专利名称：植物杀虫疫苗及其制造工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗虫疫苗(植物的一种内生细菌优势种，经将Bt杀虫基因转入后得到的转基因工程菌株，保存于CGMCC，保藏号0174，保藏日期1992年6月2日)的制造和发酵工艺。
这是一个涉及植物抗虫性和杀虫微生物农药的基因工程之间的跨学科领域。植物抗虫性研究的历史已经具有几个世纪，而杀虫微生物农药的基因工程则是近几十年的事情。关于这方面的研究可以归结为以下四类一、传统的植物抗虫性通过杂交或系统选育培育抗虫品种。
选择抗虫品种在公元第6世纪中国已有了记载(马世俊，1979)。近代的应用报道为1792年Havaens关于小麦品种Underhill抗黑森麦瘿蚊(Mayetioladestructor)的实例。此后Limdley(1831)发现苹果品种WinterMajetin能抗苹果棉蚜。另一个成功的实例是利用抗葡萄根瘤蚜品种，挽救了十九世纪整个法国的葡萄生产和酿酒业(Maxwell，1980)，以后又陆陆续续有一些应用实例。但培育一个新的抗虫作物品种需要8-10年，等育出新品种后，应用2-3年应又因为昆虫的变异而导致抗性丧失。所以，这一传统的技术远不能满足生产的需要。
二、植物抗虫育种基因工程为了加速抗虫育种的发展，现在许多学者利用遗传工程的技术，将外源的抗虫基因导入植物体内，以期获得抗虫新品种。Vaeok等(1987)和Barton等(1987)报道将Bt的杀虫基因转移到了烟草组培细胞中，再生植株可以抗烟草天蛾(Manducasexta)等鳞翅目害虫。Delannay等(1989)将Bt的杀虫基因转入到了番茄植株之中，并得到表达，以后又陆续有人将Bt杀虫基因转入到马铃薯(Cheng等，1992)、棉花(谢道听等，1991;Monsanto公司，1992)、水稻(谢道听等，1991)、油菜(杨虹，1988)等之中。
另外，英国剑桥大学植物种研究所和农业遗传有限公司1987年从亚洲、非洲和美洲栽培的豇豆种子分离到一种称为CpTI的胰蛋白酶，使害虫不能利用蛋白质而死亡。现在已将CpTI基因整合到了烟草植株上，并表现抗虫性状。
这类研究目前均未进入应用，主要原因由于大多数栽培植物的组织培养技术还未过关，因而转移外源基因主要靠花粉管导人，而不是将抗虫基因整合到同源染色体的相等位点之上，因此很难纯合，在细胞分裂时，很容易分化而丢失。再则，由原核生物的基因进入高等植物体内，由于生物排异作用，或者造成基因不能表达或表达效率极低甚至整个基因被排除掉。所以，靠遗传工程手段，将外源基因直接转入植物，以得到抗虫品种的方法，其应用尚属遥远。
三、将Bt杀虫基因转入植物根际微生物中Miller等(1983)首次报道了将Bt杀虫基因转入玉米的根际细菌一萤光假单孢杆菌(Psudomonasflworescens)之中，接着Beardsley等(1984)、Graham(1988)和Stock等(1990)都陆续报道了他们将Bt杀虫基因转入P.fluorescens之中的结果。用转化后的细菌粘附在玉米种皮上播种，就可杀死土壤中的地老虎幼虫。这些研究尚无成功的应用，主要是由于所用Pseudomonas抗逆性不强，难以在土壤中形成优势种;再者，这些细菌只限于根际，属土壤微生物的范畴，因此其效果难以稳定。应用范围也极为有限。
四、将Bt杀虫基因转入植物内生细菌Reeser等(1988)报道了他们将Bt杀虫基因转入玉米的种内一细菌(Clavibacterxyli)之中;Turnen等(1991)也报道了他们将Bt杀虫基因转入甘蔗木质部内生细菌(C.xyli)之中的结果。上述研究一方面仅为方法探讨，另一方面他们未选择优势植物内生细菌菌种作材料，所以没有杀虫试验和应用的报导。
本发明的发明人综合前人的有关研究，提出了植物抗虫疫苗的概念。即将有关杀虫基因转入植物的优势内生菌种之中，得到这类优势内生细菌的工程菌株，经这类工程内生菌处理植物的种子或植株后，就可以均匀而大量地分布到植物体内各部位，当害虫取食时，即将其杀死。植物经此类工程菌处理后，终身含有此菌，因此可以终身对某类害虫免疫。所以，本发明人将这类植物工程内生细菌称为植物抗虫疫苗。
在这一概念的指导下，分离并得到了棉花、蔬菜等双子叶植物的优势内生细菌(编号为BC9002)及小麦、水稻和玉米等单叶植物优势内生细菌(编号为BC9001)。均为芽孢杆菌属(Bacillus)。并通过细菌的转导和用质粒pUC19做载体，进行原生质体的转化等方法，将Bt的杀虫基因转移到了双叶植物的优势内生细菌BC9002中(该转基因工程菌株保存于CGMCC，保藏号0174，保藏日期1992年6月2日)。经质粒的琼脂糖凝胶电泳检测、抗性筛选及生物测定试验，都证明了这一结果。将转化子BC9002/Bt拌入人工饮料喂饲棉铃虫(Heliothisarmigera)、玉米螟及菜青虫，能够引起70%以上的害虫死亡，其余残虫生长亦受到抑制。又将转化子处理刚发芽的棉苗后，进行杀虫试验，在导入高棉酚的棉花品种(川98)后，可造成70%以上的棉铃虫死亡;在无毒棉(方数无)中，可造成60%以上的棉铃虫死亡;而对棉大卷叶螟Syleptaderogata的防效均在80%以上。
本发明包括以下步骤1、内生细菌的分离分别取作物的根、茎、叶、种子、果实等器官的不同组织10克，经5%次氯酸钠表面灭菌30-50分钟，经两次无菌水冲洗后，在超净工作台上磨碎，加入50ml无菌水稀释，用1ml的移液管吸取1ml稀释液，放入装有2mlLB培养基的试管内，在200-300rpm的摇床上振荡过液。菌液在LB固体培养基平板上划线，置25-35℃下培养24-48小时，选取优势菌种，纯化。经15分钟紫外照射诱变后，筛选出抗氨苄青霉素100ug/ml的运变株，回接植株后，再按同样的方法再分离(用抗性LB培养基)。得到的抗性菌株，即为作物的内生细菌优势种。
2、Bt杀虫基因的转化将携带Bt杀虫基因的大肠杆菌pUC19/TH12，在LB培养基中活化，然后按1%的量接种于装有200ml/500mlLB液体培养基的三角瓶中，在200-300rpm的摇床上振荡培养基20-28小时，经700rpm离心，将沉淀悬浮于400mlTEbuffer中，加入3%SDS200ml和240mg溶菌酶液，于37℃水浴中裂解30-60分钟，清亮后，逐滴加入3-5mlNaOH，使染色体DNA变性，加入3mlNaCt，于4℃下放置4小时，离心，收集上清液，加入50%PEG，以沉析出DNA。于6000-9000rpm，4℃离心8-15分钟，收集沉淀溶于适量的TE液中，即为欲提取的pUC19质粒(含Bt杀虫基因)。
再将植物内生细菌优势种活化，于LB液体培养基中，200-300rpm振荡培养过液，于500-800rpm离心5-15分钟，除去上清液，按1/10体积悬浮于SMMP溶液中。加入溶菌酶至终浓度为2mg/ml，在32-38℃下摇床培养2小时，以获得原生质体。300-5000rpm离心，除去上清液，加入SMMP至终体积为1/10-1/15。将前面提取的pUC19质粒1pg到5ug溶于0.5ml的TE液中，与等体积的2XSMM混合，加入0.5ml原生质体和1.5ml的40%PEG，混匀。2分钟后，离心、分离出原生质体，悬浮于1mlSMMP中，在22-32℃下摇动1-2小时。然后于含抗生素的DM3培养基上在22-32℃下培养24-48小时，培养出含有Bt基因的植物内生细菌转化子(菌种)。
3、生物测定上述筛选出的转化子，经质粒电泳验证和Western blot测定后，证明该内生菌转化子携带有表达功能的Bt基因片断，将该菌在LB培养基上三角瓶培养过液，过滤后，除去上清液，加无菌水配成104cfu/ml左右的悬浮液，处理种子，然后种植，待出苗后，定期采取叶片、果实等喂饲棉铃虫，并观察死亡率。如果死亡率达60%以上，即可进行生产。
4、菌种培养、换代、保藏划线接种于LB(10%蛋白胨、0.5%酵母膏、10%NacL/1.5%琼脂)斜面上培养好后，于4℃(短期)或加30%甘油封后于-20℃(长期)冰箱或冷库保存，定期转管传化(划线法)。
5、发酵工艺液体发酵(见附图
)(1)先将BC9002/Bt转化子斜面活化，接入三角瓶进行液体扩大即可用于种子罐接种。
(2)至OD(550)值达到1.35，种子罐灭菌后，降温至25-30℃时，将摇瓶种子液按5%接种量植入种子罐中，然后通入无菌空气1∶1.0vvm过液培养二级种子。
(3)发酵培养基灭菌后，当降温至25-30℃时，按2%的接种量罐发酵液接入，保持通气量1∶1.0vvm过液培养，然后放罐制成粉剂或直接液体包装即可成为产品。
(4)上述灭菌采取高压蒸气灭菌法，即在121℃、压力1.0公斤/cm2的条件下，灭菌30分钟。种子罐、发酵罐搅拌速度200-300转/分。种子罐接种后，在28-33℃条件下，培养24小时。发酵罐接种后，在28-33℃条件下，培养20-40小时。通气量为1∶1.0(vvm).
(5)种子罐配方为玉米粉0.5%、黄豆粉1.0%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.1%、葡萄糖1.5%、PH值灭菌前7.5，灭菌后7.0-7.2。
(6)发酵罐配方玉米粉3%、黄豆粉1.0%、花生饼粉1.5%豆油0.1-0.3%/葡萄糖1.5%酵母粉0.1%/(NH4)2So40.5%、K2HPO40.05%、KH2PO40.05%、MgSO47H2O0.02%、PH值消毒前7.5-7.8、消毒后7.0-7.3。
(7)产品质量标准含菌量在每g20亿个以上。
PH值7.4-7.6。
6、使用方法(1)播种将种子用水浸湿，每亩用50-100g粉剂，均匀撒入种子中，翻动数次，使菌剂均匀粘附在种子表面，稍晾干即可播种。
(2)浸根每亩用量30-50g粉剂，用水稀释，然后均匀地将菌根均匀粘附于根苗睛，稍晾即可插、栽植。
(3)喷雾每亩取50-100g粉剂，用水稀释，然后均匀地将菌液喷到植株上。
7、植物抗虫疫苗的优点(1)杀虫效果好，而且持久。一般使用植物抗虫疫苗后，可随植物生长而大量繁殖，因此，植物在整个生长期均能抗虫，其效果在70%以上，这正符合综合防治的原则，剩下的残虫生长受抑制，也便于其它天敌捕食和寄生。
(2)经济效益高。一般大田作物整个生长期需用化学农药5-10次，而用植物抗虫疫苗后，植物一生中可以不必再用或少用其他农药，这样可以节省80%以上的农药成本和用工费。
(3)生态效益好。改用植物抗虫疫苗后，既对人畜安全，没有污染和残毒问题;又由于植物抗虫疫苗的专化性，对天敌安全，便于保护天敌，促进农田生态系统的良性循环，符合国际环境与发展会议的精神。
(4)使用方便。植物杀虫疫苗的使用方法有多种，可以用于拌种、浸根、叶面喷洒，并可以和其他农药和微肥混合使用。可以在播种期或苗期使用一次即可。
(5)本发明的培育方法简便可行，易于掌握，利于推广。
下面为本发明的最佳实施例1、内生细菌的分离分别取作物的根、茎、叶、种子、果实等器官的不同组织10克，经5%次氯酸钠表面灭菌42分钟，经两次无菌水冲洗后，在超净工作台上磨碎，加入50ml无菌水稀释，用1ml的移液管吸取1ml稀释液，放入装有2mlLB培养基的试管内，在250rpm的摇床上振荡过液。菌液在LB固体培养基平板上划线，置31℃下培养36小时，选取优势菌种，纯化。经15分钟紫外照射诱变后，筛选出抗氨苄青霉素100ug/ml的运变株，回接植株后，再按同样的方法再分离(用抗性LB培养基)。得到的抗性菌株，即为作物的内生细菌优势种。
2、Bt杀虫基因的转化将携带Bt杀虫基因的大肠杆菌pUC19/TH12，在LB培养基中活化，然后按1%的量接种于装有200ml/500mlLB液体培养基的三角瓶中，在250rpm的摇床上振荡培养基24小时，经700rpm离心，将沉淀悬浮于400mlTEbuffer中，加入3%SDS200ml和240mg溶菌酶液，于37℃水浴中裂解45分钟，清亮后，逐滴加入3mlNaOH，使染色体DNA变性，加入3mlNaCt，于4℃下放置4小时，离心，收集上清液加入50%PEG，以沉析出DNA。于7000rpm，4℃离心10分钟，收集沉淀溶于适量的TE液中，即为欲提取的pUC19质粒(含Bt杀虫基因)。
再将植物内生细菌优势种活化，于LB液体培养基中，250rpm振荡培养过液，于700rpm离心10分钟，除去上清液，按1/10体积悬浮于SMMP溶液中。加入溶菌酶至终浓度为2mg/ml，在37℃下摇床培养2小时，以获得原生质体。4000rpm离心，除去上清液，加入SMMP至终体积为1/12.将前面提取的pUC19质粒3ug溶于0.5ml的TE液中，与等体积的2XSMM混合，加入0.5ml原生质体和1.5ml的40%PEG，混匀。2分钟后，离心、分离出原生质体，悬浮于1mlSMMP中，在30℃下摇动1.5小时。然后于含抗生素的DM3培养基上在30℃下培养36小时，培养出含有Bt基因的植物内生细菌转化子(菌种)。
3、生物测定上述筛选出的转化子，经质粒电泳验证和Westernblot测定后，证明该内生菌转化子携带有表达功能的Bt基因片断，将该菌在LB培养基上三角瓶培养过液，过滤后，除去上清液，加无菌水配成104cfu/ml左右的悬浮液，处理种子，然后种植，待出苗后，定期采取叶片、果实等喂饲棉铃虫，并观察死亡率。如果死亡率达60%以上，即可进行生产。
4、菌种培养、换代、保藏划线接种于LB(10%蛋白胨、0.5%酵母膏、10%NacL/1.5%琼脂)斜面上培养好后，于4℃(短期)或加30%甘油封后于-20℃(长期)冰箱或冷库保存，定期转管传化(划线法)。
5、液体发酵(1)将保存的植物抗虫疫苗(含Bt杀虫基因的植物内生细菌的转化子)活化(划线接种于LB固体培养基斜面)，然后在28.5℃条件下，用三角瓶扩大培养24小时，经培养得到的菌种制成菌种孢子悬浮液，用于种子罐接种之用。
(2)至OD(550nm)值达到1.35，种子罐灭菌(采取高压灭菌法，即在121℃、压力1.0Kg/cm2的条件下，灭菌30分钟)后，降温到28.5℃将上述菌种按5%的接种量接入种子罐中，种子罐的培养温度为了8.5℃，罐压1.0KgF/cm2，通气量为V/V1∶1.0vvm，搅拌速度250转/分，培养时间24小时，种子罐配方为玉米粉0.5%、黄豆粉1.0%、胰蛋白胨1.0%、酵母粉0.1%、葡萄糖1.5%、PH值灭菌前7.5，灭菌后7.0。
种子检查分别于接种后的20、25、30小时取样检查，测定PH值。
移罐前检查在无杂菌污染，菌体生长健壮，含菌量为3亿/ml(以上时方可移罐)。
(3)发酵培养按2%的接种量接入发酵罐中。搅拌速度250转/分，通气量为1∶1(VVm)，接种后到12小时之间，温度为28.5℃，12小时以后温度提高到32℃，发酵时间38小时。
发酵罐培养基配方为玉米粉3%、黄豆粉1.0%、花生饼粉1.5%、豆油0.2%、葡萄糖1.5%、酵母粉0.1%、(NH4)2SO40.5%、K2HPO40.05%、MgSO47H2O0.02%，PH值消毒前7.6、消毒后7.2。
接种后10小时开始，每2小时取样镜检一次，并测定PH值，检查是否有杂菌污染及菌体生长情况，该菌在接种后10-20小时繁殖迅速，菌数急剧上升，24小时开始形成芽孢及晶体，35-40小时为芽孢成熟阶段。
6、制造可湿性粉剂在发酵罐生产结束后，经加入吸附剂(轻质碳酸钙)，过滤(或离心)，干燥，加湿润剂(中性洗衣粉或皂角等0.3%)，机械粉碎，检验，包装。
根据液体菌剂的含菌量高低确定吸附剂的数量。菌的吸附回收率可达95%。
要求烘干温度不超过85℃;
烘干时间不超过5小时;
粉剂温度不超过10%;
粉剂的含菌量不低于100亿/g;
粉剂的细度为200目/英寸。
权利要求
1.一种植物抗虫疫苗的培育方法，其特征在于先用作物的根、茎、叶、种子、果实等器官的不同组织分离、选取植物的内生细菌优势种，经活化，培养后制成原生质体，再将携带Bt杀虫基因的大肠杆菌PUC19/TH12活化，培养后制成PUC19/TH12质粒，将原生质体与PUC19质粒混合均匀后离心，分离出原生质体，培养出含有Bt基因的植物内生细菌转化子(CGMCC，0174)，然后用液体发酵法制成植物抗虫疫苗产品。
2.按照权利要求1所述的一种方法，其特征在于液体发酵采用以下步骤a、将BC9002/Bt转化子斜面活化，接入三角瓶进行液体扩大，用于种子罐接种;b、至OD(550nm)值达到1.35，种子罐灭菌后，降温至25-30℃时，将摇瓶种子液按5%接种量植入种子罐中，然后通入无菌空气1∶1vvm保温培养二级种子;c、培养基灭菌后，当降温至25-30℃时，按时2%的接种量将种子罐发酵液接入，保持通气量1∶1vvm过液培养，然后放罐制成粉剂或直接进行液体包装。
3.按照权利要求1或2所述的一种方法，其特征在于在121℃、压力1.0Kg/cm2的条件下，以高压蒸气灭菌法灭菌30分钟，种子罐、发酵罐搅拌速度200-300转/分，种子罐接种后，在28-33℃条件下，培养24小时，发酵罐接种后，在28-33℃条件下，培养20-40小时。
4.按照权利要求1或2所述的一种方法，其特征在于种子缸配方为玉米粉0.5%、黄豆粉1.0%、胰蛋白胨0.1%、酵母粉0.1%、葡萄糖1.5%、PH值灭菌前7.5，灭菌后7.0-7.2。
5.按照权利要求1或2所述的一种方法，其特征在于发酵罐配方为玉米粉3%、黄豆粉1.0%、花生饼粉1.5%、豆油0.1-0.3%、葡萄糖1.5%、酵母粉0.1%、(NH4)2SO40.5%、K2HPO40.05%、MgSO47H2O0.02%，PH值消毒前7.5-7.8，消毒后7.0-7.3。
全文摘要
本发明先取作物的根、茎、叶等器官，经培养制成作物的内生细菌优势种原生质体，另把携带Bt杀虫基因的大肠杆菌PUC19/TH12制成PUC19质粒，然后将原生质体和PUC19质粒混合在一起，培养出含有Bt基因的植物内生细菌转化子，再进行液体发酵，从而制成植物抗虫疫苗。试验表明，应用该疫苗可造成60—70％的棉铃虫、棉大卷叶螟、玉米螟及菜青虫等害虫死亡，其余残虫的生长亦受到抑制。应用本发明不仅经济效益和社会效益好，而且制造简单，使用方便，易于推广。
文档编号C12N5/04GK1072455SQ9211041
公开日1993年5月26日 申请日期1992年9月10日 优先权日1992年9月10日
发明者张青文 申请人:北京农业大学