专利名称：稳定的固定化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定化技术，涉及一种对诸如环糊精糖基转移酶(CGTase)、葡糖淀粉酶(GA)、β-淀粉酶、β-葡糖苷酶(GD)和β-半乳糖苷酶对碳水化合物的作用而能增加至一定程度稳定性的固定化酶。
如今对碳水化合物作用的酶广泛地用于化学工业上。例如CGTase是一般用于商业规模上从淀粉中生产环糊精的酶。环糊精是生产笼形包含的化合物所必需的物质。以改善药物的稳定性或掩盖发出气味的物质。因此，将CGTase稳定化的技术是具有极高的工业意义。
GA和β-淀粉酶系日常使用的用于从淀粉中生产葡萄糖或麦芽糖，因此，使GA和β-淀粉酶稳定化也有极大的意义。
此外，β-葡糖苷酶是一种在木材糖化中起重要作用的酶并已试图得到稳定的产物等级。
最近在酶反应技术中已取得了显著的进展，得到了“载然相反”的感觉，特别与较早的包括酶解反应在溶液相内进行的常规方法相比较，固化酶技术已成为可能且可带来较好的效果，使酶反应有效地进行且酶用量可以减少。
许多专利申请已公开了关于在固定酶方法中使用聚氨基葡糖珠。例如，日本公开专利Kokai Tokkyo Koho第63-196290号揭示了包括在多孔聚氨基葡糖珠上固定环糊精糖基转移酶，然后再用交联剂处理珠的技术。
人们对上述酶的有效使用已作了大量的研究。但是，就酶本身稳定性而言，研究总是不能令人满意。在酶被使用时它们逐渐失去了它们的活性。例如，在普通条件下CGTase在几天后失去了其一半的最初活性，在相当于几个二十天后几乎变得无活性了。
甚至对固定化酶而言，一旦它们失去了活性就没有办法只得补充新鲜部分。同时，本发明者以前已发现在相当少量能稳定酶的特定物质(下面称为“稳定剂”)存在下进行酶反应时，该技术问题可得到较好的解决(日本专利申请第033481/1989)。
上述技术确实认识到了酶的稳定性，但由于在酶反应中稳定剂必须以能与酶呈接触的状态进量，故要求这类稳定剂的进料量相当大。此外，在反应完全后必须从反应混合物中回收稳定剂。
本发明的目的是解决上述的技术问题。
本发明提供了一种稳定的固化酶，它包括一种载体，对碳水化合物作用且可固定于所述载体上的酶，以及一种能与所述酶一起固定在所述载体上的酶稳定剂。
本发明者首次制备了有上述构成的固定化酶。
下面详细阐述本发明的构成。
在本发明中使用的载体可以是任何适合于使对碳水化合物作用的酶固定的载体，在这之中包括聚氨基葡糖珠(它一般是当今用来生产固定化酶)、琼脂糖树脂和多孔的刚性合成树脂。所述的树脂可呈珠或扁平膜状组成的形式。
作为可用于本发明的聚氨基糖珠的典型品位，可提及的是Chitopeael BCW-1000系列的聚氨基糖珠(从Fuji Spinning Co.买到)。
本发明中使用的琼脂糖树脂，可提及的是琼脂糖凝胶6B(Pharmacia)。
能用于本发明的刚性合成的多孔树脂的例子可提及从日本Organo Co.中买到的称为EF-4611和EF-4612的亲水性多孔聚合物。
在本发明的实际使用中，首先使载体与交联剂反应使在载体表面形成活性连接位点，然后使这里特定的酶固定在所述载体的所述位点上，即在交联剂的末端上。
根据本发明的一个方面，稳定剂和酶可同时被固定在载体的交联剂末端上。
根据本发明的另一方面，也可以首先使酶固定在载体的交联剂末端，然后再使稳定剂固定在载体的交联剂末端，反过来也可以。
所采用的交联剂是环氧乙烷和其它含有环氧化物的碳链以及其它一般用来制备固定酶的交联剂，例如戊二醛等。
当CGTase作为酶的例子时，例如，通过在适当温度下(例如室温)将适当载体(例如聚氨基糖珠)加至适当的碱性溶液内(例如0.6N氢氧化钠)，然后使适当交联剂(例如环氧乙烷)加至适当浓度(例如与碱等当量)，在适当温度(例如8-50℃)下使所得混合物轻摇适当的时间(例如1-4小时)，过滤混合物，用水洗涤载体，在水中或适当的缓冲液内(例如0.025M乙酸盐缓冲液，pH6.0)的载体中加入有适当浓度(例如1-500mg/ml)的CGTase溶液和同时加入适当的稳定剂(例如葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇)加至适当浓度(例如0.9-1g/ml)，使所得混合物轻摇一段适当时间(例如1-48小时)，然后使混合物过滤，固相用水洗涤，这样可产生本发明的稳定的固定化酶。
本发明者首先建立了上述方法。
作为特别适用于本发明中的稳定剂例子，可提及下式化合物及其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氢、低级烷基、羟基烷基、苯烷基、苯链烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基链烯基或苯氧基炔基，这里每个苯基部分可以是取代苯基或未取代的苯基，X是氢或为轴向或平展的羟基。
例如用日本专利公开第56-099195、60-2038、61-2076和62-242691号揭示的方法可制备现有技术已知的式[Ⅰ]化合物。
上述的葡萄糖低聚物衍生物可由下列代表
其中R的定义同上，n是0-24的整数，式[Ⅰ]和式[Ⅱ]中R表示的低级烷基是，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
羟烷基中的烷基部分可含有1-5个碳原子。
苯烷基的烷基部分可含有1-5个碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基，苯链烯基的链基部分可含有2-5个碳原子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯炔基的炔基部分可含有2-5个碳子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯氧烷基的烷基部分可含有1-5个碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基。
苯氧链烯基的链烯基部分可含有2-5个碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
苯氧基炔基的炔基部分可含有2-5个碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
除了上述的α-环糊精外，本发明所使用的稳定剂也可包括半乳糖氧化酶试剂(galactostatin)及其衍生物等。
根据本发明为了酶的稳定化，可以提出的固定化可这样进行，例如使每克载体吸附1-50mg酶，且相对于每克载体，稳定剂的存在量是10μg。稳定剂的适当用量视预期的目的而定。
作为下面给出的实施例中，本发明中稳定剂的用量比常规方法中的用量要少得多，这是本发明的一个特征。
图1表示试验实施例1中所得的稳定性试验结果[●，本发明实施例1中所得物质的数据;○，是用相同的方法但未加入脱二氧亚胺基葡糖醇制备的物质的数据(作为比较);纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图2表示试验实施例2所得的结果。[●，本发明实施例1中所得物质的数据;○，用相同方法但未加入脱二氧亚胺基葡糖醇制备所得物质的数据;纵轴，残留活性百分率;横轴，温度(℃)]。
图3表示试验实施例3中所得的结果。[●，本发明实施例2中所得物质的数据;○，用相同的方法但未入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇比制备所得物质的数据;(作用比较);纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图4表示试验实施例4中所得的结果。[●，本发明实施例2中所得物质的数据;○，用相同的方法但未加入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇而制备所得物质的数据，纵轴，残留活性百分率;横轴，温度(℃)]。
图5表示试验实施例5所得的结果。[●，本发明实施例3中所得物质的数据;○，用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇制备所得的物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图6表示试验实施例6所得的结果。[●，本发明实施例4所得物质的数据;○，用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇制备所得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图7表示试验实施例7的所得的结果[●，本发明实施例5所得的物质的数据，○，用相同方法但未加入N-(2-羟乙基)脱二氧亚胺基葡糖醇所制得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图8表示试验实施例8所得的结果。[●，本发明实施例6所得物质的数据;○，用相同方法但不加入α-环糊精所制得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图9表示试验实施例9所得的结果。[●，本发明实施例6所得物质的数据;○，用相同方法但不加入α-环糊精所制得物质的数据;纵轴，残留活性百分率;横轴，温度(℃)]。
图10表示试验实施例10所得的结果。[●，根据本发明实施例7所得物质的数据;○，用相同方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得物质的数据;纵轴，残留活性百分率;横轴，温度(℃)]。
图11表示试验实施例11所得的结果。[●，根据本发明实施例8所得物质的数据;○，用相同方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得物质的数据;纵轴，残留活性百分率;横轴，温度(℃)]。
图12表示试验实施例12所得的结果。[●，根据本发明实施例9所得物质的数据;○，用相同的方法但不加入1-脱氧半乳糖氧化酶试剂(1-deoxggalactostatin)所制得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图13表示试验实施例13所得的结果。[●，根据本发明实施例9所得物质的数据;○，用相同的方法但不加入1-脱氧半乳糖氧化酶试剂所制得物质的数据;纵轴，残留活性的百分率;横轴，温度(℃)]。
图14表示试验实施例14所得的结果。[●，根据本发明实施例10所得的物质的数据;○，用相似的方法但不加入1，4-dideoxy galaetosatin 1，4-二脱氧半乳糖氧化酶试剂所制得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横轴，时间(小时)]。
图15表示试验实施例15所得的结果。[●，根据本发明实施例10所得物质的数据;○，用相同方法但不加入1，4-二脱氧半乳糖氧化酶试剂所制得物质的数据;纵轴，残留活性的百分率;横轴，温度(℃)]。
图16表示试验实施例16所得的结果。[●，根据本发明实施例11所得物质的数据;○，用相似方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得物质的数据;纵轴，溶液的光密度;横纵，时间(小时)]。
图17表示试验实施例17所得的结果。[●，根据本发明实施例11所得物质的数据;○，用相同方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得物质的数据;纵轴，残留活性的百分率;横纵，时间(小时)]。
下列实施例进一步阐述了本发明的稳定化的方法。
参比实施例1环氧活化的琼脂糖珠将琼脂糖6B放在玻璃滤器内并抽吸过滤，使滤器上的物质抽吸干燥。向10克这样干燥的琼脂糖内加入10毫升环氧乙烷(Alolrich)和10ml 0.6N氢氧化钠。在室温下使混合物轻轻振摇16小时以进行反应。回收珠并用水充分洗涤。这样所得的珠可用作环氧活化的琼脂糖珠。
参比实施例2环氧活化的聚氨基糖珠将聚氨基糖珠(ψ1.5mm，10ml)放在玻璃滤器内并用水充分洗涤。将环氧乙烷(10ml)和10ml 0.6N氢氧化钠加至珠内，在室温下使混合物轻轻振摇16小时。用该方法进行反应后，珠用水充分洗涤，它可用作环氧活化的聚氨基糖珠。
实施例1向3克环氧活化的琼脂糖珠中加入15ml 0.1N氢氧化钠并再加入60mg脱二氧亚胺基葡糖醇。在40℃下使混合物轻轻振摇1小时，然后在玻璃滤器用水充分洗涤珠并使之分散于15ml水中，加入60mg粉末状β-葡糖苷酶(从杏仁中获得，δ)，在40℃下使混合物轻轻振摇20小时以进行反应。最后所得的结合有脱二氧亚胺基葡糖醇和β-葡糖苷酶琼脂糖珠充分用水洗涤。
实施例2将环氧活化的琼脂珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇(2克)和40mg β-葡糖苷酶(δ)，在40℃下使混合物轻轻振摇20小时。用玻璃滤器通过过滤回收珠并用水充分洗涤。
实施例3将环氧活化的琼脂糖珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇(500mg)，和30mg葡糖苷酶(由酒曲菌雪白根霉菌中获得的;Seikagku Kogyo)，在室温下使混合物轻摇20小时，然后在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
实施例4
使环氧活化的聚氨基葡糖珠(15ml)分散于10ml水中。向分散液中加入葡糖淀粉酶(从曲霉菌中获得;Glncozyme NL-3，Amano Pharmaceutical)(50μl)和500mg脱二氧亚胺基葡糖醇。在室温下使混合物轻摇20小时。反应后，在玻璃滤器上收集珠并用水充分洗涤。
实施例5使环氧活化的聚氨基葡糖珠(5ml)分散于5ml 0.1N氢氧化钠中，将1gN-(2-羟乙基)脱二氧亚胺基葡糖醇加至分散液内，在40℃下使混合物轻轻振摇20小时以进行反应。在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。将这些珠分散于5ml水中，向分散液中加入1ml葡糖淀粉酶(Amano Pharmaceutical)，在室温下使混合物轻轻振摇16小时以进行反应，在玻璃滤器上收集珠并用水彻底洗涤。
实施例6向5克环氧活化的琼脂糖珠内加入50ml 0.1N氢氧化钠以分散珠，使3克α-环糊精溶于分散液中，在40℃下使所得的分散液轻轻振摇24小时。在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤，然后分散于10ml水中。将葡糖淀粉酶(30mg;Seikgaku Kogyo)溶于分散液中，在40℃下使混合物再轻轻振摇20小时以进行反应，然后在玻璃滤器上收集并用水充分洗涤。
实施例7将环氧活化聚氨基葡糖珠(10ml)加至10ml 1N氢氧化钠中，使10克葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇溶于分散液中，在40℃下使混合物轻轻振摇16小时。珠在玻璃滤器上充分洗涤并分散于氢氧化钠水溶液调至pH10的10ml水中，加入10ml CGTase(从芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌中获得，Hayashibara Biochemical Labs)，在40℃下使混合物轻轻振摇6小时。反应后，在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
实施例8
将环氧活化的聚氨基葡糖珠(10ml)加入至10ml水中，将2.5克葡糖基-N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇溶于该分散液中，再加入0.3毫升CGTase，在40℃下使所得的混合物轻轻振摇16小时以进行反应。然后在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
实施例9将环氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入5ml水中，使250mg 1-脱氧半乳糖氧化酶试剂(l-deoxygalclostatin)和20mg β-半乳糖苷酶(从酒曲菌中获得;Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物轻轻振摇16小时以进行反应。然后在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
实施例10将环氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml水中，使500mg1，4-二脱氧半乳糖氧化酶试剂(1，4 dideoxyalaetostatin)和20mgβ-半乳糖苷酶(Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物轻轻振摇16小时以进行反应。然后在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
实施例11将环氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml 0.1N氢氧化钠中进行分散。使葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇溶于分散液中，在370℃下使所得的混合物轻轻振摇16小时以进行反应。在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。向珠内加入β-淀粉酶萃取液[5ml;用70ml水萃取10g β-淀粉酶＃500而制得(Amano Pharmaceutical)]，在室温下使混合物再轻轻振摇16小时以进行反应。然后在玻璃滤器上回收珠并用水充分洗涤。
用如下的方法来评估本发明的稳定的效果。本发明的珠和对照珠的各自用量是这样的，即在一般被推荐用来分析酶活力的样品在37-40℃温度下进行测定，两种珠显示出基本相同程度的活性，同时再将珠转移至高温环境中后，和相应的珠样品比较各自活性损失情况。
试验实施例1将根据本发明实施例1所得的物质(50mg)和用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的200mg物质(对照)各自放在相应的试管中并各自分散在10ml 0.12M水杨苷溶液1在0.1M乙酸盐缓冲液，pH5.0)。在58℃下培养，间隔一定时间重复取样，用葡萄糖氧化酶方法分析释放出来的葡萄糖。所得的结果如图1所示。它表明本发明的物质的热稳定性优于对照物质的热稳定性。
试验实施例2将根据本发明实施例1所得的物质(25mg)和用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的40mg物质(对照)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入750 μl 0.1M乙酸盐缓冲液，pH5.0)。使试管加热到40℃-75℃范围内几个特定温度中的一个温度并加热30分钟。加热后，让试管冷却到室温，向每个试管中加入250 μl 0.12M水杨苷(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)。在30℃下反应30分钟后，用葡萄糖氧化酶方法分析释放出来的葡萄糖，以及在40℃下加热处理后所得颜色强度的百分率称为“残留活性的百分率”。这样所得的数据制成如图2所示的图。它表示本发明的物质对热是稳定的。
试验实施例3将根据本发明实施例2所得的物质(20mg)和用相似方法但不加入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的120mg物质(对照)各自放在相应的试管中且各自分散于10ml 0.12M水杨苷溶液中(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)。在58℃下进行培养，间隔一定时间重复取样，用葡萄糖氧化酶方法来分析释放出来的葡萄糖。所得的结果制成如图3所述的图。它表明本发明的物质在热稳定性方面比对照的优越。
试验实施例4将根据本发明实施例2所得的物质(6mg)和用相同方法但不加入N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的60mg物质(对照)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入750 μl 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.0)，使每个混合物在40℃-75℃范围内几个特定温度中的一个温度下加热30分钟，然后冷却到室温。向每个试管中加入250 μl 0.12M水扬苷溶液(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)，让反应在30℃下进行30分钟，用葡萄糖氧化酶方法分析释放出来的葡萄糖，在40℃下热处理后所得的颜色强度百分率作为“残留活性的百分率”。所得的数据制成如图4所示的图。它表明本发明物质是热稳定的。
试验实施例5将根据本发明实施例3所得的物质(60mg)和用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇而制备的1mg物质(对照)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入200 μl 0.021M对-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0)，在55℃下进行培养。过了一定时间后，向每个试管中加入2ml 0.1M碳酸钠，将混合物在2，000rpm下离心1分钟，在400nm下测定上清液的光密度。这样所得的结果如图5所示。它表示本发明物质是热稳定的。
试验实施例6将本发明实施例4所得的物质(100格令)和用相同方法但不加入脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的物质(对照)(1格令)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入200 μl 0.021M对-硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0)，在60℃下进行培养。过了一定时间后，向每个试管中加入2ml 0.1M碳酸钠并在400nm下测量光密度。这样所得的数据制成如图6所示的图。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例7将根据本发明实施例5所得的物质(3格令)和用相同方法但不加入N-(羟乙基)脱二氧亚胺基葡糖醇而制得的物质(对照)(2格令)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入200 μl 0.021M对-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.5)并在63℃下进行培养。过了一定时间后，向每个试管中加入2ml 0.1M碳酸钠，上清液用水适度稀释，并在400nm下测量光密度。用该方法所得的数据制成如图7所示的图。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例8将本发明实施例6所得的物质(1.5mg)和用相同方法但不加入α-环糊精而制得的3mg物质(对照)各自放在相应试管内，向每个试管中加入200 μl 0.021M-对硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸盐缓冲液(pH6.0)并在55℃下进行培养。过了一定时间后，向每个试管中加入20ml 0.1M碳酸钠，所得的混合物在2，000rpm下离心1分钟。在400nm下测定上清液的光密度。这样所得的结果制成如图8所示的图。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例9将根据本发明实施例6所得的物质(10mg)和用相同方法但不加入α-环糊精而制得的20mg物质(对照)各自放入相应试管内，向每个试管内加入1ml 0.05M乙酸盐缓冲液(pH4.6)，使每个混合物在40-70℃范围里几个特定温度中一个温度下加热30分钟，然后冷却到室温。向每个试管中加入1ml 10%麦芽糖溶液。让反应在40℃下进行20分钟，然后加入2ml 0.1氢氧化钠，从所得溶液中取出100 μl部分，用葡萄糖氧化酶方法分析释放出来的葡萄糖，在40℃下热处理后所得的颜色强度的百分率作为“残留活性百分率”。这样所得的数据如图9所示。这表明本发明物质是热稳定的。
试验实施例10
将根据本发明实施例7所得的物质(2格令)和用相同方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇来制得的物质(对照)(10格令)各自放入相应的试管中，向每个试管中加入500 μl 0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.2)。使每个试管在几个特定温度(60℃-75℃)的一个温度下加热30分钟，然后冷却至室温。向试管中加入250 μl α-环糊精溶液(20mM)和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸盐缓冲液中的溶液(pH4.5)以及加入250 μl葡萄糖淀粉酶[通过使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.5)中而制得]。使反应在40℃下进行30分钟，用葡萄糖氧化酶方法来分析释放出来的葡萄糖。在40℃下热处理后所得的颜色强度的百分率被作为“残留活性的百分率”。这样所得的数据被制成如图10所示的图。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例11将根据本发明实施例8所得的物质(500格令)和用相同方法但不加入葡糖基-N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得的物质(50格令)各自放相应的试管中，向每个试管中加入500 μl 0.05M磷酸盐缓冲液(pH6.2)，使每个试管在几个特定温度(60℃-75℃)下的一个温度下热加30分钟。然后冷至室温。向每个试管中加入250 μl α-环糊精(20mM)溶液和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸盐缓盐液(pH4.5)中的溶液250 μl以及250 μl葡萄糖淀粉酶溶液[通过使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸盐缓冲液(pH4.5)中而制得了]。让反应在40℃下进行30分钟，用葡萄糖氧化酶方法分析释放出来的葡萄糖。在40℃下热处理后所得的颜色强度百分率被称为“残留活性百分率”。这样所得的数据如图11所示。这表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例12
将根据本发明实施例9所得的物质(1格令)和用相同方法但不加入1-脱氧半乳糖氧化酶试剂，所制得的物质(对照)(1格令)各自放在相应的试管内，向每个试管中加入1.5ml 0.02M邻-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)使每个混合物在65℃下培养，经过一定时间后，向每个试管中加入2ml 0.2M碳酸钠。根据所形成的颜色强度，使对照混合物进一步用水稀释10倍。在420nm处测定光密度。这样所得的结果如图12所示。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例13将根据本发明实施例9所得的物质(1格令)和用相同方法但不加入1-脱氧基半乳糖氧化酶试剂。所制得的物质(对照)(1格令)各自放入相应的试管中，向每只试管中加入1.5ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.0)，使每只试管在(50-70℃)的几个特定温度中的一个温度下加热30分钟，然后冷至室温。向每个试管中加入500 μl 0.02M邻-硝基苯基 β-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)，让反应在37℃下进行15分钟。向每个试管中加入0.2M碳酸钠(2ml)在420nm处测定其光密度。在50℃下热处理后所得的颜色强度的百分率作为“残留活性的百分率”。所得的结果如图13所示。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例14将本发明实施例10所得的物质(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脱氧半乳糖氧化酶试剂所制得的物质(对照)(1格令)各自放入相应的试管内，向每个试管中加入500 μl 0.02M邻-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)和15ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.0)。使每个试管在65℃下培养，经过一定时间后，向试管内加入2ml 0.2M的碳酸钠，在420nm处测定其光密度。在光密度测量前根据所产生的颜色深度，用水使对照样品稀释10倍。这样所得的结果如图14所示。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例15将本发明实施例10所得的物质(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脱氧基半乳糖氧化酶试剂所制得的物质(对照)(1格令)各自放入相应的试管中，向每个试管加入1.5ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.0)，使每个试管在(50-70℃)的几个特定温度中的一个温度下加热30分钟，然后冷却至室温，向每个试管中加入500 μl 0.02M邻-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸盐缓冲液中，pH5.0)。让反应在37℃下进行15分钟后，向试管中加入2 μl 0.M磷酸钠，在420nm处测量其光密度。在50℃下热处理后所得的颜色强度的百分率被作为“残留活性百分率”。所得的结果如图15所示。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例16将本发明实施例11所得的物质(2格令)和用相同的方法但不加入葡糖基二氧亚胺基葡糖醇所制得的物质(10格令)(对照)各自放在相应的试管中，向每个试管中加入2.5ml 0.02M乙酸盐缓冲液(pH4.8)和2.5ml 10%可溶性淀粉溶液。在65℃下进行培养，每间隔一定时间取出50 μl部分的样品，向每个样品中加入3，5-二硝基水杨酸溶液(500 μl)使混合物在沸水浴中加热5分钟，用水冷却，接着再加入5ml水。经充分搅拌后，在535mm处测量所得混合物的光密度。这样所得的结果如图16所示。它表明本发明的物质是热稳定的。
试验实施例17将本发明实施例11所得的物质(5格令)和用相似方法但不加入葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇所制得的物质(对照)(10格令)各自放入相应试管内，向每个试管中加入250 μl 0.02M乙酸盐缓冲液(pH4.8)在(50-75℃)的几个特定温度中的一个温度下加热30分钟，然后冷却至室温。向每个试管中加入250 μl 1%可溶性淀粉溶液，然后再在30℃下加热30分钟以进行反应。然后向混合物中加入1ml 3，5-二硝基水杨酸溶液，使混合物在沸水浴上加热5分钟。用水冷却后，加入4.5ml水，充分搅拌所得的混合物，在53mm处测量光密度。在50℃下颜色强度的百分率是被作为“残留活性的百分率”。这样所得的数据制成如图17所示的图。它表明本发明的物质是热稳定的。
权利要求
1.一种稳定的固定化酶，其特征在于它包括载体、对碳水化合物作用且固定在所述载体上的酶以及能稳定所述的酶的物质，共同地固定在所述载体上。
2.根据权利要求1所述的一种稳定的固定化酶，其特征在于其中的稳定物质是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氢、低级烷基、羟烷基、苯烷基、苯烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基烯基或苯氧基炔基，这里每个苯基部分可以是取代的苯基或未取代苯基，X是氢或是轴向的或平展的羟基。
3.根据权利要求1所述的一种稳定的固定化酶，其特征在于其中的酶稳定物质是α-环糊精。
全文摘要
本发明涉及一种稳定的固定化酶，它包括载体、对碳水化合物作用且固定在所述载体上的酶以及能稳定所述酶的物质，共同地固定在所述载体上，其中的稳定化合物是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物。
文档编号C12N11/00GK1051587SQ9010888
公开日1991年5月22日 申请日期1990年10月31日 优先权日1989年11月1日
发明者丸尾重昭, 宫崎克憲, 山田直义, 江连洋治 申请人:日本新药株式会社