新的昆虫痘病毒表达系统的制作方法

专利名称：新的昆虫痘病毒表达系统的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及重组产生蛋白质的领域，尤其是涉及新的重组昆虫痘病毒蛋白质，蛋白调节序列和它们在转化之宿主中表达异源基因中的应用。
按照分类学痘病毒属于脊索痘病病毒家族，其成员感染脊椎宿主，如牛痘真痘病毒(Orthopoxvirus vaccinia)，或属于昆虫痘病毒家族。除了个别成员的昆虫宿主范围外，对于昆虫痘病毒家族的成员了解甚少。昆虫痘病病毒(EPV)的一个种是桑红缘灯蛾(Amsacta moorel)昆虫痘病毒(AmEPV)，它最初是从桑红缘灯蛾的幼虫中分离出来的[Roberts and Granados，J.Invertebr.Pathol.，12141-143(1968)]。AmEPV是一种典型的B属EPV，并且是三种已知可以在培养的昆虫细胞中进行复制的EPV之一[R.R.Granados et al，“Replication of Amsacta moorei Entomopoxvirus and Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus in Hemocyte Cell Lines from Estigmene acrea”，in Invertebrate Tissue Cuture Applications in Medicine，Bioloqy，and Agriculture，E.kurstak and K.Maramorosch(ed.)，Academic Press，New York，pp.379-389(1976);T.Hukuharaet al，J.Invertebr.Pathol.，56222-232(1990);and T.Sato，“Establishment of Eight Cell Lines from Neonate Larvae of Torticids(Lepidoptera)，and Their several Characteristics Including Susceptibility to Insect Viruses”，in Invertebrate Cell Systems Applications，J.Mitsuhashi(ed.)，Vol.Ⅱ，pp.187-198，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida(19889)]。
AmEPV是少数能在昆虫细胞培养物中复制的昆虫痘病毒之一;AmEPV不能够在脊椎动物细胞系中复制。该AmEPV双股DNA基因组大约为225kb，非常富含A-T(18.5%G+C)[W.H.R.Langridge et al，Virolegy，76616-620(1977)]。最近，公开了一系列AmEPV的限制性酶切图[R.L.Hall et al，Arch.Virol.，11077-90(1990)]。没有检测出与牛痘病毒DNA的同源性[W.H.Langride，J.Invertebr.Pathol.，4277-82(1983)W.H.Langridge，J.Invertebr.Pathol.，4341-46(1984)]。
AmEPV的病毒复制与其他痘病毒的病毒复制周期相似，不同的只是在感染过程中闭合病毒出现较晚。对于AnEPV，一旦感染了细胞，闭合的和细胞外的病毒颗粒均可产生。成熟的闭合体颗粒，在感染过程中对病毒粒子起环境保护作用，它由包埋在晶体基质中病毒组成，该基质则主要由一种蛋白质即河豚精蛋白组成。据报道，做为AmEPV主要结构蛋白质的河豚精蛋白分子量为110千道尔顿(KD)，含有高比例带电荷的含硫氨基酸[Langridge and Roberts，J.Invertbr.Pathol.，39346-353(1982)]。将病毒和病毒蛋白用于真核宿主载体系统一直是大量研究和探索的主要课题。许多现存的病毒载体系统由于具有明显的缺点和局限性而限制了其实用性。例如，许多真核病毒载体在哺乳系统中有致瘤或致癌作用，将会产生与所得基因产物和意外感染相关的严重健康和安全问题。而且，在某些真核宿主一病毒载体系统中，基因产物本身表现出抗病毒活性，从而降低了该蛋白质的产量。
对于简单病毒来说，可以包装到简单病毒中去的外源性DNA的量有限。如果所用基因是真核的，这种限制会成为特别严重的问题。因为真核基因通常含有插入序列，因它们太大而不适于装配到简单病毒之中。而且，因为它们有许多切割位点，所以将外源性DNA插入到复合病毒中的特定位置会更加困难。
最近已将牛痘病毒制备成了真核克隆和表达载体[M.Mackett.et al，DNA cloning，Vel，Ⅱ，ed.D.M.Glover，pp.191-212，oxfordIRLPress(1985);D.Panicali et al，Proc.Natl，Acad.Sci，USA，885364-5368(1982)]。已使用牛痘病毒载体表达了许多病毒抗原[E.Paoletti et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81193-197(1984);A.Piccine et al，BioEssags，5248-252(1986)]，另外还包括HBsAg、狂犬病G蛋白、和人免疫缺陷性病毒(HIV)的gp120/gp41。以前曾将得自云杉芽虫(Spruce budworm)的调节序列与牛痘病毒[L.Yuen et al，Virdogy，175427-433(1990)]结合使用。
另外，对于牛痘病毒的研究表明，以痘病毒做为疫苗载体具有几种优越性。这些特性包括以痘病毒为基础的疫苗能够刺激细胞免疫和体液免疫、以最低成本大量生产疫苗和冻干疫苗、在非冷冻条件下的稳定性、在非无菌条件下给药方便，以及能够向感染的重组体中插入至少有25，000个碱基对的外源DNA，从而使许多抗原可在一个重组体中得以同时表达。
本技术领域中需要开发其它的病毒组合物和用于在所选择宿主细胞中表达异源基因的方法，以及实施与其相关的其他研究和生产技术的方法。
本发明一方面是提供一个昆虫痘病毒多核苷酸序列，它不含有与之天然联系的其他病毒序列，而含有编码昆虫痘病病毒河豚精蛋白基因的序列和/或其调节序列，其等位变异体，及其类似物或片段。在一特定实施方案中，从桑红缘灯蛾昆虫痘病毒中分离出了河豚精蛋白DNA序列并在图2中进行了说明。
本发明另一方面是提供编码昆虫痘病毒河豚精蛋白启动子或其等位变异体、类似物或片段的多核苷酸序列。河豚精蛋白启动子序列的特征是能够控制已可操纵地连接了该序列或片段的异源基因在选择的宿主细胞中的表达。
另一方面，本发明提供了一个重组多核苷酸序列，它含有一个编码昆虫痘病毒河豚精蛋白的序列和/或其调节序列、其等位变异体，及其类似物或片段，该序列连接到编码异源基因的第二多核苷序列上。一个有代表性的这种多核苷酸序列提供了已可操纵地连接到异源基因上的河豚精蛋白启动子幼子序列，它可以控制该异源基因在所选择的宿主细胞中的表达。另一实施方案提供了一个编码河豚精蛋白的序列，该序列以一种允许融合蛋白表达的方式被连接到异源基因上。实施方案提供了已被插入到河豚精蛋白基因中某个位点上的异源基因，从而使该异源基因在其两侧接有河豚精蛋白序列。
另一方面，本发明提供了一种昆虫痘病毒多核苷酸序列，它不含有与之天然联系的其他病毒序列，而含有编码昆虫痘病毒胸苷激酶(LK)基因的序列和/或其调节序列，其等位变异体，或其类似物或片段。在一特定的实施方案中，该序列来源于桑红缘灯蛾昆虫痘病毒并且在图3中进行了说明。
另一方面，该序列编码昆虫痘病病毒tK启动子，其等位变异体或其片段。该tK启动子序列的特征是它能够指导已可操纵地连接于该序列或片段上的异源基因在所选择之宿主细胞中的表达。
本发明的另一方面还提供了编码昆虫痘病毒tK基因的重组的上述多核苷酸序列和/或其调节序列，其等位变异体或其片段，该序列已被连接到某异源基因上。该多核苷酸序列的一种实施方案是提供已可操纵地连接到异源基因上的tK启动子序列，用以指导该异源基因在选择的宿主细胞中的表达。另一个实施方案提供了以允许表达融合蛋白质的方式连接到异源基因上的编码tK蛋白质的序列。再一个实施方案提供了被插入到tK基因中某一位点上的异源基因，以使该异源基因在其两末端带有tK序列。
本发明的另一方面是提供可融合到异源蛋白质或肽上的昆虫痘病毒河豚精蛋白多肽，以其片段，或其类似物。还提供了可选择地连接到异源蛋白质或肽上的昆虫痘病毒tK多肽，及其片段或其类似物。
本发明的另一方面提供了含有一个或多个上述多核苷酸序列的重组多核苷酸分子。该分子可以是一种表达载体或穿梭载体。该分子也可以含有除来源于能提供河豚精蛋白或tK多核苷酸序列之昆虫痘病毒如牛痘病毒以外的病毒序列。
另一方面，本发明提供了含有上述多核苷酸序列的重组病毒。还提供了用一种或几种所述重组病毒感染的宿主细胞。
本发明还提供了制备所选择之多肽的方法，包括培养用上述重组病毒感染的选择的宿主细胞，并从培养基中回收所说的多肽。
最后，本发明提供了筛选用于插入异源基因之重组宿主细胞的方法，包括用含有某种多肽分子的重组病毒感染细胞，该多肽分子含有被连接到不完整河豚精蛋白或tK多核苷酸序列上的选择的异源基因序列或被插入并打断其编码序列，从而使该异源基因在其每一末端带有一昆虫痘病毒河豚精蛋白或tK多苷酸核序列。在含有河豚精蛋白的细胞中缺少因表达河豚精蛋白而形成的闭合体，表明了异源基因的整合。也可以说，不存在胸苷激酶功能，也即不存在因无活性胸激酶序列整合所形成的对氨甲喋岭或其核苷酸类似物的抗性，从而表明了异源基因的插入。
在本发明的下列详细描述中对本发明的基他方面和优点作进一步的说明。


图1是说明AmEPV之限制性酶切片段的物理图，并且显示了正好位于HindⅢ-G片段中第29位点右侧的河豚精蛋白基因。
图2提供了桑红缘灯蛾昆虫痘病病毒河豚精蛋白基因的AmEPV DNA序列和侧翼序列，推测的河豚精蛋白氨基酸序列，和另外五个开放读码(ORF)。
图3提供了桑红缘灯蛾昆虫痘病病毒胸苷激酶(tK)基因的DNA序列和侧翼序列，该tK蛋白质的推测的氨基酸序列，以及另外两个ORF。
图4提供了合成寡聚核苷酸的核苷酸序列，分别命名为RM58，RM82，RM83，RM92，RM118，RM165，RM03，RM04和RM129。
图5是显示AmEPV片段的结构略图，它说明了河豚精蛋白ORF在物理图上的定位，并表明了同源性。
本发明提供了新的昆虫痘病毒(EPV)核苷酸酸序列，它不含有与之天然联系的其他的病毒序列。本发明还公开了含有该序列的重组多核苷酸载体，含有该序列的重组病毒和用该重组病毒感染的宿主细胞。这些成份适用于本发明方法，用以在昆虫和哺乳动物宿主细胞中表达异源基因并产生选择的蛋白质。
本发明的新多核苷酸序列编码EPV河豚精蛋白基因和/或其侧翼序列，包括为该基因表达提供调节信号的序列。本发明还提供编码EPV胸苷激酶(tK)基因和/或其侧翼序列的新的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是RNA或DNA序列。本发明的多核苷酸序列更好是DNA序列。
本发明特别公了从桑红缘灯蛾昆虫痘病病毒(AmEPV)中获得的河豚精蛋白和tK多核苷酸序列。虽然目前来说它是实施本发明方法和组合物的优选种类，但是，本领域技术人员可利用本文所述的技术，从其它种现有的昆虫痘病病毒中得到基本上同源的序列。
该AmEPV河豚精蛋白DNA序列，包括旁侧的调节序列已作为跨越从核苷酸1至6768的序列示于图1中。在该序列中，河豚精蛋白基因编码序列跨越核苷酸3079到6091。另一个有意义片段位于核苷酸3080-6188之间。可能含有启动子序列的片段跨越核苷酸2780-3200。该序列的其他区域被认为是与河豚精蛋白相关联的其他结构或调节基因的假定编码区。这些有意义的其他片段包括下列序列编码G2R ORF的核苷酸1472到2148;编码G4R ORF的核苷酸2502至2984;以及在图2中由左至右描绘的下列序列，编码G1L ORF的核苷酸68至1459，编码G3L ORF的核苷酸2242至2475;和编码G6L ORF的核苷酸6260至6769。所有的ORF均在图2中示出。
正好在河豚精蛋白基因上游的AmEPV ORF G4R与公山羊痘病病毒(capripoxvirus)HM3 ORF具有高度同源性。在牛痘病毒中发现HM3 ORF的同源部分正好位于牛痘病毒ATI基因之平截变体的上游。因此，这个区域内的微环境在两种病毒中是相似的。两个其他的ORF与牛痘病毒中的对应部分有关。这两个ORF包括与AmEPV G1L ORF相关之牛痘病毒HindⅢ-Ⅰ片段(17)的17 ORF[J.F.C.Schmitt et al，J.Virol.，621889-1897(1988)]，和与AmEPV G62 ORF相关之HindⅢ-D片段的NTPaseⅠ(NPHI)ORF[S.S.Broyles et al，J.Virol.，611738-1742(1987);和J.F.Rodriguez et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839566-9570(1986)]。将AmEPV ORF的基因组位置与牛痘病毒ORF的基因位置相比较表明，在许多情况下呈中心定位并呈共线性的脊椎动物痘病病毒的基本“核心基因”，从更宏观的水平看它们在昆虫病毒中的排布是大不相同的。
正如下面实施例所详细描述的，通过对蛋白质的直接微观序列分析即可鉴定出AmEPV的河豚精蛋白基因，并可根据这一结果来设计寡聚核苷酸探针。河豚精蛋白基因的转录可以被放线菌酮所抑制，表明它是一种晚期基因。与这一预见相一致的发现是，河豚精蛋白转录本是在一个TAATG基本序列内起始的(见图2，核苷酸3077-3082)，而且还有一个5′poly(A)序列，二者都有晚期转录本的特征。
AmEPV tK DNA序列，包括其侧翼和调节序列，在图3中表示为从核苷酸1到1511。该序列内，tK基因编码序列跨越核苷酸237-782(在图3中由左至右描绘)。另一个有意义片段可能包括该序列或其片段的核苷酸782至849。可能含有启动子区的片段是核苷酸750-890。该序列的其他区域也已被鉴定为与tK相关联之其他结构或调节基因的推断的编码区。这些其他的有意义片段包括下列序列(在图3中由左至右描绘)编码ORF Q1的核苷酸21至218;和编码ORF Q3的核苷酸853至1511。
AmEPV tK基因图定位于AmEPV基因组物理图谱左端附近的EcoR I-Q片段中(图1)[参见R.L.Hall et al，Arch.Virol.，11077-90(1990)，列为本文参考文献]。基于该基因在AmEPV基因组中的方向，该基因很可能会向末端方向转录。据信，在包括哺乳动物系统在内的其他系统中，具有相似的tK基因或其变异体。正如下面的实施例所详细描述的，通过对蛋白质的直接微观序列分析，可以鉴定出AmEPV的tK基因，并可根据此结果来设计寡聚核苷酸探针。
术语“多核苷酸序列”当用于本发明时可包括完整的EPV河豚精蛋白或在编码序列侧翼接有调节序列的tK基因。作为举例说明的AmEPV序列也包括在该术语之内。该定义还包括侧翼带有调节序列的编码序列的片段。该定义也包括只有调节序列，如启动子序列，转录位点，终止序列和其他调节序列。
本发明的序列还可包括全部或部分的河豚精蛋白或者结构上与异源基因序列相连的tK基因。另外，本发明的多核苷酸序列可以包括河豚精蛋白的序列或已在其中插入了外来或异源基因序列的tK基因，从而使EPV序列位于异源基因序列的两侧。
本发明的多核苷酸序列还包括能在严格条件下与图2和3的序列杂交的序列，该序列可以保留与图中所示序列相同的生物或调节活性。而且，在非严格条件下能够与图2和3所示序列杂交的序列，只要分别保有图2和3所示序列的生物或调节特性，也属于这一定义范围之内，严格和非严格杂交条件均系常规的条件[参见，如Sambrook et al，Molecular cloning.A Laboratory Mannual，2d edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)]。
同样，本发明的多核苷酸序列包括编码河豚精蛋白或tK蛋白序列的DNA序列或编码图2和3中所示其他ORF或其调节序列之DNA序列的等位变异(在EPV种群中自然发生的碱基改变，这种改变可以或者不会引起氨基酸改变)。同样，本发明还包括编码本发明河豚精蛋白或tK蛋白的DNA序列，但是由于遗传密码的简并性或DNA序列的突变而使这些DNA的密码子序列有所不同，其中所说的突变是由于定点突变或诱导的修饰作用引起的，从而增加了由之编码的所需多核苷酸序列的生物特性或用途。
运用图2或3中的序列数据，以及所指出的河豚精蛋白或胸苷酸激酶的特征，以得到编码这些多肽的其他DNA序列的技术是本领域中已知的。例如可以通过改变单个核苷酸来操作结构基因，或在保留正确的氨基酸的同时，使核苷酸改变，以便在不丧失酶活性的情况下对氨基酸进行修饰。可用已知技术对核苷酸进行取代、插入或者缺失，例如包括体外诱变或引物修复。
可以在其3′-末端和/或5′-末端修剪结构基因，而同时保留其生物活性。也可以将一部分多肽序列连接到异源编码序列上，从而产生融合肽。
可以用人工合成的方法制备本发明的多肽核苷酸序列，或者通过本领域中已知的化学和遗传工程技术或两者，从病毒RNA或从现有的含cDNA的质粒制得本发明的多核苷酸序列。
如本文所述，可由因为自然的等位或种变异而与图2和3的序列有所不同的多肽核苷酸序列来编码AmEPV蛋白质、河豚精蛋白、胸苷激酶及其相应的调节序列。因此，术语河豚精蛋白或tK多肽也指任何自然产生的序列及各种类似物，例如经加工处理过的或修剪过的序列或片段，包括成熟河豚精蛋白或tk多肽以及保留有相同生物活性的突变体或经修饰的多肽或片段，它们各自与图2或3所示序列较好有至少80%、更好有90%，最好有95%的同源性。
本发明的另一方面提供了由EPV河豚精蛋白和tK多核苷酸序列编码的蛋白质。在图2和3中分别显示了两种EPV蛋白质的推断的氨基酸序列以及由这些序列的ORF所编码的其他推断的蛋白质。EPV河豚精蛋白与以前报道的蛋白质没有明显的氨基酸同源性，包括杆状病毒的多角体蛋白。河豚精蛋白和tK都是非必需蛋白质，这使得它们适于作为插入外源DNA的位点。
AmEPV tK与其他tK基因的氨基酸序列比较表明，AmEPV tK基因与任何脊椎动物痘病病毒tK基因没有高度相关性(43.4-45.7%)。脊椎动物tK蛋白质与AmEPV的相关性仍然较低(39.3-41.0%)，而非洲猪热(ASF)病毒在所有被检tK蛋白中表现出最小的同源性(31.4%)。尽管ASF与痘病病毒有许多相似之处，而且ASF和AmEPV都感染脊椎动物宿主。但tK基因之间很少有共同性，和/或表现出有从非脊椎动物宿主之共同来源的指征。
河豚精蛋白和胸苷激酶多肽序列可以包括分离的自然产生的河豚精蛋白或本发明鉴定的tK氨基酸序列，或者是保留有AmEPV多肽之生物或调节功能的特定修饰序列(这些序列分别示于图2和3中)。因此，尽管有这种修饰，但只要全部或部分地保留了这些多肽的生物活性，本发明则包括对本文所公开的所有氨基酸序列以及其保留有河豚精蛋白或tK生物活性之类似物的利用。一般情况下，这些类似物的不同只是在于1，2，3或4个密码子的改变。同样，由其他河豚精蛋白或tK ORF编码的蛋白质或功能也可包括含有少量氨基酸修饰但保留其调节或其他生物学功能的序列。
这种修饰的例子包括带有从昆虫痘病毒河豚精蛋白或胸苷激酶之天然氨基酸序列而来的有少量氨基酸改变的多肽;尤其是保守性的氨基酸取代。保守性取代是指那些发生在与其侧链相关的氨基酸家族中的取代。遗传编码的氨基酸一般分为四类(1)酸性的天冬氨酸，谷氨酸;(2)碱性的赖氨酸，精氨酸，组氨酸;(3)非极性的丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸;和(4)不带电荷的极性氨基酸甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分入芳香族氨基酸类。例如，有理由设想，亮氨酸与异亮氨酸或缬氨酸，天冬氨酸与谷氨酸，苏氨酸与丝氨酸的分离取代，或者某种氨基酸与另一结构上相关的氨基酸的类似保守性取代，对生物活性都不会有较大的影响，尤其是当这种取代不涉及到多肽活性位点上的氨基酸时。
本文所用术语“多肽”是指氨基酸聚合物，而不是单指特定长度的产物;因此，肽、寡肽、和蛋白质都属于多肽的定义范围之内。该术语也不是指或包括多肽的表达后修饰，例如糖基化，乙酰化，磷酸化等产物。包括在该定义范围内的是，例如，含有某种氨基酸的一种或几种类似物(如包括非天然氨基酸等)的多肽，带有取代键的多肽，以及本技术领域中已知的其他修饰产物，包括天然存在的和非天然存在的产物。
本发明的蛋白质或多肽可用常规方法(Sambrook et al，文献同上)在宿主细胞中表达并且从细胞或培养基中纯化而得到。
本发明还涉及新的病毒重组体多核苷酸分子或载体，它们可以允许在某种选择的宿主细胞内表达异源基因。本发明的多核苷酸载体包括编码全部或部分河豚精蛋白或tK基因的多核苷酸序列，来源于某种选择的痘病病毒的RNA聚合酶，和编码某种所需异源基因的多核苷酸序列。这样的序列较好包括EMV河豚精蛋白或tK基因的调节区，且最好包括它们的启动子区。另外，该聚合酶的来源不仅局限于EMV，而是任何痘病病毒RNA聚合酶都可以使用。
因此，病毒载体可以含有由另一种痘病病毒，不管是脊椎还是非脊椎动物的痘病病毒所提供的其他病毒成份，并且只有EPV序列是由于EPV河豚精蛋白或tK基因序列，或其片段的存在而提供的。许多常规病毒表达载体和表达系统是本领域中已知的。尤其适用的载体系统是那些脊椎或非脊椎动物痘病病毒的载体系统。可以将昆虫痘病病毒河豚精蛋白和tK基因调节序列用于含有痘病病毒RNA聚合酶的其他病毒载体系统中，以提高那些系统的效能，例如，用于牛痘病毒载体中。一般说来，用于构建表达系统及其成份如表达载体和转化之宿主细胞的方法，都是本技术领域中已知的。一般可参见标准教科书中所述的方法，如上面所述的Sambrook等人的文献。因此，本发明并不局限于任何可以插入本发明之多核苷酸序列的特定病毒表达系统或载体，而是只要该载体或系统含有痘病病毒RNA聚合酶即可。
本发明的载体是一种不需要辅助成份的载体，也就是说，在向载体提供成份，如提供RNA聚合酶的痘病病毒中，存在或不存在功能性河豚精蛋白或tK基因都不会影响对所产生之重组病毒载体的使用。因为河豚精蛋白和tK都是非必需基因，所以本发明的病毒载体并不需要任何其他病毒蛋白质的存在，依靠辅助成份的载体系统中，这些病毒蛋白质可由另外的病毒提供以共同感染所选择的宿主细胞。
在被病毒载体感染后，包括昆虫和哺乳动物细胞在内的选择的宿主细胞将允许表达异源基因，具体地说，如果该病毒载体含有已插入昆虫痘病病毒家族任何成员(如，任何种类的EPV)的本发明EPV河豚精蛋白或tK基因序列，则宿主细胞将限于通常是被EPV感染的昆虫细胞。如病毒载体含有已插入某种脊椎动物痘病毒(如牛痘或猪痘病毒)中的本发明EPV河豚精蛋白或tK基因序列，则宿主细胞可以是选自被野生型脊椎动物痘病病毒正常感染的哺乳动物细胞。这类哺乳动物细胞是本领域熟练技术人员已知并可得到的人类细胞、啮齿动物细胞和灵长类细胞。
因此，根据本发明的一个方面，本发明的载体可以利用EPV河豚精蛋白之多核苷酸序列的一个片段，尤其是负责天然高水平表达该基因的启动子和辅助调节序列。优选的河豚蛋白序列存在于图2所示的序列之中，更优选的是在核苷酸2780至3200的区域内。该区域内更小的片段也可以用作调节序列。可使用预期的河豚精蛋白启动子序列，将其与某种选择的异源基因可操作地联在一起，置入能够在脊椎动物或非脊椎动物宿主细胞中发挥功能的病毒表达载体中，以大量产生所需的蛋白质。
本文所用术语“操作联系”是指调节序列与所选择之蛋白基因之间的关系，这种关系使得调节序列能够控制该蛋白质在合适的宿主细胞进行复制和表达。本领域的熟练技术人员可利用常规技术来操作联系这些序列。
如果载体中的河豚精蛋白多核苷酸序列含有全部或部分与异源基因联系或连接的河豚精蛋白编码序列，则在宿主细胞中产生的蛋白质可以是由有全部或部分河豚精蛋白和异源蛋白质组成的融合蛋白质。如果载体中的河豚精蛋白多核苷酸序列不含有足够的用于表达河豚精蛋白或肽片段的编码序列，则可只产生异源蛋白质。
以类似的方法，可以将tK的启动子和调节序列(图3)用于表达载体的构建中，以驱动异源蛋白质或融合蛋白质在选择的已知表达系统中表达。这种tK调节序列最好是得自于图3的序列，尤其是核苷酸750至890间的片段。该区域中的更小的片段也可以用作调节序列。
使用本发明的新的EPV河豚精蛋白或tK启动子序列的优点是这些调节序列能够在脊椎动物痘病病毒(如牛痘病毒)-哺乳动物细胞表达载体系统中发挥作用。例如，可以通过同源重组将强的河豚精蛋白启动子结合到牛痘病毒系统中。与杆状病毒多角体蛋白基因的启动子不同的是，EPV河豚精蛋白基因的启动子可以被直接用于牛痘或猪痘病毒表达载体之中。
为了构建本发明的载体，可从某种选择的昆虫痘病病毒如AmEPV中分离并纯化河豚精蛋白或tK多核苷酸序列，并且用合适的限制性核酸内切酶消化，以产生含有全部或部分河豚精蛋白或tK基因的片段。也可以用化学方法合成这样的片段。
而且，所需的AmEPV序列也可以从含有质粒pRH512、PMEGtK-1或pRH7的细菌培养物中得到。下面的实施例对质粒pRH512的物建进行了描述。这种质粒含有被插入到常规载体PUC9中Bam HⅠ位点上的4.51kb BgⅠⅡ片段AmEPV DNA序列。可用Bsp 1286Ⅰ消化按实施例1所述方法制得的AmEPV基因组DNA，然后用Hae

Ⅰ消化所得到的片段来构建质粒pRH7。用T4DNA聚合酶将AmEPV DNA修成平端，并将含有河豚精蛋白基因的片段连接到SmaⅠ消化pUC9片段后所得的大片段上。该片段含有完整的河豚精蛋白开放读码和某些侧翼序列，这些序列包括在图2中跨越核苷酸序列2274-6182之间的部分。质粒PMEG tK-1的结构含有tK基因的调节序列和下面实施例8中所述的结构基因。它是将AmEPV的EcoRI-Q片段插入到常规载体PUC18中而构建成的。
含有质粒pRH512，pMEG tK-1，和pRH7的细菌培养物已保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，USA)。
培养物 登记号 保藏日期大肠杆菌SURE菌株 ATCC68532 91年2月26日(Stratagene)pMEG-tK1大肠杆菌SURE菌株 ATCC68533 91年2月26日(Stratagene)pRH512大肠杆菌SURE菌株 ATCC(Stratagene)pRH7可使用标准方法，例如可用澄清的溶胞产物-等密度密度梯度离心法从寄存的细菌培养物中得到质粒。
这些ATCC寄存物是在下面条件下保藏的即在本专利申请未决时期能确保由专利和商标委员会成员确定的人员按37cFR1.14和35USC 122的规定得到该培养物。当本申请或其后续申请在某国家申请时，可根据该国家的专利法要求得到本发明的寄存物。但是，应当指出的是，寄存物的可得到性并不构成允许实施本发明，并进而导致对已授予之专利的侵权行为。
另外，本发明培养物是根据布达佩斯条约关于微生物保藏的规定保藏的，并且是公众可以得到的。也就是说，该保藏是在必需的精心照顾中保藏的，以使得该培养物在最近请求提供保藏样本之后的至少五年之内是活的而且是未被污染的，并且在任何情况下，寄存日之后至少30年或任何可能公开该培养物的专利可实施期限内，该保藏培养物都是有生命力和未被污染的。如保藏中心在被请求提供样品时，由于保藏的条件而不能提供时，寄存人承担更换寄存物的义务。在公开该培养物的专利被批准后，所有有关对公众得到本发明培养物的限制条件均将不可改变地取消。
本文所指的用于构建本发明载体的分子生物学方法是已知的标准方法。用于制备质粒载体和转化或感染宿主生物的各种方法都是本领域中已知的。这些方法都已在例如上述的Sambrook等人的文献中作了描述。因此，从微生物细胞中提取DNA进行限制酶消化、DNA片段电泳，使质粒加尾和退火并插入DNA、连接DNA，转化细胞，制备质粒DNA、蛋白质电泳及DNA序列分析都属于遗传工程领域中的已知技术。
因为AmEPV基因组没有特定的限制位点可使选择的基因以位点特异性方法有效地导入到该位点上以使之处于河豚精蛋白或tK基因的控制之下，因此必需先将这样的限制性位点引入到选择的EPV多核苷酸序列内的所需位点中。例如，位于河豚精蛋白基因起点下游3172位核苷酸处的特定Bst B1位点，就是用遗传工程方法产生适用于克隆的有用插入序列的最接近位点。因此，必需特意地插入较接近于河豚精蛋白基因起始Met的限制性位点。
插入限制性位点的方法是本领域的熟练技术人员已知的，包括利用中间穿梭性载体，如通过将EPV序列克隆到合适的克隆载体的位点上。本领域中的熟练技术人员应当明了，只要能在功能上将河豚精蛋白或tK基因和侧翼病毒DNA结合起来，任何合适的克隆载体均可使用。
可构建河豚精蛋白穿梭载体，使之包括河豚精蛋白结构基因部分、位于或引入到该基因中的克隆位点、以使所选择的异源基因能够被适当地插入到病毒基因组中而正好位于河豚精蛋白启动子附近，并在其控制之下，而且还包括连接到河豚精蛋白基因任一端上的侧翼病毒DNA，以便于将河豚精蛋白外源基因侧翼序列插入到另一表达载体中。侧翼病毒DNA的存在也有利于与野生型昆虫痘病病毒重组，从而将选择的基因转移到复制病毒基因组中。
然后可以对穿梭载体进行修饰以便插入某个选择的基因，方法是在相应的转录起始位点附近，删除部分或全部编码河豚精蛋白或tK的序列，这种位点在河豚精蛋白中可以是在3077和3080位核苷酸之间，而在tK中则包括809位核苷酸。可以用常规方法删除河豚精蛋白或tK编码序列。
除了限制位点之外，另外也可在缺失位点处插入各种不同的合成或天然的寡聚核苷酸接头序列。可以在缺失位点处插入一个多核苷酸接头序列(可以是人工合成的或天然的)，以使DNA片段在该位点处相偶联。这样的接头序列可以在两个被连接的序列，如启动子序列和要表达的基因之间提供一个合适的间隔区。如果需要，该接头序列也可以编码能用常规化学或酶促方法选择性地切割或消化的多肽。例如，选择的切割位点可以是一个酶切位点，包括被蛋白水解酶切割的位点，这些蛋白水解酶可以是肠激酶，Xa因子，胰蛋白酶，胶原酶和凝血酶。另外接头中的切割位点也可以是当暴露于某种选择的化学物质(如溴化氰或羟胺)时能够被切割的位点。一个切割位点，如果是被插入到某种适用于本发明之序列的接头中，并不限制本发明。任何所需要的切割位点都可以用于本发明，且其中许多在本领域中都是已知的。另一种情况是，该接头序列可以编码一个或一系列限制性位点。
本领域熟练技术人员在参考本发明时应当了解到，并不需要插入带有某种适当的限制性位点的接头序列来取代全部或部分河豚精蛋白结构序列，而且有可能将接头插入到昆虫痘病毒基因组中的某个位置上，使编码选择之多肽的序列和河豚精蛋白的结构序列均能得以表达。例如，可以将编码选择之多肽的序列插入到tK基因中以取代全部或部分tK结构序列，并且使之处于tK启动子的转录控制之下。
也可以使用聚合酶链反应(PCR)技术将合适的限制性位点导入EPV DNA中，并且扩增该EPV DNA的特定区域。这些方法对于本领域中的熟练技术人员是已知的，例如参见PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications，M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，and T.J.White(1990)。
利用这些技术，可以将几种不同的已经插入某种基因或其部分的可选择修饰的穿梭载体用于本发明中。
因此，本发明的一个实施方案是，用如上所述的多核苷酸序列做为穿梭载体，将某种选择的异源基因转移到选择的病毒中。在该方案中，编码EMV河豚精蛋白基因或EMV tK基因或其片段的多核苷酸序列连接到源基因上。该多核苷酸序列在河豚精蛋白异源基因或tK-异源基因的任一侧还有一侧翼区域，以便于容易地转移到某种选择的病毒中。所产生的这一构建体被称为基因暗盒(Cassette)。这样的侧翼区可以是从EPV中得到，或者是可与靶病毒互补的。例如，如果希望向牛痘病毒中插入一选择的异源基因以产生重组病毒，可以使用与靶牛痘病毒互补的侧翼区。同样，如果将异源基因插入到EPV河豚精蛋白或tK基因中，以便使所选择的EPV调节序列和异源基因侧翼接有EPV基因的本身序列，则可以使用这种基因暗盒转移到与侧翼序列具有同源序列的野生型EPV中。
可以按照上述的方法，将外源基因插入或连接到本发明的tK或河豚精蛋白序列上或者将外来侧翼序列连接到河豚精蛋白或tK基因上。本发明的载体可以使用外源基因的cDNA克隆，因为痘病病毒基因不含有内含子，据推测该内含子是整个细胞质感染部位的伴随序列。
可按照标准的克隆方法，将任何选择的基因插入到载体的已有限制性位点中以产生重组穿梭载体。最终可以将任何有意义基因插入到本文所述的载体中以获得所需蛋白质的高度表达。之后将片段中的限制性位点去除，以便产生优选的河豚精蛋白或tK穿梭性载体，该载体在河豚精蛋白启动子序列的3′下游具有一个或多个切割或克隆位点。因此，本发明不受异源基因选择的限制。
本发明的载体还可以含有一种已插入到全部或部分EMV河豚精蛋白或tK蛋白质编码序列中的异源基因，以干扰该蛋白质的天然加工。但是，当把该载体转移到另一种含有野生型河豚精蛋白或tK基因的病毒中时，可得以表达被插入的异源基因。因此，可以用昆虫痘病毒河豚精蛋白基因(图2)和/或tK基因(图3)作为在任何上述的表达系统中插入外源或外来DNA的位置。可以用如此构建的载体作为一种研究和生产方法的标志物，以鉴定是否已将异源基因成功地插入到所选择的表达系统中。
tK基因是插入某种选择的异源基因的尤其期望的位点。与河豚精蛋白不同的是，tK是在感染的早期并且以较少量产生的。另外，许多痘病病毒含有与EPVtK有足够同源性的tK基因，从而便于重组。例如，在用于哺乳动物细胞的牛痘病毒表达系统中，牛痘tK基因是公共的插入位点。因此，为构建一穿梭载体以在载体系统间直接往返选择的基因时，这种基因尤其适用。特别是，希望将一外来基因在核甘酸460至560之间插入EPVtK基因序列中(见图3)。
利用同源重组方法可以完成含有外源基因之基因暗盒向野生型病毒内的插入。用来将有意义基因插入到本发明病毒中的同源重组技术是本领域技术人员熟知的。当穿梭载体与野生型病毒共同感染到宿主细胞时，可以通过同源重组将含有选择之基因的基因暗盒转移到病毒中，从而产生重组病毒载体。
用本发明的重组病毒载体在合适的生长培养基中感染易感宿主昆虫细胞以完成所选择之基因的表达。EPV表达载体通过感染病毒颗粒的组装和复制在昆虫细胞或昆虫中繁殖。可以用这些感染性载体在适当昆虫细胞中产生选择的基因，从而促使选择的DNA序列在被感染细胞内的有效表达。如果用上述的同样方法将EPV河豚精蛋白基因(或tK基因)-异源基因片段插入脊椎动物痘病病毒中，即可用此重组病毒感染哺乳类动物细胞，并且在哺乳动物细胞中产生异源蛋白质。
例如，可以直接将已经插入牛痘病毒系统之tK位点中的基因转移到本发明昆虫痘病病毒载体的tK座位上，反之亦然。例如，可用同源重组法完成这一穿梭过程。同样将某种选择的基因插入到病毒载体中的河豚精蛋白基因或tK基因内，可使该基因被转移到分别具有同源河豚精蛋白或tK序列的其他病毒中。
下面举例描述本发明之有代表性的载体，它是用编码人β-干扰素(IFN-β)合成的基因作为异源基因。按传统方法用限制酶消化或修成平头以制备含有IFN-β基因的DNA片段，并将其克隆到AmEPV河豚精蛋白基因的合适位点中，其中已用上述方法工程化改造了限制性位点。
IFN-β基因的插入产生杂合或融合的河豚精蛋白-IFN-β基因，如果只有一部分河豚精蛋白基因按上述方法删除，则该基因便能够产生一种融合的多肽产物。如果全部河豚精蛋白结构序列被删除，则只能产生干扰素。另外，该杂合基因可以含有河豚精蛋白启动子、IFN-β蛋白质编码序列、以及编码河豚精蛋白之一部分多肽序列的序列，只要所有这些编码序列没有从所用的特定穿梭载体中删除即可。
所产生的穿梭载体含有与IFN-β基因偶联的AmEPV河豚精蛋白基因序列。然后可将重组穿梭载体的杂合河豚精蛋白-IFN-β基因转移到一合适的昆虫痘病病毒(如优选的AmEPV昆虫痘病病毒)的基因组中，以产生能够在宿主昆虫细胞中表达编码β-干扰素之基因的重组病毒表达载体。用本领域中熟练技术人员熟知的方法完成杂合基因向野生型病毒的转移。例如，可以用野生型昆虫痘病病毒感染合适的昆虫细胞。然后用本发明的穿梭载体转染这些被感染的细胞。如参见DNA cloningA Practical Approach，Vol.Ⅱ，D.M.Glorer edited，chapter 7，1985。本领域中的熟练技术人员能够选择适用于本发明的合适昆虫细胞。例如可以使用盐沼泽蠋(solt marsh caterpillars)和培养的舞毒蛾细胞。
在转染后之AmEPV DNA的复制过程中，杂合基因通过重组穿梭载体和AmEPV DNA之间的同源重组被转移到野生型AmEPV中。因此，产生含有野生型，非重组EPV和能表达IFN-β基因之重组EPV的混合物。
虽然转染是将杂合基因转移到EPV基因组中的优选方法，但是，本领域中的熟练技术人员可以了解到，其他方法也可有效地将基因插入到EPV基因组中，并且只要在杂合基因序列和其他病毒株的相应序列之间有足够的同源性以允许重组发生，即可在重组穿梭载体和EPV(或其他痘病病毒)的其他毒株之间发生重组。
然后可以从非重组和重组昆虫痘病病毒的混合物中选择含有已掺入到AmEPV基因组中之杂合河豚精蛋白-IFN-β基因的优选重组AmEPV表达载体。优选但并非仅有的选择方法是，筛选由不产生病毒闭合体的病毒感染之宿主昆虫细胞所形成的噬斑。之所以以这种方式进行选择，是由于河豚精蛋白基因的插入失活，而使不含足够未中断之河豚精蛋白编码序列的重组EPV病毒不能有效地产生病毒闭合体。
另外，该选择方法可包括使用β-半乳糖苷酶基因以便进行颜色选择。该方法包括将大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因结合到穿梭载体中，而且是本领域中的技术人员熟知的。如果将外源性DNA插入到tK基因中又仍然能够表达河豚精蛋白基因，这种方法便尤其有价值。本领域中的技术人员也可以根据本发明使用其他的选择方法。
然后，从重组病毒中纯化DNA，并用合适的限制酶或PCR技术进行分析，以证实重组的AmEPV载体已在适当的位置插入了选择的基因。
本发明所提供的载体和方法的特征在于与已知的载体和载体系统相比有许多优越性。其优点是本发明的EPV病毒载体在哺乳动物中没有致癌或致肿瘤作用。而且，控制桑红缘灯蛾昆虫痘病病毒(AmEPV)基因表达的调节信号与牛痘的相似。因此，不仅有可能作为表达暗盒在昆虫细胞中转移强表达的河豚精蛋白基因，或胸苷激酶基因，而且也可以用于脊椎动物痘病病毒如牛痘和猪痘病毒中。
根据已报导的有关牛痘、疱疹、和杆状病毒载体系统的数据，提示在不破坏载体存活性的情况下转移30Kb，当使用本发明的新的EPV载体和方法时，就不会受到能够包装到病毒中之外源DNA量之正常限度的限制。
另一个优点是，对于本发明的新的载体来说，外源性蛋白质的转录和翻译是整个细胞质的转录和翻译。还有一个优点则是，当EPV河豚精蛋白调节序列与源基因操纵结合在本发明的载体中时，其表达能力可导致异源蛋白质在选择的宿主细胞中的高水平表达。
如上所述，本发明EPV载体以及用它们在昆虫细胞中表达选择的异源蛋白质的方法，具有能在昆虫细胞中复制的优点，这样就避免了使用哺乳动物病毒，从而减少了哺乳动物病毒污染产物的可能性。本发明的表达系统还是一种不依赖辅助成份的病毒表达载体系统。已知的杆状病毒表达系统也具有这两个特征。但是，如表1所示，利用本发明载体的EPV表达系统(EEVS)与杆状病毒表达系统(BEVS)相比具有某些重要的突出特征。
表1EEV和BEV间的差异EEV BEV复制部位 细胞质 细胞核病毒科 痘病毒科 杆状病毒科外来基因的 河豚精蛋白和 多角体蛋白和插入部位 胸苷激酶(tK)P10在脊椎动物和 可以 无哺乳动物对应物;
昆虫系统间穿梭 (真痘病毒) 已知杆状病毒不含的可能性 (兔痘病毒) tK基因;未发现(猪痘病毒) 哺乳动物系统中有(禽痘病毒) 多角体本发明还提供了一种筛选重组宿主细胞的方法，借此得以利用本发明的重组病毒多核苷酸分子来插入异源基因。将含有选择之异源基因序列的病毒分子连接到编码比全部昆虫痘病毒河豚精蛋白之序列较小的多核苷酸序列上。该异源基因可在不存在完整编码序列的情况下连接到河豚精蛋白或tK调节序列上，或者将其插入到河豚精蛋白或tK基因编码序列中，从而中断该编码序列。在适合于表达外源蛋白质(非融合的或是作为与部分河豚精蛋白序列融合的蛋白质)的条件下培养被重组载体感染的细胞。不存在通常由表达完整河豚精蛋白所形成的闭合体表明已整合了异源基因。
如果病毒载体同样含有不完整的或中断的EPVtK编码序列，因无活性胸苷激酶序列的整合而产生的胸苷激酶功能(如，对氨甲喋呤或其类似物的抗性)消失即表明已插入了异源基因。
或者，如果亲代病毒删除其部分tK或河豚精蛋白基因，然后与含有已与外源基因融合之完整tK或河豚精蛋白的病毒载体混合，那么重组体则会分别表达氨甲喋呤抗性或产生闭合体，从而证实活性tK或河豚精蛋白以及外源基因的整合。
上述的选择方法为选择重组昆虫痘病毒表达载体提供了有效而方便的手段。
本发明的另一个实施方案包括，使用本发明的新EPV表达载体和方法来控制昆虫。可利用上述本发明的载体和方法实施对昆虫害虫的控制。例如，可以将编码某种选择的昆虫毒素的基因插入处于河豚精蛋白或tK调节序列控制下的病毒表达载体中，或者插入到上述两个基因中的任一个中，以便将其重组到具有同源侧翼区的选择的病毒中。
编码昆虫毒素的基因对于本领域中的熟练技术人员是熟知的。根据本发明可以使用例如一种从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)中分离的毒素基因。例如美国专利4，775，131号和4，865，981号中描述的B.t.基因。其他已知的昆虫毒素也可以用于本方法。
将所得到的含有毒素基因的EPV载体施用于靶害虫或其周围环境中。其优点是，该病毒载体会感染靶昆虫，从而产生大量的毒素，而实现对害虫的控制。如果用昆虫痘病病毒河豚精蛋白基因的调节序列表达该毒素，可以产生特别大量的毒素蛋白质。
或者，使河豚精蛋白保持完整而将毒素基因插入到不同的昆虫痘病病毒基因如tK基因中。在这种构建体中，将由该系统产生毒素，然后被天然产生的河豚精蛋白有效地复盖或包裹。因此该系统能够产生可以在环境中持续存在的毒素，从而延长了与靶害虫的接触机会。
除了本发明新的昆虫痘病毒表达载体和上述使用方法外，本发明还涉及用来源于昆虫痘病毒的新的调节成份构建新的嵌合牛痘和猪痘疫苗以及能在多种哺乳动物痘病毒中发挥作用的表达系统。也可以将本发明的多核苷酸序列与病毒疫苗(如已知的牛痘病毒疫苗)一起使用，以加强这些疫苗的作用。已将这些疫苗用于控制发生在哺乳动物中的狂犬病及其他传染性疾病。特别是可期望将EPV河豚精蛋白启动子序列在体外导入到用来在哺乳动物宿主中表达选择之蛋白质的已知病毒载体中，从而可使强有力的河豚精蛋白启动子增进该蛋白在病毒疫苗中的表达。在这方面本发明较其他表达系统，包括杆状病毒表达系统(BEVS)有明显的改进。
下面的实施例描述了实施本发明的组成成份和方法，包括最佳的实施方式。这些实施例不应当成为对本发明的限制。除了另外指明，所有的百分比都指重量百分比，而所有的溶解的混合物比率都是按体积计算的。本文所公开的限制酶可以从Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD，或New England Biolabs，Beverly，MA，买到。可按照厂家提供的说明书使用这些酶。DNA聚合酶的Klenew片段，T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶都是从New England和Promega公司得到的。
实施例1.制备AmEPV DNA以前曾描述过AmEPV的复制[R.H.Goodwin et al，J.lnvertebr.Pathol.，56190-205(1990)]。将舞毒蛾(Lymantria dispar)细胞系IPLB-LD-652[Inseet Pathology Laboratory，Agricultural Research Service，U.S.Department of Agriecelture，Beltsville，MD]在每毫升添加了10%胎牛血清、100U青霉素和100μg链霉素的EX-CELL400[JRH Bioseionces，Lencxa，KS]中于26至28℃下保温。其他的昆虫细胞系是本领域中熟练技术人员已知的，而且也可用于本发明。用于细胞培养的AmEPV接种物得自AmEPV感染过的于-70℃贮存冷冻干燥过的E.acren幼虫[P.L.Hall et al，Arch，Virol.11077-90(1990)]。将该幼虫压碎浸泡于5meEX-CELL400(含有青霉素和链霉素但不含胎牛血清)中，其中已经加入0.003g的盐酸半胱氨酸以防止黑变(melaniration)。以200×g转速离心5分钟沉淀碎片，将上清通过0.45μm孔径的过滤器。
向会合前的细胞单层上加入接种物(每个细胞约0.1至1PFU)，在第一天内不时地搅拌平皿，以便用AmEPV感染舞毒蛾细胞。感染后5到6天收获感染的细胞。
用两种方法之一从感染的细胞中制备AmEPV DNA。第一种方法是对包埋于琼脂填料中的感染细胞进行原位消化，以脉冲电场电泳法[Bio-Rad CHEF-Ⅱ-DR系统]分离释放出的细胞和病毒DNA。用第一次细胞培养物传代的AmEPV感染IPLB-LD-652细胞。在感染后6天以200×g转速离心5分钟收集感染的细胞、洗涤、并将其悬浮于改良的Hank氏磷酸盐缓冲液(PBS)中，其中每升含有15g葡萄糖，但不含Ca2+和Mg2+。
为了将感染的细胞包埋于琼脂填料中，将1%Sea Plague GTG琼脂糖(用改进的Hank's PBS制备并在37℃下平衡)与感染的细胞以1∶1的比例混合，得到每ml含有5×106个细胞的0.5%琼脂。通过将插入物在每ml含有1%Sarkosyl-0.5MEDTA-1mg蛋白酶

的溶液中于50℃下轻轻振荡2天进行消化，以释放出DNA[C.L.Smith et al.，Methods Enzymol.151461-489(1987)]。用于DNA分离的CHEF-Ⅱ-DR参数是180V，脉冲比率为1，起始脉冲时间50秒，最终脉冲时间90秒，电泳在4℃下进行20至25小时。分离凝胶是1%Seakem GTG琼脂糖和0.5×TBE缓冲液[Sambrook et al，文献同上]。通过电洗脱和溴乙啶染色观察病毒DNA谱带[W.B.Allington et al，Anal.Biochem.85188-196(1978)]。在乙醇沉淀之后，将回收的DNA用于质粒克隆。
第二种制备病毒DNA的方法是使用存在于被感染细胞培养物上清中的细胞外病毒。通过以200×g离心5分钟从感染10天后的细胞培养物中得到澄清的上清液。以12，000×g离心从上清中收集病毒。将沉淀的病毒再悬浮于6ml1×TE中。加入DNaseⅠ和RNaseA(最终浓度分别是10和20μg/ml)，将混合液在37℃下保温30分钟。将混合物加热至50℃保持15分钟，然后加入SDS和蛋白酶K(分别为1%和200μg/ml)。在50℃下保温该样本过夜，用缓冲液饱和的苯酚提取三次，再用SEVAG提取1次(Sambrook et al，文献同上)。用乙醇沉淀DNA，并再将其悬浮于1×TE(PH8)中。
为了进行常规的病毒定量，向一个60mm培养皿中的会合前细胞单层上加入1ml合适的病毒稀释液(在未加其他成份的EX-CELL 400中制备的)，在26至28℃下间断地搅拌经过5小时的吸收期。去除病毒接种物，然后将用2×EX-CELL400制备的并在37℃下平衡过的5ml 0.75%Sea Plaque琼脂糖[FMC BioProducts，Rockland，ME]覆盖到细胞单层上。在26℃下保温5天后用立体显微镜观察噬斑。
用各种不同的限制性核酸内切酶(如BamHⅠ、EcoRⅠ，HindⅢ，PstⅠ和XhoⅠ)切割上述任一种方法制备的DNA，得到各种片段，这些片段的物理图示于图1中。下文提及每个限制性片段时均用相应内切酶及合适的字母表示)如BennHⅠ-A至BamHⅠ-E，EcoRⅠ-A至EcoRⅠ-S等。
实施例2分离河豚精蛋白基因为了对河豚精蛋白基因进行定位，溶解从感染的毛虫中纯化制备的闭合体(OBs)，并用4%丙烯酰胺堆积凝胶(staeking gel)和7.5%分离凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[J.K.Laemmli，Nature(London)227680-685(1970]。用AQ 501×8树脂[Bio-Rad，Richmond，CA)使经丙烯酰胺分离的用于进行蛋白质微序列分析的河豚精蛋白去离子化。使凝胶在4℃下聚合过夜。使用由125μM Tris-Hcl(PH6.8)、4%SDS(W/V)、10%β-巯基乙醇(V/V)和20%甘油组成的2×Laemmli样本缓冲液制备样品。
用2×Laemmli样本缓冲液对OB悬浮液样本进行1∶1稀释，并煮沸5分钟。电泳分离OB蛋白制品得到几条谱带。河豚精蛋白(113KDa)是纯化之OB的主要蛋白质组份。通过间隔性的酸性-席夫(Schiff)染色法。[R.M.Zacharius et al，Anal.Biochem.，30149-152(1969)]检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的河豚精蛋白是否糖基化。
电泳分离之后，用Bio-Rad Trans Blot设备将未染色凝胶上的几条谱带转移到一种Immobilon聚二氟乙烯(PVDF)膜上，包含在含有10mM丙磺酸吗啉(PH6.0)和20%甲醇的缓冲液中以90V电泳2小时。通过考马斯兰染色后在PVDF膜上观察到河豚精蛋白。
将PVDF膜上含有河豚精蛋白的区域从该膜上切下，用Applied Biosystems气相序列分析仪直接进行蛋白质微序列分析。完整蛋白质的微序列分析没有成功，可能是因为该蛋白的N末端被封闭所致。
对从PVDF膜上洗脱的河豚精蛋白样本进行溴化氰切割，以产生用于序列分析的内部肽片段。结果得到了15、9、8和6.2KDa的主要多肽。
实施例3序列分析，杂交反应用[α-35S]d ATP和序列酶[VS Bio-chemical，Cleveland，OH]通过双脱氧链终止方法[F.Sanger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(1977)]对所有DNA进行序列分析。按照美国生物化学公司(Bio-chemical)提供的说明书用序列酶进行标准序列分析反应。
从实施例3中产生之9、8、和6.2KDa多肽中得到一个可靠的氨基酸序列。8和9KDa多肽代表了重叠部分的CNBr切割产物，同时还产生了最长的连续氨基酸序列Met-Ala-(Asn or Arg)-Asp-Leu-Val-Ser-Leu-Leu-Phe-Met-(Ans or Arg)-( )-Tyr-Val-(Asn )-Ile-Glu-Ile-Asn-Glu-Ala-Val-( )-(Glu ).从6.2KDa片段中获得的氨基酸序列是Met-Lys-Ile-Thr-Ser-Ser-Thr-Glu-Val-Asp-Pro-Glu-Tyr-Val-(Thr or Ile)-Ser-(Asn ).从15KDa片段中得到的部分序列是(Asn )-Ala-Leu-Phe-(Phe )(Asn )-Val-Phe。所有序列最终都定位于河豚精蛋白基因序列之内。
实施例4质粒pRH512根据厂家提供的说明书用BglⅡ消化基因组AmEPV DNA以制备BglⅡAmEPV DNA文库。对质粒pUC9[GIBCO;Bethesda Research Labs]进行Bam HI消化和磷酸酶处理。将BglⅡ切割的基因组AmEPV用散弹抢式法克隆到pUC9的BamHⅠ位点上。按照厂家提供的散弹抢式连接反应法说明书用含有不同重组质粒的Bio-Rad基因脉冲仪(Gene Pulser)通过电穿孔来转化大肠杆菌SURE[Stratagene，La Jolla，CA]。可用常规碱溶解方法小量制备质粒。用EcoRⅠ-SalⅠ切割这些质粒以释放出插入段，并电泳分离之。将产生的质粒DNA在尼龙膜上进行Southern印迹反应，产生出许多克隆。
对基因组DNA进行限制酶消化所产生的片段是4.4BglⅡ片段和EcoRⅠ-D片段。为了从如上产生的那些克隆中定位所需要的克隆，用从6.2KDa CNBr片段中得到的序列设计一简并寡聚核苷酸，用来作为探针以在克隆中确定河豚精蛋白基因的位置。这种叫做RM58的探针的核苷酸序列是GA5GT7GA6CC7GA5TA6GT，其中5代表A或G，6代表C或T，和7代表A、G、C或T，该探针的肽序列是Glu-Val-Asp-Pro-Glu-Tyr-Val.
用[α-32P]dcTP通过随机寡聚核苷酸延伸方法[A.P.Feinberg et al，Anal.Biochem.，1326-13(1983)]或用[γ-32p]ATP和T4多核苷酸酶[Sambrook et al，文献同上]对DNA探针进行放射性标记。用同样的方法标记下面所述的所有其他寡聚核苷酸探针。通过Sephadex-G50柱对两种类型的探针进行纯化。
用Hybond-N[Amersham]进行Southern转移;通过UV交叉连接将转移的DNA固定在膜上。用转移的DNA(包括上述的限制性片段以及克隆到上述BamHⅠ消化之质粒pUC9中的AmEPV DNA的BglⅡ文库)进行Southern杂交。用BLOTTO[Bambrook et al.，文献同上]在37或45℃下与寡聚核苷酸探针杂交，然后用0.3M NaCl-0.06M Tris(PH8)-2mM EDTA在室温下洗两次，每次5分钟。
RM58探针杂交到Am EPV DNA的4.4kbBglⅡ片段和EcoRⅠ-D片段上[见图1]。经与RM58寡聚核苷酸杂交还鉴定出了一个由散弹枪式克隆法产生的质粒，即重组的pRH512(如被插入到含有长约1.5kb河豚精蛋白基因5'端之pUC9BamHⅠ位点中的BalⅡ 4.56kb片段)。
分离4.51Kb pRH512 BalⅡ插入段，并按上述方法放射性标记之，然后按下述方法再杂交到各种不同的AmEPV基因组消化产物上。在65℃下用BLOTTO[Sambrook et al，文献同上]进行DNA-DNA杂交，然后在室温下用0.3M NaCl-0.06M Tris(PH8)-2mM EDTA洗两次，每次5分钟，再在65℃下用加入0.4%SDS的上述缓冲液洗两次每次15分钟，然后在室温下用0.03M NaCl-0.06M Tris(PH8)-0.2mM EDTA再洗两次。观察到了与AmEPV DNA的BamHⅠ-A、EcoRⅠ-D、HindⅢ-G和-J、PstⅠ-A和XhoⅠ-B片段的杂交。这些杂交反应的结果表明pRH512中的4.51Kb片段与由BglⅡ消化基因组DNA所产生的4.4Kb片段基本相同。
然后用两种方法对pRH512的4.51Kb BglⅡ插入段进行序列分析。一个是双股质粒序列分析方法[M.Hatlori et al，Anal.Biochem.，152232-238(1986)]，该方法是在每次序列分析反应中使用“小型制备”[Sambrook et al.文献同上]DNA和1pmol通用的、逆转的或常规设计的寡聚核苷酸引物。按照这种方法经嵌套核酸外切酶Ⅱ缺失[S.Henikoff.Methods Enlymol.，155156-165[(1987)]对质粒pRH512进行序列分析。该缺失是从通用的引物末端开始的。为制备这些缺失，用EcoRⅠ切割DNA，利用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段充填α-硫代磷酸盐d NTP[S.D.Putney et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，787350-7354(1981)]，用SmaⅠ切割，然后用核酸外切酶Ⅲ处理。每30秒钟取样本，使之再连接，并且通过电穿孔法用以转化大肠杆菌SURE细胞。用通用的引物进行序列分析反应。如果制备一个与该序列互补的引物，并且通过RM58结合位点(碱基3983至4002)反回来进行序列分析，所产生的序列如被翻译，则可以得到对6.2 KDa CNBr多肽片段进行微序列而产生的氨基酸序列。
第二种序列分析方法是，按下面所述结合使用M12散弹枪式序列分析法并使标准的和通用的且逆反的M13引物进入MB噬菌体中，以进行单链序列分析。对质粒pRH512进行超声处理产生随机片段，用噬菌体T4DNA聚合酶修复，并将这些片段散弹枪式克隆到SmaⅠ切割的M13mp19[GIBCO]中。使用见于pRH512中的4.5Kb插入段制备的放射标记探针，筛选噬斑以鉴定合适的克隆用散弹枪式单链序列分析[如参见Sambrook et al，文献同上]。对pRH512之BglⅡ插入段的序列分析将其隔离至核苷酸0至4505，从而使之5'和3'延伸到河豚精蛋白基因处(图2)。
实施例5获得其他的AmEPV序列用DraⅠ消化基因组DNA以制备DraⅠAmEPV DNA文库。将这些DraⅠ片段散弹枪式克隆到SmaⅠ消化的、磷酸酶处理过的载体M13mpl9中。用标准方法[J.Sambrook et al，文献同上]制备M13病毒和DNA。按常规方法进行连接和热休克转化[Sambrook et al，文献同上]，得到被转化到大肠杆菌UT481菌株[得自田纳西大学]或SURE菌株中的散弹枪式克隆的片段。
用400mg基因组AmEPV DNA作为模板进行标准PCR[Innis et al，文献同上]以制备从DraⅠ切割之AmEPV片段的M13散弹枪式基因库的硝化纤维素滤膜复制本(噬斑样品)[Micron Separations，lnc.]中鉴定586bp DraⅠ克隆的探针。用这种方法分离出复盖河豚精蛋白基因中心未知序列区的克隆。用于该反应的标准PCR引物是RM92(GCCTGGTTGGGTAACACCTC)和RM118(CTGCTAGATTATCTACTCCG)该序列测定表明在碱基931处有一个单一HindⅢ位点，并且河豚精蛋白公开读码(oRF)的3′端被切成平头(图2)。
将反向聚合酶链反应(PCR)方法[M.A.Innis et al，PCR Protoeol，a guide to methods and applications，Academic Press，Inc.San D

CA(1990)]和ClaⅠ消化的已连接成环的AmEPV DNA片段，制备探针用以鉴定含有侧翼序列的克隆或证实在临近克隆中没有干扰序列。在反向PCR中使用的引物是从pRH512序列中得到的RM82和RM83。RM82的序列是TTTCAAATTAACTGGCAACC，而RM83的序列是GGGATGGATTTTAGATTGCG。
进行34轮PCR反应，其特定反应条件是在94℃下变性30秒，在37℃下退火30秒，在72℃下延伸15分钟。最后，在72℃下将样本保温8.5分钟以完成延伸反应。每种引物的浓度都是1μM。
用ClaⅠ消化所得到的2.2Kb反向PCR产物，并用凝胶电泳法纯化1.7Kb片段。用KM83作为引物对该1.7Kb PCR片段进行序列分析。如鉴定这种新序列须制备用于该序列的其他PCR引物。该序列分析方法使用序列酶、5pmol的每种引物，和10到50ng的模板。在序列分析之前，用氯仿提取PCR产物，并在Sephaeryls-400层析柱[Sambrook，et al，文献同上]上纯化之。集中各DNA序列并使之排成直线，可以得到一致的序列[S.Staden，Nucleic Acids Res.，104731-4751(1982)]。已测出两条链的完整序列;用常规序列测定法证实了PCR产物序列。
1.7kb PCR片段的相关ClaⅠ位点位于核苷酸3485和6165处。对此片段进行放射性标记，并用它作为探针从BglⅡ片段库中定位其他的克隆，即PKR827(307bp)，PRH85(1.88Kb)和PRH87(1.88kb)。使用上述用于PRH512的相同的嵌套核酸外切酶Ⅱ缺失和序列测定方法对质粒PRH85和pRH87进行序列分析。用常规设计的引物对反向PCR产物进行序列测定，证实质粒pRH85和pRH87代表了相同而方向相反的1.88kbBglⅡDNA插入段，但也提示在pRH827和PRH85之间有一个80bp缺失。已在DraⅠ片段中鉴定出这个80bp DNA片段，它是被克隆到M13中之从碱基4543延伸到5128的片段。
河豚精蛋白ORF在物理图上的定向如图1所示。有意义的是发现1.7kb反向PCR片段只与AmEPV HindⅢ-G片段杂交。从8和9KDa重叠CnBr产生的多肽中得到的氨基酸序列见于4883至4957位核苷酸。从6.2KDa多肽得到的序列见于3962至4012位核苷酸，而从15KDa多肽得到的氨基酸序列见于4628至4651位核苷酸。因此，所有从蛋白质微序列测定得到的序列最终都见于河豚精蛋白ORF之内。
实施例6河豚精蛋白基因转录确定河豚精蛋白基因转录的起始点。制备以推测的起始蛋氨酸下游65bp开始的、与河豚精蛋白基因序列互补的引物，并用它进行一系列引物延伸反应。
A.RNA的制备和引物延伸反应。
制备六个150mm亚会合细胞培养皿。抽吸培养基，向每个培养皿中加入2ml的病毒接种物。病毒浓度是每个细胞大约0.1至1PFU。在3小时的吸收过程中不时地搅拌培养皿。在吸收期结束后，用5ml改进的PBS洗细胞。更换培养基，在27℃下将感染细胞保温72小时。用硫氰酸鈲-氯化铯方法[J.M.chirgwin et al，Biochemistry，185294-5299(1979)]从感染细胞中分离总RNA。
用引物RM165进行引物延伸反应，该引物为35碱基的寡核苷酸(GTTCGAAACAAGTATTTTCATCTTTTAAATAAATC)，其起始点和终止点分别位于TAAATG主结构中起始蛋氨酸密码子下游的100和65bp处。用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶对该引物进行末端标记，并在“旋制柱”(“Spun Column”)(Sambrook et al、文献同上)上纯化之。为了退火，用乙醇使4μg总量被感染细胞的总RNA和106cpm放射性标记引物共同沉淀。将沉淀物再悬浮于25μl杂交缓冲液[80%甲酰胺、40mM N，N'-双(2-乙基磺酸)呱嗪(pH6.4)、400mM NaCl、1mMEDTA(pH8.0)]中，使之在72℃下变性15分钟，并在30℃下保温18小时。
为了进行引物延伸，用乙醇沉淀RNA-引物杂交产物，再悬浮，并将其用于5个单个反应中。每份反应混合物均含有8μg感染的细胞的总RNA、50mM Tris-HCl，(pH8.3)，50mM KCl、IOmM二硫苏糖醇、10mM MgCl2、4单位鸟成髓细胞性白血病病毒反转录酶(Life Sciceces)、8单位RNasin(Promcga)、0.25mM三磷酸脱氧核苷(dNTP)和0.25mM合适的三磷酸二脱氧核苷(ddNTP)，对照组反应混合物则不含有ddNTP。用于C、T、A和G反应的dNTP/ddNTP比率分别是4∶1，5∶1，5∶1，和2∶1。反应在42℃下进行30分钟。
向每种反应混合物中各加入1微升的追加缓冲液(4μl 5mM dNTP混合液和1μl浓度为20单位/μl的反转录酶)，然后将它们在42℃下继续保温30分钟。在序列测定凝胶(含有7M尿素的8%丙烯酰胺)上分离反应产物，通过放射自显影观察之。观察互补性可以至TAAATG主结构上游的AAA，表明该基因的转录是在所说的晚期启动子的TAAATG成份中起始的。直接上游是转录本上非编码之poly(A)的5'区，poly(A)平均长度大于6bp。
实施例7河豚精蛋白序列分析对上述的RM58寡核苷酸引物结合区进行序列分析，以开始鉴定河豚精蛋白ORF(G5R)。检查AmEPV河豚精蛋白基因序列(ORF G5K)，发现了潜在的能够编码1，003个氨基酸或大约1.5KDa之蛋白质的3.0Kb ORF。与已报道的完整AmEPV基因的18.5%[Langridge，W、H、R.，R.F.Bozarth，D.W.Roberts(1977)，Virology76618-620]相比，该DRF含有29%G+C。对起始ATG上游的92个碱基进行检查，发现只有7个G或C残基。还发现在河豚精蛋白ORF的92bp 5′区中存在着一个已知的脊椎动物痘病毒调节序列。包括的是三个TTTTTNT早期基因终止信号和TAAATG，推断它是代表了启动河豚精蛋白基因转录和翻译的晚期转录起始信号。在河豚精蛋白ORF上游92bp中还存在几个相临的翻译终止密码子。
对河豚精蛋白基因上游序列的分析揭示了其他四个潜在的ORF即G1L、G2R、G3L和G4R(图2)。由ORF G2R或G3L编码的较小的潜在多肽之间没有发现明显的同源性。但是ORF G1L与存在于牛痘病毒HindⅢ-Ⅰ片段中的ORF17有很大程度的同源性，其功能尚属未知。ORFG4R显示与山羊痘病毒(Sapripoxvirus)的ORF HM3有同源性。在牛痘病毒中，发现ORF HM3同源序列与不完全ATI基因的位点非常接近。位于河豚精蛋白基因右侧的部分G61 OKF表现出与牛痘病毒NTP酶Ⅰ有良好的同源性。在另一种昆虫痘病毒，cbEPV[Yuen，L.et al，Virol.182403-406(1991)]的部分G6LORF和NPHI之间发现存在有更好的同源性(18.4%等同，共162个氨基酸)。
实施例8分离含有tK基因的AMEPV EcoRⅠ-Q片段并进行序列测定。
使用上述用于河豚精蛋白的方法对实施例1中的基因组AmEPV的EcoRⅠ-Q片段进行序列测定。序列分析表明有含有两个完整和一个部分ORF的1151bp。对ORF Q2的DNA序列分析表明鉴别性简并寡聚核苷酸(RM03和RM04)的位点可能是杂交位点。用上述的方法制备两个寡聚核苷酸RM03和RM04。这两个寡聚核苷酸是以几种痘病毒和脊椎动物tK基因[C.Upton etal，J.Virol.，60920-927(1986);D.B.Boyle et al，Virology，156355-365(1987)]的不同但非常保守的区域为基础的。RM03是与牛痘tK蛋白质中从82位天冬氨酸至87位苯丙氨酸的氨基酸残基相应的32重简并寡聚核苷酸GA(T/C)GA(G/A)GG(G/A)GG(G/A)CC(G/A)TT(C/T)TT。RM04是与牛痘中从11位甘氨酸至16位甘氨酸之间的区域相应并有32重简并的GGNCCCATGTT(C/T)TCNGG。用上述标记RH58探针的方法对这些探针进行放射性标记。
通过将简并寡聚核苷酸探针RM03和RM04与ECORⅠ-消化之EPV DNA的Southern印迹杂交，鉴定AmEPV的胸苷激酶(tK)基因。分离、纯化有用的EcoRⅠ带(EcoRⅠ-Q)，并将其连接到已用EcoRⅠ消化并用牛小肠碱性磷酸酶处理过的pUC18载体(GIBCO)中。通过与放射活性标记的寡聚核苷酸探针杂交并根据插入段的大小来鉴定重组克隆。
其中一个克隆称作PMEGtK-1(图6)。使用含有位于pUC18载体序列两个相关方向上之EcoRⅠ-Q片段的重组克隆进行序列测定。使用上述的用于pRH512的Henikoff方法产生序列嵌套缺失。用这些克隆对完整EcoRⅠ-Q片段进行序列分析。
接着，使用这些寡聚核苷酸和另一个RM129(它是一个从ORFQ1中制备的非简并寡核苷酸GGTGCAAAATCTGATATTTC作为序列测定引物，以证实它们在ORF Q2中所示的位置。ORF Q2可能编码182个氨基酸的蛋白质(21.2KDa)。ORF3可能编码一种至少有68个氨基酸的多肽，但它是不完整的而且是从ORF Q2以反方向转录的。ORF Q1可能编码66个氨基酸的小肽(7.75KDa)。
对EcoRⅠ-Q片段的进一步分析还揭示了其他的几点首先，ATT含量非常高(80%)。对于ORF Q2，翻译起始密码子上游100个核酸中有90%ATT。在ORF Q1和Q2中发现了一些潜在的痘病毒转录信号。正好位于ORF Q1之起始密码子之前的5个碱基是TAAATG，它包含有一个相符晚期痘病病毒启动子。一个潜在的痘病病毒早期转录终止序列(TTTTTAT)位于Q2的翻译终止密码子之后2nt处。
可以将由EcoRⅠ-Q片段之ORF Q2编码的推断的tK氨基酸序列与下列痘病毒的tK基因相比较，它们是猪痘病病毒[W.M.Schnitzlein et al，Virol.，181;727-732(1991);J.A.Feller et al，Virol.183578-585(1991)];家禽痘病毒[Boyle et al.，文献同上;M.M.Binns et al，J.Gen.Virol.，691275-1283(1988)];牛痘病毒[J.P.Weir et al，J.Virol.，46530-537(1983);D.E.Hruby et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，803411-3415(1983)];天花和猴痘病毒[J.J.Esposito et al，Virol.，135561-567(1984)];山羊痘病毒[P.D.Gershon et al，J.Gen.Virol.，70525-533(1989)];shope纤维瘤病毒[Upton et al.，文献同上];人的细胞胸苷激酶[H.D.Bradshaw et al，Gene，52267-277(1987)];鼠的tK[P.F.Lin et al，Mol.Cell.Biol.，53149-3156(1985)];鸡的tK[T.J.Kwoh et al，Nucl.Acids.ReS.，12;3959-3971(1984)];ASF[R.Blasco et al，Virol.，178301-304(1990);A.M.Martin Hernandez et al，J.Virol.，65;1046-1052(1991)]。
实施例9在牛痘病毒中表达AmEPV tK基因按下述方法将Am EPV tK基因克隆到牛痘病毒株tK突变体中，对Am EPV tK基因进行功能检验。
将上述的Am EPVEcoRⅠ-Q片段以两种可能的方向插入到通过碱溶解法从细菌细胞中分离的穿梭质粒pHGN3.1[D.D.Bloom et al，J.Virol.，651530-1542(1991)]中。此EcoRⅠ-Q DNA片段含有Am EPV tK开放读码(ORF)。按常规方法进行克隆。所得到的质粒命名为pHGN3.1/EcoRⅠ-Q。
按照下面具体描述的方法用Lipofectin[GIBCO]将质粒转染到牛痘病毒感染的哺乳动物细胞中。这些细胞可以是牛痘病毒VSC8赖以繁殖的鼠tK、人143tK或CV-1细胞系。将这些细胞保持在含有Earle氏盐的Eagle氏基本培养基中[Massung et al，Virol.，180347-354(1991)，列为本文参考文献]。
VSC8牛痘病毒株[Dr.Bernard Moss]含有被插入到病毒tK基因中的牛痘P11启动子(P11-1acz基因暗盒)控制的β-半乳糖苷酶基因。虽然VSC8含有因β-半乳糖苷酶插入而失去活性的tK基因，但是保留了部分牛痘tK序列。因此VSC8为tK阴性，而且用x-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)染色会形成兰色噬斑(β-半乳糖苷酶阳性)。
使细胞生长至80%汇合(每个60mm的平皿中有4×106个细胞)。向含有10μg质粒DNA(pHGN3.1/AmEPV E1coRⅠ-Q)的50μl dH2O中加入Lipofectin溶液(50μl dH2O中含有20μg Lipofectin)，室温下保温15分钟。2小时病毒吸收(m.o.i.为2，37℃)期之后，用不含血清的OptiMEM将单层细胞洗三次。然后再向每个60mm平皿中加入3毫升无血清OptiMEM。逐滴缓慢加入Lipofectin/DNA混合液同时轻轻摇晃，并在37℃下，再保温12至18小时。然后加入胎牛血清(终浓度10%)并在感染48小时后收获感染的细胞。
将按上述方法放射性标记的AmEPVEcoRⅠ-Q片段与从感染的细胞单层中得到的病毒噬斑在硝化纤维素滤膜上的复印本进行杂交，以鉴别含有已插入到牛痘血凝素(HA)基因中之EcoRⅠ-Q片段的重组病毒。从复制滤膜上分离可能的重组体，并在试验前进行几次噬斑纯化。
AmEPV的tK与牛痘的tK表现出某种程度的同源性。为了证实AmEPV tK基因插入到牛痘的HA基因中而不是插入到保留在USC8中的残留tK序列中，通过与各种病毒的HindⅢ消化产物进行一系列Southern杂交反应来检查重组体。当来源于野生型病毒的DNA与牛痘病毒tK探针杂交时，发现杂交反应全部发生在AmEPV的约5kb HindⅢ-J片段内。
当用牛痘tK探针检查VSC8或含有重组体的AmEPV tK时，在放射标记底物存在的情况下，杂交则发生在与聚合酶一致的约8kb片段上。延伸反应将终止在PstⅠ-F片段的末端。
然后使放射性标记的产物与AmEPV DNA的EcoRⅠ消化产物杂交。如果基因的方向是使tKORF向基因组的末端阅读，它将与EcoR-E片段杂交;如果该基因向基因组的中心阅读，则将与EcoRⅠ-Ⅰ片段杂交。
结果表明不仅与EcoRⅠ-A和EcoRⅠ-E片段杂交，而且还与EcoRⅠ-A片段杂交。从这些结果可以推出tK基因的阅读方向是朝向基因组的左端。脱落延伸产物也与EcoRⅠ-A片段杂交表明存在有在痘病毒中常见的反向末端重复，而且在EcoRⅠ-E片段中有相同的序列。
在实验室中，AmEPV的最适生长温度是28℃。而脊椎动物痘病毒的最适生长温度是37℃。如本文所述，当将有完整tK基因的AmEPV DNA片段克隆到牛痘病毒的tK病毒株中时，重组病毒能够于37℃下在氨甲喋呤(Sigma)存在的情况下生长，此即tK+表型的指征。该实施例证明可以将昆虫痘病毒tK基因成功地转移到哺乳动物表达系统中，而且该AmEPV tK在一个较大的温度范围内具有功能活性。
应当明确的是，这里所描述的实例如实施方案只是为了举例说明。本领域中的熟练技术人员根据本说明书可以进行各种修改和变动。本发明包括那些与本文实施例所具体描述的相同的重组核苷酸序列、质粒、载体、和转化的宿主，即使对DNA序列进行不重要的修改，所说的相同结构中仍保留有其表达特征。例如，本领域中的专业技术人员为了获得所需要的表达水平，能够使用位于该结构基因上游的河豚精蛋白基因非编码区的片段。只要获得保留这种系统之特征的所需表达水平，该调节序列的这些片段便属于本发明的范围之内。而且，在不影响所公开的这些序列的功能的情况下，可以对核苷酸序列进行无关紧要的改变。这种修改也属于本发明的范围之内，并且属于本申请的精神和范围之内和待批权利要求的范围之内。
权利要求
1.一种昆虫痘病毒河豚蛋白多核苷酸序列，它不含有与之天然相关联的其他病毒核苷酸序列。
2.根据权利要求1的序列，它选自由一或多个河豚精蛋白基因编码序列、河豚精蛋白基因调节序列、河豚精蛋白基因启动子序列、以及其等位变异体或片段组成的一组中。
3.根据权利要求1的序列，其中所说的多核苷酸序列是DNA序列。
4.根据权利要求1的序列，其中所说的序列来自于桑红缘灯蛾(Amsacta Modrei)昆虫痘病毒。
5.根据权利要求4的序列，它选自下列一组序列图2中跨越核苷酸1至6773的序列，图2跨越核苷酸3080至6091的序列，及其等位变异体、类似物或片段。
6.根据权利要求2的序列，其特征在于它能够指导与所说序列或片段可操纵地连接之异源基因在某种选择之宿主细胞中的表达。
7.多核苷酸序列，其包括含有昆虫痘病毒河豚精蛋白基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段的第一多核苷酸序列以及与之联系的编码异源基因的第二多核苷酸序列。
8.昆虫痘病毒胸苷激酶基因多核苷酸序列，它不含有与之天然联系的其他病毒核苷酸序列。
9.根据权利要求1的序列，它选自由下列一种或多种成分组成的一组序列胸苷激酶基因编码序列，胸苷激酶基因调节序列，胸苷激酶基因启动子序列，及其等位变异体或片段。
10.根据权利要求8的序列，其中所说的多核苷酸序列是DNA序列。
11.根据权利要求8的序列，其中所说的序列来自桑红缘灯蛾昆虫痘病毒。
12.根据权利要求11的序列，它选自下面一组序列图3中跨越核苷酸1至1511的序列，图3中跨越核苷酸236至782的序列，图3中跨越核苷酸782至849的序列，及其等位变异体或片段。
13.根据权利要求9的序列，其特征在于它能够指导与所说序列或片段可操纵地连接的异源基因在某种选择之宿主细胞中的表达。
14.多核苷酸序列，它包括含有昆虫痘病毒之胸苷激酶基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段的第一多核苷酸序列以及与之相联系的编码异源基因的第二多核苷酸序列。
15.昆虫痘病病毒河豚精蛋白多肽，及其片段或类似物。
16.根据权利要求15的多肽，它与异源蛋白质或肽融合。
17.昆虫痘病病毒胸苷激酶多肽，及其片段或类似物。
18.根据权利要求17的多肽，它与异源蛋白质或肽融合。
19.重组多核苷酸分子，包含编码昆虫痘病病毒河豚精蛋白启动子序列及其等位变异体或片段的多核苷酸序列，其中所说的启动子序列可操纵地连接到选择的异源基因序列上，所说的启动子序列能够指导所说的基因在选择之宿细胞或病毒中的复制和表达。
20.重组多核苷酸分子，包含有编码昆虫痘病病毒胸苷激酶启动子序列及其等位变异体或片段的多核苷酸序列，其中所说的启动子序列可操纵地连接到选择的异源基因序列上，所说的启动子序列能够指导所说基因在选择的宿主细胞中的复制和表达。
21.重组分子，包含编码昆虫痘病毒河豚精蛋白的基因及其等位变异体或片段的多核苷酸序列，结构上它与编码选择的异源基因序列的多核苷酸序列相连接。
22.重组分子，包含编码昆虫痘病毒胸苷激酶基因及其等位变异体或片段的多核苷酸序列，结构上它与编码选择的异源基因序列的多核苷酸序列相连。
23.重组分子，包含已经插入了某种选择的异源基因序列的昆虫痘病毒河豚精蛋白基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段。
24.重组分子，包含已经插入了某种选择的异源基因序列的昆虫痘病毒胸苷激酶基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段。
25.重组病毒，包含多核苷酸序列，该序列含有被可操纵地连接到选择的异源基因序列上的昆虫痘病病毒河豚精蛋白基因多核苷酸序列及其变异体或片段。
26.根据权利要求25的病毒，它是选自下列一组病毒的痘病病毒脊椎动物痘病毒、真痘病毒(Orthopoxvirus)、猪痘病毒(Suipoxvirus)、牛痘病毒和昆虫痘病毒。
27.重组病毒，它包含多核苷酸序列，该序列含有被可操纵地连接到选择之异源基因序列上的昆虫痘病毒胸苷激酶基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段。
28.根据权利要求29的病毒，它是选自下列一组病毒的痘病病毒脊椎动物痘病毒、真痘病毒(Orthopoxvirus)、猪痘病毒(Suipoxvirus)、牛痘病毒和昆虫痘病毒。
29.被感染的细胞，该细胞是被含有可操纵地连接到某种选择的异源基因序列上的昆虫痘病毒河豚精蛋白基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段的重组病毒感染过的。
30.根据权利要求30的细胞，它选自昆虫细胞和哺乳动物细胞。
31.感染的细胞，该细胞是被含有可操纵地连接到某种选择的异源基因序列上的昆虫痘病毒胸苷激酶基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段的重组病毒感染的。
32.根据权利要求32的细胞，它选自昆虫细胞和哺乳动物细胞。
33.生产选择的多肽的方法，包括培养选择的宿主细胞，该细胞已被含有可操纵地连接到编码所说选择之多肽的异源基因序列上的昆虫痘病病毒胸苷激酶基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段的重组病毒感染，并从培养基中回收所说的多肽。
34.生产选择的多肽的方法，包括培养选择的宿主细胞，该细胞已被重组病毒感染，所说的重组病毒包含已可操纵地连接到编码所说选择之多肽的选择的异源基因序列上的昆虫痘病毒河豚精蛋白基因多核苷酸序列及其等位变异体或片段，并从培养基中回收所说的多肽。
35.筛选插入异源基因之重组宿主细胞的方法，包括用一多核苷酸分子转化所说的细胞，该多核苷酸分子包含已被插入到编码昆虫痘病病毒河豚精蛋白的多核苷酸序列中的选择的异源基因序列，其中以没有正常情况下因河豚精蛋白的表达而形成的闭合体来指示外源基因的整合。
36.筛选插入异源基因之重组宿主细胞的方法，包括用一多核苷酸分子感染所说的细胞，该多核苷酸分子包含已被插入到编码昆虫痘病病毒胸苷激酶的多核苷酸序列中的选择的异源基因序列，其中以不存在无活性胸苷激酶序列的整合而形成的胸苷激酶功能来指示异源基因的插入。
全文摘要
本发明涉及新的昆虫痘病病毒(EPV)多核酸序列，它不含有与之天然联系的其他病毒序列；本发明还提供了含有该序列的重组多核苷酸载体、含有该序列的重组病毒、被该重组病毒感染的宿主细胞，以及它们在昆虫和哺乳动物宿主细胞中表达异源蛋白的使用方法。
文档编号C12N15/65GK1065293SQ9210198
公开日1992年10月14日 申请日期1992年2月19日 优先权日1991年2月19日
发明者R·W·莫易尔, R·L·哈尔, M·E·格鲁多 申请人:佛罗里达大学