肝细胞癌致癌基因的制作方法

专利名称：肝细胞癌致癌基因的制作方法
技术领域：
本发明总的来说，涉及一种肝癌细胞的蛋白质，具体地说本发明涉及一种致癌蛋白质，它是肝癌细胞的一种放大的基因表达产物。本发明还涉及到编码这种致癌蛋白质的核苷酸片段、包含这种片段的重组分子和用它转化的细胞。本发明还涉及到检查病人体内肝癌存在的方法以及在此基础上的药盒。
流行病学表明人类的某些癌症和其他疾病的发生与几种DNA病毒有很密切的病因学相关性。这些病毒包括颈部癌症(HPV16)和疣状表皮发育障碍中(HPV3和8)的乳头状瘤病毒;非洲淋巴瘤中的EB病毒;和人肝细胞癌中的乙型肝炎病毒(HBV)(Beasley et al，InVyas GN，Dienstag J.L，Hoofnagle JH，eds。“病毒性肝炎和肝脏疾病”Orlando，FL，Grune and Stratton，1984，209-224)。这些发现，以及逆转录病毒的感染如HTLV-1在成熟的T细胞中白血病的相关性表明传染性病毒在上述人类肿瘤和疾病的发病机理中可能起着转导因子的作用。
根据该机制，相信传染性病毒是通过与宿主细胞DNA进行DNA重组而产生影响的。哺乳动物基因组中含有某些基因(被称为致癌基因前体)，在被转移到急性转化逆转录病毒基因组中时，它能获得致癌性质(Bishop，Ann.Rev.Biochem.1983，52301;Bishop，Cell 1985，4223)。在特定的人类癌症中(如，T24和EJ人膀胱癌)，已经证实鉴定出的转化基因(H-ras-1位点)与Harvey鼠肉瘤病毒的V-ras H有关。在致癌基因前体和致癌基因中，该ras族已经被完全表征，并且对在人类肝瘤中的活化和表达进行了研究。当一种致癌基因前体经过点突变(如C-rasH)或者重排(如n-myc)，这种改变可以引起分化和生长过程中细胞调节的丧失，并且最终产生致癌性。
最近，从人(Mahlavu)肝细胞癌中得到的一种转化DNA顺序，hhcM已被鉴别并且被分子克隆成为一种大片段的部分片段(Yang et al，J.Gen.Virol.1982，6325;Yang et al，Environmental Health Perspectives 1985，62231)。从另外几种人肝细胞癌中分离出一些对NIH/3T3细胞适度转化活性显示为零的，hhCM相关DNA克隆。已经有两种被部分地表征，它们是从Mahlavu肝细胞癌中得到的适当地细胞-转化基因(hhCM)和一种从正常人体肝脏DNA中分离的，推断的细胞同系物(C-hhC)它不具有细胞转化活性。已经表明了二种hhCM和一种Korean hhCK3的分子克隆与C-hhC的生物活性特征并加以比较(Yang et al，白血病 1988，2(12增刊)102S)。观察了hhCM序列在来源于2个中国人，1个非洲人和17个朝鲜人肝细胞瘤的几种基因组DNAS中的放大反应，并且与在相同肝细胞瘤中整合的HBV DNA序列的分布进行了比较，以便对hhCM的可能的作用提供一些了解。
本发明涉及到一种肝细胞癌特异的癌蛋白和一种编码这种蛋白质的核苷酸顺序。本发明还涉及到利用该癌蛋白(或它的特异抗体)和核苷酸顺序进行诊断和筛选的方法(在此基础上建立的药盒)。
本发明的一个目的是提供一种肝细胞癌蛋白和一种编码它的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种肝细胞癌的存在和肝脏癌前或病理状态的诊断检查。
该技术中的熟练人员通过下面的描述可以清楚地知道本发明的其它目的和优点。
在一个优选方案中，本发明涉及到一种编码了

图1中的氨基酸序列或该序列的一种等位基因变异体或该序列的一个特定部分的DNA片段。
在另一个优选方案中，本发明涉及一种重组体DNA分子，它们含有ⅰ)一种载体，和ⅱ)上述DNA片段在另一个优选方案中，本发明涉及到用上述重组DNA分子转化的宿主细胞。
在另一个优选方案中，本发明涉及到与上述DNA片段充分互补并与之杂化的一种核苷酸片段。
在还有一个优选方案中，本发明涉及到一种具有图1中氨基酸序列或该序列的一种等位基因变异体或该序列的一个特定部分的蛋白质。
在另一个优选方案中，本发明涉及到上述蛋白质的特异抗体(多克隆的和/或单克隆的)。
在另一个优选方案中，本发明涉及到一种产生上述蛋白质的方法，包括在可以表达DNA片段的条件下培养一种用上述重组DNA分子转化的宿主细胞，从而产生该蛋白质;并分离该蛋白质。
在另一个实施例中，本发明涉及到一种检查样本中上述蛋白质存在的检查方法，包括ⅰ)在可以使抗体与蛋白质结合的条件下将样本与该蛋白质特异性抗体接触，从而形成一种复合物;和ⅱ)检测该复合物的存在。
在另一个实施例中，本发明涉及到一种检查样本中存在编码上述蛋白质的核苷酸序列的方法，包括ⅰ)在可以进行杂化反应的条件下将样本与该核苷酸序列充分互补的核苷酸片段接触，使它们发生杂化，从而形成一种复合物;和ⅱ)检测该复合物的存在。
在另一个实施例中，本发明涉及到一种病人肝细胞癌存在的诊断方法，包括ⅰ)将从病人的生物学样本与上述抗体在使得抗体与样本中蛋白结合的条件下进行接触，从而形成一种复合物;和ⅱ)检测这种复合物的存在。
在另一个实施例中，本发明涉及到一种诊断病人肝细胞癌存在的方法，包括ⅰ)将从病人的细胞样本中获得的核酸序列与上述核苷酸片段在可以进行杂化反应的条件下接触，从而形成一种复合物;和ⅱ)检测这种复合物的存在。
在另一个实施例中，本发明涉及到用于检查样本中存在上述蛋白质的一种诊断药盒，它包括一种盛有该蛋白质特异性抗体的容器。
在另一个实施方案中，本发明涉及到一种用于检查一种核酸序列的存在的诊断药盒，这种核酸序列编码了一种具有图1所描述的氨基酸序列或该序列的一种等位基因变异体，或它的一个特定部分的蛋白质，这种药盒包含有一个盛有上述核苷酸片段的容器。
图1表示hhCM的完整核苷酸序列，和一种编码了其开放阅读框架中的52，000道尔顿蛋白质的氨基酸序列。
图2表示产生hhCM52KD蛋白质的hhCM-LaCZ嵌合质粒的结构。
图3表示结合到从人肝细胞癌(Mahlavu)，人正常肝和从鼠(NIH/3T3)成纤维细胞中制备的大分子量DNAs上的黄曲霉素B1环氧化物。
图4表示用一种改良的Maxam-Gilbert定序法来识别在hhCM(PM-1)DNA中的AFB1环氧化物结合的dG。在一旁列出了核苷酸序列。左侧的谱带表示对应于全部四种6脱氧核苷酸和AFB1-dG的梯形谱带;右侧的另外三个谱带中只给出了天然dG和AFB1-dG。在全部时间过程中aG＝AFB1结合的dG;0G＝不与AFB1反应的dG;而0G＝适度优选的dG。
图5表示在含有pJZ102的大肠杆菌细胞中产生的蛋白质的动态分析。将质粒pJZ102和对照质粒pJZ101在大肠杆菌细胞中进行培养，直到细胞密度的Klett读数达到80，此时，加入诱导剂、IPTG(最终浓度，10-3mol)，以激活从lac启动子开始的转录，制备嵌合hhCM-lac 52-KD蛋白质。在特定时间取一毫升培养物样品，通过离心沉淀，并使之溶解，然后在Laemmli缓冲液中煮沸使蛋白质变性。取各种样本等量的等分试样，通过参考文献中所述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行分析(Somerville等人，Structural and
Organizational Aspects of Metabolic Regulation;UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，New Series，Vol.133，R.181-197.New Yovk;Alan R.Liss Inc.1990)。这些谱带代表(a)在时间为0时的pJZ102+ITPG;(b)在时间为0时的pJZ102-ITPG;(c)在时间为20小时的PJZ102-ITPG;其它分别是在30分钟时(d)、4小时(e)，7小时(f)和20小时(g)的pJZ102+ITPG。在0时(a′)、30分钟(b′)，4小时(e′)、7小时(f′)和20小时(g′)时pJZ102转化的大肠杆菌细胞+ITPG的暗背景显微图。预先染色的分子量标记(m)以KD计算是130(顶部的浅色谱带)，94，75，50，39，27，17。
图6A和6B表示在细菌中产生的纯化的hhCM融合蛋白质p52(图6A)和一种多克隆抗-p52IgG的特异性(图6B)。图6A表示细菌表达的p52的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。嵌合hhCM-lac融合蛋白质的细菌表达的全部条件如图5所述。谱带d，e，和e′代表被IPTG诱导的带有pJZ102的大肠杆菌细胞(以各种各样的量)的总细胞提取物，而谱带f代表带有pJZ101的大肠杆菌细胞的阴性对照的总细胞提取物。谱带a(5μl)，b(15μl)和c(1μl)代表用于免疫兔子的凝胶纯化的p52的不同量。谱带m代表预先染色的分子量标记，以KD计为75，57，50，39，27，17。
图6B代表一种多克隆抗-p52的反应活性。通过对兔子进行免疫可以产生抗-p52多克隆IgG。用惯用技术、用SDS聚丙烯酰胺凝胶纯化的p52在各为0.8到1.0mg的量对新西兰白兔进行免疫。给予两次辅助加强注射。将去垢剂(0.2%SDS)溶解的相当于0.2ml封装的人肝癌细胞(1/3V/V)的样本，包括Mahlavu肝细胞癌、Hp3p21.7和HPG2，pBrpM-1转染的BRL-1肿瘤细胞以及对照BRL-1细胞和p52以每种10μl加到样品孔中，并使之扩散，与多克隆抗-p52IgG进行交叉反应过夜。在48小时时记录结果。
图7表示与32P-hhCMDNA进行的DNA-DNA杂化反应。
本发明涉及到一种由于肝细胞癌的核苷酸序列转化而编码的致癌蛋白以及这种转化序列本身。本发明还涉及这种癌蛋白的特定部分(即至少5个氨基酸)，和编码这种多肽的核苷酸序列(片段)。本发明还涉及与上述核苷酸序列(片段)充分互补的核苷酸片段，这种片段被用作为探针来检查这种核苷酸序列(片段)的存在。本发明也涉及到用于检查温血动物肝细胞癌(和肝脏的癌前或病理状态)存在的诊断和筛选方法。
本发明的这种癌蛋白是一种与肝癌特异相关的肝癌细胞的放大基因表达产物。这种蛋白质可以具有图1所给出的完整顺序，在这种情况下它被称为hhCM。这种蛋白质也可以具有与图1所给分子特性(如免疫学特性)基本相同的分子的氨基酸序列(加图1序列的等位基因形式)。另外，本发明的这种蛋白质(或多肽)可以具有与图1所给序列的某一特定部份(或它的等位基因形式)相一致的氨基酸序列。
该蛋白质可以基本纯化的形式存在，也就是基本上不含有肝脏内通常结合在一起的蛋白质和核酸。本发明的癌蛋白，包括用相应的mRNA在无细胞的提取物中制备的和用重组技术制备的，可以使用现有技术中的已知方法纯化。可用本领域的已知方法将这种癌蛋白或它的特定部份用作为一种抗原来产生它的单克隆和多克隆抗体。
在另一实施方案中，本发明还涉及到如上所述的编码了图1所给完整氨基酸序列(图1所给的具体的DNA序列只是一个实施例)，或它的任何特定部份的核苷酸序列(片段)(包括cDNA序列)。本发明所涉及的核苷酸序列还包括那些编码了具有与hhCM多肽基本相同特性(如免疫学特性)的蛋白质(或多肽)的序列(例如图1的等位基因形式的氨基酸顺序)。本发明还涉及到与上述核苷酸序列(片段)充份互补并与之杂化(如在严格条件下)的核苷酸片段。
在另一个实施方案中，本发明涉及到一种包括一种载体和一个如上所述核苷酸序列(片段)(最好是一种编码了图1所示分子或具有其特性的分子的DNA序列)的重组分子。这种载体可以是一种病毒或者一种质粒载体。该序列可以存在于这种载体中并能被可操纵地连接到调节元件，包括例如一种启动子(如LacZ启动子)上。这种重组分子适用于转化原核或真核细胞，最好是蛋白酶缺乏大肠杆菌细胞。
本发明一种重组分子的具体实例如图2所示。在该实例中，通过合适的重组DNA操作，用原核生物LacZ表达/翻译序列加上11个氨基酸的密码子来取代hhcMp52KD的原始的N-末端18个氨基酸的密码子，从而将hhcM核苷酸序列置于一个嵌合结构中(Yang et al.Proc.of the XIV Inter.Symp.Sponsored by the International Association for Comparative Research onLeukemla and Related Diseases Nov.1989(Vale，Colorado))。在lacZ启动子的驱动下，所得到的嵌合基因在一种蛋白酶缺乏大肠杆菌突变体中于30℃下进行高水平表达。在另一个实施方案中，本发明涉及一种用上述重组分子转化的宿主细胞。该宿主可以是原核生物(例如，细菌(最好是大肠杆菌))、低级真核生物(即真菌，包括酵母菌)或高级真核生物(即哺乳动物，包括人类)。可以利用本领域的已知方法进行有效地转化。这些转化的宿主细胞即可作为上述核苷酸序列的来源(这些序列构成重组分子的部份)。如果重组分子是一种表达系统的形式(见上述具体结构)，这种转化细胞即可作为癌蛋白的来源。
本发明的癌蛋白和核酸顺序既可以用于研究(如促进对肝细胞癌为什么以及怎样发生的理解)，也可以用于临床，例如诊断(和/或筛选)肝细胞癌(以及肝脏的癌前或病理状态)的存在和/或发展。
可以使用抗本发明癌蛋白(或它的特定部分)的抗血清或单克隆抗体(用已知技术产生)来完成上述的诊断/筛选方法。例如，这种诊断方法可以采取免疫检测的形式用于高度怀疑肝细胞癌的病人(如慢性肝炎患者)和/或肝癌地理位置高发区(如中国江苏省的启东区)人群的尿或血清样本。这种筛选免疫检测可以是简单的浸棒型法，该方法是粘在棒上的抗原/抗体对中的一种成员与样本中的另一成员结合时，出现颜色改变(这种浸棒型检测方法用于各种不同的结合对已被描述)。这种简单的试验可以容易和广泛地用于不容易得到分析电泳仪(用于检查病人血清中的甲胎蛋白含量，该含量水平目前用来筛选和诊断肝细胞癌的存在)的地区的人群。
本发明的诊断方法也可以是一种包括了利用抗本发明蛋白质或多肽的抗体而进行的组织化学诊断检查。为了能够更准确地诊断肝癌，该试验可使用冷冻或预先固定的肝脏薄切片样本。
本发明的诊断方法也可以用作为与本发明的部份核酸顺序充份互补并与之杂化的核酸探针，这种探针可用于例如，在时间合适的限制酶消化的基因组DNA进行电泳后，检查内源性序列的存在，该探针可以用例如32P标记，以便进行检测。
本发明还涉及用来实现上述方法的诊断/筛选药盒。这种药盒可以包括例如本发明癌蛋白(或多肽)的上述特异性抗体，或者，也可以包括上述核酸探针，以及完成该检查所必须的任何辅剂(例如，缓冲液，可检测的标记物，酶底物等)。
在下列非限制性实例中，本发明被进一步详细地描述。
在下面的实施例中参考了下列方案hhCM分子克隆化用HindⅢ限制性核酸内切酶，按照下述方法，对从人体正常肝脏和Mahlavu(非洲人)肝细胞癌(HHC)中纯化的基因组DNA进行完全消化。(为了克隆HHC DNA序列还尝试使用了其他的限制性核酸内切酶，包括BamHI，EcoRI和PstⅠ，从HHC和肝脏DNA中分离基因组DNA片段，而用这些手段分离的克隆在转染过程研究方面是不成功的)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将〔3H〕黄曲霉毒素B1(AFB1)-环氧化物结合的(如下所述)和未结合的DNA样本分离成180个组份。测定每μg DNA的〔3H〕AF1B-环氧化物特异性。将具有明显〔3H〕AFB1-环氧化物特异活性的组分用于如下所述的对NⅠH3T3细胞进行DNA转染测定。识别那些能够显示阳性细胞转化的阳性聚焦组份，并平行地将未结合DNA的组份联结到pBR322，pBR325和/或Puc8质粒DNA的HindⅢ位点上进行分子克隆化，使其进行如其他文献所描述的大肠杆菌HB101细胞的转化。(Yang et al.，J.Gen.Vivol.1982，6325)。对所得克隆的初级选择是根据(1)对四环素的敏感性，和/或与含有该质粒的半乳糖苷酶编码序列的Lacz操纵子的破坏相关的颜色改变;和(2)在有或没有AFB1结合的NIH3T3细胞的转染测定中细胞的转化能力;(3)在对从人Alu序列中制备的〔32P〕探针(Lawn et al.，Cell 1978.151157)和〔32P〕标记的HindⅢ切割的MAH、HHC、DNA片段进行的菌落杂交反应和DNA-DNA杂化反应中人类序列的存在;和(4)〔3H〕AFB1-环氧化物与该DNA的结合。通过包括〔3H〕AFB1的结合、NIH3T3细胞的转染测定和对〔32P〕Alu和〔32P〕HindⅢ MAH，HHC，DNA探针的DNA-DNA杂化反应在内的这些四联技术的运用，对30，000个克隆进行筛选后，可以分离出三个克隆，一个特定3.1Kb DNA限制片段构成了该hhcMDNA。
质粒DNA和AFB1结合的制备用于这些研究的克隆一直被称为PM-1。通过Holmes方法，即快速加热法，然后以180，000×g转速通过CsCl2-溴化乙锭等密度离心20小时来制备质粒DNA(Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor，N.Y.1982)。通过异丙醇提取和用TEN缓冲液彻底透析，去除溴化乙锭，纯化带状PM-1 DNA。一般可以获得每5ml培养物25到50μg总质粒DNA的产率。通过用HindⅢ核酸内切酶消化PM-1 DNA，然后进行琼脂凝胶电泳，并电洗脱该分离的3.1Kb谱带。将3.1Kb hhcMDNA从PUC8DNA和其他污染物中分离出来。将所得到的3.1Kb hhcMDNA进行同源纯化，并将其用于AFB1激活实验。
也可以将hhcM3.1Kb DNA克隆到一个除了带有新霉素对抗基因外还带有一种鼠逆转录病毒(Moloney)LTR，SV40启动子和部份T抗原的pSVneo载体当中。当被转染到细胞中时，这种克隆，rpMpN-1，以非常高的水平进行表达，并且对于转染测定具有特别的优越性。
从Morales实验室，可以获得大约15Ci/mmole特异性的〔3H〕AFB1。通过HPLC将其进一步纯化到同源化。所得到的〔3H〕AFB1单峰具有9，250cpm/pmole的特异活性。它可以与从肝微粒体新鲜制备的或者通过用如前所述的氯代过苯甲酸和二氯甲烷进行化学过氧化反应而新鲜制备的混合功能氧化酶一起用于激活反应(Bennett et al.，Cancer Res.1981，41650;Garner et al.，Chem.Biol.Interact.1979，2657)。通过动态分析对〔3H〕AFB1环氧化物与大分子量HHC或质粒DNA的结合进行监测(Yang et al.，Environmental Health Perspective 1985，62231 and Modali and Yang，Monintoring of Occupational Genotoxicants PP.147-158(1986))。对每个时间点采取的样本用氯仿冲涤去除未结合的〔3H〕AFB1环氧化物，在将〔3H〕AFB1-DNA再次溶解在Tris-EDTA-NaCl(TEN)缓冲液中之前用乙醇进行沉淀，用于转染测定或序列分析。
细胞组织培养和转染测定将6到11代NIH/3T3细胞和用于转染测定的Buffalo鼠肝脏细胞(BRL-1)保持在含有10%热灭活胎牛血清，青霉素(50单位ml-1)和链霉素(25μg ml-1)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中，置于37℃，5%CO2的环境中。
按照如前所述的方法进行DNA转染(见Yang et al.1985 and Modali and Yang 1986，上文已参考)。通过细心地滴定DNA-磷酸钙复合物的混合物的PH曲线可以获得最佳条件，通常发现PH6.75可以保证良好的复合物沉淀。
组织培养细胞和癌组织DNA和RNA的制备按照其他文献所述的方法以组织培养细胞和癌组织中提取和纯化全部大分子量(HMW)DNA。(Yang et al.，1985，上文已参考)。对这样纯化的HMW DNA进行蛋白酶K消化，用苯酚-甲酚，氯仿-异戊醇、乙醚和乙醇-NaCl沉淀进行第一次有序化学纯化，然后进行RNase消化和第二次有序化学纯化。然后用TEN缓冲液对纯化的DNA进行透析以便用于实验。按照前面所述的方法，从组织培养细胞中提取和制备总RNA(Maniatis et al.，1982，上文已参考)。通过用寡dT纤维素(Collaborative Research，MA.)柱洗脱进行亲和分离来获得富RNA的多聚腺核苷酸。
肿瘤发生将从转染的细胞培养物中通过克隆柱方法或终端洗脱方法克隆出的转化细胞进行扩大，并以104到106个细胞的剂量接种到无胸腺Swiss nu/nu小鼠皮下。对该激发小鼠体内的肿瘤发生进行密切监测。
核苷酸序列分析和靶位点致突变运用“酶学”1980，65499中的标准Maxam-Gilbert方法和Sanger(M13)双脱氧定序法(Maniatis et al.，1982，上文已参考)对hhcM3.1Kb和通过靶位点致突变产生的变异体进行核苷酸定序。
用实用生物系统寡聚核苷酸合成仪来合成带有定靶为dG…
T突变体的20聚物的特定寡聚核苷酸序列。在产生的突变克隆中用这些序列作为模板，按照Amersham(Arlington Hts.IL)提供的方法，运用Amersham的寡聚核苷酸控制体外系统产生突变DNA克隆，通过核苷酸定序来验证该突变克隆的DNA。通过对NIH/3T3细胞转染测定中细胞转化的增强和对用BRL园点印迹法在转染细胞中RNA的表达来分析这些靶位点致突变DNA的效果(Bethesda Research Laboratovy，Rockville，MD)。
实施例1AFB1结合的剂量和在NIH/3T3细胞中hhCM细胞转化能力的增强使AFB1环氧化物与从人肝细胞癌、人肝脏和小鼠NIH/3T3细胞中制备的大分子量DNA进行有效结合(图3)。每个结合动力学的起始率非常快。在结合反应一分钟之后，AFB1一环氧化物与人正常肝脏或肝癌DNA以及鼠NIH/3T3细胞DNA结合的速度则出现显著差异。MAH HHC DNA比正常肝脏DNA表现出较快的结合速度，并且全部dG靶位较早地变得饱和。而AFB1环氧化物结合的正常肝脏DNA的速度较慢，但是全部dG最终以稍低水平饱和。人DNA比鼠NIH/3T3细胞表现出较高的AFB1结合水平。发现在这些大分子量双链DNA中，总的AFB1特异活性，即AF1B-dG加合，大约是每10个核苷酸有一个dG结合。这种总特异性也要考虑到大分子量DNA二级或三级结构的存在。与这种观点一致的发现是AFB1环氧化物与线性3.1Kb双链hhcMDNA的结合为每104个核苷酸有4到8个dG结合。这种较高的结合能力反映了在线性双链PM-1DNA中AFB1环氧化物可以相对容易地与dG结合，而且不能与大分子量天然双链DNA的AFB1-dG结合物形成率相比。
正如从表1所述的实验中所见，在一种有限的剂量测定法表明AFB1环氧化物与dG的结合使hhCM的细胞转化能力增加了10到20倍。
表1 PM-1DNA 在NUB/3T3细胞转化中的AFB1剂量依赖性激活DNA来源 AFTB1毫微微摩尔聚焦数//100ng DNA 100ng DNAhhcM(PM-1) 0 15×10-1C-Ha-ras-1 0 465C-K-ras-1 0 0c-hhc 0 0(人肝脏同源染色体)E.coli 0 0hhcM(PM-1) 0 15×10-1hhcM(PM-1) 5 1814 2624 6635 3c-hhc 0 08 015 030 040 0AFB1结合与转染测定如方法中所述。数据计算以每100ng为基础。在未结合的hhcMDNA测定中，用500ng至1.5μg的DNA进行转染测定以获得NIH/3T3细胞的合理聚集形成。以50至500ng DNA的范围进行AFB1一环氧化物结合DNA的转染。将数据标准化以表明AFB1一环氧化物激活对hhcM细胞转化能力的增强。
观察到未结合的PM-1在转化NIH/3T3细胞时的效率一般是大约15FFU/μg DNA，而AFB1环氧化物激活的PM-1DNA的理想转化率是66FFU/100ng DNA，增加了20倍。这种增强作用的原因可考虑由于非特异性诱变带来的。在合适的对照实验中表明，在相同剂量测定法中，正常肝脏或大肠杆菌DNA的活性缺乏激活任何细胞转化的能力，因此早已排除了这种增强作用是由于扩散到细胞中的游离AFB或AFB1结合物的再环化所致(Yang et al.1985，上文已参考)。而且在用从c-rask-1或c-hhc中得到的AFB1激活的DNA实验中，以一种hhcM的正常人体肝脏同源染色体作为合适的对照物，没有获得NIH/3T3细胞的细胞转化。这表明了AFB1环氧化物激活的PM-1DNA不是一种随机的现象。再者，PM-1DNA在细胞转化效率中的AFB1剂量依赖性(表1)进一步证实了AFB1环氧化物的结合在增强细胞转化方面的特异性。尽管最佳剂量测定为24毫微微摩尔AFB1/100ng的PM-1DNA，但是在超过45毫微微摩尔/10.0ng的PM-1DNA的剂量测定时，观察到了过多杀伤作用。虽然人DNA以降解的方式被结合到NIH/3T3细胞中，但是在用AFB1环氧化物结合的PM-1DNA转染的NIH/3T3细胞中没有获得转化的聚集点(Yang et al.1985 and Modali and Yang，1986，上文已作参考)。这一发现表明，PM-1DNA的过度激活不仅产生分子的分裂，而且可能会发生降解，导致生物活性的丧失。该结果还表明，在hhcMDNA的生物活性受损和该活性的幸存有危险之前，每个PM-1DNA分子中没有一个或者至多只有几个AFB1-dG结合物能够被hhcMDNA接受。而且，hhcMDNA在细胞转化中的增强作用可能不需要或者至多需要有限量的AFB1结合。
实施例2PM-1DNA在dG上AFB1环氧化物结合的特异性天然DNA中的脱氧鸟嘌呤核苷酸被AFB1环氧化物结合后则变成碱，从而能通过六氢吡啶切割后而被识别，而在同样的天然DNA中未结合的脱氧鸟嘌呤核苷酸如果不经过二甲硫(碱)处理则不能分裂。图4表示在饱和条件下结合时PM-1DNA中的dG靶位点。在一系列四核苷酸中评价靶序列时，根据AFB1环氧化物与PM-1DNA中的dG的结合方式可以推断出一种经验分子式。表2概括了被AFB1环氧化物所识别和攻击的一系列四核苷酸系列的核苷酸序列。如图4所示，下列四核苷酸AGAG，AGTT，TGTT，TGAT或AGAA中任何一种序列中的dG不受AFB1环氧化物攻击。因而在没有预先经DMS处理的情况下不会出现序列分裂。AFB1环氧化物攻击GGGC，CGGC，AGGC，TGGC或CGCG的序列中的dG后产生明显的dG分裂证实了这一观点。根据可以被AFB1环氧化物接近的dG靶的各种序列的评价，可以断定在一种双链DNA中，可能性最小的dG靶位是两侧为dA和dT的位点即Ⅲ型。最适当的dG靶的两侧是dG和/或dC，即Ⅰ型。而dG之前接有dA或T而其后接有dG和dC的四核苷酸序列是AFB1环氧化物的适度优选靶位。也即Ⅱ型位点。由于这种分析是根据线性双链DNA而作的，当然就没有考虑DNA处于天然状态下的二级或三级结构。还应当指出的是尽管在双链PM-1DNA中AFB1一环氧化物的dG结合亲和性在很大程度上受到邻位核苷酸的影响。但是没有发现AFB1一环氧化物与单链DNA中的dG结合的特异性。Modali和Yang的发现(1986，上文已引用)与有关AFB1与OX174和pBR322DNA结合的其他研究基本一致(Misra et al.，Biochemistry，1983，223351)。
在过去两年中，一直是将Maxam-Gilbert核苷酸定序法和利用BRL千碱基定序系统的M13双脱氧方法结合使用来分析hhcM的核苷酸序列。将这些经验规律用于hhcM3.1Kb核苷酸序列的计算机分析，已推断出hhcM的各种位点中最佳和适度优选dG靶位(表3)。虽然在AFB1一环氧化物与线性3.1Kb hhcMDNA结合研究基础上推断出了dG靶位点的最大数目60个，但是，通过对hhcM序列可能的二级结构和三级结构的研究表明，能够被AFB1一环氧化物结合的dG靶位的量却要小得多。而且，只有少数这样导致的突变可以产生幸存价值的作用。
表2 邻近的核苷酸顺序支配AFB1一环氧化物结合的dG靶位Ⅰ类 最佳靶位 Ⅲ类 最不利的靶位＊ ＊GGGG AGAGGGGC AGTGGGGA AGAAGGGT AGACAGATCGGG TGAGAGGG TGACTGGG TGAATGACCGGC TGTGAGGC TGTATGGC TGTCTGTTCGGAAGGATGGACGGTAGGTTGGT
＊ 本表代表在用线性双链PM-1 DNA进行研究中所观察到的AFB1一环氧化物结合的dG靶位。本表没有列出适度优选的dG靶位点，即Ⅱ型，但在其他文献中已有记载(Modali and Yong，1986)。
表3 在hhcM核苷酸顺序中AFB1一环氧化物优选攻击的推断的dG靶位
<p>表3(续)
56056157769286090111251320132113301354140414051431154315881637165217651815
表3(续)
185318621868187819862064209422052315233123522352246024822718279728842926
为了对这种AFB1诱导的dG-＞T突变的可能效应进行分析，使用带有一个推断的dG-＞T点突变，假定是由AFB1一环氧化物诱变所致的20聚物的多核苷酸对hhcMDNA进行靶位点致突变研究。迄今为止，只分析了几个推断的dG-＞dT致突变位点，这些位点总结在表4中，在这种研究中使用了带有SV40T抗原载体中的hhcM序列加上一种抗新霉毒标记物，rpNrpM-1的重组结构，因为它提供了通过它对硫酸庆大霉素(G418)(新霉素的一种类似物)的抗性来选择转染细胞的优点。使用hhcM特异的mRNA的表达作为标准，我们通过Northern印迹反应，在半定量分析mRNA，即富RNA的聚A，分析了用致突变的hhcM序列转染后的抗G418的NIH/3T3细胞中的表达。对这些细胞中的点转化监测4到6周。
从可以确定其核苷酸序列的七个突变克隆中所得的结果表明，迄今为止，未见到引起结构蛋白改变的突变对hhcM的细胞转化的增强(表4)。另外，导致氨基酸取代的诱导dG-＞T的突变迄今也没有改变细胞转化或mRNA水平的表达。这包括可以引起Gly-＞val氨基酸取代的577位突变和由于摇摆编码而不引起氨基酸取代的1005位的突变。
在hhcM核苷酸序列中，存在着一种编码了一种大约467个氨基酸多肽的明显开放阅读码，ORF。这与55-57KD蛋白质和某些包括用hhcM特异的mRNA在兔网状细胞溶解物系统中进行无细胞蛋白合成过程中观察到的一种53KD蛋白质在内的较小多肽具有良好的一致性。尽管hhcM特异的mRNA水平没有不同，但是正好在5′的第一个蛋氨酸密码子前带有与核糖RNA结合位点一致的序列的5′末端上73和74位核苷酸的dG-＞T突变阻遏细胞转化。这可能是阻遏蛋白质合成的结果。同样，由于在每种情况下都插入了一个终止密码子(UGA)以过早地终止了蛋白合成，因此认为是在492和550处的突变也可以阻遏细胞转化。
有意义的是要注意到在626位的dG-＞T突变产生一种与RNA聚合酶Ⅱ的强化因子序列类似的序列，据报道，它甚至在编码序列中可以有功能作用(表4的脚注)。mRNA水平增加了1.5倍，而细胞转化似乎是每μg DNA只有少数的聚集点增加。这种发现表明，在本身就是一种适度转化DNA序列的hhcM中，AFB1诱导的突变是通过增强hhcM表达来增加其转化的可能。这类似于其他发现所说的由一种含有启动子和强化因子序列的鼠LTR序列所驱动的细胞ras致癌基因前体的加强表达也可以在原先倾向于不变化的组织培养细胞中引起细胞转化。
表4 在hhcMDNA序列中由靶位点致突变的dG-＞dT突变的效果＃on hhcM序列 mRNA合成细胞转化＊73 AGGA-＞ATGA +-@1＊74 AGGA-＞AGTG +-@1＊492 TGGG-＞TGTG +-@2＊550 GGAG-＞GTAG +-@2＊577 GGGC-＞GTGC + +＊626 GGGG-＞GTGG ++++@3＊1005 TGCA-＞TTCA + +@1 核糖体RNA(16S)结合位点AGGA的分裂＊@2 终止密码子UGA的产生＊@3 生产一种强化因子序列GGTGTGGTAAAG(Watson et al.，1987，Dynan and Tjian，1985，Schaffner et al.1985)和加强表达。
＃ 通过方法中所述的转染分析测定细胞转化并通过Northern印迹反应分析用〔32P〕3.1Kb hhcMDNA测定转染细胞中的mRNA合成。
实施例3HhcM-p52和抗-p52以及它们在人类肝细胞癌和涉及肝脏肿瘤前病理状态中作为筛选和诊断剂的应用。
通过上述的细菌系统以高水平产生融合蛋白HhcM-p52(图5)。用这种蛋白质产生一组抗涉及人肝细胞癌蛋白的单克隆和多克隆抗体(见图6A和6B)。产生了一种抗hhcM-p52的一种多价抗体，抗-p52，并且在抗非洲人(Mahlavu)肝细胞癌和费城(Philadelphia)肝细胞癌方面它具有高度特异性(图6A和图6B)。
肿瘤样本提取物必须与具有或不具有放射活性或免疫荧光标记的抗-p52反应进行扩散和免疫沉淀来测定癌样本中肝细胞癌特异蛋白p52的存在。还可以将用放射活性化合物或发色团标记的抗-p52分别用于RIPA或颜色变化测定试验来检查病人脱落在血清和尿样本中的肝细胞癌相关蛋白的存在。还可以使用与一种荧光化合物或其他合适的化合物结合在一起的抗p52进行系统造影，通过荧光成像分析扫描来就地确定癌前或癌瘤部位。确定了损害部位则可以进行外科激光切除和/或其他治疗。
适当标记的HhcM-p52核苷酸序列可用于活组织样本中肝细胞癌的诊断。在怀疑有癌前结节或肝癌的病人穿刺活检组织样本中可以检出HhcM相关核酸序列。这项工作的完成是通过使用hhcM-p52序列片段作为引物通过聚合酶链反应使“hhcM-类似”序列放大，然后用标记的hhcM-p52作为DNA-DNA杂化反应的探针来检查活检组织样本中hhcM-类似序列的存在。这种举例见图7所示。
在本文中引用的所有参考文献的全部内容通过参考被结合在本文中。
为了清楚易懂本发明已被详细地描述。本领域的熟练人员通过阅读本发明说明书，可以在不超出本发明实际范围的情况下对本发明在形式上和细节上作出各种不同的改变。
权利要求
1.一种编码了图1所描述的氨基酸序列或所说序列的等位基因变异体或它的某一特定部份的DNA片段。
2.如权利要求1中的DNA片段，其中所说的片段编码了图1所描述的氨基酸序列或它的某一特定部份。
3.一种重组DNA分子，包括(ⅰ)一个载体，和(ⅱ)如权利要求1所说的DNA片段。
4.如权利要求3中的重组分子，其中所说的DNA片段编码了图1所描述的氨基酸序列，或它的某一特定部份。
5.如权利要求3中的重组DNA分子，还包括一种可操作地连接到所说DNA片段上的启动子序列。
6.一种用权利要求5所说的重组DNA分子转化的宿主细胞。
7.如权利要求6中的宿主细胞，其中所说的细胞是一种原核细胞。
8.如权利要求7中的宿主细胞，其中所说的细胞是一种大肠杆菌细胞。
9.一种与权利要求1所说的DNA片段充份互补并与之杂化的核苷酸片段。
10.一种具有图1所描述的氨基酸序列或所说序列的等位基因变异体或它的某一特定部份的蛋白质。
11.如权利要求10的蛋白质，其中所说的蛋白质具有图1所描述的氨基酸序列或它的某一特定部位。
12.权利要求10所说的特异性抗体。
13.如权利要求12的抗体，其中所说的抗体是多克隆抗体。
14.一种制备权利要求10所说蛋白质的方法，包括在使得所说的DNA片段表达和所说蛋白质能产生的条件下培养一种含有ⅰ)一种载体和ⅱ)一种编码了所说蛋白质的DNA片段的重组DNA分子转化的宿主细胞，并分离所说的蛋白质。
15.一种检查样本中如权利要求10所说蛋白质存在的方法包括ⅰ)用所说蛋白质的一种特异性抗体在使所说抗体与所说蛋白质进行结合的条件下与样本接触，从而形成一种复合物，和ⅱ)检测所说复合物的存在。
16.一种如权利要求15的方法，其中所说的抗体被连接到一种可检出的标记物上。
17.一种检查样本中存在有一种编码了如权利要求10所说蛋白质的核苷酸序列的方法，包括ⅰ)用一种与所说核苷酸序列充份互补并与之杂交的核苷酸片段在可以进行杂交反应的条件下与样本进行接触，从而形成一种复合物，和ⅱ)检查所说复合物的存在。
18.如权利要求17的方法，其中所说的核苷酸片段被连接到一种可检出的标记物上。
19.一种诊断病人体内肝细胞癌存在的方法，包括ⅰ)用一种权利要求12所说的抗体与从所说病人体内取出的生物样本在使所说抗体与所说的存在于所说样本中的蛋白质进行结合的条件下进行接触，从而形成一种复合物，和ⅱ)检查所说复合物的存在。
20.如权利要求19的方法，其中所说的样本是一种组织样本。
21.一种诊断病人体内肝细胞癌存在的方法，包括ⅰ)用权利要求9所说的核苷酸片段与所说病人体内的细胞样本中得到的核酸序列在可以发生杂交反应的条件下进行接触，从而形成一种复合物;和ⅱ)检查所说复合物的存在。
22.一种用于检查样本中如权利要求10的蛋白质存在的诊断药盒，它包括一种其中盛有所述的蛋白质的特异性抗体的容器盒。
23.一种用于检查编码了具有图1所描述的氨基酸序列或所说序列的一种等位基因变异体或它的某一特定部分的蛋白质的一种核酸序列存在的诊断药盒，它包括一种盛有权利要求9所说的核苷酸片段的容器盒。
全文摘要
本发明涉及一种对肝细胞癌有特异性的致癌蛋白质和一种编码了这种蛋白质的核苷酸序列。本发明还涉及使用该癌蛋白(或它的特异抗体)和核苷酸序列的筛选和诊断方法和根据该方法而建立的药盒。
文档编号C12N5/10GK1054615SQ90110448
公开日1991年9月18日 申请日期1990年12月19日 优先权日1989年12月19日
发明者杨素 申请人:美国政府(美国商务部代表)