一种在预防和治疗人体逆转录病毒中作为抗病毒剂和免疫原的非复制性的重组逆转录病...的制作方法

专利名称：一种在预防和治疗人体逆转录病毒中作为抗病毒剂和免疫原的非复制性的重组逆转录病 ...的制作方法
1.序言 本发明涉及到非传染性重组制备的逆转病毒颗粒，和产生这种颗粒的体外系统，以及在抗人体逆转录病毒如人体免疫缺陷病毒(HIV)的预防和治疗过程中作为抗病毒剂和免疫原的用途。本发明的重组制备的HIV颗粒结合有正确加工的HIV核心和壳蛋白，并且在形态学上和免疫学上与天然HIV非常相似。而且，由于本发明的重组HIV颗粒不含有病毒复制所必需的HIV基因组的全部成份，因此这些病毒颗粒是非传染性的。
2.
背景技术：
已经识别出两种类型的人体逆转录病毒，白血病病毒和艾滋病(AIDS)病毒或艾滋病相关性病毒。人体逆转录病毒的主要靶是T淋巴细胞和中枢神经系统细胞。所有人体逆转录病毒都是通过密切接触、血液污染，和宫内感染或出生后喂奶感染而进行传染的。似乎全部人类逆转录病毒起源于非洲，并且有可能通过种间感染，可能通过非洲绿猿或相关种与人类相遇。首次发现的人类逆转录病毒，人体T淋巴细胞亲和性Ⅰ型病毒(HTLV-Ⅰ)和人体T淋巴细胞亲和性Ⅱ型病毒(HTLV-Ⅱ)，对T4细胞和某些T8细胞具有一种偏向亲和性，并且具有明显的顺序同源性，并且主要与T细胞白血病和淋巴瘤有关。下面对另外一种人体逆转录病毒，一般称之为人体免疫缺陷病毒(HIV)进行更为详细的讨论。这两种类型的人体逆转录病毒之间有两个主要的区别(1)在各种HIV分离体中有很大的基因组变异性，而HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ病毒的基因组是稳定的;和(2)近来进入人群中的HTV要比HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ病毒多得多。
2.1 人免疫缺陷病毒和艾滋病 人体免疫缺陷性病毒(HIV)是一种致细胞病的逆转录病毒，并且是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的致病因素。已经识别出两种类型的HIV。原型病毒HIV-Ⅰ以前被称为淋巴结病相关病毒(LAV)和人体T淋巴细胞亲和性Ⅲ型病毒(HTLV-Ⅲ)是世界上所报道的大多数艾滋病(AIDS)病例的致病因素。另一种逆转录病毒HIV-2最初已经从西部非洲的艾滋病人中分离出，并且与HIV-1具有致病相关性。在遗传学水平上，HIV-2实际上与猴免疫缺陷性病毒(SIV)，一种传染猴子的逆转录病毒，更为密切相关。
到1989年5月31日，仅在美国已经报道有97，000多例艾滋病患者，这些病人中的一半以上已经死亡。在这个国家有三百万之多的人数可能是HIV病毒的无症状携带者，并且能够传播这种病毒。估计到1991年美国会有270，000例艾滋病病人出现(美国公共卫生服务部，1986，Public Health Rep.101341)。艾滋病的死亡率是令人担忧的高，超过80%是在诊断后三年之内死亡，而在更长一些的期间内可能会达到100%。
在世界范围内，艾滋病的流行可能包括大约五到十百万目前被感染的病人，尤其令人担忧的是从非洲大陆上所得到的统计学资料，其中几百万的人被认为感染有HIV，死亡范围在几十万，并且异性传染占优势。到目前为止，既没有一种已知的艾滋病治疗方法，也没有一种有效地抗HIV感染的疫苗。
2.2 HIV病毒感染的发病机制 HIV病毒是逆转录病毒的非转化的，细胞病慢病毒(Lentivi-rus)科的一个成员。HIV可以引起一种典型的致使疾病，其特征表现为严重的免疫缺陷或神经变性疾病，或二者皆有。HIV诱导的免疫抑制的主要基础是表达CD4分子(T4或CD4+细胞)的T淋巴细胞的辅剂/诱导剂亚单位的耗尽，它是病毒的高亲和性细胞表面受体。T4淋巴细胞直接或间接地诱导体内几乎每一个免疫功能，它的缺失可以导致广泛机会的致病菌感染和肿瘤的易感性。
除了T4淋巴细胞外，其它一些表达CD4分子的细胞也是HIV感染的靶，尤其是单核细胞-巨噬细胞和大脑的某些神经元和神经胶质细胞。HIV病毒感染也可以引起严重的B细胞异常，包括多细胞系激活，高丙种球蛋白血症，循环免疫复合物水平升高，和自身抗体。在艾滋病病人体内逐发现功能性自然杀伤细胞(NK)的数量减少。
CD4+细胞的感染是由CD4分子与大量HIV壳糖蛋白gp120的相互作用而引起的，接着则发生病毒粒子的内化和去壳，通过病毒编码的反转录酶将基因组RNA转录成DNA，并将得到的前病毒DNA整合到宿主细胞染色体DNA中，而且，未整合的前病毒DNA可以在感染的细胞中大量积蓄，可能是HIV细胞病的明显致病因素(Shaw et al.，1984，Seience 2261165)。在复制过程中，整合的前病毒DNA的mRNA转录本被翻译成HIV病毒蛋白。然后这些蛋白被加工，使之与HIV基因组RNA一起装配，从感染的T淋巴细胞表面和巨噬细胞内生长出的成熟病毒粒子与宿主细胞膜类脂结合形成病毒的壳。
虽然感染之后HIV会在一定时间保持休眠，但是，当出现病毒的活性复制时，宿主CD4+细胞一般可被杀死。尽管已经提出几种机理(如，大量未整合病毒DNA在感染细胞中的积蓄;当大量病毒从细胞表面长出时细胞膜通透性增加;推测HIV可以引起感染的T4细胞的末端分化，导致寿命缩短)，但是通过HIV产生其致细胞病效应的准确机制尚不知道。逐渐表明CD4分子和病毒壳在HIV感染细胞中的致细胞病效应中都起着一定作用。HIV感染的细胞病理学中一个突出的特征就是似乎是由gp120/gp41壳蛋白引起的多核合体细胞的形成。相反，HIV-感染的巨噬细胞可以继续制备HIV病毒而在长时间内没有细胞病效应。
不得不认为单核细胞和巨噬细胞在HIV感染的发病机制中起着主要作用。除了通过吞噬作用以吞食病毒之外，单核细胞-巨噬细胞的某些亚单位可以表达CD4表面抗原，并且从而能够结合到HIV壳上。单核细胞-巨噬细胞是大脑内感染的主要细胞类型，并且与发生HIV感染的神经精神病学现象有关。而且，在感染的病人中一般会观察到单核细胞-巨噬细胞的功能缺陷。这些缺陷可以产生艾滋病病人特有的感染机会。
HIV可以在单核细胞-巨噬细胞中以休眠状态生存是具有重要意义的。或许是由于CD4细胞表面受体的密度较低，感染的单核细胞不表现出HIV对T4细胞所具有的细胞溶解效应。因而单核细胞可以作为HIV贮主，尽可能地将病毒转送到大脑，中枢神经系统，和体内各个器官。存在于单核细胞内的病毒可能会通过血脑屏障，影响monkines，酶和趋化性因子的释放，引起神经元的破坏或损伤和脑组织炎症(Ho et al.，1987，N.Engl.J.Med.311278;Fauci，1988，Science 239617)。在直接起源于HIV感染的各种神经病学综合症学中，最普遍的是亚急性脑炎或艾滋病痴呆(几乎90%的艾滋病患者)，其临床特征包括痴呆、精神运动性阻滞，和行为改变。
2.3 HIV的形态学和基因组差异 已经通过免疫学方法和电子显微镜分析技术确定出HIV病毒的细微结构(Gelderblom et al.，1988，Micron and Microscopia 1941;Gelderblom et al.，1987，Virology 156171)。在HIV-1和HIV-2株之间没有鉴定出形态学差异(Gelderblom et al.，1988，Micron and Microscopia 1941)。HIV病毒粒子是一种直径大约100到120nm的球形颗粒，并且含有一个电子密度，P24，gag蛋白组成的管状核心，一种由gag P17组成的膜下基质，和一种由分散在类脂质两层膜之间的壳蛋白gp120和gp41组成的壳。HIV基因组RNA存在于核心作为核糖蛋白(RNP)复合物的一部分，该复合物结合有反转录酶分子(该酶催化RNA转录成前病毒DNA)和核蛋白。从前体gp160中通过蛋白水解切割而得到的衣壳蛋白gp120和gp41，作为非共价结合复合物嵌入到膜当中。观察这些壳蛋白复合物，显现为具有最大直径约14nm，高度9-10nm的球形突出，并且似乎以T＝7左侧对称的二十面体结构形式排列。该突出含有gp120，疏松地连接到它的横跨膜的gp41锚状物上。壳gp120在很大程度上自动地从病毒表面脱落，这种现象可以影响HIV病的发病机制。在发芽过程学中和刚刚结束之后都可以发生病毒成熟。在从感染细胞的表面长出芽以后，通过一种HIV-编码的蛋白酶从前体上切割HIV核蛋白，成为组织形成该核结构的成熟结构蛋白。
HIV病毒基因组含有三个编码该病毒粒子主要结构成份的基因env(编码衣壳蛋白)，gag(编码核蛋白)和pol(编码反转录酶，蛋白酶，和核酸内切酶)。这三个基因两侧是被称作长末端复制段(LTR)的核苷酸延伸段，这些LTR含有在病毒基因表达的控制过程中具有一定作用的序列。但是，不象其他反转录病毒，HIV的基因组包括至少6个其他基因，其中三个具有已知的调节功能。这些调节基因的表达被认为对HIV发病机制具有一定的影响。tat基因编码了一种蛋白质，该蛋白质对于HIV基因的表达具有强的激活剂功能，从而在病毒复制的放大中起着重要的作用。该rev基因产物调节对HIV mRNA的连接和转送。相反，nef基因则往下调节病毒的表达。vif基因对于病毒粒子形成并不绝对需要，但是对于有效地产生感染病毒粒子和在体外影响病毒传染来说是十分重要的。Vpr基因编码了一种未知功能的免疫基因蛋白。最后，最近所报道的Vpu开放阅读框架编码了一种参与调节病毒成熟和致细胞病效应的蛋白质。
已经获得HIV的许多不同分离物，并且已确定出它们的核苷酸顺序，表明了在env基因中有很大程度的基因组差异性。具有明显分支特征的env基因区域点辍有保存于各种不同分离物当中的区域。估计正如全部HIV分离物结合到CD4细胞表面受体分子上一样，一种如此保存的区域是CD4结合区。已经从感染一段时间的个体艾滋病患者身上分离出相关的但是与众不同的HIV-1变体，其中有些具有抗原多变性。这些分离物对于特定细胞类型的向性各不相同。关于这方面，某些分离物似乎倾各于在CD4+T细胞或在大脑产生的巨噬细胞中复制，表明HIV病毒感染因选择性的发病机制产生各种不同的临床表现。
2.4 疫苗展望 病毒疫苗的传统研究包括以活的减毒形式或灭活制剂的形式使用完整的病毒粒子。这些研究已经成功地用来抵抗许多疾病如天花、脊髓灰质炎、麻疹、流行性腮腺炎、风疹等。但是对于将这些研究用于HIV疫苗制备的可能性一直存在问题。除了具有与回复有关的实际危险和活性不足之外，由于这些传统的处理包含把整个逆转病毒基因导入到健康个体中，因而产生导致疾病，例如艾滋病的理论上的危险性。因此，目前在制备艾滋病疫苗方面的大部分精力都集中在重组方法上，不论是以亚单位形式还是以病毒载体疫苗的形式。
对HIV靶抗原的研究在很大程度上一直局限于衣壳糖蛋白方面，在较小程度上，局限于核心抗原。关于衣壳糖蛋白复合物(也即gp120-gp41多聚复合物，与可溶性gp120或gp160相反)或衣壳-核心抗原复合物的免疫致病性方面的信息，即使存在，也没有多少。一系列迹象表明在特定结构中同时存在衣壳糖蛋白复合物和核心抗原可能是重要的。首先，乙型肝炎表面抗原的研究表明，做为部分颗粒结构的那种抗原的存在比可溶性抗原更有意义(Cabral et al.，1978，J.Gen.Virol.38339)。第二，某种给定的抗原决定基，(如腺病毒六邻体的属特异性中和表面抗原决定基)的致免疫性质具有形态依赖性。第三，由于HIV的核心抗原相对保存于各种分离物中，将核心抗原做为免疫原可以广泛地对各种HIV-1分离物激发出免疫应答反应。因此，设计和评价结合了传统方法和重组方法优越性的疫苗是具有重要意义的，也就是说，保存天然病毒粒子的致免疫性质的重组制备的疫苗，都没有整个病毒制剂的感染活性和其他潜在的缺点。
除了其预防用途之外，疫苗还可以用于感染后的免疫治疗。例如，将有效的狂犬疫苗给狂犬病毒有潜在暴发结果的患者使用。由于在感染和发病之间有一个较长的潜伏期，有人提出免疫方法对于感染了HIV的人预防艾滋病也具有价值(Salk，1987，Nature 327473-476) 3.发明概述 本发明涉及到非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，含有非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒的疫苗配制品，制备非复制性重组制备逆转录病毒颗粒的方法，和非复制性重组制备逆转录病毒颗粒作为抗病毒剂的用途。本发明的重组制备逆转录病毒颗粒含有逆转录病毒核心和衣壳蛋白，它们被装配成为具有在免疫学和形态学特征非常接近于那些天然逆转录病毒的病毒粒子的结构。本发明的重组制备的逆转录病毒颗粒和天然逆转录病毒颗粒之间的主要的结构区别是前者缺少一个完整的逆转录病毒基因组。如果没有一种能控制表达，特别是逆转录病毒传染和复制所必需的各种基因产物的逆转录病毒基因组，本发明重组制备的逆转录病毒颗粒则完全没有传染性并且不能够繁殖。但是，由于重组制备的反转录病毒颗粒在结构上被设计成为传染性反转录病毒颗粒，因此，它们是高致免疫的，并且不仅能够激发一种防预性免疫应答来抵抗特定的有意义反转录病毒，而且还可以有效地阻止反转录病毒的感染性。
申请人:和用于制备本发明非复制性重组反转录病毒颗粒的方法包括，在哺乳动物宿主细胞中共同表达反转录病毒核心和衣壳结构蛋白，该宿主细胞能够控制反转录病毒核心和衣壳蛋白的成熟，并且促进它们与正确装配的芽体颗粒结合。使用各种已经建立的技术如通过活病毒载体感染和用DNA载体转染，可以完成将编码这些反转录病毒核心和衣壳结构蛋白的核苷酸序列导入到哺乳动物宿主细胞中。另外，申请人相信还应当将编码反转录病毒蛋白酶的核苷酸序列导入到哺乳动物宿主细胞学中，以保证对反转录病毒核心蛋白进行适当的加工。
更进一步说，本发明涉及到非复制性重组制备的HIV病毒颗粒，抗人体免疫缺陷病毒的疫苗，制备非复制性重组制备的HIV病毒颗粒的方法，和使用非复制性重组制备的HIV病毒颗粒来抑制HIV感染和治疗感染了HIV病毒患者的用途。在本文以实例方式描述的具体实施方案中，重组疫苗病毒被作为载体，将人体免疫缺陷病毒的gag，蛋白酶和衣壳基因导入到哺乳动物宿主细胞当中，以控制制备具有免疫学和形态学特征非常接近于那些天然HIV-1的HIV-1-相似颗粒。这些重组制备的HIV-1颗粒能够阻止活的HIV病毒在体外的传染力，并且在体内具有高度的致免疫性。
4.附图的简单描述

图1.用重组疫苗病毒感染的BSC-40细胞中表达的HIV-1蛋白的放射免疫沉淀分析。使BSC-40细胞的单层在含有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改进的伊格尔培养基(DMEM)中生长到汇合(confluency)。用v-env5(A和B组)，V-env5+v-gag2(C和D组)，v-gag2(E和F组)，或者V-NY亲代病毒(G和H组)以每个病毒10PFU/细胞的MOI感染这些细胞。在感染后12小时，用[35S]-蛋氨酸和[35S]-半胱氨酸(100uCi/ml)对细胞放射标记4小时。收集培养基并用PBS冲洗细胞，收集，然后在RIP缓冲液(1%NP40，0.5%脱氧胆酸盐，含有0.1%SDS的PBS)中溶解。用人体多克隆抗HIV-1血清(下面的第6.1.2节)通过RIP，然后再在11.5%丙烯酰胺基质中通过SDS-PAGE进行分级分离，对与培养基(B，D，F和H组)和核后细胞溶解物(A，C，E和G组)平行地进行HIV-1蛋白测定。通过放射自显影术对放射标记的蛋白进行观察。分子量标记物以千道尔顿(KD)表示。
图2 感染BSC-40的细胞合成的HIV衣壳蛋白的细胞表面隔室化。以每种病毒10PFU/细胞的MOI，用与亲代V-NY病毒相似的v-env5感染或用v-env5和v-gag2共同感染这些细胞。在感染后16小时时，抽取培养基并洗涤细胞，然后通过乳酸过氧化酶催化的反应用0.5mCi[125I]对该细胞进行放射标记(Haffar et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71508)。然后按照图Ⅰ和下面6.1.2节中所述，通过RIP和SDS-PAGE对核后细胞溶解物进行HIV蛋白测定。
图3 含有HIV-1gag和env蛋白的重组HIV颗粒的分离。(1)放射自显影照片在感染后5小时时用[35S]-蛋氨酸和[35S]半胱氨酸(60μCi/ml)对如图2所述感染的BSC-40细胞进行放射标记10小时。收集每个感染条件下的培养基(14ml)，并且在600xg离心10分钟使细胞澄清。收集2毫升的所得上清液进行起始物(TS)测定。将每个样本中剩余的12ml在SW55Ti离心机中在120，000xg离心3小时，分离成一个颗粒小丸和颗粒后上清液(S)。将该小丸洗涤，再悬浮于PBS当中，并且覆盖于一个2ml的15%蔗糖垫上。在一种SW55Ti离心机中以120，000xg的转速进行超速离心1.5小时使颗粒物质再沉淀。将所得的颗粒沉淀小丸(P)再悬浮于RIP缓冲液中。如下面6.1.2节中所述的那样，用RIP测定P部分(B，E和H组)的HIV蛋白，并且平行地测定2ml(来自总量12ml)S部分(C，F和I组)和2ml TS物质(A，D和G组。(2)曲线图将双重感染的BSC-40培养物上清液的第一次超离心所得颗粒小丸覆盖在一个连续蔗糖密度梯度(15%-60%)上，并且在SW55Ti离心机中在120，000xg离心1.5小时进行沉淀。以200μl等分形式从梯度末端收集梯度组分。将收集的材料分成两份，并按照如下面6.1.2节中所述的EIA方法测定gag p24含量。EIA的峰值部分代表每个收集组分(实点线)中测出的p24的毫微克量，并且与蔗糖浓度有关(圆圈表示)。Western印迹反应分析表明梯度顶部的组分(没有表示出)不含有任何p24。
图4 薄切面电子显微镜和免疫电子显微镜对装配的重组HIV-1颗粒的分析。将使用从培养上清液中沉淀得到的颗粒小丸(图3)相平行地用v-env5和v-gag2(MOI＝10PFU/细胞每个病毒)共同感染的完整的BSC-40细胞在4%的多聚甲醛中固定20分钟。然后用0.8%牛血清白蛋白，0.1%明胶和5%含有普通羊血清的PBS冲洗样本并阻断。将MAbs110-4或41-1(下面6.1.2节)做为腹水液(1∶2000的阻断缓冲液)按照所述方法加入到各种样本当中。3.5小时之后，用PBS洗涤样本，并用金结合的羊抗-鼠IgG进行培养，以用于进行下面6.1.3节中所述步骤的EM分析。
图5 如下面6.2.4节中所述的园点印迹杂交测定方法测定的重组制备的HIV-1颗粒中的核酸含量。A组gag-特异性探针。B组env-特异性探针。以ng p24当量测定重组制备HIV-1颗粒和灭活HIV病毒粒子的浓度。(灭活病毒1泳道，2600ng p24;2泳道，260ng p24;3泳道，26ng p24;4泳道，2.6ng p24;重组制备HIV颗粒1泳道，300ng p24)。C组分别用于重组疫苗病毒v-gag2和v-env5的制备过程中的gag-pol基因(258-3317)和env基因(5671-8572)之间的协调线图。箭头表示位于gag-pol基因(Lever et al.，1989，J.Virol.634085-4087)上游的RNA包装序列(300-319)的位点。
图6 质粒pv-G2E5的结构示意图。
图7 重组疫苗病毒感染细胞的Western印迹反应。以5pfu/细胞的MOI感染BSC-40细胞，并在感染后24小时时，收集细胞进行PAGE分析。将感染的细胞溶解物在7-15%丙烯酰胺凝胶上进行电泳并且电转移到硝化纤维素上。用HIV+人血清(Trimar)与免疫印迹进行反应，然后再用过氧物酶结合的羊-抗-人IgG与之反应。用2-氯-萘酚做为底物使印迹显影。按照所述的方法装填凝胶谱带。
图8 对用V-G2E5感染的BSC-40细胞而制备的重组HIV-1颗粒的放射免疫沉淀分析。
图9 下面8.1节中所述质粒载体结构的图解。
图10 在转染CHO细胞中产生的重组制备的HIV-1颗粒的免疫反应性。从3010-C6细胞的培养基中收集重组制备的HIV颗粒，通过高速离心使其浓缩，并通过在一个15-60%的蔗糖梯度中走带进行分级分离。顶部用Gag抗原EIA分析梯度组分的Gag蛋白含量，并用一种析光仪分析蔗糖密度。底部所选择组分(在顶部组 用＊指示)的等分试样在7-15%梯度上选择的组分聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并且电转移到一种硝化纤维素滤器上，用一种艾滋病病人血清和125-Ⅰ标记的蛋白质A对其进行探查。还装载未分离的病毒颗粒的等分试样和分离的HIV病毒。
图11 对在用编码了HIV-lenv，tat和rev基因的质粒载体转染的在HeLa细胞中表达的HIV-特异性抗原的分析。用CmHiTgfbEnv5(每条谱带)加上每条谱带上方所标示的tat和rev质粒[“BS”是一种含有编码顺序插入的“兰线加(Bluescribe plus)”载体的对照质粒]共同转染HeLa细胞。在收集样本24小时前在培养基中加入锌，以“+Zn”表示。将全部细胞溶解物在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，并电转移到一种硝化纤维素滤器上，用125-Ⅰ标记的单克隆抗体110-4进行探查。还装载用牛痘病毒v-env5感染的BSC-40细胞的等分试样。
图12 重组牛痘病毒感染细胞的Western印迹分析。以10pfu/细胞的MOI感染BSC-40细胞，并在感染后23小时时收集细胞进行PAGE分析。将溶解的感染细胞在一种8.5%丙烯酰胺凝胶上进行电泳并使之电转移到硝化纤维素上。用HIV+人血清(Trimar)与免疫印迹进行反应，然后再用过氧化物酶结合的羊-抗-人IgG与之反应。用2-氯-萘酚作为底物使印迹显影。凝胶谱带按所示进行装载。
图13 用重组制备的HIV-1颗粒对T-成淋巴细胞类(T-Lymphoblastoid)细胞传染力的分析。按照下面7.1节中所述，或者用重组制备的HIV-1颗粒(与3ng p24gag相对应)或者用HIV病毒(与5pg p24 gag相对应)与成淋巴细胞(CEM)一起培养。在感染后5天从每个孔中收集细胞样本，并且按照下面7.1节中所述的方法通过间接免疫荧光对细胞内HIV抗原进行分析。用Evans Blue染色(红染色剂)来方便地对细胞进行定位。A组用重组制备的HIV-1颗粒培养的CEM细胞。B组用HIV病毒培养的CEM细胞，显示荧光阳性。C组用HIV病毒培养的CEM细胞的合体细胞。
图14，从用(A)重组制备HIV-1颗粒，和(B)补骨脂素灭活的HIV-1免疫的新西兰白兔中采集的血清样本通过ELISA测定的相对抗体滴度。所测定的详细情况见下面的14.1节。
图15，免疫动物中的体液免疫应答。用重组制备的HIV-1颗粒(R＃238和R＃241)和无活性HIV-1病毒(R＃239和R＃243)对新西兰白兔进行免疫。在免疫反应开始后的不同时间间隔收集血清样本，并且通过ELISA在破碎的整个病毒(A和B组)或纯化gp120(C和D组)上测定HIV-1特异性抗体。数据(纵座标)是以2倍的致免疫血清滴度计算的HIV-1将异性抗体的终点滴度。横座标的值代表最初的免疫反应开始后以星期计采集血清样本的时间。箭头表示第二次(4周R＃241和243，5周R＃238和239)和第三次(18周R＃241，35周R＃238)免疫反应的时间。
图16 用兔血清与CEM细胞的HIV-1感染性进行中和反应。测定从免疫兔子中选择的血清样本(A组R＃238和R＃241，B组R＃239和R＃243)中的HIV-1特异性中和活性。在加入到细胞中之前先用合适的血清与同源病毒(BRU分离物)在37℃下培养45分钟。1小时后于37℃下从细胞中去除病毒和血清，并且用合适稀释的血清培养基取代之。使用一种EIA测定细胞释放p24gag蛋白量的减少来确定中和作用。所标示的中和滴度(纵座标)表示培养基中p24水平减少75%。横座标值如图15所描述。
图17，通过Western印迹分析测定的个体病毒蛋白质的抗体反应活性。对于所用实验方法和对结果讨论的详细描述见下面的14.2.4节。
图18，将CD4基因转染的HeLa细胞先与重组HIV-1颗粒，然后再与HIV特异性抗体进行培养后的同焦点激光扫描显微照片。对方法的详细描述见下面的15.1节。
5.本发明的详细描述
本发明涉及在免疫学、结构和形态特征方面非常接近于活的反转录病毒病毒粒子的非复制性重组制备的反转录病毒颗粒。本发明方法适用于构件类似于任何一种人造转录病毒(如HTLV-Ⅰ，HILV-Ⅱ，HIV-1，HIV-2)的重组制备颗粒。
本发明尤其涉及到重组制备的HIV颗粒，像自然HIV一样，重组制备的HIV颗粒含有经过正确加工和装配的仍保存抗-HIV血清免疫反应活性的HIV核心和衣壳蛋白。但是重组制备的HIV颗粒不含有HIV基因组，因而是不能复制的。本发明的方法通过实施例加以详细描述，在这些实施例中，使用了一种新的体外系统制备表面带有gp120/gp41衣壳蛋白复合物的重组HIV-1颗粒。本领域的熟练人员应当明白，本发明包括了许多具体的实施例。而且本文没有具体地描述和说明的任何落在本发明权利要求范围之内的技术都在本发明范围之内。
本发明的以下几点特征证明本发明对于艾滋病疫苗是一种新方法。首先，重组制备的HIV颗粒不论是在形态学方面还是在抗原特性方面都非常接近于真正的HIV病毒粒子。当作为一种免疫原使用时，这些颗粒显示类似于HIV感染过程中抗原表现方式的抗原性，从而激发出对于天然感染高度有关并且具有潜在保护能力的免疫应答反应。目前所公开的任何重组亚单位疫苗是不能达到本发明的这种特征的。第二，本发明方法根据重组DNA技术，提供了一种使从HIV-1和HIV-2的不同分离物得到的抗原结合的灵活性，从而产生对于抗艾滋病有效的疫苗来说最基本的定义反应免疫应答。还可以使用重组DNA方法去除或修饰使病毒感染性或致病性增强的潜在的有害的表面抗原决定基。第三，本文所描述的重组HIV颗粒不具有传染性并且不含有完整的HIV基因组。因此，用这些颗粒进行的免疫反应不会带来与灭活或减毒完整病毒疫苗相联系的潜在的感染危险性。下面的章节中对本发明的这些和其他的特征还会做进一步的描述。
本发明的重组制备的HIV颗粒还可作为特异性免疫加强剂。通过激发抗该病毒的免疫反应来防止已经感染上HIV病毒的人体内艾滋病的发生。本发明的这一具体特征指导了强化和保存已经在血清阳性病人当中诱发出的免疫保护因子。Dr.Jonas Salk使用灭活的，除衣壳蛋白的HIV配制对一种类似的方法已进行了评价。
本发明重组制备的HIV颗粒的其他预期用途包括将它们作为一种干扰HIV感染的抗病毒剂的应用，产生HIV核心和衣壳蛋白抗原的单克隆抗体的应用，制备抗基因型抗体的应用和阐明HIV病毒包壳(encapsidation)过程的应用。本发明的重组HIV-1病毒颗粒具有抗病毒效应(见下面的12和13节)，并且可以用本颗粒在免疫的兔和maeaque猴体内激发HIV-特异性体液和细胞免疫应答(分别见14和16节)。
5.1.用作抗人体免疫缺陷病毒疫苗
的非复制性重组体制备的HIV颗粒的制备
本申请人提供的制备重组HIV颗粒的方法包括在哺乳动物细胞中共同表达HIV env编码的和gag编码的结构蛋白。所选择的培养宿主细胞必须能够合成和正确加工HIV蛋白质。可以使用现有技术中已知的已被建立的方法，包括通过活病毒载体，如疫苗病毒和逆转录病毒载体进行感染和用DNA载体转染的方法，将env和gag基因导入到宿主细胞当中。在宿主细胞中成功地表达出HIV蛋白之后，可以使用现有技术中规范方法从培养基中分离重组体制备的HIV颗粒。
在下面第6部分的实施例中进一步详细描述的一个具体实施方案中，用两种重组疫苗病毒(一种带有HIV-1的完整gag基因而另一种带有HIV-1的完整env基因)共同感染非洲绿猴肾胚(BSC-40)细胞，来制备重组的HIV颗粒。这种双重感染导致所装配的重组HIV-1颗粒从BSC-40细胞表面长出芽体。生物化学分析表明这种颗粒结合了成熟的免疫反应性gag和env蛋白。通过电子显微镜观察，这种重组制备颗粒的形态与活的HIV实际相同。
在一个相关的实施例中，介绍了一种运用病毒载体产生本发明重组逆转录病毒颗粒的另一种系统，在该实施例中，使用含有HIV-1的env和gag基因的单个重组疫苗病毒用来转染哺乳动物细胞，然后产生重组制备的HIV-1颗粒(见下面的第7节)
在另一个实施例中，使用编码了该逆转录病毒结构蛋白的DNA转染哺乳动物细胞这一系统产生重组的逆转录病毒颗粒。作为这种具体实施方案的举例，在下面的第8部份进一步地作了详细的描述。用分别编码了HIV-1 gag和HIV-lenv基团的两种质粒载体转染CHO细胞，然后这种细胞则控制被装配到重组HIV-1gag和env抗原的合成。与本实施例相关的其他方案包括，但不局限于用含有多个HIV基因的复合质粒载体进行转染，使用基本的和可调节的增强子/启动子原件控制HIV基因的表达，与HIV结构基因表达相结合并对其进行控制的HIV调节蛋白质的表达，各种不同的细胞系的使用，和编码修饰HIV蛋白的质粒载体的使用。
例如，在下面的8.3节、9节和10节中描述了用于表达HIV结构蛋白和产生重组HIV颗粒的其他方案。
运用本发明系统可得到若干选择方案来控制所得颗粒的性质。在病毒构造和感染期都可以运用这些选择。
5.1.1.重组DNA和病毒载体的制备
按照和本申请一起悬而未决的美国专利申请779，907(申请日1985.9.25);1986年3月27日申请的842，984和1986年9月9日申请的905，217中所描述的方法可以构建重组DNA载体和病毒载体如疫苗病毒，通过引用，本发明结合了这些发明的全部内容。
在本发明的一个特定实施例中，构建携带HIV env和gag序列的重组疫苗病毒并将它用作载体。简要地说，构建在疫苗启动子的转录控制下的含有HIV核心和衣壳蛋白编码顺序的质粒载体，通过体外重组方法用它来影响HIV基因顺序与疫苗病毒基因组的整合。按照上面引用的共同申请的专利文献中所述的方法，识别、纯化重组疫苗病毒并评估它们对感染细胞中HIV蛋白合成的控制能力。
在另一个实施例中，构件一种编码了HIV结构和/或调节基因的各种结合的重组质粒载体，并用它作为载体来转染能够产生重组制备HIV颗粒的细胞。后面第8部份对这些载体的典型排列结构进行了描述。
在重组DNA载体、重组疫苗病毒等的构建过程中，可以利用重组DNA技术来修饰本发明重组制备颗粒的各个蛋白组分的准确性质。用这种方法，也可以确定这种颗粒上逆转录病毒抗原决定簇的存在及其结构组成。例如，这些抗原决定簇可以包括从不同HIV分离物中得到的HIV gp120不同的抗原决定簇以产生交叉反应的免疫应答。同样，可以将各种不同的HIV gag基因顺序结合到重组载体当中，以改变重组制备HIV颗粒的致免疫性，也可使用编码了突变HIV基因序列的载体来产生能够改善致免疫能力和抗病毒效应的重组HIV颗粒。申请人认为，结合有这种修改的核心和/或衣壳蛋白的重组制备的逆转录病毒颗粒属于本发明和后面所附权利要求的范围之内。
5.1.2.用重组载体感染/转染宿主细胞
以产生重组制备的逆转录病毒蛋白
对重组制备的逆转录病毒颗粒性质的控制在很大程度上不仅取决于所用重组载体的组成成份，而且取决于在感染或转染过程中所用的载体的结合，这种选择在本发明的整个方法中是一个主要的可变因素。作为简要的说明，申请人发现用携带有HIV-1 gag基因(v-gag2)的单一重组疫苗菌株感染BSC-40宿主细胞，可以形成被装配到病毒颗粒中的HIV-1核心蛋白。然而，当用v-gag2和携带HIV-1 env基因(v-env5)的重组疫苗共同感染这些相同细胞时，导致这些装配颗粒结合有并且在其表面上呈现出HIV-1衣壳蛋白(后面第6部份)。因此，虽然用v-gag2感染后形成只含有核心蛋白的颗粒，但将v-env5加入到该感染系统中可以产生结合有衣壳蛋白的结构更为复杂的颗粒。对以上的说明再深入一步，预料用v-gag2，v-env5和第三种携带有从HIV-2中得到的env基因的重组疫苗共同感染宿主细胞会形成有HIV-1核心 以及HIV-1和HIV-2衣壳旦白的异种颗粒。作为另一种选择，也可以将编码了多个HIV基因的单一种重组疫苗病毒用作感染载体。正如由后面第7部份实例所描述的那样，用这种疫苗病毒载体感染的宿主细胞也产生出免疫活性的重组制备的HIV-1颗粒。
同样的原理也适用于其他载体系统，如质粒载体来转染宿主细胞产生重组颗粒。例如，可以用单独一个编码了HIV env和gag的质粒载体或一个编码HIV env，gag和其他HIV基因的载体转染宿主细胞。也可以用多个分别编码不同HIV基因或HIV基因结合的质粒载体来转染细胞。而且，还可以用设计成对该颗粒产生系统增加其他HIV基因表达的载体对该转染的细胞系再次进行转染。可以使用编码了可调节启动子的载体，对转染宿主细胞中HIV蛋白的表达进行调节(如后面的第8.3.2节)。可以使用编码了其他HIV基因的载体来影响在转染细胞中，它们与HIV结构基因连同一起的表达，可以将这种HIV调节和/或辅助蛋白在该系统中的表达作用一种改变颗粒特征和/或它们的生产水平的方法。
重要的是要注意到在没有gag蛋白存在的情况下是不能够形成颗粒的，因此，在该重组载体中必须包含有基本的HIV核心蛋白基因序列。尽管在装配该颗粒时不需要HIV蛋白酶，但是在形成感染性病毒粒子过程中它是具有作用的(Peng et al.1989.Virology 632550)。因此，在重组制备的HIV颗粒制备过程中，最好包括HIV蛋白酶的功能，以便这些颗粒与天然病毒粒子非常接近。另外，可以用从HIV-1，HIV-2或它们的不同分离物中得到的gag基因来构建重组载体。正如本领域专业人员会清楚地知道的那样，上述的多重感染方法，和运用其他重组载体的类似方法都可以被用来制备具有广泛的表面和核心抗原特征的重组HIV颗粒。各种不同组合的数目基本上是没有限制的。
所选择的特定宿主细胞也会影响用本发明方法所制备的颗粒的性质。所选择的细胞要能够表达和正确地加工处理成熟HIV蛋白。由于HIV衣壳蛋白gp120和gp41被糖基化，并且是通过蛋白水解酶切割由较大的gp160前体派生出来的，因此要选择一种细胞能够控制这些翻译后的加工修改过程。当然，如果使用重组病毒载体，宿主细胞必须对重组病毒的感染有易感性。在本发明的优选实施方案中，使用了来源于人类、猿或啮齿动物的宿主细胞。
可以用重组疫苗病毒按照下面第6部分中所述的条件感染宿主细胞，或者用重组质粒载体按照下面第8部份中所述转染宿主细胞，当使用如下第6部份所述的重组疫苗载体系统时，可以用每种重组疫苗病毒大约10PFU/细胞的感染重复数(MOI)对细胞进行感染。但是，该技术的专业人员明白，可以增加或减少一个或多个重组疫苗的MOI，以影响所产生颗粒的性质。在设计多嗜的或异种的颗粒时这将是一个重要的因素。例如，可以通过用一个合适的相应MOI比率的感染来获得异种颗粒表面上HIV-1与HIV-2衣壳抗原的所需比率。
在如下第六部份中详细描述的一个特定实施例当中，用重组疫苗病毒v-env5和v-gag2共同感染培养的非洲绿猴的肾脏(BSC-40)细胞。被感染的BSC-40细胞合成出HIV-1衣壳蛋白gp120，gp41和gp160前体，以及HIV-1 gag蛋白p24，p17，p15，p55，p45，和p39。而且，至少p24，p17，gp120和gp41装配颗粒对多克隆抗-HIV-1抗血清以及对p17，p24，gp120和gp41有特异性的单克隆抗体是有免疫反应的。通过薄层切面电子显微镜及免疫金(immunogold)标记对重组制备的HIV-1颗粒进行超微结构分析，表明它与天然HIV在形态学上基本上是一致的。关于这一点，观察到重组制备的HIV-1颗粒是具有直径在100和120nm之间的球形物体，并且含有一个取决于切面角的柱形或球形的电子稠密的内核。通过俘获酶免疫测定和使用抗p24和p17的单克隆抗体进行免疫电子显微镜分析，分别证实了HIV核心结构的一致性。使用对HIV-1gp120和gp41特异的单克隆抗体进行免疫电子显微镜分析表明在重组制备的HIV-1颗粒表面上存在有gp120/gp41配合物。还观察到与HIV-1病毒粒子的形态学发生过程相一致的各种形式的未成熟颗粒。这些特征与从HIV-1病毒粒子的类似分析中观察到的特征实际是一致的(将图4中所示的电子显微镜照片与Gelderblom等人在1988，Micron and Microscopia 1941中的Gelderblom等人在1987，J.Virol.156171中提供的那些电子显微镜照片进行比较)。申请人的结果表明这些重组制备的HIV-1颗粒的超微结构与活HIV-1的超微结构不同之处仅在于它们不含有病毒基因组或反转录酶。
还可以用编码了HIV gag，env和其它HIV基因的重组质粒载体转染细胞来产生本发明的重组HIV颗粒。在下面的8.2节中描述了本发明这方面的各种具体的实施例。在一个特定实施例中，用编码了HIV-1 gag，env，tat和rev基因的质粒载体转染中国大田鼠卵巢(CHO)细胞。获得了表达和分泌重组HIV-1颗粒形式的被加工的env和gag蛋白的稳定CHO细胞系。使用通过各种质粒或其结合转染的Hela，BSC-40和Vero细胞可以得到类似的结果(见下面;例如8.3.1节，8.3.2节和8.3.3节)。
5.2 识别和分离含有免疫反应性核心和
衣壳蛋白的非复制性重组颗粒
可以通过各种免疫化学方法和/或通过电子显微镜(EM)显影识别重组制备的颗粒。可以使用免疫化学检测方法如放射免疫沉淀法(RIP)，俘获酶免疫测定法(EIA)，Western印迹分析及其类似方法。下面的第6部分通过举例方式描述了如何使用这些方法识别重组制备HIV颗粒的一些具体的实施例。可以使用各种EM方法、如下面6.1.3节中所述的薄切片EM和免疫电子显微镜技术，来识别重组制备的HIV颗粒并描述其特性。可以使用的其它EM技术包括扫描电子显微镜(SEM)，表面复制电子显微镜，和免疫冷冻超微切开术(immunocryoultramicrotomy)，已经证明所有这些方法都可用于阐明HIV的精细结构(Gelderblom et al，1988，Micron and Microscopia，1941)。
可以用该技术中熟知的标准方法从宿主细胞的培养基中分离出重组制备的颗粒。但是重要的是，所使用的分离方法要使gp120的脱落水平减至最小，以便使重组制备的HIV颗粒的致免疫性增至最大。
5.3 测定非复制性重组制备颗粒的致免疫性
可以通过监测免疫后实验动物的免疫应答来测定重组制备颗粒的致免疫性。实验动物可以包括小鼠、兔子、黑猩猩，甚至人。可以考虑的几种免疫途径包括口腔、真皮内、肌内，腹膜内、静脉内、皮下、鼻内等途径。可以从三个方面对重组制备的HIV颗粒免疫原所诱导的免疫应答进行分析(a)运用已知的技术如酶连接免疫吸附剂测定法(ELISA)，免疫印迹法，放射免疫沉淀法等测定所产生的免疫血清对真正的HIV抗原的反应性，(b)免疫血清在体外中和HIV感染性的能力(Robert Guroff，1985，Nature 31672)，和(c)防止免疫动物HIV感染和/或减少感染症状(Francis，1984，Lancet 21276;Gujdusek，1985，Lancet 155)。
在一个特定实施例中，测定分离的重组制备HIV-1颗粒(下面的第6部分)在兔子体内的致免疫性(下面的第14部分等)。这种分析的结果表明，重组制备的HIV-1颗粒具有高度的致免疫性，因为这种颗粒可以激发对HIV衣壳和核心结构蛋白具有特异性的明显的体液和细胞免疫应答。而且，用重组制备的HIV-1颗粒免疫的兔子产生HIV-1的中和抗体。
在一个有关的实施例中，对重组制备的HIV-1颗粒化非人的灵长类动物中的被免疫性进行了评价(见下面的第16部分)。具体地说，用重组制备的HIV-1颗粒与其它HIV-1抗原联合使用对Macaque猴子进行免疫。可通过各种测定方法，包括全部病毒的ELISA，gp120 ELISA，病灶免疫测定(focal immunoassay)和淋巴组织增生反应来测定免疫动物体内的免疫应答。正如下面第16部分等中的实施例所描述的，作为初级和二次免疫反应的唯一免疫原，重组制备的HIV-1颗粒可激发HIV-特异性体液和细胞免疫应答。当用来免疫预先使用过一种编码了HIV-1 env和gag抗原的重组疫苗病毒的动物时，重组制备的HIV-1颗粒尤其有效。
5.4 疫苗配制品
本发明的一个特定实施例就是配制能够激发有助于预防逆转录病毒感染或发生逆转录病毒相关疾病如艾滋病的免疫应答的疫苗。该疫苗配剂用本发明的重组制备的逆转录病毒颗粒作为免疫原，这种免疫原结合有一些重要的逆转录病毒核心和衣壳蛋白，所以在性质上是多价的。在一些有关的实施例中，可以用重组制备的逆转录病毒颗粒作为特异性免疫学加强剂，将它用来使已经感染逆转录病毒的个体内的逆转录相关疾病向好的方向发展。
5.4.1 抗人体免疫缺陷病毒的疫苗
本发明的另一个特定实施例包括能够激发有助于防止HIV感染或发生艾滋病的免疫应答的疫苗配制品。这种疫苗配剂使用重组制备的HIV颗粒作为免疫原。
按照传统的方法，病毒疫苗是由减毒的或失活的完整病毒制备的。一直没有一种好的方法可以用来设计一种主要抗HIV-1的疫苗，这主要是因为大量制备病毒、潜在的不完全病毒活性和将HIV基因组输入到健康受体中可能带来的危险性(Minor，1989，J.Antimic-robial.Chemotherapy 23，Supp.A55)。因此HIV疫苗的研制集中到了亚单位疫苗上面。虽然最初倾向于使用含有重组gp120衣壳蛋白的亚单位配制品，但是目前已经清楚，gp120和gp41都是产生中和抗体(Chahn et al.，1986，EMBO J.53065;Ho et al，1987，J.Virol.612024;Skinner et al.，1988，J.Virol.624195)，传递细胞毒性(Tyler et al.，1989，第五届艾滋病国际讨论会，Abstract T.C.O.33521)，和带来细胞毒性T淋巴细胞杀伤易感性(Zarling et al.，1987，J.Immunol.139988)的靶抗原。这些结果主张在设计HIV-1疫苗时要包括有gp120和gp41。
由于gp41与细胞膜结合在一起，并且它与gp120有较弱的非共价的相互作用，使得纯化完整的可溶性gp120/gp41配合物成为不切实际。更为重要的是，像其它以膜结构成分出现的病毒抗原如乙型肝炎表面抗原(Cabral et al.，1978，J.Gen.Virol.38339)和单纯性疱疹病毒糖蛋白(Ho et al.，1989，J.Virol.632951)一样，膜结合的gp120/gp41配合物很可能比可溶性的相应物更具有致免疫性。
正如本申请的发明背景部分中所讨论的，HIV的几个特征使得制备一种有效的HIV疫苗复杂化。本发明可以避开许多问题，如果不是避开了大多数问题的话。除了在它们的自然构造中含有gag和env蛋白外，还可以对本发明的重组制备HIV颗粒进行设计，保留所需要的抗原决定簇，而去掉或修饰不需要的抗原决定簇。而且，通过本发明提供的方法可以将同一HIV蛋白的几个不同的可变抗原决定簇结合到用于疫苗配剂中的颗粒中。本发明还提供了一种产生异种的重组制备的HIV颗粒的方法，使用这种颗粒可以配制一种能够防止HIV-1和HIV-2感染的疫苗。
利用本发明进行的接种方法的新特征之一是可以将一组这些和其它这种抗原决定簇合并到一个致免疫性颗粒当中。而且，这些抗原决定簇和它们在天然HIV上一样被带到该免疫系统中，从而诱导出有效地抵抗天然病毒感染的免疫应答。
5.4.1.1 HIV-1疫苗
对于抗HIV的保护免疫性尚没有完全解释清楚。由于HIV能够以与细胞无关或有关的形式传染，一般认为可能需要中和抗体和细胞传递的免疫力。在HIV-1感染的个体中已经识别出可以识别多个不同HIV抗原决定簇的中和抗体，包括那些可以识别在衣壳蛋白gp120的高度保留区域和可变区域上的抗原决定簇的抗体。同样，已经识别出抗gp41和p17的抗原决定簇的中和抗体(Papsidero et al.，1989，J.Virol.63267-272)。在HIV感染的个体中检测出的其它抗体包括那些对结合到CD4细胞表面受体上的gp120区域具有特异性的抗体。还有一些结合到gp120的高度可变区上的其它抗体能够抑制HIV感染的细胞融合成合体细胞(Rusche et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.O.S.A.853198)。在HIV感染的人体当中还可以看见细胞免疫应答，具体地说，已经识别出抗env，gag和pol基因产物的细胞毒性T-淋巴细胞(Walker et al.，1987，Nature 328345;Nixon et al.，1988，Nature 336484;Riviere et al.，1989，J.Virol.632270-2277)。
本发明的一个实施例是一种抗HIV当前最流行形式的HIV-1病毒的疫苗，该疫苗使用了重组制备的HIV-1颗粒病毒的疫苗，如下面第6部分中所述的重组制备的HIV-1颗粒，这种颗粒含有Ⅰ型病毒的成熟核心和衣壳蛋白，被装配在一个与活HIV的形态学和抗原性相仿的结构中。这一实施例包括运用各种重组制备的HIV-1颗粒的疫苗配制品。例如，可以使用同时带有两个或多个HIV分离物上的gp120/gp41配合物的颗粒来诱导产生抗多个可变区抗原决定簇的保护性抗体。可以用分别带有从不同HIV-1分离物中获得的env基因的多个不同的重组疫苗病毒共同感染宿主细胞来制备这样一些病毒。用这种颗粒免疫的个体能够产生抗多种不同HIV-1株的免疫应答。
同样，多嗜性颗粒的结构也可以增加该疫苗配制品的效能。在这个实施例中，所设计的颗粒结合有从HIV-1株中得到的具有不同嗜性的抗原决定簇。例如，利用多重感染方法可以制备显示对单核细胞相关HIV-1株独特的、并与T4细胞相关病毒株共有的决定簇相结合的重组制备的HIV-1颗粒。具体地说，可以使用三种重组疫苗，一种带有从一种菌株中获得的gag基因，一种带有从该同一菌株中获得的env基因，而另一种带有从一种嗜性不同的菌株中获得的env基因，共同感染宿主细胞来制备这种颗粒。
最有效的抗HIV-1的疫苗包括将本发明的重组制备的HIV-1颗粒与其它免疫原联合使用。关于这一点，在非人类灵长类动物中用重组gp160初次免疫后，将重组制备的HIV-1颗粒用作二次免疫原时，呈现出最有效地激发体液和细胞免疫。
5.4.1.2. HIV-2疫苗和异种疫苗
本发明的其它实施方案涉及到抗HIV-2的疫苗以及异种疫苗，可以包括例如用于HIV-1和HIV-2的单独一种疫苗。用于这种异种疫苗的重组制备颗粒可以包括例如HIV-1的核心蛋白和HIV-与HIV-2的衣壳蛋白。作为另一种选择，还会希望制备一种由两种或多种不同的重组制备的HIV颗粒组成的疫苗。尤其在设计一种疫苗可以预防HIV-1和HIV-2的许多不同分离物时更是如此。
可以用一种合适的辅剂配制含有单独一种重组HIV颗粒类型或不同类型结合在一起的疫苗，以增强对它们抗原的免疫学应答。合适的辅剂包括、但不限于矿物胶，表面活性物质，如溶血卵磷脂，多离子多元醇，聚阴离子，肽，油性乳剂，和可能有用的人类辅剂如BCG(卡介苗bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌。
可以使用上述的在该技术中熟知的多种方法来接种这种疫苗配制品，包括真皮内划痕、静脉注射，皮下注射、肌肉注射、鼻内给药、口服给药等方式。
6.实施例非复制性重组体制造的HIV-1
颗粒的产生和分离
这里描述的是一种产生重组体制造的HIV-1颗粒的体外系统，该颗粒含有装配的核心与衣壳蛋白质，并且在其表面上呈现出envgp120和gp41抗原。简单地说，用携带HIV-1之完整衣壳基因(v-env5)或完整HIV-1 gag及蛋白酶基因(v-gag2)的重组牛痘病毒共感染BSC-41细胞。HIV-1蛋白是在BSC-40细胞中表达的，并组装到由细胞膜上芽生的HIV-1颗粒中。所产生的颗粒是非复制性的，其可与对HIV-1衣壳及核心蛋白质具有特异性的单克隆抗体反应，并且在形态学上相似于HIV-1病毒粒子。
6.1.一般方法
6.1.1.细胞和病毒
在添加10%胎牛血清和各100单位/ml青霉素及链霉素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Gibco，Grand Ishand，NY)中增殖非洲绿猴肾细胞(BSC-40细胞株，其为衍生于BSC-1细胞，ATCC No.CCL26的非洲绿猴细胞的连续细胞系)。
按照共同待批的905，217号美国专利申请(申请日1986年9月9日)中所述方法制备携带HIV-1 env与gag基因序列的重组牛痘病毒，并对其进行评估。重组牛痘病毒v-env5携带HIV-1的完整env基因。重组牛痘病毒v-gag2则携带完整的HIV-1 gag和Prt基因及部分pol基因。
从购自Wyeth Laboratories(Marietta，PA)的商品天花病毒(Dryvax Lot 321501G)制品中纯化牛痘病毒的New York City Board of Health病毒株。用PBSAM(见下文)稀释天花病毒并在BSC-40细胞上进行连续三次噬斑纯化。在BSC-40细胞上由这种噬斑纯化的分离物中制取储备物(下文称为V-NY)，并用以构建重组体病毒。
6.1.2.HIV衣壳与核心抗原的检定
使用四种技术检定HIV-1 env与gag蛋白放射免疫沉淀法(RIP)、俘获酶免疫分析法(EIA)、Western印迹分析法及免疫电镜镜检法。
放射免疫沉淀法基本上是按已述方法(Haffar et al.，1988，J.Cell.Biol.，1071677)使用人多克隆抗HIV-1血清(Trimar，Inc.)进行的。简单地说，即以每个病毒每个细胞10PFU的重复感染数(MOI)感染BSC-40细胞。感染后12小时，用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸(100μCi/ml)对细胞放射标记4小时。收集培养基并用PBS洗细胞，收获细胞，并在RIP缓冲液(PBS中加入1%NP40、0.5%脱氧胆酸盐、0.1%SDS)溶解之。然后使核后细胞溶胞产物或培养基与多克隆抗血清反应30分钟。室温下抗体-抗原复合物与10%戊二醛固定的金黄色葡萄球菌(Staph A)保温30分钟。离心沉淀Staph A-抗体-抗原复合物，并用RIP洗涤缓冲液(PBS中加有1%NP40、0.1%SDS)洗两次。所得到的团块用SDS-PAGE样品缓冲液溶解(Laemmli，1970，Nature 227680)、在11.5%聚丙烯酰胺凝胶中分级分离，并用放射自显影法显现免疫沉淀的蛋白质。
可按已述方法(Hu et al.，1987，Nature 328721)，使用抗P24单克隆抗体，以俘获酶免疫分析法和Western印迹法特异地检测HIV-1 p24。用在p24蛋白中限定交迭序列的重组融合肽免疫小鼠，以产生用于俘获酶免疫分析法和Western印迹法的单克隆抗体。在Genetic Systems(Seattle，WA)上产生单克隆抗体25-2和25-3，这些抗体已在美国专利申请054，026号(申请日1987年4月30日)和105，761号(1987年10月7日)中述及。
使用对gp120特异的MAb110-4(Thomas et al.，1988，AIDS Res.Hum.Retroviruses 225;Linsley et al.，1988，J.Virol.，623695)和对gp40特异的MAB41-1(Gosting et al.，1987，J.Clin.Microbiol.，25845)，以免疫电镜检测法检定重组体制造的HIV-1颗粒表面上的gp120和gp41衣壳蛋白，并阐明成熟重组体制造之HIV颗粒的形态学，下文6.1.3.节中描述电子显微镜检技术。
6.1.3.电子显微镜检术
按下述方法分离并制备用于EM显象的重组体制造的HIV-1颗粒由感染15小时的细胞培养物中收集培养基并合并之。在冷冻的平顶离心管中，以600xg离心，由污染细胞中澄清出培养基。然后以120，000xg超速离心，由澄清的上清液中分离出颗粒部分。作为微颗粒后材料(S)收集所得到的上清液。将颗粒部分重新悬浮于pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并通过15%蔗糖溶液层，以120，000xg超速离心重新沉淀之。两次沉淀的材料即为颗粒部分(P)。
反复用PBS轻轻复盖沉淀团块后吸出，如此将沉淀的颗粒沉淀物(P)洗几次。然后用4%多聚甲醛将沉淀团块固定20分钟，并再次用PBS洗涤。以相似方法，用适当的重组病毒感染小单层BSC40细胞(104-105个细胞)。15小时后弃去生长培养基，并再用PBS将细胞单层洗几次，然后于22℃下用4%多聚甲醛固定20分钟。
用PBS将固定的细胞和固定的颗粒沉淀物洗5次，然后用含有0.8%牛血清白蛋白(BSA)、0.1%明胶和5%正常羊血清的PBS溶液(封闭缓冲液)封闭30分钟。倾去封闭溶液并向细胞内加入单克隆抗体(作为在封闭溶液中1∶2000稀释的腹水液)并保温2至3小时。用PBS洗细胞，然后与1∶5稀释的金结合的羊抗小鼠第二抗体(IgG结合到15nm胶质金上;Janssen，Piscataway，NJ)继续保温2小时，用PBS洗并在2%戊二醛中固定。样品于22℃下与在0.1M Cacadylate缓冲液中的1%四氧化锇(OsO4)保温30分钟。用PBS充分洗涤样品，并在35%、50%和75%乙醇中连续保温3分钟使之脱水，然后将样品在22℃下用在70%乙醇中的乙酸双氧铀(uranyl acetate)染色30分钟。按上述方法，再次于80%、90%、95%和最后的100%乙醇(3次)中22℃连续保温，进一步脱水。
然后按下述方法将样品包埋到甲基丙烯酸酯树脂中分别用无水乙醇/塑料(2∶1)将样品处理1小时，用100%塑料处理过夜。然后于60℃下使树脂聚合2天。由园盘上机械除去有包埋之样品的塑料，并切成薄片(100nm)，然后收集在聚醋酸甲基乙烯酯涂层的栅格上。栅格用饱和乙酸双氧铀/柠檬酸铝(Millonig′s)染色10分钟，并充分洗涤之。干燥后用JEOL100B透射电子显微镜以60kv，100，000倍观察栅格。
6.2.含成熟gag和env蛋白之非复制性重组体
制造之HIV-1颗粒的产生
6.2.1.分析在重组牛痘病毒感染之BSC-40
细胞中表达的HIV-1蛋白质
按上文6.2.1节所述，使用人多克隆抗HIV-1血清，以RIP方法分析由v-env5、v-gag2、两种重组体、或亲代牛痘病毒V-NY感染的代射上放射标记之BSC-40细胞的溶胞产物及生长培养基，以检测HIV-1蛋白质。如图1中所示，在v-env5感染之细胞的溶胞产物中检测出gp160env前体蛋白质，及其蛋白水解加工产物gp120和gp41(泳道A)。另外，检测到v-env5感染的细胞分泌的gp120(泳道B)。在v-gag2感染的细胞中合成的p55gag前体也受到加工，产生成熟的gag蛋白质p24、p17、p15及两种中间前体p45和p39(泳道E)(Gowda et al.，1989，citation)。令人感兴趣的是，在培养物上清中也检测到了gag蛋白质(泳道F)。
被v-env5和v-gag2共感染的BSC-40细胞所产生的已加工之env和gag蛋白质与个别感染的细胞中所表达者完全相同(泳道C，与泳道A和E比较)。由这些双重感染的细胞所产生的成熟env和gag蛋白质同样集中在培养物上清液中(泳道D，与泳道B和F比较)，它们具有相同的动力学。此外，对乳过氧化物酶催化的原生质膜相关蛋白质的碘化作用表明，在v-env5感染的细胞中与双重感染的细胞中一样，gp160、gp120和gp41均运输到细胞表面上(图2，泳道A和B)。
6.2.2.分离非复制性重组体制造的HIV-1颗粒
为了检测是否由感染的BSC40细胞表达的细胞外gp120和gp41可作为可溶性蛋白质或芽生颗粒的成分被释放出来，将培养物上清液分离成颗粒(p)和颗粒后(S)部分(见上文6.1.3节)，并与未分离的培养物上清液(TS)进行平行的RIP试验，以分析各部分的HIV蛋白含量。如图3(1)(泳道A、B和C)所示，测知由v-env5感染之细胞衍生的细胞外gp120主要在S部分中，此提示该蛋白质不是芽生颗粒的成分。然而，测得由V-env5和v-gag2共感染之细胞衍生的gp120在P部分及S部分中(分别见图3(1)，泳道E和F)，尽管颗粒形成相关的gp120对可检测之细胞外gp120总体水平的贡献很小。
与gp120相反，只在双重感染之细胞的P部分上清中检测到gp41(图3(1)，泳道E对D和F)，此表明gp41仅仅与芽生颗粒结合。有趣的是，虽然含量很少，但在双重感染之细胞上清的P部分中检测到了gp160env前体(图3(1)，泳道E对D和F)。
对由感染的BSC-40细胞表达的HIV-1核心蛋白进行了相似的分析。在v-gag2感染的(图3(1)，比较泳道H与I)和双重感染的(图3(1)，比较泳道E与F)细胞培养物上清液之P部分中均观察到所有可检测的核心蛋白质-p24、p55、p45、p39和p17。也用离心沉淀法通过15-60%的连续蔗糖密度梯度再分离得自双重感染细胞的P部分，并按上文6.1.2.节中所述用EIA法估计p24抗原的存在。图3(2)所示的结果表明p24与36%-40%蔗糖部分一同分离成一个显著的单一峰。这些结果提示，由感染的BSC40细胞表达的gag蛋白质作为粒度相当均匀的颗粒被释放出来。此外，双重感染之细胞上清P部分中存在gp120和gp41，表明从共感染细胞释放的颗粒结合了gp120/gp41复合物。这一结论进一步得到免疫电镜分析之结果的支持(见下文6.2.3节)。
6.2.3.用薄切片电子显微镜检法对重组体
制造的HIV颗粒 进行微结构分析
为了直接分析重组体制造的HIV-1颗粒，由v-env5和v-gag2共感染的BSC40细胞之培养物上清中分离P部分，并使之与gp120(MAb110-4)或gp41(MAb41-1)特异性单克隆抗体(MAbs)反应。基本抗原-抗体复合物再与包埋在塑料中的第二抗体-胶质金结合物反应，并按上文6.1.3.节中所述用薄切片电子显微镜检术观察之。这些分析表明，含有电子致密柱形(图4，“a”和“c”)或球形(图4，“b”)核心的直径约100-120nm的颗粒在形态学上相似于被分离之HIV-1病毒粒子的EM影象(Gelderblom et al.，1988，Micron and Microscopia，1941;Gelderblom et al.，1987，Virology，156171)。此外，用胶质金结合物标记颗粒，表明在它们的表面上呈现出gp120(图4，“a”和“b”)和gp41(图4，“c”)。
使用抗gp120MAb对被两重组牛痘病毒共感染的完整BSC40细胞进行相似分析。观察到大量对gp120抗原呈阳性反应的100-120nm颗粒。假设大多数与这些细胞相关联的颗粒具有两种独特形态之一，其一个特征是分散的囊泡形式(图4，“e”，开放箭头)，另一种不同的形态是有离域定位的、厚的双膜区(图4，“d”，双箭头)。申请人推测这些不同的结构代表不成熟颗粒的各种形式，此可与HIV-1病毒粒子形态形成期间出现者平行。有时可在细胞表面附近看到含有充分形成之棒状壳体结构的颗粒，此正如图4，“e”(开放箭头)所示之电镜图象中追踪到的。由细胞膜上芽生的牛痘病毒颗粒没有结合gp120(图4，“d”，双箭头)。
6.2.4.重组体产生之HIV-1颗粒的核酸含量
与对gag或env序列有反应性的RNA探针进行点印迹杂交，以检测重组体产生之HIV-1颗粒的核酸含量。按照制造商推荐的方法，使用Promega Riboprobe体外转录试剂盒，在放射标记的核苷酸存在下，经体外转录携带gag或env序列的DNA模板以合成探针。简单地说，将相当于300ng p24的重组体颗粒溶解于RNA制剂溶解缓冲液[2M异硫氰酸胍、125mM柠檬酸钠(pH7.0)、0.125%Sarkocinate、50%二甲基亚砜]中，并转印到硝化纤维素滤膜上，对各种浓度相似溶解的补骨脂素失活的HIV(相当于2600ng、260ng、26ng和2.6ng P24)作平行检测。制备分别与gag特异性或env特异性探针反应的滤膜。将硝化纤维素滤膜于42℃下，在杂交缓冲液(3×ssc、50%甲酰胺、5×Denhardt氏溶液和150μg非特异性RNA)中保温2小时，然后加入各探针。滤膜与探针于42℃下保温过夜，然后用0.1×ssc/0.1%SDS溶液充分洗涤，空气干燥，并用放射自显影术分析之。
图5中显示了点印迹杂交的放射自显影图谱。重组体颗粒样品中只有gag探针与核酸反应(A组对B组)。相反，两探针均与补骨脂素灭活的对照组病毒反应。这一结果提示重组体产生的HIV-1颗粒包裹了gag RNA，而未包裹env RNA。此结论符合这一事实，即用以产生v-gag2牛痘重组体病毒的gag基因包括了最近鉴定为HIV病毒RNA之包裹信号的5′未转译序列(图5，C组，箭头)。
这些结果表明，重组体制得的HIV-1颗粒不具有复制能力。这一结论得到了下文12节中所述实验的支持，它证明，与重组体产生之HIV-1颗粒长时间保温的CD4+细胞中没有细胞内HIV抗原。
7.实施例使用单一重组牛痘病毒载体产生非复制性
重组体制造的HIV-1颗粒
作为用两种重组牛痘病毒载体产生重组体制造之HIV-1颗粒(见第6节)的一个可替代方法，可使用包括构建含HIV-1 env和gag基因之重组牛痘病毒的单一病毒载体系统。下列实施例中，使用含有HIV-1 env和gag基因的重组牛痘病毒感染BSC40细胞。被感染的细胞表达HIV-1的衣壳和核心抗原，其装配在被感染细胞内以产生重组体HIV-1颗粒。由被感染细胞之培养基中纯化的重组HIV-1颗粒是具有体内免疫原性的。
7.1. 一般方法
7.2.构建V-G2E5一种含HIV ENV和
GAG基因的重组牛痘病毒
用限制性核酸内切酶EcoRI由质粒pv-env5(见共同待批美国专利申请No.07/593，401，申请日1990年10月5日)上切下含有HIV-1之完整env编码序列(其受牛痘病毒7.5K启动子的控制)的3.2kbp片段(核苷酸5707-8608)。将该片段插入质粒pv-gag2N(该质粒与共同待批美国专利申请07/593，401中所述者基本相同，只是在gag编码序列下游的SmaⅠ位点插入了一个含转译终止信号的合成接头)的EcoRI位点中。质粒pv-gag2N也含有处于牛痘病毒7.5K启动子控制下的HIV-1 gag基因。图6中给出了构建质粒pv-G2E5的流程。用共同待批美国专利申请No.07/593，401中所述的体内重组法，将HIV-1 gag和env基因引入牛痘病毒的胸苷激酶基因中，从而产生含有HIV-1之gag和env基因的重组牛痘病毒V-G2E5。
7.3.在V-G2E5感染的BSC-40细胞中共表达
HIV-1衣壳和核心抗原
以5pfu/细胞的重复感染数，用重组V-G2E5感染非洲绿猴肾细胞(BSC-40)。感染后24小时洗细胞并在7-15%凝胶上经SDS-PAGE分离溶胞产物。将细胞溶胞产物中的蛋白质转移到硝化纤维素滤膜上并与HIV阳性人血清反应，然后与连接到棘根过氧化物酶上的羊抗人免疫球蛋白抗体反应。图7所示结果表明HIV-1的衣壳和核心抗原均在V-G2E5感染的细胞内得以表达和加工。两种抗原的水平与单用含env或含gag的重组牛痘病毒表达者差不多。
7.4 V-G2E5感染之BSC-40细胞
产生的重组HIV-1颗粒
使用重组V-G2E5由BSC-40细胞中产生HIV-1样颗粒。将BSC-40细胞接种在Cytodex 3小珠(Pharmacia LKB Biotechnology)上，并按厂商推荐的方法在含有5%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle氏培养基中，于转瓶内培养之。当细胞达到融合时，用重组牛痘病毒V-G2E5以5pfu/细胞的MOI数感染之。吸附1小时后，用新鲜培养基洗细胞两次，以除去过量接种物。37.5℃保温24小时后，收集培养基并以低速离心除去细胞碎片。然后在19型转子(Sorvall)中以19，000rpm将预澄清的培养基离心3小时。将此高速离心的沉淀物重新悬浮于PBS，合并后使用SW55Ti转子(Beckman)以32，000rpm离心1小时再次沉淀之。将最后的沉淀物再悬浮于冷PBS中并储存于-70.5℃下备用。基本上按着上文6.1.2.节所述方法，分别用p24抗原俘获及免疫印迹法定量分析该颗粒制剂的p24和gp120抗原含量。
图8中给出了由V-G2E5感染之细胞产生的颗粒的放射免疫沉淀分析结果。这些结果表明，高速离心后，被感染细胞培养基的沉淀团块部分中存在gp120和p24抗原，此表明这些成熟的病毒粒子蛋白质选择性地组装成颗粒形式。这些颗粒中相对富集了p24和gp120，相似于HIV-1病毒粒子制剂中的含量，这是由重组体制造的颗粒与固有HIV-1病毒粒子之间的结构和生物学相似性所决定的。
8.实施例将质粒DNA转染到哺乳动物细胞中
产生非复制性重组体制造的HIV-1颗粒
除上文6和7节中所述的使用重组牛痘病毒载体产生重组HIV-1颗粒的系统外，还可使用包括用编码HIV-1 env和gag基因的DNA转染哺乳动物细胞的系统。
可使多种方案以本文描述的系统产生重组体HIV颗粒，其包括但不仅限于(1)转染含有多个HIV结构和调节基因的复合质粒载体，(2)共转染含不同HIV基因的多重质粒载体，(3)同时使用必要的和可调节的增强子/启动子元件，以驱动HIV蛋白质的表达，(4)使用包括tat和/或rev的HIV调节蛋白以间接控制HIV gag和env结构蛋白质的表达，(5)使用不同的细胞系表达HIV蛋白质及重组HIV颗粒，(6)使用编码被修饰之HIV蛋白质的质粒载体。可以作某些改动，以使该系统适用于不同的细胞类型，达到最佳化，并操纵重组HIV颗粒中不同的蛋白质种类和结构。
8.1.质粒结构
用于该系统的许多质粒载体均含有衍生于表达载体pH3MPy的杂合CMVHIV增强子启动子(称为CmHi)，所说的载体含有与HIV之增强子和tat区融合的巨细胞病毒直接早期基因的增强子(核苷酸-69至+78)。其中某些质粒载体含有可选用的得自巨细胞病毒直接早期基因(称为CMV)或小鼠金属硫因-Ⅰ基因(Mt)的增强子启动子元件。这些调节元件被连接到编码HIV蛋白质的基因序列上，然后是含Ela基因poly A附加位点之腺病毒2的HpaⅠ至HhaⅠ(核苷酸1569-1680)片段，接下来是克隆到质粒Bluescribe+(Strategene)中的pBR322的BamHI至SphⅠ片段。由这些质粒载体编码的个别HIV蛋白质示于表Ⅰ中，这些质粒的构建流程则示于图9中。
表Ⅰ
由质粒载体编码的HIV基因
载体 HIV基因
Gag+Pro Tat Rev Env other
CmHiEnv5(1104-(b1) +
CmHiTgfbEnv5(1113-a1) +
CmHiGag2Rre(1158-a1) +
CmVGag2Rre(1159-a1) +
CmHiRev(1132-c1) +
CmvRev(1152-a1) +
CmHiTat(1132-b1) +
BsMtRev(1202-2) +
BsMtTAT(1203-1) +
CmHIVdelXmn(1133-a1) + + + Vif，Vpr，
Vpu
CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) + + + + Vpu
(1160-a1)
质粒CmHiEnv5(1104-b1)具有pH3MpY的NruⅠ至HindⅢ片段，其含有巨细胞病毒直接早期基因增强子和HIV启动子及tat元件，并连接到HIV衣壳Env5基因暗盒(5671-8572，AvaⅡ至KpnⅠ)上。
质粒CmHiTgfbEnv5(1113-a1)含有连接到嵌合TGF-βHIV env基因上的pH3MPy的NruⅠ至PstⅠ增强子启动子片段;提供5′非转译区和信号肽的猴TGF-β基因被直接融合在由核苷酸5856延伸至核苷酸8572处之KpnⅠ位点的HIV env基因信号裂解位点上。
质粒CmHiGag2Rre(1158-a1)含有连接到从核苷酸257处BssHⅡ位点延伸到核苷酸3372处Asp718位点之HIV gag和Pol编码序列上的、pH3MPy的NruⅠ至XbaⅠ增强子启动子片段。这是一个与包含在重组牛痘病毒v-gag2中之gag编码序列同样的区域，并包括完整的gag读码，其后是大约一半的pol读码。该区域中还包括编码HIV蛋白酶的序列，以及大部分但不是所有的反转录酶编码区。提供转译终止密码子的XbaⅠ接头被连接到Asp718位点上。其后是由核苷酸7178处BgIⅡ位点延至7698处HindⅢ位点的，含有Rev反应性元件的HIV env基因片段。质粒CmvGag2Rre(1159-a1)与之基本相同，不同的是使用得自表达载体CDM8(Invitrogen)的NruI至XbaⅠ巨细胞病毒增强子和启动子片段。
质粒CmHiRev(1132-c1)含有无内含子HIV Rev基因之pH3MPy上游的NruⅠ至PstⅠ增强子启动子片段，其由核苷酸5500处的Bsu36Ⅰ位点延伸到核苷酸8572处的KpnⅠ位点，并缺失了核苷酸5590-7935。质粒CmvRev(1152-a1)与之大致相同，不同的是使用了得自表达载体CDM8(Invitrogen)的NruⅠ至XbaⅠ巨细胞病毒增强子和启动子片段。
质粒CmHiTat(1132-b1)含有无内含子HIV tat基因之pH3MPy上游的NruⅠ至Bg1Ⅱ增强子启动子片段，其由核苷酸5331处的Sa1Ⅰ位点延伸至核苷酸8572处的KpnⅠ位点，并缺失了核苷酸5590-7935。
质粒BsMtRev(1202-2)含有由大约-1700位之EcoRⅠ位点延伸到转录起始位点的小鼠金属硫因1基因的1.7kb片段，由核苷酸5500处之Bsu36Ⅰ位点延至核苷酸8572处之KpnⅠ位点的无内含子HIV rev基因的上游区，并缺失核苷酸5590-7935。
质粒BsMtTat(1203-1)含有从大约-1700位之EcoRⅠ位点延伸到转录起始位点的小鼠金属硫因Ⅰ基因的1.7kb片段、由核苷酸5331处之SalⅠ位点延伸到核苷酸8572位之KpnⅠ位点的无内含子HIV tat基因的上游区。
质粒CmHIVdelXmn(1133-a1)含有得自用于上述质粒中之表达载体pH3MPy的同一杂合CMVHIV增强子启动子。该质粒将HIV5′先导RNA序列掺入恰在gag读码区之N末端内的核苷酸384处的XmnⅠ位点中;该片段内含有的是切接供体位点，该位点被切接成位于许多HIV基因上游的受体位点，所说的HIV基因包括编码tat、rev和env蛋白质的基因。位于核苷酸384处的XmnⅠ位点通过一个XbaⅠ接头(其含有TAG转译终止密码子，终止约20个氨基酸残基后之gag N末端肽的转译过程)被连接到接近pol读码C末端的核苷酸4034处之XmnⅠ位点上。之后HIV序列通过编码HIV调节蛋白和较小结构蛋白(包括vif、vpr、tat、rev、vpu和HIV env蛋白)的区域延续到核苷酸8572处的KpnⅠ位点。通过在位于gag基因之N末端前面的5′切接供体位点和位于编码各种蛋白质之读码区上游的切接受体位点之间进行切接，该质粒将能够编码上面列出的各个HIV蛋白质。
质粒CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)(1160-a1)含有驱动整个gag读码和pol读码N末端部分之表达的杂合CMV-HIV增强子启动子，其直接连接在含有tat、rev和env蛋白质之编码序列的HIV基因组的3′部分中。该质粒中，表达载体p3MPy的NruⅠ至EcoRⅠ巨细胞病毒直接早期基因增强子片段被连接到开始于核苷酸-69处的HIV启动子序列上;HIV前导RNA序列通过gag基因并进入pol基因，而延续到核苷酸3372处的Kpnl位点，其被引入一个包括NheⅠ位点的多聚接头，该NheⅠ位点处含有pol读码的TAG转译终止密码子。然后HIV序列延续到核苷酸8572处的Kpnl位点。该载体含有据信对于HIV gag、蛋白酶、tat、rev和env蛋白质的合成、切接、胞质转运、转译、加工和功能均很重要的所有序列元件。该质粒将可以通过在位于gag基因N末端前面的5′切接供体位点和位于编码各蛋白质之读码区上游的切接受体位点之间进行切接，而能够编码未切接mRNA的HIV蛋白质及上面列出的各其他蛋白质。其还包含位于HIV一级mRNA转录本之前60个核苷酸内的tar元件(其对于HIV启动子的tat反活化作用是必要的)，以及位于核苷酸7315和7559之间的Rre(rev反应性元件，其对于rev催化的编码HIV结构蛋白之mRNA的胞浆内定位是必要的)。该质粒载体中不含能编码一半pol读码(包括部分反转录酶蛋白质和所有整合酶蛋白质、所有vif读码及vpr读码的N末端)之HIV基因组的中央区;该载体还缺少大部分5′LTR和所有3′LTR以及多数nef读码。
8.2.在稳定的CHO细胞中转染以产生重组体HIV-1颗粒
将质粒载体CmHIV del KpnAvr(Gag2TRE)和CmHiEnv5转染到dhfr-CHO细胞中。经用质粒pSV2dhfr共转染而选择被转染的细胞系。CHO转染体含有在颗粒形成中分泌的免疫反应性成熟gag和env蛋白质，其沉降性质与上文第6节中所述的HIV病毒粒子及重组体制造的HIV-1颗粒的蛋白质相似。
8.2.1.细胞的转染和选择
在60mm组织培养皿中，使CHO细胞于添加有10%胎牛血清和150μg/ml脯氨酸的Ham氏F12营养混合物(不含次黄嘌呤)内生长至50%融合，然后移入无血清培养基中。与Lipo-fectin(BRL)、HIV表达质粒CmHIVde1KpnAvr(Gag2TRE)(1160-a1)和CmHiEnv5(1104-b1)以及可选择质粒pSV2dhfr的混合物保温5小时，除去LipofectinDNA混合物并移回含血清培养基中，从而转染CHO细胞。转染后2-3天，将培养物移到选择性培养基(DMEM加10%FBS及脯氨酸)中。2天后，用胰蛋白酶处理培养物，并将含有约0.08%和0.4%细胞的等分样品(估计各含1和5×103个转染细胞)移入96小井组织培养皿中。将含有7.8%细胞的等分样品移入6小井组织培养皿中。
在选择性培养基中继续培养13天后，将一组6小井平皿固定，并经与爱滋病病人血清(TriMar)、然后与偶联过氧化物酶的羊抗人抗体以及棘根过氧化物酶底物(3-氨基-9-乙基-咔唑)保温，而对细胞进行免疫染色以检测HIV蛋白质的表达。每小井有15-20个选择之细胞的集落;经免疫染色分析，发现其中约有10%的集落含有HIV蛋白质。这一分析表明，接种了较少数目细胞的96小井平皿中，只有大约10至15个小井含有已转染之细胞的集落，且其中一部分将可能表达HIV蛋白质。
然后收集来自96小井平皿的每小井内组织培养基，并借助gag蛋白质抗原EIA法检测已分泌的gag蛋白质(上文6.1.2.节)。用这一检测法鉴定出许多候选小井。然后选择12个潜在阳性的小井(由三次独立转染中各得到4个)进行细胞分散处理。此时用肉眼观察阳性小井，发现有的小井是基本上融合的，其他则只有生长细胞的小集落，还有的显然没有存活的细胞。将得自所有三个潜在阳性小井的细胞分散开;用胰蛋白酶消化并将细胞移入6小井平皿中进行扩充。
此外，将各候选细胞系的小部分细胞接种到重复的24小井平皿中。生长5天后，向各小井内加入野生型HeLa细胞或Hela T4细胞(已被转染并表达CD4蛋白质)。第二天，用聚焦免疫检测法检测gag表达和env功能。简单地说，固定细胞并与人抗HIV血清、连接棘根过氧化物酶的羊抗人抗体及过氧化物酶底物(3-氨基-9-乙基-咔唑)保温。经该法检测后，有4个细胞系(分为两类)是阳性的。两个细胞系(3010-C1和3010-C6)只有少数细胞，但其染色非常浓，而且与Hela T4细胞有效地形成了巨大合胞体，但与野生型Hela细胞则未形成合胞体。另外两个细胞系(3010-C5和3010-C13)有许多阳性细胞，但其染色不太强，而且只有一部分与Hela T4细胞形成了合胞体。其他细胞系的细胞没有着染。对阳性细胞的抗体染色表明它们合成了gag蛋白质，而与Hela T4细胞形成合胞体则证明这些细胞表面上有功能性gp120和gp41衣壳蛋白质。
进一步扩充各候选细胞系后，用Western印迹法分析细胞溶胞产物的HIV蛋白质合成。用PBS将60mm和100mm组织培养皿中的细胞洗两次并直接收集到300μl或750μl Laemmli样品缓冲液中。煮沸后，经在10%聚丙烯酰胺凝胶或8-16%梯度聚丙烯酶胺凝胶上电泳，使样品中的总细胞蛋白质分解。对HIV、HIV感染的CEM细胞及牛痘重组v-gag1、v-gag2或v-env5感染的BSC-40细胞的等分样品(作为对照组)进行保温。将凝胶的内容物电泳转移到一片硝化纤维素滤膜上。滤膜与爱滋病病人血清或得自v-env5感染之细胞的gp160免疫的兔血清反应，充分洗涤，再与125Ⅰ标记的蛋白A反应，并再次充分洗涤。然后用X线胶片经放射自显影法显现反应产物。
还发现在先前的检测中鉴定的四个阳性细胞系对gag蛋白质呈阳性反应。3010-C1和3010-C6溶胞产物比3010-C5和3010-C13溶胞产物含有多几倍的gag蛋白。在先前检测中呈阴性的细胞系在Western印迹分析中对gag也呈阴性。大多数免疫反应性材料均与p55前体共迁移，并作为稍小产物，而与HIV，或HIV或VacGag1感染之细胞中的主产物不相符;细胞溶胞产物中只可测到很小量成熟p24和p17gag蛋白质。这一分析还证明阳性细胞系的溶胞产生中存在gp160、gp120和gp41衣壳蛋白质。
8.2.2.重组体制造之HIV-1颗粒的特性
为证明这些细胞中合成的gag和env蛋白质组装成病毒样颗粒并被分泌出来，收集培养物上清并以低速离心澄清之。离心(在SW55转子中32，000rpm，在SW41转子中27，000rpm，在19型转子中19，000rpm)收集颗粒部分。Western印迹分析证明该材料含有gag和env蛋白质。在颗粒中测到的基本gag蛋白质是成熟的p24和p17蛋白;也可测到较小量的p55和p40前体蛋白。反之，细胞溶胞产物中大部分为前体蛋白。gp160、gp120 gp41衣壳蛋白均可在颗粒中检测到。
比较Western印迹，可知细胞中含有的小部分gag和env蛋白质是作为颗粒分泌的。对多3010-C6细胞产生的颗粒制剂所作的定量gag抗原EIA分析表明，每毫升培养物中产生3-17ng gag。也通过在蔗糖梯度中的沉降(在SW55转子中，通过15-60%蔗糖以50，000rpm离心2小时)分析了3010-C5细胞系产生的颗粒。如图10所示，对梯度离心各部分的EIA和Western印迹分析表明颗粒在大约35-40%蔗糖处形成了单峰带。
8.3.在哺乳动物细胞内表达ENV和GAG蛋白质
并产生重组体HIV-1及颗粒的其他适用战略
本节中描述为在转化的细胞内表达HIV蛋白质及重组体制造的HIV颗粒所采用的多种不同的可代用之战略。可能的改动包括但不仅限于(1)转染含有多个HIV结构和/或调节基因的复合质粒载体，(2)共转染多个含不同HIV基因的质粒载体，(3)使用结构性和可调节的增强子/启动子元件以驱动HIV颗粒的表达，(4)利用调节包括tat和/或rev在内之HIV调节蛋白表达，以间接控制HIV gag和env结构蛋白的表达，以及(5)在不同类型细胞内表达HIV蛋白质。这些改变可用于使系统的各参数最佳化，并可独立地控制颗粒之蛋白成分及在不同类型细胞内的表达水平。
用标准磷酸钙转染法，经瞬时转染Hela(有时使用BSC-40和Vero)细胞来试验质粒和质粒组合。对总溶胞产物或重组HIV颗粒(以高速离心从培养基中收集之)产物作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将产物电转移到硝化纤维素滤膜上并用特异性抗血清探查之。分析env蛋白质时，用125Ⅰ标记的单克隆抗体110-4探查滤膜(见上文6.1.2.节)，后者可结合到gp160和gp120之V3区域的抗原决定基上;分析gag蛋白质时，用爱滋病病人血清(TriMar)，然后用125Ⅰ标记的蛋白质A探查滤膜。用X线胶片以放射自显影法显现产物。
8.3.1.可利用许多不同的质粒和质粒组合实现
HIV蛋白质在Hela细胞中的表达
可经转染编码多种HIV蛋白质，包括结构和调节蛋白的复合质粒而实现HIV gag和env蛋白质的表达;另外，也可一同转染编码不同HIV蛋白质的多种质粒。
将独立编码env(CmHiTgfbEnv5或CmHiEnv5)，或gag(CmHiGag2Rre)的质粒，结合编码tat和rev蛋白质的质粒转染到Hela细胞中，可导致免疫反应性gp160和gp120HIV衣壳蛋白的表达，或导致包括p55基本转译产物、p47和p39加工中间产物，以及p24、p17成熟gag蛋白质在内之免疫反应性HIV gag相关蛋白质的表达。
另外，可以将在单一转录单位中包含tat和rev调节蛋白及env，或env与gag、结构蛋白之功能性编码序列的质粒载体(CmHIVdelXmn或CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)转染到Hela细胞中，也可导致前体和成熟env或gag与env蛋白质的合成。用CmHIVdelXmn与CmHiGag2Rre或CmVGag2Rre共转染也导致gag和env蛋白质的合成。使用各个质粒或联合使用CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)(1160-a1)、CmHIVdelXmn(1133-1a)+CmHiGag2Rre(1158-a1)、及CmHIVdelXmn(1133-a1)+CmvGag2Rre(1159-a1)也可导致重组体HIV颗粒分泌到培养基中。
因此，可用多种途径，使用该系统实现gag和env结构蛋白质的表达和重组体HIV颗粒的产生。表Ⅱ中比较了用不同质粒组合所达到的表达水平，证明不同组合可最佳表达不同的蛋白质。例如，当用分别编码tat和rev蛋白质的质粒共转染时，可更为有效地表达env。另一方面，可由包含在单一转录单位中的两种调节蛋白之功能性编码序列的质粒CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)(1160-a1)更为有效地表达gag。用复合质粒CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE)(1160-a1)和分离的env编码质粒共转染时，可得到中等水平的两种蛋白质。
表Ⅱ
合用不同的质粒所得到的env和gag蛋白质表达
的相对水平
质粒 env gag
CmHiEnv5+CmHiTat+CmHiRev ++++ -
CmHiGag2Rre+CmHiTat+CmHiRev - ++
CmvGag2+CmvRev - +
CmHIVdelXmn + -
CmHiGag2Rre+CmHIVdelXmn + ++++
CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) + ++++
CmHiEnv5+CmHIVdelKpnAvr(Gag2TRE) +++ +++
合用各种不同质粒转染后获得的gag和env的相对表达水平以任意单位指示;分别测定gag和env表达水平，且不必用同一标准表示。
在这些实施例中，rev对于编码HIV结构蛋白质之mRNA的有效地胞浆内定位是很重要的，并且依赖于位于编码gp41分子N末端部分之HIV env基因的部分内的、称为rev反应性元件(Rre)的顺式作用调节元件，将其作为衣壳基因的Bg1Ⅱ至HindⅢ片段引入gag质粒中，并可能对于有效地表达HIVgag和env蛋白质是必要的。tat蛋白通过与称为tar，位于HIV RNA转录本之前75个核苷酸内的顺式作用调节元件的相互作用，可增强由HIV启动子开始的转录过程。该tar基因存在于被CmHiGag2Rre、CmHiTgfbEnv5，及CmHiRev利用的CmHi杂合增强子元件中。
可以不依赖tat经共转染质粒如CmvGag2Rre和CmvRev来表达gag或env，因为这些质粒不含有tat区。但是，用CmvGag2Rre+CmvRev转染时，gag的表达水平比用CmHiGag2Rre+CmHiTat-CmHiRev转染低。由于已知巨细胞病毒直接早期基因的增强子启动子是很强的转录元件，故证明CMVHIV增强子启动子元件加HIV tat基因可能是特别强的表达系统。对env蛋白质表达也作了相似的研究。其他增强子元件与HIV启动子/tat元件之间的杂合可具有其他有用的性质。
这些结果表明，不同的HIV结构蛋白质为达到最大表达而对HIV调节蛋白或其他因子的要求可能有所差异，而且可通过选择适当质粒或合用这些质粒来控制gag对env蛋白质的比例。例如，可以用编码次要HIV蛋白如vpu或vif的质粒进一步转染产生重组体HIV颗粒的细胞系，以改变重组体HIV颗粒的生产水平和/或性质。另一个例子是可以选择用编码tat、rev和gag蛋白质的质粒转染细胞系(因而其可产生只编码gag蛋白质的颗粒)，并继之用不同的env编码质粒转染之，以产生含有来自不同病毒株或具有其他结构改变之env蛋白质的颗粒。例如，对由含有HIV env基因之天然信号序列(CMHIEnv5)或包含猴TGF-β-1信号序列与成熟gp160N末端之融合结构(CmHiTgfbEnv5)的基因表达的env蛋白质进行比较，可见具有同样有效地表达。
8.3.2.使用可调节的启动子调节HIVenv
蛋白质的表达
在另一具体实施方案中，使用结合了CmHiTgfbEnv5+CmHiTat+CmHiRev的质粒，与可选择质粒pSV2dhfr一起转染dhfr-CHO细胞。对该实验中选择的细胞系的最初检验并没有发现可测水平的HIV env表达。然后使细胞生长在渐增氨甲喋呤的培养基中，扩增已转染的可选择性pSV2dhfr质粒，并共扩增HIV tat、rev和env编码质粒以选择细胞，从而期望能选择扩增低水平的HIV env表达。结果表明一个细胞系中合成了HIV env蛋白质。在渐增浓度的氨甲喋呤中生长以选择进一步扩增dhfr基因及共转染的HIV蛋白编码质粒的细胞，并不能导致env蛋白质表达水平的逐渐提高。为保持env蛋白质表达水平最好继续进行选择，因为如果没有进一步的选择，则细胞生长中可出现衣壳蛋白质表达水平降低。细胞表达env蛋白质的水平越高，似乎其生长越慢，而且比那些回复至较低env蛋白质表达水平的细胞系密度更低。这些结果表明，在这些细胞中衣壳蛋白质表达是有毒性的，且可因此而将env蛋白质表达限制在一个可达到的水平上。
可使用具有控制HIV蛋白质表达之可调节启动子的质粒来克服这种限制。可将这些质粒转染到最初以未诱导状态生长的细胞中，然后再诱导使之高水平地表达HIV蛋白质，从而受到毒性作用攻击之前使其在短时间内高水平产生表达产物。
作为这样一种方法的实例，构建了处于金属调节之小鼠金属硫因启动子控制下的分别编码tat和rev蛋白质的质粒，合用下列质粒共转染Hela细胞(a)CmHiTgfbEnv5+CmHiTat+CmHiRev，(b)CmHiTgfbEnv5+BsMtTat+CmHiRev和(c)CmHiTgfbEnv5+CmHiTat+BsMtRev，然后用Western印迹法分析细胞总溶胞产物，证明所有细胞均产生了免疫反应性gp160和gp120 HIV衣壳蛋白质(图11)。用CmHiTgfbEnv5+CmHiTat+CmHiRev转染产生了最高水平的env蛋白质表达。更有意义的是，发现在以利用Mt启动子的质粒进行的转染中，可经于收获细胞前一天向组织培养基内加入锌而使表达水平提高几倍(见图11)。
这些结果表明，可利用可调节的启动子来调节HIV蛋白质的表达，并可通过调节HIV tat和rev调节蛋白质来调节HIV结构蛋白的表达。该方法的另一个实例包括使用可调节的启动子控制编码多种HIV蛋白质之复合质粒的表达，或者构建新的可诱导的调节元件，如含有金属硫因启动子之调节元件(该结构与HIV的启动子和tar区相连)杂合MtHi增强子启动子。
8.3.3.在BSC-40和VERO细胞中表达HIV蛋白质
本实施例中，合用编码HIV tat、rev、env和gag蛋白质的各种质粒(包括CmHiGag2Rre+CmHiEnv5+CmHiTat+CmHiRev)，以及CmHIVdelKpnAvr(Gag2 TRE)转染Hela、BSC-40及Vero细胞。就产物制造和表达效率来说，各细胞系gag和env的基本表达特征都是相似的。但总的表达水平在Hela细胞为最高，BSC40细胞约低3倍，而Vero细胞中则低5倍。
这些结果与上述用CHO细胞所作分析的结果一同证明，可使用得自不同种和不同器官的多种细胞系表达HIV蛋白质，从而可为特定目的选用有特定所需特性的细胞。
9.实施例使用表达截短形式之HIV-1衣壳抗原的重组
牛痘病毒产生有修饰之结构特征的重组HIV-1颗粒
下面描述在感染的BSC-40细胞中指导截短之HIV-1gp160表达的两株重组牛痘病毒。可使用这些重组牛痘病毒作载体，并合用v-gag2(上文第6节)或其他编码核心抗原的载体，以上文第6节所述系统产生改善了抗病毒和/或免疫原性性质的重组HIV-1颗粒。
9.1.重组牛痘病毒V-ED2
构建含有HIV-1 env编码序列的重组质粒，所说的序列为在7.5K启动子下游BamHI位点插入牛痘重组载体pGS62内的核苷酸5705至8068。HIV-1序列是作为质粒pv-env5(见共同待批美国专利申请No.07/593，401，申请日1990年10月5日)的2.36Kbp BamHI片段得到的。该片段含有完整的gp120编码序列，以及gp41的N末端241个氨基酸，包括在可能的跨膜序列之C末端的gp41胞浆区的前49个氨基酸残基。按上述共同待批美国专利申请中所述方法，将含有7.5K启动子和HIV-1 env序列的嵌合基因插入牛痘病毒胸苷激酶基因中。
所得重组体病毒v-ED2指导被剪短的gp160的表达，后者同野生型gp160一样被有效地裂解成gp120和gp41(图12)。被v-ED2感染的HelaCD+4细胞比v-env5感染者更易于形成全胞体(多核巨大细胞，为HIV-1感染的特征)，其可表达全长gp160衣壳糖蛋白前体。这些结果揭示，由v-ED2产生的衣壳糖蛋白可比“野生型”衣壳糖蛋白有更好的功能活性或能更有效地呈现之。
9.2.重组牛痘病毒V-ENV5DCT
构建重组病毒v-ENV5DCT，以含有除gp41之C末端13个氨基酸以外的HIV-1v全部env编码序列(BRV分离物;Wain-Hobson et al.，1985，Cell，409317)。按已述的寡核苷酸诱变方法(Kunkel et al.，1987，Meth.In Enzymol.，154367-382)引入缺失突变。按待批美国专利申请No.07/593，401(申请日1990年10月5日)中所述方法将含有7.5K启动子和突变之HIV env序列的嵌合基因插入牛痘病毒胸苷激酶基因中。
10.实施例使用表达未加工GP160的重组牛痘病毒产生
具有被修饰之结构特征的重组HIV-1颗粒
以下描述两个指导gp160前体衣壳糖蛋白表达的重组牛痘病毒，其中所说的糖蛋白在gp120和gp41之间的蛋白水解裂解位点(S)中具有突变。可使用这些重组牛痘病毒作载体，并结合v-gag2或其他编码核心-抗原的载体，以利用上文第6节中所述的系统产生提高了抗病毒和/或免疫原性质的重组HIV-1颗粒。
10.1.重组牛痘病毒v-160NG
构建重组质粒(pv-160NC)，该质粒含有插入牛痘重组载体pGS62中7.5K启动子下游的、从核苷酸5803至8495的突变的gp160编码序列。突变是大致按已述方法(Kunkel et al.，1987，Meth.Enzymol.，154367-382)经寡核苷酸特异性突变引入的。突变序列如下所示(“+”代表gp120和gp41之间的裂解位点)
HIV-1 BR envgp120 ↑gp41
Gln Arg Glu Lys Arg↑Ala
“野生型
” ...CAG AGA GAA AAA AGA ↑GCA...
v-160ONC...CAG ATA GAA GAA TTC↑GCA...
GlnIleGluPhe↑Ala
按照共同待批美国专利申请07/593，401(申请日1990年10月5日)中所述方法，经体内重组将嵌合基因在胸苷激酶基因处插入牛痘病毒基因组中。所得重组病毒指导不被裂解成gp120和gp41之gp160前体衣壳糖蛋白的表达。
10.2.重组牛痘病毒v-11K160NC
构建含有与v＝160NC(见上文10.1节)同样的、但处于牛痘病毒11K启动子控制下的突变HIV-1 env基因的重组牛痘病毒。由质粒pv-160NC上切下2.26kbp BamHI片段，并在11K启动子下游的EcoRI位点处插入牛痘重组载体pSC10(Chakrabarti et al.，1985，Mol.Cell.Biol.，53405-3409)的衍生体中。如此便产生了含有牛痘病毒11K启动子和完整突变gp160编码序列的嵌合基因。该嵌合基因在胸苷激酶基因处插入牛痘病毒基因组中。所得的重组病毒指导在感染的细胞中高水平产生突变的HIV-1gp160。
11.实施例表达HIV-1 vpu基因的重组牛痘病毒
除共表达HIV-1衣壳和核心抗原外，重组HIV-1颗粒的组装和产生不需HIV-1特异性蛋白质。但病毒和细胞来源的其他因子可参予并加速这一过程。一种因子是由vpu编码的病毒蛋白质。该蛋白质是显然与胞浆膜内表面有关联的16kb的糖基化多肽。虽然vpu对于颗粒形成并不是必要的，但vpu中的突变可导致由被感染的细胞释放的病毒粒子减少(Terwilliger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865163-5167;Strebel et al.，1989，J.Virol.，633487-3791)。vpu作用的机理尚不明了，而且没有确定其在本文所述的重组系统中对颗粒形成的作用。预期辅助分子如vpu可促进病毒粒子组装和/或释放过程。下列实施例描述一个可用于检测这些辅助分子作用，并证明它们在重组颗粒产生中之实用性的系统。
构建一含有完整HIV-1 vpu编码序列的重组牛痘病毒。将核苷酸5636至5927的HIV-1cDNA之290bp片段在7.5K启动子下游的SmaⅠ和EcoRⅠ位点间插入牛痘重组载体pGW62中。该片段含有vpu编码序列及7bp5′未转译序列和37bp3′未转译序列。然后经体内重组将该嵌合基因插入牛痘病毒基因组中。按上文第7节等章节中所述方法，在用v-vpu和v-G2E5共转染的细胞中证明vpu对重组颗粒形成和释放的作用。
12.实施例重组HIV-1颗粒的抗病毒作用
本实施例旨在证明本发明的重组HIV-1颗粒在体外降低或消除HIV对CD4+淋巴细胞之感染性的能力。结果表明重组HIV-1颗粒可以剂量依赖方式有效地抑制HIV-1感染。
12.1.感染性检测法
以每小井4×104个细胞将0.4ml培养基(添加10%胎牛血清的RPMI-1640)中的T淋巴母细胞(CEM)接种到24小井培养板中。每对重复小井各接受不同量(见表1)的0.4ml培养基中的重组HIV颗粒。根据EIA(见上文第6.1.2.节)测得的等价p24 gag浓度定量所加入的颗粒。对照小井不加颗粒，只加0.4ml培养基补足体积。细胞和颗粒于37℃下保温3小时，然后加入HIV。一组相当于各不同颗粒浓度的重复小井各接受(1)不加HIV，(2)相当于5pg p24 gag的40TCID50(组织培养物感染性剂量单位50)低病毒剂量，或(3)相当于50pg p24的400TCID50的高病毒剂量。感染后第3天，由各小井弃去培养基并换成含适当初始颗粒浓度的新鲜培养基。于感染后第5和6天时，由各小井收集等分的细胞样品，用间接免疫荧光检测法，检测细胞内HIV抗原的表达来确定感染性，其中利用人多克隆抗HIV血清作第一抗血清，然后用结合荧光素的羊抗人IgG作第二抗血清。
12.2.结果
表Ⅰ下部给出的感染性结果表明，重组HIV-1颗粒可以以剂量依赖方式阻滞HIV病毒粒子对CEM细胞的感染性。还可推断，重组颗粒本身是非感染性的，且不能在细胞内复制，因为与高浓度重组HIV-1颗粒保温的细胞内没有检测出细胞内荧光(图13，A组)。另外，尽管在加入HIV的细胞培养物(图13.C组)中观察到多个合胞体，但重组颗粒并不能诱导合胞体形成。
表Ⅲ
用重组HIV-1颗粒抑制HIV病毒的感染性
CEM细胞 重组HIV-1颗粒 病毒2荧光 %
(过量倍数)1(TCID50) 5天 6天
+ 0 0 0 0
+ 60 0 0 0
+ 600 0 0 0
+ 0 40 20 ＞90
+ 60 40 10-20 ＞90
+ 600 40 ＜1 10
+ 0 400 90 ＞90
+ 60 400 60-80 ＞90
+ 600 400 30 ＞90
1 颗粒对病毒的过量倍数是相对于等量p24蛋白质而言的。
2 人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，LAV-1病毒株。
13.实施例重组HIV-1颗粒抑制由HIV-1血清
阳性供体分离之外周血淋巴细胞的HIV-1感染
上文第12节中所述的实施例证明重组HIV-1颗粒以剂量依赖方式于体外抑制HIV-1对T淋巴母细胞(CEM)的感染。下述实施例使用培养的外周血淋巴细胞(PBL)系统进一步证实重组HIV-1颗粒的抗病毒作用。用于该分析系统的PBL是由HIV-1感染的血清阳性供体分离的，分离的PBL中被感染细胞的感染频率范围为0.04%-1.3%(Psallidopoulos，M.C.，et al.，1989，J.Virol.，6314626-4644)。培养期间，病毒感染通过无细胞及细胞-细胞传播途径迅速播及未感染的CD4+细胞。最近由其他研究小组得到的结果(Daar，E.S.，et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876574-6578)提示，就对中和作用和对抗病毒剂(如可溶性CD4)之作用的反应来说，HIV-1的实验室分离物不同于最初的病人分离物。因此，使用培养的外周血淋巴细胞系统估价重组HIV-1颗粒的抗病毒作用可能比上文第12节所述的CEM细胞系统有更好的生物学相关性。
13.1.感染性检测法
分离Hypaque ficoll缓冲剂上的淡黄色覆层材料，由HIV-1血清阳性供体的血液中收获外周血淋巴细胞(PBL)。然后将细胞置于培养基(添加10%胎牛血清的RPMI-1640)中保温37℃下用CD8、CD16和CD20特异性单克隆抗体处理1小时，再加入兔补体于4℃下处理1小时，以除去CD8+淋巴细胞(Zarl-ing，J.M.，et al.，1990，Nature(London)34792-95)。所得细胞制品主要由CD4+淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞组成。将0.5ml培养基中的细胞以1M细胞/小井的浓度接种到24小井培养板中。各重复的小井内分别加入不同浓度(见表Ⅳ和Ⅴ)的重组HIV颗粒、补骨脂素-紫外光失活的HIV-1病毒粒子或纯化的HIV-1衣壳糖蛋白前体gp160。然后所有小井均添加0.5ml含有与T细胞CD3抗原有反应活性之MAb G19.4(Hoxie，J.A.，et al.，1986，Science，2341123-1127)(终浓度为1μg/ml)以及白细胞介素2(IL-2)(终浓度5%)的培养基。用可溶性CD3 MAb活化T细胞已显示可诱导潜伏期HIV-1病毒的复制(Zarling，J.M.et al.，1990，Nature(London)34792-95)。
活化后4或5天(分别是供体Z29、Z30或供体Z31、Z39)，由小井内抽除培养基，用添加10%人血清的PBS洗细胞并换成新鲜培养基。使完全相同的样品单与新鲜培养基(见下文)或再添加适当浓度的重组HIV-1颗粒或失活的HIV-1病毒保温。第二次加入颗粒或失活病毒后，以一定的间隔期间由小井内收获培养基样品并用特异性EIA法(见上文6.1.2节)分析p24gag含量。另外，可同时收集细胞并使用与gp120和gp24gag反应的单克隆抗体混合物检测HIV-1蛋白质的表达。
第4或5天时洗出有重组颗粒或失活之病毒的细胞，于第8天移入含有固相化抗CD3 MAb的新的小井中，以诱导细胞继续复制。第11天用EIA法检测培养物上清液样品中p24gag的产生，(见表Ⅴ)。设计该部分实验以估价是否在用重组HIV-1颗粒处理后测得的对病毒产生的抑制作用为可逆现象。
13.2.结果
表Ⅳ和Ⅴ中给出了感染性分析的结果。重组HIV-1颗粒抑制通过从四个不同血清阳性病人获得之样品的培养物传播病毒感染。这种抑制是剂量依赖性的，并可在用重组HIV-1颗粒处理的样品中以0.1μg/ml等价p24gag蛋白质的量测定出来。虽然在某些情况下补骨脂素/紫外光失活的病毒可相似地抑制病毒感染的扩散(表Ⅳ，供体Z29，第6天的样品)，但与重组HIV-1颗粒相比，需要多10倍的失活病毒。
在第4天已洗掉重组HIV-1颗粒或失活病毒的细胞仍持续抑制p24gag产生，提示除去颗粒并不足以使这一现象逆转(表Ⅴ)。令人感兴趣的是，数据还提示在该抑制作用中重组HIV-1颗粒比失活的HIV-1病毒粒子更为有效(表Ⅴ，两供体)。
表Ⅳ
重组HIV-1颗粒对HIV-1病毒感染性的抑制作用
供体 处理 剂量(μg/ml)1p24gag产生的百分抑制率
第9天
Z31 颗粒 1 86
0.1 18
0.01 0
Z39 颗粒 1 99
0.1 5
0.01 0
第6天
Z29 颗粒 10 96
1 97
0.1 73
0.01 15
灭活的HIV 10 90
1 78
0.1 0
Z30 颗粒 10 86
1 84
0.1 22
0.01 0
灭活的HIV 10 84
1 78
0.1 0
1重组HIV-1颗粒和失活病毒的浓度是相对于p24gag浓度列出的。这些制剂的相关衣壳糖蛋白含量为p24gag的5-10%。
表Ⅴ
重组HIV-1颗粒对HIV感染的抑制作用是不可逆的
供体 处理 剂量(μg/ml)1p24gag产生的百分抑制率
Z29 颗粒 10 ＞79
1 ＞51
0.1 0
0.01 0
灭活的HIV 10 ＞44
1 0
0.1 0
Z30 颗粒 10 99
1 91
0.1 52
0.01 4
灭活的HIV 10 50
1 15
0.1 1
1 处理的浓度同表Ⅳ所示。
2 于感染后第11天检测对p24gag产生的抑制作用。第4天洗细胞使之恢复未处理状况。为确保细胞生长，于5%IL-2存在下培养细胞并于第8天使细胞接触固相化的CD3 MAb。
14.实施例重组HIV-1颗粒的体内免疫原性
使用小动物模型进行下述实验，以估价非复制性重组HIV-1颗粒的体内免疫原性。这些研究中选用兔，是因为以前曾报导在接受各种形式HIV基免疫原免疫的兔体内存在中和抗体。
用ELISA和Western印迹分析法估价各被免疫兔的体液免疫反应。可用ELISA法检测总HIV特异性抗体滴度，而用Western印迹分析法估测与个别病毒蛋白质的抗体反应性。另外，鉴定了在两只被免疫兔体内引发之细胞免疫反应的特征。这些实验的结果进一步证实了重组HIV-1颗粒在被免疫动物体内产生HIV-1特异性免疫反应的能力。
14.1.免疫原性检测法
用重组HIV-1颗粒(上文第6节)或补骨脂素灭活的HIV-1病毒免疫两只雌性新西兰白兔。所用免疫原的量是根据以俘获EIA法(上文第6.1.2.节)测得的相对p24gag蛋白浓度得以标准化的。免疫程序示于下列表Ⅵ中。对于基础免疫(1°)，以1∶1的比率加完全弗氏佐剂配制免疫原并以相当于120μg p24gag和4-6μg gp120env蛋白质的量经肌肉内注射免疫动物。5周后，以1∶1比率加不完全弗氏佐剂配制免疫原，经皮下途径对兔作第二次免疫(2°，加强免疫)。加强免疫中所用免疫原的量相当于190μg p24和10-20μg gp120蛋白质。
以不同时间间隔由动物体内收集血清，使用固相化完全破坏的病毒或固相化的纯gp120以ELISA法和/或Western印迹法检测抗HIV反应性。另外从开始实验前一周收集各动物的血清，用作预免疫对照。对于Western印迹分析，将纯化的LAV-1病毒溶解在SDS-PAGE样品缓冲液中，并在丙烯酰胺梯度(7%-15%)板凝胶中进行电泳分离。用标准技术将分离的病毒蛋白质转移到硝化纤维素滤膜上。然后将滤膜切成完全相同的条并用于Western印迹分析。简单地说，用阻断缓冲液(3%干燥的牛奶溶于PBS中，BLOTTO)于22℃下将滤膜条阻断3小时后，使滤膜条与在BLOTTO 0.2%NP40中1∶50稀释的特异性兔血清样品4℃下保温过夜。然后充分洗涤这些滤膜条，与在BLOTTO 0.2%NP40中的125Ⅰ蛋白A(ICN Radiochemicals)22℃下保温2小时。经放射自显影显现蛋白带。作为病毒产生和释放的一个指征，还检验了血清中可降低p24gag产生水平之中和抗体的存在。
使用体外CEM细胞感染性检测法检测被免疫兔血清内中和LAV-BRU分离物之抗体的存在。加热灭活血清，然后在培养基(添加10%胎牛血清的RPMI-1640)中连续稀释之。混合等体积稀释的血清和30TCID50病毒接种物并于37℃下保温45分钟。向存在于96小井微量滴定板内的0.1mlCEM细胞培养物(2×104个细胞)中加入攻击的病毒制剂(0.1ml)，37℃下保温并随时混合之。保温1小时后，由小井内除去病毒-血清混合物，并换成含有适当稀释度之初始兔血清的培养基。5天后用EIA法检测上清中的p24gag水平，以监测培养物中的感染进程。
表Ⅵ
兔免疫程序
兔238，239 0周1°免疫
5周2°免疫
33周3°免疫(只有兔238)
241，243 0周1°免疫
4周2°免疫
18周3°免疫(只有兔241)
免疫1
兔 免疫原
1° 2° 3°
238 重组HIV-1颗粒 120μg 190μg 140μg
120μg 100μg 120μg
239 灭活的HIV-1 120μg 190μg
120μg 100μg
1在完全弗氏佐剂中配制基础免疫原并经肌肉内注射给药;在不完全弗氏佐剂中配制第一和第三次免疫的免疫原并经皮下注射给药。
14.2.结果
14.2.1.用ELISA法测得的抗体滴度
图14给出了用ELISA法测得的兔238和239于1°免疫前及免疫后2、5和7周时收集之血清样品中的相对抗体滴度。兔238(图14，A)表现于免疫后5周(维持到2°免疫后)提高了对HIV蛋白质的免疫反应(见7周数据，即加强免疫后2周数据)。相反，在兔239样品中1°免疫后2周测得与HIV蛋白质的明显反应活性(图14，B)，且于5周后降低。但于第7周时由兔239体内收集的血清样品中可观察到抗体滴度的显著加强作用。
对兔238中加强反应差的一种解释是对动物的2°免疫是在峰值免疫反应期间进行的(见表Ⅵ的放血程序)。反之，当施以2°免疫时兔239体内的抗体滴度已在下降(比较2和5周时放血检测结果)，因此加强反应更为显著。
图15中给出的是使用固相化全破裂病毒(组1和2)或固相化纯化之衣壳糖蛋白gp120对所有兔血清进行ELISA试验的结果。所示数据是基础免疫后不同间隔期间的终点滴度。横座标值代表基础免疫后收集血清样品时的周数。箭头指示第二次和第三次免疫的时间(见表Ⅵ)。如图所示，用重组HIV-1病毒粒子免疫的兔(R238和R241)以及用补骨脂素/紫外光灭活之HIV-1病毒粒子免疫的兔(R239和R243)均产生了与加强程序相关联的抗原反应性图形。与破碎的全病毒有反应活性的各兔血清中抗体的滴度主要反映了与p24gag蛋白质(其构成重组HIV-1内HIV-1病毒粒子中约90%的蛋白质含量)的反应性。与全病毒的反应性约比与gp120的反应性高2至3个数量级，此代表了直接与颗粒结构中衣壳糖蛋白之低水平(5-10%)相关的差异性。
14.2.2.用兔抗血清中和HIV-1的感染性
图16显示用重组HIV-1颗粒免疫产生了抗同源HIV-1(LAV-1病毒株，BRU分离物)的中和抗体。如对病毒蛋白质的总反应性一样，中和抗体的滴度与加强免疫程序有关。图7C还显示，在用重组HIV-1颗粒免疫的兔238和241血清中出现了高中和滴度(图16，A)。所报告的滴度与p24gag产生的75%抑制率有关。
14.2.3.细胞免疫反应
下列表Ⅶ中总结了用重组颗粒免疫后引发的细胞免疫反应。这些结果表明，由被免疫兔体内分离的淋巴细胞在对HIV-1抗原之特异性刺激的反应中发生增殖，此为指示细胞免疫中所必须之记忆性T细胞活性的一种反应。两只用重组HIV-1颗粒免疫的兔在经过第三次免疫后刺激指数更有意义。对兔243测得的很高的刺激指数与所测得的总体高免疫反应性有关(图15，B;图16)。
表Ⅶ
被免疫兔的HIV特异性T细胞增殖反应
免疫原 动物 刺激抗原 刺激指数
第一次加强 第二次加强
重组颗粒 238 灭活的HIV 3.0 15.0
重组颗粒 N.T. 8.4
241 灭活的HIV 2.2 5.4
重组颗粒 N.T. N.T.
紫外光/补骨 239 灭活的HIV 2.6 N.B.
脂素灭活的 重组颗粒 N.T. N.B.
243 灭活的HIV 95.0 N.B.
重组颗粒 33.0 N.B.
N.B.未加强。
N.T.未试验。
刺激指数掺入被刺激的PB1中的3[H]TdR cpm数除以掺入被刺激的PBL中的3[H]TdR cpm数。
14.2.4.对抗体反应性的Western印迹分析
图8中给出了Western印迹分析的结果。兔238之第5周血清中出现的基础免疫反应是对抗gag蛋白质的，且只与gp41env蛋白质有反应活性(图17，泳道1)。虽然用ELISA法检测兔238之第7周血清样品没有测出明确的加强效果，但Western印迹分析则表明各种类型蛋白质之间有抗体反应的重新分配，且出现与较高分子量HIV蛋白质的新抗体反应性(图17，泳道2)。反之，由失活病毒所致的显著加强效应(图17，泳道3)则主要是由于提高了与gag蛋白质及env gp120蛋白质的反应性。图17的泳道5、6和7代表各种浓度(分别为1∶100、1∶1000和1∶10000)之合并的血清阳性个体人血清的反应性，并用作对照抗体。
15.实施例重组HIV-1颗粒结合于CD4+
细胞上并进入CD4+细胞内
设计该实验以检查本发明的重组HIV-1颗粒是否与CD4+细胞结合，并如HIV病毒粒子一样经与胞浆膜融合而进入细胞内。
15.1.内在化检测法
该检测法中使用了由编码CD4分子的基因转染的Hela细胞。已确定了这些细胞的特性，并显示其支持生产性HIV-1感染。使细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagles培养基中于玻片上呈单层生长。用PBS/1%FCS洗细胞并与50μg/ml重组HIV颗粒于37℃下保温2小时。然后充分洗涤细胞并用3.7%多聚甲醛溶液固定之。固定的细胞与1∶100稀释的、可与HIV-1之gp120和p24gag蛋白质反应的单克隆抗体混合物于22℃下保温30分钟。再次充分洗涤细胞并与1∶50稀释的结合到FITC上的亲合纯化之羊抗小鼠抗体保温。22℃下保温30分钟后，用PBS/1%FCS洗细胞并固定于封固基质中以备观察。用同焦激光扫描显微镜检法(CLSM)分析样品以显示细胞内染色。
15.2.结果
图18中所示的CLS显微照片即代表上述检验结果。图18A显示与重组HIV-1颗粒保温后呈现阳性荧光的Hela CD4+细胞。图18B显示对同一细胞用CLSM法进行光学剖分检查的结果，从样品顶部开始并以1μm增距逐渐推向玻片表面。这些显微照片显示，荧光随着细胞内环境更多地显现而增加，此表明重组HIV-1颗粒在与细胞结合后进而内在化了。
16.实施例重组HIV-1颗粒在非人类灵长目动物
中的免疫原性
下述实施例说明如何检测重组HIV-1颗粒在用重组HIV-1颗粒、补骨脂素/紫外光灭活的HIV-1病毒粒子及表达HIV-1gag和env蛋白质之重组牛痘病毒免疫的非人类灵长目动物体内的免疫原性。结果证明重组HIV-1颗粒引发了细胞免疫及包括抗HIV-1中和抗体产生的体液免疫反应。
16.1.免疫程序
按下述程序用重组HIV-1颗粒、补骨脂素/紫外光灭活的HIV-1病毒粒子或表达HIV-1gag及env蛋白质的重组牛痘病毒免疫十二只猕猴(Macaca fascicularis)
组号(n＝2) 基础免疫原/佐剂 二次免疫原/佐剂 加强免疫
1 V-G2E5/无 颗粒/IFA 第8周
2 V-G2E5/无 rgp160/IFA 第8周
3 颗粒/IFA 颗粒/IFA 第4周
4 颗粒/DETOX 颗粒/DETOX 第4周
5 灭活的HIV/IFA 灭活的HIV/IFA 第4周
6 灭活的HIV/DETOX 灭活的HIV/DETOX 第4周
使用皮肤划痕法以每只被接种动物1×107个V-G2E5的噬斑形成单位(上文第7节)，用活的重组牛痘病毒进行免疫。用p24抗原俘获检测法(Genetic Systems)检测到每剂重组HIV样颗粒和补骨脂素/紫外光灭活之HIV病毒粒子相当于含有200μg的p24，且用免疫印迹法检测其大约含有6μg的gp120。由用表达同一抗原的重组牛痘病毒感染的BSC-40细胞中纯化重组gp160，并以每只动物每次免疫6μg的剂量使用之，此剂量水平相似于重组HIV-1颗粒的剂量水平。在不完全弗氏佐剂(Difco)或DETOX(RIBI Immunobiochm)(其含有去毒性的单磷酰脂A和细菌细胞壁骨架)中配制所有颗粒或亚单位免疫原。用重组颗粒、灭活的HIV-1病毒粒子或重组gp160进行的所有免疫均以肌肉注射法完成。
16.2.结果
用下述方法检测这些猕猴产生的抗HIV-1免疫反应(1)用全病毒粒子ELISA法检测总HIV-1特异性抗体;(2)用gp120ELISA法检测HIV-1衣壳特异性抗体;(3)用聚焦免疫检测法检测中和抗体;(4)根据对HIV-1刺激作用的淋巴组织增殖反应检测细胞介导的免疫性。结果总结于下列表Ⅷ中。
表Ⅷ
被免疫之猕猴产生的抗HIV-1免疫反应
组号和免疫 动物 抗体反应a
HIV gp120 中和 S.Ib
1 v-G2E5/ 89133 ＞25600 ＞1600 ＞400 2.1
颗粒 89149 12800 ＞1600 ＞400 115.4
2 v-G2E5/ 89147 1600 400 25 74.3
gp160 89138 0 800 100 69.7
3 颗粒 88079 ＞51200 ＞800 25 3.9
(IFA) 89068 6400 ＞1600 25 50.0
4 颗粒 88116 800 1600 25 2.8
(DETOX) 89072 0 ＞25 0 4.6
5 灭活HIV 89150 12800 800 ＞25 4.7
(IFA) 89086 3200 ＞25 0 43.3
6 灭活HIV 89151 1600 1600 25 5.7
(DETOX) 89156 50 800 0 3.9
对照猴 0 0 0 0.9
a 抗体反应是在第二次免疫后4周，即第1和2组动物于免疫后12周，第3至6组动物于免疫后8周时检测的。
b 淋巴组织增殖反应是在基础免疫后4周时检测的。刺激指数(S.I.)是以掺入HIV-1刺激之细胞内的3H-胸苷c.p.m数除以掺入未刺激之细胞内的3H-胸苷c.p.m.数而确定的。
表Ⅵ所示结果表明(1)重组HIV-1颗粒是免疫原并可引发HIV特异性免疫反应，特别是当用于此前已用表达env和gag抗原的重组牛痘病毒预免疫的动物时;(2)加强先前用重组HIV-1颗粒预免疫之动物的免疫力，可使之比用等量可溶性gp160加强免疫更有效地引发免疫反应，此很可能是由于重组HIV-1颗粒可有效地传递衣壳抗原;(3)当作为单一免疫原用于基础和二次免疫时，重组HIV-1颗粒可以在大多数接受免疫的猕猴体内，以相似于用等剂量灭活HIV-1病毒粒子免疫之动物的水平，引发HIV特异性抗体的T细胞免疫反应。
17.微生物保藏
下列重组疫苗病毒已保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，并指定了保藏登记号
重组病毒 登记号
v-env5 VR 2113
v-gag2 VR 2265
v-G2E5
下列重组质粒已保藏在NRRL(Peoria，Illinois)并指定了保藏登记号
质粒 宿主 登记号
CMHiEnv5(1104-b1) E.coli DH5a
CmHIVdelKpnAvr E.coli DH5a
(Gag2TRE)(1160-a1)
本发明不仅限于已保藏之病毒的范围，因为已保藏的实例病毒只是作为本发明之一个方面的个别例子，其任何功能等同物均在本发明范围之内。除本文所显示并描述者外，对本发明的各种改动对于本领域熟练技术人员看说，参照上文的说明和附图均变为显而易见的。这些改动均落入本发明待批权利要求之范围内。
还应明确的是，涉及核苷酸和肽的所有碱基对和氨基酸残基数目以及所给出的大小范围都是近似的，而且只是为了描述之目的。
所给出的HIV-1基因的核苷酸位置都是基于已在Wain-Hobson et al.，1985，Cell 409317中发表的LAV-BRU分离物的基因组序列而定的。
权利要求
1、一种含有装配的核心和衣壳蛋白的非复制性重组制备的HIV颗粒，它结合有自然人体免疫缺陷病毒的许多致免疫原的抗原决定基。
2、一种含有装配的核心和衣壳蛋白的非复制性重组制备的HIV颗粒，它结合有自然人体免疫缺陷病毒的许多致免疫原的抗原决定基，并且具有与自然人体免疫缺陷病毒基本相同的形态。
3、如权利要求1或2所述的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中的核心蛋白含有人体免疫缺陷病毒1型核心蛋白。
4、如权利要求3的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中的人体免疫缺陷病毒1型核心蛋白含有p24。
5、如权利要求3的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中的人体免疫缺陷病毒1型核心蛋白含有p24和p17。
6、如权利要求1或2的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中的衣壳蛋白含有人体免疫缺陷病毒1型衣壳蛋白。
7、如权利要求6的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中的HIV-1衣壳蛋白含有gp41。
8、如权利要求6的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中人体免疫缺陷病毒1型衣壳蛋白含有gp41和gp120。
9、如权利要求6的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中HIV-1衣壳蛋白含有gp160。
10、如权利要求9的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中gp160不能切开而产生gp120和gp41。
11、如权利要求9的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中gp160是被截短的。
12、如权利要求10的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中gp160是被截短的。
13、如权利要求1和2的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中核心蛋白含有HIV-2核心蛋白。
14、如权利要求1和2的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中该衣壳蛋白含有HIV-2衣壳蛋白。
15、如权利要求1和2的非复制性重组制备的HIV颗粒，其中该衣壳蛋白含有HIV-1和HIV-2衣壳蛋白。
16、一种含有装配的HIV-1核心和结合有天然HIV-1的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白的非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
17、一种含有装配的HIV-2核心和结合有天然HIV-2的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白的非复制性重组制备的HIV-2颗粒。
18、一种含有装配的HIV核心和结合有天然HIV-1和天然HIV-2的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白的非复制性重组制备的HIV颗粒。
19、一种疫苗配制品，其中的免疫原含有权利要求1的非复制性重组制备的HIV颗粒。
20、一种疫苗配制品，其中的免疫原含有权利要求2的非复制性重组制备的HIV颗粒。
21、一种疫苗配制品，其中免疫原包含有权利要求3的非复制性重组制备的HIV颗粒。
22、一种疫苗配制品，其中免疫原包含有权利要求4的非复制性重组制备的HIV颗粒。
23、一种疫苗配制品，其中免疫原包含有权利要求5的非复制性重组制备的HIV颗粒。
24、一种疫苗配制品，其中免疫原包含有权利要求6的非复制性重组制备的HIV颗粒。
25、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求7的非复制性重组制备的HIV颗粒。
26、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求8所述的非复制性重组制备的HIV颗粒。
27、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求9中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
28、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求10中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
29、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求11中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
30、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求12中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
31、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求13中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
32、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求14中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
33、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求15中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
34、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求16中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
35、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求17中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
36、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求18中的非复制性重组制备的HIV颗粒。
37、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有多种不同的非复制性重组制备的HIV颗粒。
38、一种在感染了人体免疫缺陷病毒的个体内抑制获得性免疫缺陷综合症发展的方法，包括以有效抑制人体免疫缺陷病毒感染的剂量的非复制性重组制备的HIV颗粒对该个体给药。
39、一种在感染了人体免疫缺陷病毒的个体内抑制淋巴结病发展的方法，包括以有效抑制人体免疫缺陷病毒感染剂量的非复制性重组制备的HIV颗粒对该个体给药。
40、一种在感染了人体免疫缺陷病毒的人体内抑制艾滋病相关综合症发展的方法，包括以有效抑制人体免疫缺陷病毒感染剂量的非复制性重组制备的HIV颗粒对该个体给药。
41、一种减少由人体免疫缺陷病毒引起的CD4+淋巴细胞感染力的方法，包括可用抑制人体免疫缺陷性病毒感染有效剂量的非复制性重组制备的HIV颗粒处理这些淋巴细胞。
42、一种非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，它含有装配的逆转录病毒的核心和结合有天然人逆转录病毒的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白。
43、一种非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，含有装配的逆转录病毒核心和结合有天然人逆转录病毒的多个致免疫性抗原决定基并与天然人逆转录病毒在形态学上基本相同的壳蛋白。
44、如权利要求42或43的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，其中的逆转录病毒核心蛋白含有HTLV-1核心蛋白。
45、如权利要求42或43的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，其中的逆转录病毒核心蛋白含有HTLV-Ⅱ核心蛋白。
46、如权利要求42或43的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，其中逆转录病毒的衣壳蛋白含有HTLV-Ⅰ衣壳蛋白。
47、如权利要求42或43的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，其中逆转录病毒的衣壳蛋白含有HTLV-Ⅱ衣壳蛋白。
48、如权利要求42或43的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒，其中逆转录病毒的衣壳蛋白含有HTLV-1和HTLV-Ⅱ衣壳蛋白。
49、一种非复制性重组制备的HTLV-1颗粒，含有被装配的HTLV-1核心和结合有天然HTLV-1的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白。
50、一种非复制性重组制备的HTLV-Ⅱ颗粒，含有装配的HTLV-Ⅱ核心和结合有天然HTLV-Ⅱ的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白。
51、一种非复制性重组制备的HTLV颗粒，含有被装配的HTLV核心和结合有自然HTLV-1和HTLV-Ⅱ的多个致免疫性抗原决定基的衣壳蛋白。
52、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求42中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
53、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求43中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
54、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求44中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
55、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求45中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
56、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求46中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
57、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求47中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
58、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求48中的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
59、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求49中的非复制性重组制备的HTLV-1颗粒。
60、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求50中的非复制性重组制备的HTLV-1颗粒。
61、一种疫苗配制品，其中的免疫原包含有权利要求51中的非复制性重组制备的HTLV颗粒。
62、一种在感染了HTLV-1个体内抑制成熟T细胞性白血病发展的方法，包括以有效抑制HTLV-1感染剂量的非复制性重组制备的HTLV-1颗粒对该个体给药。
63、一种在感染了HTLV-1的个体内抑制HTLV-1相关性淋巴瘤的发展方法，包括以有效抑制HTLV-1感染剂量的非复制性重组制备的HTLV-Ⅰ颗粒对该个体给药。
64、一种在感染了HTLV-Ⅱ个体内抑制HTLV-Ⅱ相关性白血病发展的方法，包括以有效抑制HTLV-Ⅱ感染剂量的非复制性重组制备的HTLV-Ⅱ颗粒对该个体用药。
65、一种减少由人逆转录病毒引起的CD4+淋巴细胞的感染力的方法，包括用有效抑制人体逆转录病毒感染剂量的能够与CD4细胞表面受体结合的非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒处理该淋巴细胞。
66、一种制备非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒的方法包括
(a)将编码了逆转录病毒核心，蛋白酶，和衣壳蛋白的核苷酸顺序引入到哺乳动物宿主细胞学中;
(b)在该哺乳动物宿主细胞内同时表达成熟逆转录核心和衣壳蛋白;
(c)培养该哺乳动物宿主细胞;和
(d)从培养基中回收该非复制性重组制备的逆转录病毒颗粒。
67、根据权利要求66的方法，其中通过用一种活病毒载体进行感染将编码了逆转录病毒核心、蛋白酶和衣壳蛋白的核苷酸顺序引入到该哺乳动物细胞中。
68、根据权利要求66的方法，其中通过用多种活病毒载体进行感染将编码了逆转录病毒核心、蛋白酶和衣壳蛋白的核苷酸顺序引入到该哺乳动物细胞中。
69、根据权利要求67的方法，其中的活病毒载体包含有一个重组疫苗病毒。
70、根据权利要求68的方法，其中的活病毒载体含有重组疫苗病毒。
71、根据权利要求67的方法，其中的活病毒载体含有一个重组逆转录病毒。
72、根据权利要求68的方法，其中的活病毒载体含有重组逆转录病毒。
73、根据权利要求66的方法，其中通过用一个DNA载体传染将编码了逆转录病毒核心、蛋白酶和衣壳蛋白的核苷酸顺序引入到该哺乳动物细胞中。
74、根据权利要求66的方法，其中通过用多个DNA载体传染将编码了逆转录病毒核心、蛋白酶和衣壳蛋白的核苷酸顺序引入到该哺乳动物细胞中。
75、一种制备非复制性重组制备的HIV颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)一种携带有HIV env基因的重组疫苗病毒和(ⅱ)一种带有HIV gag和蛋白酶基因的重组疫苗病毒同时感染一种哺乳动物宿主细胞;
(b)在感染的哺乳动物宿主细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养该感染的哺乳动物宿主细胞;和
(d)从该培养基中回收该非复制性重组制备的HIV颗粒。
76、根据权利要求75的方法，还包括用携带选自于tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因的至少一种HIV基因的重组疫苗病毒对该哺乳动物宿主细胞进行感染。
77、根据权利要求75的方法，还包括用带有选自tat，rev，rif，vpr和vpu一组基因中至少两种基因的多种重组疫苗病毒对哺乳动物宿主细胞进行感染。
78、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-1 env基因。
79、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-2 env基因。
80、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-1 gag基因。
81、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-2gag基因。
82、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-1蛋白酶基因。
83、根据权利要求75，76或77的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-2蛋白酶基因。
84、根据权利要求75，76或77的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种非洲绿猴细胞。
85、一种制备非复制性重组制备的HIV颗粒的方法包括
(a)用一种带有HIV env，gag和蛋白酶基因的重组疫苗病毒感染一种哺乳动物宿主细胞;
(b)在感染的哺乳动物宿主细胞内同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养感染的哺乳动物宿主细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV颗粒。
86、根据权利要求85的方法，还包括用一种带有选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因的至少一种HIV基因的重组疫苗病毒感染哺乳动物宿主细胞。
87、根据权利要求85的方法，还包括用同时带有选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因的至少两种HIV基因的多种重组疫苗病毒对哺乳动物宿主细胞进行感染。
88、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-1 env基因。
89、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-2 env基因。
90、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-1 gag基因。
91、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-2 gag基因。
92、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-1蛋白酶基因。
93、根据权利要求85，86或87的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-2蛋白酶基因。
94、根据权利要求85，86或87的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种非洲绿猴细胞。
95、一种制备非复制性重组制备的HIV颗粒的方法包括
(a)用一种带有HIV env，gag和蛋白酶基因的重组质粒转染一种哺乳动物宿主细胞;
(b)在转染的哺乳动物宿主细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)对转染的哺乳动物宿主细胞进行培养;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV颗粒。
96、根据权利要求95的方法，其中的重组质粒还带有至少一种其他的选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因的HIV基因。
97、根据权利要求95的方法，还包括用一种带有至少一个选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因的HIV基因的重组质粒对哺乳动物宿主细胞进行转染。
98、根据权利要求95的方法，还包括用同时带有至少两个选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因中的HIV基因的多种重组质粒对哺乳动物宿主细胞进行转染。
99、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-1 env基因。
100、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-2 env基因。
101、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-1 gag基因。
102、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-2 gag基因。
103、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-1蛋白酶基因。
104、根据权利要求95，96，97或98的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-2蛋白酶基因。
105、一种制备非复制性重组制备的HIV颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)一种带有至少一个HIV env基因的重组质粒和(ⅱ)一种带有至少HIV gag和蛋白酶基因的重组质粒对一种哺乳动物宿主细胞进行转染;
(b)在转染的哺乳动物宿主细胞中同时表达成熟HIV env gag编码的基因产物;
(c)培养转染的哺乳动物宿主细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV颗粒。
106、根据权利要求105的方法，还包括用一种带有选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因中至少一个HIV基因的重组质粒对哺乳动物宿主细胞进行转染。
107、根据权利要求105的方法，还包括同时带有选自tat，rev，vif，vpr和vpu一组基因中至少两个HIV基因的多种重组质粒对哺乳动物宿主细胞进行转染。
108、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-1 env基因。
109、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV env基因是一种HIV-2 env基因。
110、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-1 gag基因。
111、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV gag基因是一种HIV-2 gag基因。
112、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-1蛋白酶基因。
113、根据权利要求105，106或107的方法，其中的HIV蛋白酶基因是一种HIV-2蛋白酶基因。
114、根据权利要求95或105的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种中国大田鼠卵巢细胞。
115、根据权利要求95或105的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种非洲绿猴细胞。
116、根据权利要求95或105的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种Vero细胞。
117、根据权利要求95或105的方法，其中的哺乳动物宿主细胞是一种HeLa细胞。
118、根据权利要求75，85，95或105的方法，其中的HIV env基因编码一种未切开的gp160蛋白。
119、根据权利要求75，85，95或105的方法，其中的HIV env基因编码了一种截短的gp160蛋白质。
120、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在ATCC的重组疫苗病毒v-env5和V-gag2对一种BSC-40宿主细胞进行同时感染;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
121、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒包括
(a)用(ⅰ)分别带有不同HIV-1 env基因的多种重组疫苗病毒和(ⅱ)一种带有HIV-1 gag和蛋白酶基因的重组疫苗病毒同时对一种哺乳动物宿主细胞进行感染;
(b)培养感染的哺乳动物宿主细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
122、一种制备非复制性重组制备的HIV-2颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)分别带有不同HIV-2 env基因的多种重组疫苗病毒和(ⅱ)一种带有HIV-2 gag和蛋白酶基因的重组疫苗病毒对一种哺乳动物宿主细胞同时进行感染;
(b)培养感染的哺乳动物宿主细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-2颗粒。
123、一种制备非复制性重组制备的HIV颗粒的方法包括
(a)在哺乳动物细胞中同时表达HIV env编码的和HIV gag编码的结构蛋白;并且
(b)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV颗粒。
124、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在ATCC的重组疫苗病毒v-G2E5感染一种BSC-40宿主细胞;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收获得非复制性重组制备的HIV-1颗粒
125、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)重组疫苗病毒v-ED2和(ⅱ)重组疫苗病毒v-gag2同时感染一种BSC-40宿主细胞;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
126、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法，包括
(a)用(ⅰ)重组疫苗病毒v-ENV5DCT和
(ⅱ)重组疫苗病毒v-gag2，同时感染一种BSC-40宿主细胞;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
127、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)重组疫苗病毒v-160NC和(ⅱ)重组疫苗病毒v-gag2对一种BSC-40宿主细胞同时进行感染;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
128、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用(ⅰ)重组疫苗病毒V-11K160NC和(ⅱ)重组疫苗病毒v-gag2同时对一种BSC-40宿主细胞进行感染;
(b)培养感染的BSC-40细胞;并且
(c)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
129、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在NRRL的重组质粒CmHIVdel KpnAvr(Gag2 TRE)(1160-al)和CmHiEnv5(1104-b1)同时转染一种哺乳动物细胞;
(b)在转染的CHO细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养转染的CHO细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
130、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用一种保藏在NRRL的重组质粒CmHIV del KpnAvr(Gag2 TRE)(1160-al)转染一种哺乳动物细胞;
(b)在转染的CHO细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码基因产物;
(c)培养转染的CHO细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
131、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在NRRL的重组质粒CmHiGag2Rre(1158-al)和CmHIVdelXmn(1133-al)共同转染一种哺乳动物细胞;
(b)在转染的CHO细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养转染的CHO细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
132、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在NRRL的重组质粒CmHIVdelXmn(1133-al)和CmVGag2Rre(1159-al)共同转染一种哺乳动物细胞;
(b)在转染的CHO细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养转染的CHO细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
133、一种制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒的方法包括
(a)用保藏在NRRL的重组质粒CmHiGag2Rre，CmHiEnv5，CmHiTat和CmHiRev共同转染一种哺乳动物细胞;
(b)在转染的CHO细胞中同时表达成熟HIV env和gag编码的基因产物;
(c)培养转染的CHO细胞;并且
(d)从培养基中回收非复制性重组制备的HIV-1颗粒。
134、根据权利要求129，130，131，132或133的方法，其中的哺乳动物细胞是一种BSC-40细胞。
135、根据权利要求129，130，131，132或133的方法，其中的哺乳动物细胞是一种HeLa细胞。
136、根据权利要求129，130，131，132或133的方法，其中的哺乳动物细胞是一种Vero细胞。
137、根据权利要求129，130，131，132或133的方法，其中的哺乳动物细胞是一种CHO细胞。
138、根据权利要求129，130，131，132或133的方法，其中的哺乳动物细胞是一种dhfr-缺陷CHO细胞。
139、保藏在ATCC，其指定的保藏号是
的重组疫苗病毒V-gag2。
140、保藏在ATCC，其指定的保藏号是
的重组疫苗病毒V-G2E5。
141、重组疫苗病毒V-ED2。
142、重组疫苗病毒v-ENV5DCT。
143、重组疫苗病毒v-160NC。
144、重组疫苗病毒v-11K160NC。
145、质粒CmHiVdelKpnAvr(Gag2 TRE)(1160-a1)。
146、质粒CmHiEnv5(1104-b1)。
147、质粒CmHiGag2Rre(1158-a1)。
148、质粒CmHIVdelXmn(1133-a1)。
149、质粒CmvGag2Rre(1159-a1)。
150、质粒CmHiTat。
151、质粒CmHiRev。
全文摘要
本发明方法包括用带人体免疫缺陷病毒I型(HIV-1)gag和蛋白酶基因的重组疫苗病毒和带有HIV-2env基因的重组疫苗病毒共同感染哺乳动物宿主细胞，制备非复制性重组制备的HIV-1颗粒。这些与天然HIV-1具有非常接近的免疫学和形态学特征的非复制性重组制备的HIV-1颗粒能在体外阻止活的HIV的感染，在体内具有高度的致免疫性。重组制备的HIV-1颗粒可用作抗病毒剂和疫苗制品中的免疫原，有效地抑制或预防HIV的感染和/或获得性免疫缺陷综合症的发展。
文档编号C12N15/00GK1054613SQ90110329
公开日1991年9月18日 申请日期1990年11月20日 优先权日1989年11月20日
发明者奥马尔·K·哈发, 阿伦·W·塞尼尔, 布鲁斯·M·特拉维斯 申请人:翁科根公司