养价值的态度，但是仍必须积极面对消费市场的这一看法。
虽然天然产生的色素被首先用作食品的着色剂，但是，化学的发展作为一种惩戒，导致很多合成染料(特别是苯胺类染料)排挤了天然产生的色素，而用作为食品添加剂。作为一类合成着色剂，它具有很多优点，例如在颜色的均匀性和再现性，颜色稳定性，无味性，和对氧化和/或热和/或光的稳定性等方面，都比天然产生的色素优越;它来源广泛，相对地不太受作物收成的影响。其结果是，合成着色剂的普及最终被理解了。
然而，随着消费者对食品添加剂更多的了解，及对某些有代表性样品的检验水平的提高，因而关心起这些合成着色剂的安全性了。最近几年，已经看到，过去用作食品色素的某些材料，全都不仅受到谴责，而且受到怀疑，甚至受到废除或者至少限制其使用。例如FD&C红2号及FD&C紫1号，在美国及其它国家已被禁用。由于从FD&C黄5号单独诱发多种过敏性反应，因此最近美国命令凡是用该染料染色的食品，必须在其产品标签上作出标记。其结果是，舆论开始再一次移向了作为食品添加剂的天然产生的色素。
由红曲霉属的真菌所产生的色素(一般由东方的大米来培植)是橙黄色的，相对地不溶于水，但是很容易和含有氨基的化合物进行反应，而生成水溶性的着色剂。红曲霉属色素作为一般的食用色素及酒和腐乳的色素，在东方已经使用几百年了。该色素也可作成水溶性的或者油溶性的，它在PH2～10的范围内是稳定的，并且对热稳定，而且可用高压灭菌器来灭菌。在东方各国，这种类型的微生物一般由大米粒来培养，而且一旦该大米粒被红色菌丝体所渗透，则将该大米细磨成粉末，而用作为食品着色剂。该橙黄色色素是红曲红素(monascorubin)和红色点状菌落(rubropunctatin)的混合物，其结构由Fielding等人在Tetrahedron Letter NO.5，24～7(1960)和Kumasaki等人在Tetrahedron，18，1171(1962)中作了说明。二者的结构不同，前者具有一个7碳酮基，而后者具有一个5碳酮基。为了本申请的目的，“前体物色素”指的是含有红曲红素和红色点状菌落的水不溶橙黄色色素的任何混合物，混合物是通过合适的红曲霉属的发酵来制备的。
前体物色素的工业化生产，需要适合的发酵方法的改进。近年来，已有很多报导涉及这一主题。Shepherd等人在美国专利U.S.4，145，254中通过使用两相的方法，作出了重要改进，其中该微生物首先在PH4～7的生长促进介质中进行培养，然后将其转移到其PH值为2～4的第2种介质中，以刺激前体物色素的生成。低的PH值并不影响前体物色素的生成，但是都能干扰在该介质中的随后与蛋白质的氨基和/或铵离子的反应。其结果是，排除了作为染料的橙黄色前体物色素的生成。另一例子是U.S.4，442，209，其权利要求是，通过在含有麦芽糖醇的介质中培养红曲霉属，而增加前体物色素的生成。
正如Shepherd等人所说的“希望工业上得到的色素具有完全可以测定的结构(该色素可进行严格的宽容度检验，并显示完美的可重现性)，首先应该研究的问题就是高纯橙黄色色素的高产率生成。”迄今介绍的所有方法中，在高纯度前体物色素的分离和离析方面都存在着严重的缺点。特别是在现有制法中，所生成的前体物色素都是以无定形、块状物的形式存在，而据信，这是某些类型色素-类脂结合的结果。该固体物质不能从菌丝体中分离出来，因为它被分配进入另一个相中了。前体物色素与真菌产生的类脂强烈结合，造成了色素萃取和纯化的极大困难、麻烦及费用大。在一种可能是典型的方法中，在菌丝体分离之后，用有机溶剂将色素产生介质进行萃取，或是用有机溶剂来萃取含有均匀菌丝体的生成介质，然后将溶剂蒸发以得到前体物色素的粗产品，接着将该粗产品进一步纯化，例如通过层析法和结晶法来进行。就纯前体物色素的产率及及生产费用而言，这样萃取-层析-结晶的方法是没有效果的，因为要使用溶剂来萃取色素，以及需要昂贵的能源从萃取液中蒸去溶剂，而且这不易于被用作连续的发酵方法，以连续地生成前体物色素。
虽然在由红曲霉属生产前体物色素中，还有其它需要注意的方面，例如得到适宜的突变体或得到另外的遗传改变的微生物等，但是本发明只瞄准前体物色素的生产，取消费用大的萃取方法。具体地说，业已发现，如在红曲霉属生产色素的发酵过程中，其介质含有某种外来的物质，则该前体物色素以结晶状来形成，其自身较纯，并且不与真菌产生的类脂相结合。同样重要的是，已经观察到这样形成的前体物色素晶体能容易地分配进入到一种油相，从而使其能很容易地从菌丝体和发酵介质中分离出来。本发明的理论基础尚不确定，但可能是某些物质起着生物调节剂的作用，该调节剂阻塞了类脂的合成，但不影响前体物色素的生成。不管其理论基础如何，这些生物化学调节剂的附加效果在于该前体物色素由细胞中被排泄出来，并很快地形成可以被收集的大的嫩橙黄色结晶，该结晶本身是相当纯的，并且通常在使用之前不需进一步纯化。基于这种发现的制法，用葡萄糖作为碳的来源，来有效地生产前体物色素，生成效率为7%，并且可以方便地用作连续发酵。正如将要认识到的，本方法与产生前体色素的特殊微生物和微生物赖以生长的介质皆无关系。
本发明的目的是提高由红曲霉属在发酵条件下生成的水不溶橙黄色色素离析的易行性及效率。一种具体实施包括在含有结晶色素诱导物(其数量足以有效地诱导结晶色素的生成)的色素产生培养介质中培养红曲霉属。在特殊的实施例中，该诱导物是一种液态植物油。在另一具体的实施方案中，该结晶诱导物是棕榈酸的聚(氧乙烯)山梨糖醇酐酯。在另外的更为具体实施方案中，该诱导物是棕榈酸的聚(氧乙烯)山梨糖醇酐酯，其存在于产生色素的培养介质中的量为大约0.1%至大约1%重量，其它实施方案通过下面的叙述将会明白。
构成本发明基础的观察结论是，当红曲霉属在生成色素的培养介质中生长时，以及当该介质中含有某种添加剂时，则色素可以被诱导而生成结晶。所生成的结晶色素，不与菌丝体相结合，这种情况与本发明的不含有结晶诱导物的情况相反，因此色素可以相当简单地收集起来而予以分离，不必对均匀的发酵培养液进行萃取。其结果是，基于这一观察结果的本制法，使得以明显低于过去成本而更有效地分离色素变得可能了，另外，在进行色素分离时，该方法不杀死红曲霉属真菌细胞，从而提供了重复利用细胞的机会，也提供了一种连续生产色素的方法。
需要强调的是，本发明的关键之处在于由生成了前体物色素的发酵培养液直接生产结晶的前体物色素。本发明的添加剂并不诱导色素的生成，而是在发酵过程中当它生成时即诱导之，使其结晶，因此本发明的成功与所用的特殊红曲霉属无关，而且也没有任何联系，只要红曲霉属能生产足够的色素，使其超过其在发酵介质中的溶解极限就可以了。特殊的红曲霉属对例如前体物色素的产生数量和产生速度方面有影响，然而不影响结晶前体物色素的生成。
长期以来人们就知道，红曲霉属可用于制备一种代谢物，即水不溶的橙黄色色素(红曲红素和红色点状菌落的混合物)。在本申请中，此色素称作为前体物色素。可以使用任何能产生其数量超过其在生成培养介质中溶解极限的前体物色素的红曲霉属。为了所有实用目的，这种需要就是在生成色素的条件下，每1升应该至少生成30毫克前体物色素。适用的红曲霉属可以从各种来源中方便地得到，例如，Lin在〔J.Ferment.Technol.，51，407(1973)〕中已经描述了由高粱白兰地(Koaliang brandy)的粬(沉积物)得到的多种离析物。相同的离析物可以很容易地从用红曲霉属霉菌着色的东方发酵食品如红米、红米酒、红豆干酪等中得到。Lin还报导由几种来源所得到的以类型培养液公开提供的物种。在他们的分类研究中，Hawksworth和pitt在〔Aust.J.Bot.，31，51(1983)〕已经鉴定了多种离析物，它们之中的许多种，都可由保藏处得到，或者易于由东方发发酵食品中离析出来。
上述中需要指出的是，适宜的红曲霉属菌株广泛存在，也即它们中的多数可以由保藏处得到，而且更能由东方的发酵食品中常规地离析出来。因此，为适应更合适地生产前体物色素的要求，在本发明的实施中，所用的红曲霉属，只是从任何人都容易得到的大量菌株中选择。尽管如M.purpureus，M.major，M.rubinginosus及M.Anka一类品种已列作为前体物色素的生产者，但是Hawksworth和pitt的分类研究工作认为，这些菌还需进行再分类。
如Shepherd等人在U.S.4，145，254中所指出的，在完全抑制第二种代谢物(例如前体物色素)的条件下红曲霉属可以生长。因此，本发明的目的在于必须使红曲霉属在生产色素的培养介质中生长。在本发明中，在色素生长过程中，产生色素的培养介质的PH需要在约2至约4之间。一种通用色素生成培养介质可以含有KH2PO4(1～100mM)，MgSO4(0.1～10mM)，NaCl(1～10mM)，FeSO4(0.01～1.0mM)，以及NH4Cl或KNO3(1～20mM)。几种碳水化合物可以用作为色素生产中的碳源和能源，其浓度为0.1～40%，而且还可以包括复杂的碳水化合物，例如淀粉，二糖类(例如蔗糖或乳糖)，及单糖类(例如葡萄糖或果糖)，而最好的基质物是葡萄糖。
红曲霉属在适宜的介质中生长以生成前体物色素是众所周知的，本发明与现有技术的区别之处在于，生成前体物色素的培养介质含有添加剂(结晶色素诱导剂或诱导物)，该添加物可以有许多类型，其中之一是聚(氧乙烯)山梨糖醇酐酯类，其成员一般以其商标吐温(Tween)而为人们所知晓。特别是吐温20，吐温40和吐温80已被发现非常有效，不仅可以诱导结晶色素的生成，而且还可以诱导大晶体(即至少为10微米长的晶体)的生成。所有的前述吐温都是酯的混合物，其脂肪酸组分包括棕榈酸。吐温的使用浓度低至约0.01%重量仍然有效，但是推荐其使用浓度至少约为0.1%重量及高达约1%重量。也可以在培养介质中使用较高百分浓度的吐温，虽然这并不具有任何明显效果。当使用吐温来作为结晶诱导物时，和本发明的其他结晶诱导物一样，必须对培养介质进行良好的混合，以保证所用的结晶诱导物获得充分的分散。
另外一类的结晶诱导物是由液态植物油所组成，特别是玉米油和豆油，也包括下述物料，如棉子油，棕榈油，花生油，葵花子油，红花油，芝麻油，油菜子油和橄榄油，虽然这些植物油当其加入量是培养介质的大约0.1%重量至约10%重量时是有效的，但是所生成的结晶常常比较小，即小于10微米长。由于这些植物油不溶于发酵介质中，因此生成乳浊液，该乳浊液在色素生长的过程中，影响了真菌的良好通风性。另外，这些油在发酵过程中会部分地水解而成为游离的脂肪酸，此脂肪酸在油中形成不溶的薄膜。最后，该色素有时会溶于液态植物油中，在收集结晶时，一部分色素(有时是很大一部分)就会被损失掉。这些特性使得液态植物油的使用不够理想，而宁愿使用吐温来作为结晶色素诱导物。
第三类结晶色素诱导物由甘油三酯组成。用甘油三醋酸酯，甘油三花生酸酯，甘油三丁酸酯，甘油三亚油酸酯，甘油三棕榈酸酯，甘油三硬脂酸酯得到勉强可以的较小结晶。另外，甘油三油酸酯，甘油三棕榈酸酯及甘油三岩芹酸酯都可以导致较大结晶的生成，因此这些材料或它们的任意结合，被特别推荐用在本发明的实施中。可以预料，如果甘油三酯中的脂肪酸基团是棕榈酸、棕榈油酸、油酸或岩芹酸的任意结合，都可能是有效的结晶色素诱导物。
在结晶前体物色素的制备中，该红曲霉属一般在含有一定量结晶色素诱导物的生成色素培养介质中生长，该诱导物在一般的生长条件下可以诱导结晶色素的生成。这些生长条件包括温度为大约20到35℃之间，时间为约2至30天。如上所述，必须很好地进行混合以保证诱导物的分散，也必须使培养介质有良好的通风以保证真菌的继续生长。然而加入结晶诱导物时，除了要进行充分混合外，不附加其它要求，可是以前并未认识到把它用于以红曲霉属发酵来制备前体物色素的方法。经过适当的发酵过程之后，该结晶色素可以用适当的方式来收集。
下述实施例仅仅说明了本发明，而绝不是以任何方式作为对本发明进行限制。
实施例Ⅰ红曲霉属的离析红曲霉属真菌很容易从中国的发酵食品中离析出来，所用的这种特殊微生物由当地中国餐馆中的福建(Fukien)型红色酱油样品中分离而得。为了离析每种菌落，可将此红色浆液置于固态西瑞糖和淀粉(5%)介质上(该介质含有1%的
蛋白胨、1.5%的琼脂)划出界线。产生红色色素的每种真菌菌落再在相同的介质中进行无性繁殖，所产生的最红色的离析物(其颜色是由颜色强度来判断)被选择用于所有下一步的试验中。
红曲霉属的典型发酵方法将上述红曲霉属真菌保持在琼脂斜面上，该琼脂斜面包含(以每升介质计)酵母抽出物(3克)，麦芽浸膏(3克)，细菌胨(5克)，葡萄糖(10克)及琼脂(15克)，该斜面用红曲霉属真菌进行接种，在30℃培育2周。在这些条件下，真菌制备出稳定的有性孢子，后者可以在4℃下贮存数月。
斜面被用来接种一种约100ml的培养液生长介质，此培养液含有(以每升计)葡萄糖(40克)，酵母抽出物(10克)，KH2PO4(3克)，和0.1～10毫升的吐温-40。在生长介质中吐温40可以防止细胞诱导色素的合成，使真菌以分散的菌丝体而生长。该培养物于30℃在250ml的烧瓶中培育，以每分钟200次的转数摇荡，时间为一周。
将上述培养液培养物的接种物的10%，用于接种1～20升的，色素产生介质，后者含有(以每升介质计)KH2PO4(1克)，MgSO4·7H2O(0.5克)，NaCl(0.5克)，FeSO4·7H2O(0.1克)，NH4Cl(0.5克)，葡萄糖(40克)及适合的结晶色素诱导物。培养物在28℃在通气下被进行接种，时间一般为2周。在这些生长条件下，介质的发酵液使PH值降至约3.0，色素生成。当在发酵介质中的葡萄糖消耗净尽及大量色素已经生产出来之后，则收集此前体物色素结晶。
实施例Ⅱ用吐温生产结晶色素在如实施例1中所说的由发酵红色大米离析出来的红曲霉真菌，在发酵介质中长大，该介质含有1%重量的作为结晶诱导物的各种吐温。其结果示于表1。表中标出的“大”结晶表示此结晶至少为10微米长，“小”结晶表示此结晶长度在10微米以下。
表1 用不同吐温化合物诱导结晶生长诱导物 结晶生长3天 17天吐温20 结晶少，结晶小 结晶多，结晶大吐温40 结晶少，结晶大 结晶多，结晶大吐温60 结晶少，结晶小 结晶少，结晶小吐温80 无结晶 结晶多，结晶大实施例Ⅲ液态植物油作为结晶诱导物上述的红曲霉属，在实施例1所说的生长介质中生长。该介质含有不同用量的液态植物油。其结果总结在表2中。当使用1.0%重量的植物油时，表现出良好的通风性，而真菌在装有培养物的摇荡烧瓶中生长。
表2 用不同植物油诱导结晶生长油(重量5) 结晶生长9天 17天玉米油(1.0%) 结晶少，结晶小 结晶多，结晶小玉米油(10.0%) 无结晶 无结晶豆油(1.0%) 结晶少，结晶小 结晶多，结晶小豆油(10.0%) 无结晶 无结晶实施例Ⅳ甘油三酯作为诱导物按上述两个实施例，使红曲霉属生长，但要将1%重量的各种甘油三酯添加到生长介质中。
表3 用不同的甘油脂肪酸酯诱导结晶生长甘油三酯 结晶生长4天 12天甘油三醋酸酯 无结晶 结晶少，结晶小甘油三花生酸酯 无结晶 结晶少，结晶小甘油三山萮酸酯 无结晶 无结晶甘油三丁酸酯 结晶少，结晶小 结晶少，结晶小甘油三癸酸酯 无结晶 无结晶甘油三己酸酯 无结晶 无结晶甘油三辛酸酯 无结晶 无结晶甘油三-11-花生酸酯 无结晶 无结晶甘油(三)反油酸酯 无结晶 无结晶甘油三芥酸酯 无结晶 无结晶甘油三月桂酸酯 无结晶 无结晶甘油三亚油酸酯 无结晶 无结晶甘油三亚麻酸酯 无结晶 结晶少，结晶小甘油三肉豆蔻酸酯 无结晶 无结晶甘油三油酸酯 结晶少，结晶小 结晶多，结晶大甘油三棕榈酸酯 结晶少，结晶小 结晶少，结晶小甘油三棕榈油酸酯 结晶少，结晶小 结晶多，结晶大甘油三岩芹酸酯 结晶少，结晶小 结晶多，结晶大甘油三硬脂酸酯 无结晶 无结晶对比实验 无结晶 无结晶
权利要求
1.一种由红曲霉属诱导生成结晶前体物色素的方法，该红曲霉属在色素生成培养介质中生成前体物色素，其特征在于该红曲霉属在含有结晶色素诱导物的色素生成培养介质中生长，该诱导物的量应能有效地诱导结晶色素的形成。
2.按照权利要求1的方法，其进一步的特征在于该红曲霉属是从由M.anka，M.purpureus，M.major及M.rubiginosus所组成的一组中选择的。
3.按照权利要求1的方法，其进一步的特征在于该结晶色素诱导物是棕榈酸的聚(氧乙烯)山梨糖醇酐酯。
4.按照权利要求1的方法，其进一步的特征在于该结晶色素诱导物是一种液态植物油。
5.按照权利要求1的方法，其进一步的特征在于该结晶色素诱导物是棕榈酸，油酸，棕榈油酸，及岩芹酸的甘油三酯，或者是它们的任意结合。
6.按照权利要求1的方法，其进一步的特征在于结晶色素诱导物是至少含有一种酸成分的甘油三酯，该酸成分选自由棕榈酸，油酸，棕榈油酸，及岩芹酸所组成的一组。
全文摘要
结晶前体物色素的生成是在含有红曲霉属的色素生成培养介质中，通过添加有效的结晶色素诱导物而直接制得的。通过在培养介质中直接诱导生成结晶色素而实质上改进了作为红曲霉属的第二种代谢物所产生的水不溶橙黄色色素分离的难易程度及成本，棕榈酸的聚(氧乙烯)山梨糖醇酐酯特别有效，并且可以导致大结晶的生成。另外一类的结晶色素诱导物是液态植物油，不过它一般导致较小的结晶。
文档编号C12N1/14GK1056711SQ90103080
公开日1991年12月4日 申请日期1990年5月21日 优先权日1989年6月15日
发明者爱德华·J·圣马丁 申请人:美国环球油品公司