专利名称：由核酸直接生产核苷二磷酸的工艺的制作方法
技术领域：
本发明是以核酸为原料，通过多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的磷酸解作用，直接生产核苷二磷酸的工艺。
核苷二磷酸主要有四种，即腺苷二磷酸(ADP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胞苷二磷酸(CDP)和尿苷二磷酸(UDP)，它门都是重要的生化试剂，其中ADP和CDP又是生产广谱性抗病毒药物-聚肌胞(PolyI∶C)的基本原料。
关于核苷二磷酸的制备方法，目前有化学合成法、酶促合成法及核苷三磷酸降解法几种，现举例说明其工艺过程。附
图1为酶促合成法和核苷三磷酸降解法生产核苷二磷酸的工艺流程图，从图中可以看出，从酶促合成开始就需将四种核苷一磷酸分开进行。采用此工艺其核苷二磷酸的收率只有核酸的12%左右。附图2为核苷一磷酸化学合成核苷二磷酸的工艺流程图，采用此工艺其核苷二磷酸的收率为核酸的35%左右。
这几种工艺方法都比较复杂烦锁，并且产率低，生产成本高。化学合成法虽然操作毒性大，有污染环境之弊，但是现在生产上还多是采用此工艺。利用多核苷酸磷酸化酶(PNPase)对核酸进行磷酸解反应，虽然也有一些探索性的基础研究工作，由于反应液中核酸的浓度很低(1-5mg/ml)，不适于大量生产的要求，讫今没看到采用类似的方法用于大量生产核苷二磷酸的报导。本发明的目的就是针对以上存在问题，设计一种适合工业上大量生产的用核酸直接制备核苷二磷酸的生产工艺，具有工艺简单、产率高、成本低、无污染等特点，而且可以一次同时制备四种核苷二磷酸。
本发明是利用核苷酸磷酸化酶(PNPase)对核酸进行磷酸解反应直接生产核苷二磷酸，附图3为本发明的工艺流程图。
本发明的工艺是这样实现的用0.1-0.6Mol/L(PH8.2)的磷酸缓冲液，把核酸配成60-150g/L的溶液，并使溶液中含KC10.1Mol/L，MgCl20.01Mol/L，CuSO40.004Mol/L，脲0.3Mol/L，PNPase1000-3000单位/L，37±2℃反应30-48小时。结束反应后，按每克树脂吸附4-5克核酸的比例，把反应液直接上国产D296大孔阴离子交换树脂柱，选用0.02Mol/L的甲酸洗脱CDP，再用0.15Mol/L的甲酸洗脱ADP，用0.01Mol/L甲酸-0.05Mol/L甲酸钠溶液洗脱UDP，最后用0.1Mol/L甲酸-0.1Mol/L甲酸钠溶液洗脱GDP。把洗脱下来的四种核苷二磷酸溶液，分别调PH至4.5-5.0，按每克树脂吸附3克核苷二磷酸的比例上国产D001-cc大孔阴离子交换树脂柱，用0.05N盐酸洗脱，此为浓缩过程。洗脱液加2.5-3.0体积的95%冷乙醇，使核苷二磷酸沉淀，离心收集沉淀，真空干燥得到成品。
本发明的核酸原料选用脱磷脱脂脱二级结构的核酸。工艺中磷酸缓冲液的浓度和PNPase的单位浓度是随核酸原料浓度的增加而增加，因而不能确定它们的浓度在一个值上。反应液的反应时间，一般在25-28小时时，单位时间内核苷二磷酸的生成量最大，而后逐渐下降，至50小时还有生成量，因而无法确定反应结束的时间，反应温度、加酶量、酶活等等都影响着反应时间的长短，所以结束反应的最佳时间范围为34-48小时。
总之，本发明在较高底物浓度下，用PNPase进行磷酸解直接制备四种核苷二磷酸，适合于较大规模的工业生产，并且具有工艺简单、产率高(收率为核酸的60%左右，最高可达80%)、成本低(比目前生产的成本至少降低1000元/公斤)、无污染等优点，在工业生产上的应用，则有非常重要的意义。
权利要求
1.一种利用多核苷酸磷酸化酶(PNPase)对核酸进行磷酸解反应，生产核苷二磷酸的工艺方法。本发明的特征在于用0.1-0.6Mol/L(PH8.2)的磷酸缓冲液，把核酸配成60-150g/L的溶液，并使溶液中含KClMol/L；MgCl20.01Mol/L，CuSO40.004Mol/L，脲0.3Mol/L，PNPase1000-3000单位/L，37±2℃反应34-48小时，结束反应后，分离浓缩、沉淀、干燥，即得成品。
2.根据权利要求1所述的工艺方法，其特征在于核酸原料选用脱磷脱脂二级结构的核酸。
3.根据权利要求1.2所述的工艺方法，其特征在于，分离方法是按每克树脂吸附4-5克核酸的比例，把反应液直接上国产D296大孔阴离子交换树脂柱，选用0.02Mol/L\的甲酸洗脱CDP，再用0.15Mol/L的甲酸洗脱ADP，用0.01Mol/L甲酸-0.05Mol/L甲酸钠溶液洗脱UDP，最后用0.1Mol/L甲酸-0.Mol/L甲酸钠溶液洗脱GDP。
4.根据权利要求3所述的工艺方法，其特征在于，浓缩的方法是把洗脱下来的四种核苷二磷酸溶液，分别调PH至4.5-5.0，按每克树脂吸附3克核苷二磷酸的比例上国产D001-cc大孔阴离子交换树脂柱，用0.05N盐酸洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种用多核苷酸磷酸化酶对核酸进行磷酸解，反应直接生产核苷二磷酸的工艺方法，具有在较高底物浓度下，直接制备四种核苷二磷酸的特点，适合于大规模的工业生产，并有工艺简单、产率高、成本低、无污染等优点。
文档编号C12P19/38GK1055202SQ9011039
公开日1991年10月9日 申请日期1990年12月30日 优先权日1990年12月30日
发明者谢伯泰, 齐凡 申请人:陕西省微生物研究所