专利名称：人工合成的转运核糖核酸的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及肽类的体外合成，尤其涉及在大肠杆菌(Es-cherichia coli)的核糖体上利用人工合成的tRNA来合成新生的肽类。
在很长的一段时间里，科学家们一直在试图发展一种方法学，以便能在活细胞体外有效地修饰和产生蛋白质。这种努力的一个技术组成部分就是通过改变酶促氨酰化反应的反密码子或识别位点而进行的tRNA的修饰。通过产生一组修饰过的tRNA均能阅读的一个单个的新密码子，修饰的tRNA使在蛋白质的靶位点上替换不同的氨基酸变得相对简单了。
通过使用一组修饰的tRNA，每一个对应一种不同的氨基酸，可在蛋白质的目的靶位点上掺入特异的氨基酸。因为任一体系在大多数情况下只合成一种蛋白质，所以氨基酸替换对于多肽活性的影响可以直接测定，不必为每一种氨基酸的替换制备克隆，不会遇到与表达相关的常出现的问题，也避免了随后对在完整细胞中产生的蛋白质的测试。
最终，随着根据氨基酸顺序预测蛋白质三级结构的能力的改进，通过使用仅包含20个密码子的mRNA，可以产生全人工设计的蛋白质。其中每一个密码子与自然存在的20种蛋白质一一对应。(在通用的遗传密码中均有一个密码子与这20种氨基酸相对应。)通过使用含有反密码子的修饰后的tRNA，氨基酸也可以掺入蛋白质上一个或多个特异位点，这些反密码子对应于未使用的41种密码子中的某些密码子。更进一步，通过对修饰过的tRNA的进行化学而不是酶促氨酰化反应，有可能将在自然界中不存在相应tRNA的氨基酸掺入到这些人工合成的蛋白质中去。这使得将来有可能可以设计、测试和生产那些使用在活的有机体内不存在的催化机理和底物的人工酶。
tRNA与一种特异的氨基酸的酰化反应可以通过化学反应或酶促反应而进行，后者使用氨酰基-tRNA合成酶(以下简称AS)。tR-NA的化学氨酰化反应的过程已经知晓。(见S.A.Robertson等(1989)NuclAcid Res.179649-9660和M.Hagen等(1988)J.org.Chem.535040-5045)。
在活的体系，AS必须高特异性地识别将要氨酰化的tRNA和氨基酸。AS对一种tRNA的识别取决于tRNA的特异性的结构特性。在不同的tRNA中，并不存在一种单一的结构特征，使它们相应的AS能够特异识别它们。(见C.de Duve(1988)Nature 333117-118)。在不同的生物体中，一种特定的tRNA的许多结构特征，并不是非常地保守。以来源于大肠杆菌、酵母和免子网状细胞的AS，在氨酰化反应进行的条件下(盐浓度、精胺或亚精胺浓度、温度)，已经发现人工合成的tRNA的氨酰化的特异性有很大的变化。已经知道tRNA被相应的AS识别的某些原则。一些AS似乎对所有的反密码子都有严格的要求，而另一些仅识别部分反密码子。Met-tRNA AS严格依赖于反密码子CAU，(G.Ghosh et al(1990)Biochem 292220-2225)其他tRNA的AS也许对反密码子的第二个或第三个核苷酸有要求。
至于其他氨基酸，看来是识别tRNA的与反密码子无关的特征，并且对应于存在tRNA结构其它地方的正的识别位点，在某些情况下对应于负的识别位点。
Schimmel和Hou的结果表明在tRNAAla的氨基酸基上G3-C70碱基对是Ala-tRNA AS的主要识别位点(Y.M.Hou et al(1988)Nature 333140-145)。
现在在体外设计和生产人工合成的被酶促氨酰化的tRNA已成为可能，这种tRNA能够用于无细胞的翻译体系。这些合成的tR-NA在阐明核糖体的功能，尤其关于新生的肽在核糖体内的移动及其折叠成有活性的构象方面可能有重要的价值。当新生的肽在核糖体形成时，关于它的准确位置和构象，至今仍不清楚。
因此本发明的一个目的在于提供人工合成的tRNA。
本发明的另一目的在于提供生产合成tRNA的方法。
本发明进一步的目的在于使用人工合成的tRNA在体外提供增强的多肽。
根据本发明，tRNACys，tRNASer，tRNAAlae和tRNAAlai由
图1A-D所示的DNA序列所编码。
本发明的据信是具有新颖性的特征，在附录的权利要求中将详细地陈述。通过参考以下描述及有关附图，将有助于更好地理解本发明本身及其目的和优点。
附图包括图1显示pCYS，pSER，pALA和pFMET的序列。tRNACys(AAA)和tRNASer(GGA)的序列来自于M.Sprinzl等(1984)Nu-cl.Acid Res.12r1-r131。限制性酶切位点的位置及17个碱基的T7RNA聚合酶启动子(在图上)被指明。在每个序列上方的字母，代表了存在于野生型的序列中，而现在被替换的核苷酸。对每一个tRNA，反密码子AAA下自有划线。
1AtRNACys(AAA)基因(pCYS或序列识别编号No.1)由四个寡核苷酸构建而成。这些寡核苷酸退火后连接在经Hind Ⅲ/Bam HI消化的PUC18质粒上。四种寡核苷酸以在pCYS序列上方和下方的实线标出。在pCYS序列的上方的星号显示表示这里有一个碱基插入。
1BtRNASer(AAA)基团(pSER或序列识别编号No.2)是这样构建的通过使用两个特异性引物的PCR方法，从大肠杆菌的基因组中复制得到tRNASer(GGA)基因。在pSER序列的上方和下方用实线标明这些引物。在pSER中，由T到A的替换是为了增加氨酰化反应。
1CtRNAAlae(AAA)基因(pALA或序列识别编别No.3)是通过PCR方法，从大肠杆菌的基因组中复制得到tRNAALA(GGC)基因而构建的。
1DtRNAAlai(AAA)基因(pFMET或序列识别编号No.4)是通过PCR方法，从大肠杆菌的基因组中复制得到tRNAMetf(CAT)基因而构建的，在pFMET序列上方的星号表示这里有一个碱基插入。
图2是在poly(U)引导的延伸过程中，在新生肽的氨基末端的探针的荧光各向异性。多肽合成是由CPM-Phe-tRNA(A)或CPM-Ser-tRNA(B)开始的，在此期间测定各向异性。在A和B中，多聚苯丙氨酸(poly(Phe))合成用空心三角和点状线(……)表示;多聚半胱氨酸(poly(Cys))合成用空心圆圈和破折线(----)表示;多聚丝氨酸用空心圆圈和实线(-)表示。在60分钟内测量各向异性(采用20℃，荧光受激发波长为385nm，荧光发射波长为475nm)。
图3是poly(U)引导的采用tRNAAlae(AAA)的多聚丙氨酸(poly(Ala))的合成。Ac Phe-tRNA(0.5μm)预先结合于poly(U)编序(poly(U)-programmed)的核糖体(0.5μM)，以便在0.1ml终体积中以0.3A260的tRNAAlai(AAA)(空心标记)或0.1A260的tRNAAlae(AAA)(实心标记)作为延伸的tRNA来源而进行的多聚丙氨酸的合成更方便。
在37℃保温时用0.5M NaOH使所有氨酰化的tRNA去酰基，并用5ml10%的冰冷的三氯乙酸(TCA)沉淀多聚丙氨酸，再测定沉淀物的放射性，以确定[14C]丙氨酸的掺入。同时测定在4μM红霉素存在情况下多聚丙氨酸的合成，以作对照(……)。
图4是游离的或者与核糖体结合的延伸物成起始物CPM-Ala-tRNAAla(AAA)的发射光谱。
A.对游离的tRNA(-)和与核糖体结合的tRNA(……)的测量在总体积为600μl中进行。核糖体浓度为0.5μM。加入核糖体之后，反应混合物在37℃保温15分钟。荧光测量采用激发波长385nm，在20℃进行。在测量结束之后，加入红霉素至终浓度为4μM。并监测红霉素对每种与核糖体结合的的tRNA的光谱的结合效应(……)。
B.在另外的实验中，在核糖体结合后，每种tRNA的发射光谱都经过测量。随后加入稀疏霉素(终浓度＝5μM)测定发射光谱，然后加入嘌呤霉素至浓度为0.5mM，再次测量发射光谱(-…-…)。在嘌呤霉素存在条件下，测量发射光谱结束之后，测量每一样品的荧光各向异性，以确信没有发生各向异性的下降，这种下降表明了嘌呤霉素的反应性。
当新生的肽从核糖体延伸出来时，其构象很可能在决定最后的肽产物如何折叠方面，是很关键的。令人信服的证据已经有所报导一部分，也可能所有的，从天然的mRNA产生的新生的肽，在核糖体的大亚基外表面相对于肽基转移酶中心的远端，退出核糖体。(C.Bernaeu et al(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 793111-3115)。新生的肽的包含30至40个氨基酸的部分，被核糖体保护着不被降解。(L.I.Makin et al.(1967)J.Mol.Biol.26329-346)这也许反映了横跨肽基转移酶中心和出口区域所需的肽的长度。
天然的新生肽离开肽基转移中心时它们的构象如何，还不清楚。W.D.Picking et al.((1990)J.Biol.Chem.2661534-1542)已经证实，分别由poly(U)和poly(A)形成的正在延伸的新生的苯丙氨酸(Phe)和赖氨酸(lys)，两者行为相当不同。为了理解这些研究的结果，能够促进poly(U)指导的多肽合成的人工合成的tR-NA，已被制造出来。
材料和化学药品下面列出此申请中用到的缩写及其定义EDTA，乙二胺四乙酸二钠盐;HEPES，N-(2-羟基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸;TRIS，三羟基甲胺;Poly(U)，聚尿苷酸;Poly(A)，聚腺苷酸;AcPhe-tR-NA，在其α-氨基被酰化的Phe-tRNA;CPM-Phe-tRNA，Phe-tRNA，在其α-氨基被巯基乙酰化然后与CPM反应;CPM-Ser-tRNA，Ser-tRNASer(AAA)在其α-氨基被巯基乙酰化然后与CPM反应;CPM，3-(4-顺丁烯亚氨苯基)-7-二乙氨基-4-甲基香豆素;tRNACys(AAA)，含有一个AAA反密码子的合成tRNACys(AAA);tRNASer(AAA)，含有一个AAA反密码子的合成tRNASer;tRNAAlae(AAA)，含有一个AAA反密码子的合成延伸物tRNA;tRNAAlai(AAA)，含有一个AAA反密码子的合成起始物tRNA;LB，Lennox LB培养基;X-Gal，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷;PCR，聚合酶链式反应。
PUC18质粒构自Bethesda Research Laboratories(Gaithers-burg，MD)。寡聚脱氧核糖核苷酸在Applied Biosystems公司(Foster City，CA)的381A合成仪上合成，在Applied Biosystems的OPC柱上，根据制造者的说明书进行纯化。DNA聚合酶的Klenow片段、T4DNA连接酶，RNasin(核糖核酸酶阻抑蛋白)和限制在内切酶得自Promega Biotec(Madison，WI)、限制性内切酶Bst NI和Bst BI购自New England Biolabs(Beverly，MA)，PCR试剂来自Perkin-Elmer Cetus(Norwalk，CT)双链测序使用自United States Biochemicals(Cleveland，OH)的测序酶Ⅱ试剂盒。[α-35S]dATP，[35S]半胱氨酸(Cys)、[14C]苯丙氨酸(Phe)和[14C]丝氨酸(Ser)购自New England Nuclear(Boston，MA)，脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸及鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)得自Pharmacia(Piscataway，NJ).CPM来自Molecular Probes(Junc-tion City，OR)。酵母tRNAPhe来自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO).纯化的大肠杆菌起始因子2(IF-2)赠自C.Gualerzi博士(Max-Planck-Insitiut fur Molekulare Genetik，Berlin).NuSieve GTG琼脂糖来自FMC(Rockland，ME).A202凝胶光谱仪购自Fischer Scientific(Houston，TX)。T7RNA聚合酶，根据P.Davanloo et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94971-78所述的程序，从含有质粒pAR1219的E.coli BL21中分离得到。大肠杆菌E.coli K12，菌株A19，最初由Drs.K.Nierhaus和H.G.Wittmanu，(柏林)提供给我们。这些生物体的生长和保存以及核糖体亚基的分离，在O.Odom et al.(1980)Biochemistry195947-5954中已有描述。
pCYS的构建选择人工合成的tRNA与Cys进行氨酰化，是因为Cys的硫氢基(HS-)基因，能够容易地、特异地与荧光团的顺丁烯二酰亚胺或烷基卤(RX)衍生物起反应。以前的研究已经表明Cys-tRNA合成酶识别的，是tRNA接受茎的3∶70碱基对而不是反密码子的碱基组成。(Y.M.Hou et al.(1988)Nature 33140-145.)。这样，可以构造一个在无细胞的翻译体系中识别poly(U)的Cys-tR-NA。
tRNACys基因(pCYS或序列识别编号No.1)含有一个HindⅢ位点、T7RNA聚合酶启动子、突变的E.coli基因、Bst NI位点和Bam HI位点。它的合成显示于图1A。为了尽可能地保持与野生型tRNACys的相似性，在碱基顺序上只改变了三个位点。首先，反密码子由ACA变成AAA。其次，为了便于转化子筛选及以后的遗传操作，构造了两个内部的限制性酶切位点。在D茎上将碱基A21和T24分别变成C21和C24，产生一个PstⅠ位点。为了保持茎上的碱基配对，A10变成了G10。通过在额外臂上U42和C43中增加一个A，产生了一个SpeⅠ位点。
在分别的反应中，5′-3′和3′-5′的Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸及5′-3′和3′-5′的PstⅠ/BamHI寡核苷酸，经过加热到65℃，然后缓慢冷却至25℃，从而退火连接。两个生成的双链寡核苷酸，和Hind Ⅲ/BamHI消化的pUC18产生的三个片段，加入T4DNA连接酶，在16°保温过夜，从而连接并插入到Hind Ⅲ/BamHI消化的pUC18质粒中。E.coli XL1B用连接混合物转化，再涂布在含有α-氨基苄青霉素(Amp)和X-gal的LB平板上。带有包含插入片段的质粒的转化子，因为完整的tRNACys(AAA)基因的存在，所以采用Spe Ⅰ对质粒DNA的少量溶菌产物进行限制性酶切分析方法检出。随后，插入分段的两条链经测序测出。
pSER的构建和Cys-tRNA合成酶的情形相同，Ser-tRNA合成酶识别tRNA的其他部分而不是反密码子。(J.Normanly and J.Abelson(1989)Am.Rev.Biochem.581029-1049.这样，可以制备用于poly(U)引导的翻译体系的合成Ser-tRNA。完整的tRNASer(AAA)基因序列(pSER或序列识别编号No.2)不是用化学方法合成的，而是合成两个寡核苷酸作为PCR反应的引物，从E.coli染色体复制得到基因(图1B)，5′引物在含有5′端的4个额外核苷酸、5′-31HindⅢ序列，T7RNA聚合酶启动子和包含反密码子AAA在内的tRNA的43个碱基。3′引物含有4个额外核苷酸、3′-5′Bam HI和Bst NI序列及tRNA的12个碱基。与野生型的tRNACys相反，在tRNASer的T环中存在一个Bst BI限制性位点，因而对于并不必需的检出目的，多了一个新的限制法位点。
0.1ml PCR反应包含两种引物各100p mol，E.coli染色体DNA 20ng，和10单位的Taq I DNA聚合酶。上面覆以矿物油。反应按以下程序94℃5分钟，1个循环;94℃1分钟→55℃2分钟→72℃3分钟，29个循环;94℃1分钟→55℃2分钟→72℃10分钟，1个循环。循环结束后，反应混合物经氯仿抽提，产物经电泳分离4%Nusieve GTG琼脂糖凝胶，用40mM Tris-醋酸(pH7.8)，2mM EDTA)主要产物预期为124bp的片段。经酚抽提除去琼脂糖之后，124bp的片段的末端用DNA聚合酶的Klenow片段进行补平(blunt)，并且用Hind Ⅲ和Bam HI消化。然后，此片段与Hind Ⅲ/Bam HI消化的pUC18一起在T4DNA连接酶存在下，16℃保温过夜，从而连接起来。带有包含插入的质粒的转化子E coli XL1B，因为完整的tRNASer(AAA)基因的存在，所以采用Bst BI对质粒DNA的少量溶解物进行限制性酶切分析而检出。插入片段的两条链经测序测出。
用Bst NI对pCYS和pSER进行消化，结果产生一个线性的转录模板，此模板含有一个单一的5′伸出的胸腺嘧啶(T)，互补于tRNA3′未端的腺嘌呤(A)。这样，经Bst NI消化的pCYS和pSER的完全转录预计将分别产生75个和88个核苷酸的RNA。这些RNA以tRNA接受臂序列3′ACCA而结束。用终浓度为0.1mg/ml的T7RNA聚合酶，每μgDNA模板产生7-8μg tRNA。虽然，Milligan和Uhlenbeck((1989)Meth，Enzymol.18051-62)报导过，当转录小的RNA时，会产生短的流产转录(体)，但是在凝胶过滤层析法(get filtration chromatography)处理之后，20%变性胶的电泳表明只有一种主要的RNA产物继续存在。(数据没有列出)。
pALA和pFMET的构建另外两种新的tRNA也在形成。这些tRNAs通过酶催化和丙氨酸(Ala)起氨酰化反应，并且拥有可以识别poly(U)模板的反密码子AAA。第一个tRNA，即tRNAAlae(AAA)，被构建得与E.coli的延伸物tRNAAla相类似。(M.Sprinzl et al.(1985)Nucl.Acid.Res.13rl-r104)tRNAAlae基因(pALA或序列识别编号No.3)，其构建采用PCR方法，从E.coli基因组中复制得到tRNAAla(GGC)基因，再将反密码子GGC变成AAA。然后，使用用于pSER的补平、消化、连接、转化和筛选等过程，形成pALA。
第二个tRNA，即tRNAAlai(AAA)，是通过复制E.coli的起始物tRNAfMet而构建的，并且与之相类似。(M，Sprinzl et al.(1985)，Nucl.Acid.Res.13rl-r104)。尽管这个tRNA的原始结构被修饰过以用于体外转录和氨酰化反应，但是，据信对起始物功能是必需的特征被保留了下来。这些特征包括在接受茎未端的一个非Wat-son-Crick碱基配对(B.L.Seong et al.(1987)Proc Natl.Acad.Sci.USA.84334-338H.Wakao et al.(1989)J.Biol Chem.26420363-20371)，一个在二氢尿嘧啶茎(D茎)上的11位嘧啶-24位嘌呤的碱基配对(B.L.Seong et al(1987)，和在连续形成3个G-C碱基对的反密码茎上的，一系列的鸟嘌呤和胞嘧啶的残基。(B.L.Seong et al.(1987))。
为产生tRNAAi(AAA)基因(pFMET或序列识别编号No.4)对野生型tRNAfMet的进行的修饰如下基因反密码子的碱基C和T被A代替，形成反密码子AAA;碱基1C和3C被替换成G;碱基70G和72A被替换成T;基因的碱基17C和17aT之间插入一个A。然后，用于pSER的补平、消化、连接、转化和筛选等过程，被用来形成pFMET。
体外转录质粒DNA用BstNI(3U/μg)在60℃消化一小时，为转录作准备。混合物经酚抽提后，用乙醇沉淀DNA。线性的DNA(40μg)加入到2ml的转录反应体系，其中含有50mM Hepe-KOH(pH7.6);10mM二硫苏糖醇(DTT);50mM Nacl;4mM亚精胺;25mM MgCl2;1.6mM GTP;4mM GMP，ATP，CTP，UTP;50URNasin和0.1mg/ml T7RNA聚合酶。37℃保温2小时后，用100U不含核糖酸酶(RNase)的脱氧核糖核酸酸I(DNaseI)消化模板DNA。采用A202凝胶光谱仪，(用10mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，和150mM NaCl使之平衡)，将短的流产转录(体)、dNTP和rNTP等与tRNA转录物用胶过滤分开。tRNA部分用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，然后用乙醇沉淀两次。
tRNA的氯酰(基)化反应用0-70%的硫酸铵((NH4)2SO4)沉淀S150蛋白质后，利用沉淀中存在的麦胚合成酶将人工合成的tRNA氨酰(基)化，(S.Lax et al.(1986)，Meth，Enzymol.118109-128).典型的混合物含有100mM Hepes-KOH(pH7.8);15mM Mg(OAC)22mM亚精胺;5mM二硫苏糖醇(DTT);5mM ATP;30μM各种放射性氨基酸(100Ci/mol);0.8mg/ml合成酶组分和0.5-1A260tRNA/ml。混合物在27℃保温20分钟。氨酰(基)化的效率，通过用三氯乙酸(TCA)沉淀tRNA，再用液体闪烁计数测量过滤后的沉淀物之放射性而确定。
尽管tRNACys(AAA)上从E.coli的野生型tRNACys基因制得的，它不能被E.coli S150组分的合成酶所氨酰基化。含有0-70%(NH4)2SO4沉淀的麦胚S150组分的合成酶确实氨酰化了tRNACys(AAA)。这个酶组分也有效地氨酰化了合成的tRNASer(AAA)。根据仅含有E.coli S150组分的翻译反应，E.coli合成酶也理应能氨酰化tRNASer(AAA)(表1)。
用E.coli S150组分作为氨酰基tRNA合成酶的来源，将酵母tRNAPhe氨酰(基)化，(B.Hardesty et al.(1971)Meth.Enzy-mol.20316-330)，tRNASer(AAA)、tRNAAlae(AAA)和tRNAAlai(AAA)被上面提及的麦胚的合成酶组分所氨酰基化。为了用于非酶促起始的翻译，Phe-tRNA，Ser-tRNA，Ala-tRNAAlae(AAA)和tRNAAlai(AAA)，采用Rappoport和Lapidot的步骤((1974)Meth-Enzymol 29685-688)，在它们的α-氨基基团上被酰基化。
氨酰化的效率对不同的合成tRNA品种是不同的。体外转录的tRNACys(AAA)仅有大约20%被氨酰化，而用麦胚的合成酶能使55%以上的tRNASer(AAA)氨酰化。(数据没有列出).不幸的是，Cys-tRNACys(AAA)是不稳定的，这妨碍了它在氨酰化之后的分离。
Cys-tRNACys(AAA)的不稳定性妨碍了随后的纯化。但是为了更进一步的研究，可以将氨酰化反应和大肠杆菌的翻译反应结合起来。相反地，通过重复Ser-tRNASer(AAA)的纯化和用香豆素(coumarin)标记的操作，Ser-tRNASer(AAA)是很稳定的。
使用麦胚的合成酶或者去除tRNA的E.coliS-150组分作为氨基-tRNA合成酶的来源时，tRNAAlae(AAA)的氨酰化通常达到60%左右(pmol掺入的Ala/pmol tRNA)用两种制备的合成酶中任何一种时，tRNAAlai(AAA)的氨酰化达到大约20%。这两种tR-NA都没有被观察到和丙氨酸(Ala)之外的任一种氨基酸发生氨酰化。(数据没有列出)。
表1.
poly(U)引导的(poly(U)-directed)的多聚苯丙氨酸、多聚半胱氨酸和多聚丝氨酸的合成。通过在37℃5分钟下，预先结合60pmol的Ac Phe-tRNA或者Ac Ser-tRNA时，(与核糖体的浓度相同)，所有反应都是非酶促起始的。所有样品在37℃保温30分钟，在此期间加入NaOH至样品浓度为0.1M，接着在室温下放置15分钟使tRNA-氨基酸之间的键水解。在反应混合物中的蛋白质用三氯乙酸(TCA)沉淀，然后过滤，过滤物干燥后，测量它们的放射性。在测量[35S]Cys掺入之前，样品在28℃保温120分钟。
反应 掺入的氨基酸 抑制多肽 温度(℃) (pmol) 红霉素 %由AcPhe-tRNA起始Poly(Phe) 37 1549 -1617 + -5Poly(Cys) 37 99 -58 + 4128 247 -Poly(Ser) 37 499 -47 + 91由AcSer-tRNA起始Poly(Phe) 37 1801 -1797 + 0Poly(Cys) 28 176 -116 + 34Poly(Ser) 37 593 -67 + 89利用人工合成的tRNA进行体外翻译为了测试tRNACys(AAA)和tRNASer(AAA)的合成反应性，将两者各自用于依赖于poly(U)的多肽合成。依赖于poly(U)的[14C]Phe对多聚苯丙氨酸的掺入，按照O.Odom et al.(1980)所描述的进行测量。为了非酶促起始，在poly(U)存在情况下将0.6μM Ac Phe-tRNA或Ac Ser-tRNA预先结合于0.6μM的大肠杆菌核糖体(37℃10分钟)。(W.D.Picking et al.(1990))。为了检测红霉素(注一种抗菌素)的敏感性(Sensitivity)，在预保温步骤之前，加入抗菌素至终浓度5μM。多聚丝氨酸中[14C]Ser的掺入，除了用1.17A260/ml合成的tRNASer(AAA)替换了tRNAPhe(AAA)以外，和多聚苯丙氨酸同样进行。在最终体积100μl中加入E.coli S150组分，使延伸开始。
为了协助依赖于poly(U)的多聚半胱氨酸的合成，翻译的分析(assay)作了修改。如上所述，Ac Phe-tRNA或Ac Ser-tRNA(60 pmol)预先结合于60pmol的核糖体。然后加入翻译所需的所有东西(除了tRNA和氨基酸)至100μl。为了使多聚半胱氨酸的合成起始，上面所述的Cys-tRNACys(AAA)的氨酰化反应偶联于翻译混合物，每种都加入相等体积至最终反应体积200μl。然后，反应在37℃保温30分钟或28℃保温120分钟，使tRNACys(AAA)能被麦胚的半胱氨酰-tRNA合成酶再次氨酰基化。为了检测每种新生的肽的构象和周围环境，将CPM-Phe-tRNA或CPU-S-tR-NA，按上述所述预先结合。为了保证大多数荧光团确实都结合，荧光氨酰基-tRNA结构类似物的浓度减小到核糖体浓度的10%左右。用CPM标记两种合成的[14C]丙氨酰-tRNA中每一种的氨基酸基团，按照前面描述的对天然的和人工合成的tRNA的标记一样进行。CPM-Ala-tRNA的纯化，基本按照描述过的对CPM-Ser-tRNASer(AAA)纯化，采用反相的高效液相层析(HPLC)在C1柱上进行。
应用人工合成的CYS-tRNA和Ser-tRNA及野生型tR-NAPhe进行的体外翻译，结果显示于表1。Cys的掺入在28℃和37℃两个温度下测量。在较低温度下，便于麦胚的酶对tRNACys(AAA)的再次氨酰化作用更大。在poly(U)存在下，AcPhe-tRNA或Ac Ser-tRNA和核糖体以1∶1的摩尔比预先结合时，所有的翻译反应都是非酶促起始的。产生了六种类型的带有新生肽的核糖体的反应混合物。其中每三种在氨基未端各分别含有N-Ac Phe和N-Ac Ser。5μM红霉素抑制每一种多肽合成的敏感性，同样被测试。平行地，在未标记氨基酸存在下，用[14C]Ac Phe-tRNA来起始每一种多肽，目的在于估计在合成每种新生肽时都完全有活性的核糖体的数目。(数据未列出)在红霉素存在或不存在的情况下，掺入多聚苯丙氨酸的Phe超过1500 pmol(表1)，这确定了在多聚苯丙氨酸合成中，反应混合物中30%的核糖体(18pmol)是有活性的。利用这个数值，可以计算出新生的多聚苯丙氨酸长度大约为80个氨基酸。因为合成的tR-NASer(AAA)能被粗制的E.coli S150组分所氨酰基化，因此，多聚丝氨酸的合成，按照多聚苯丙氨酸合成的方式同样进行。在这种情形中，然后，只有大约500p mol的Ser掺入到多聚丝氨酸。这个合成被红霉素抑制大约90%(表1)。仅有10%左右的核糖体在多聚丝氨酸合成中是有活性的。但是，这同样给出了肽的平均长度为80个氨基酸左右(数据没有列出)。
在37℃，30分钟内，99p mol的Cys掺入到多聚半胱氨酸中(被红霉素抑制41%)(表1)。估计在多聚半胱氨酸合成中，15%的核糖体(10p mol)是有活性的，这意味着肽平均长度为10个氨基酸。需要注意的是，这个合成是在麦胚氨酰化和E.coli翻译相偶联的系统中进行的。在37℃，只有很有限的tRNA能被麦胚合成酶氨酰基化。为了校正之，多聚半胱氨酸的合成同样在28°起始，并在此温度下反应120分钟。(表1)，这种情况下，掺入了247p mol Cys。象在37℃时一样，多聚半胱氨酸合成中有10p mol核糖体具有活性，所以这给出了这种情况下肽平均长度大约为25个氨基酸。
在poly(U)引导的翻译体系，大量的多聚苯丙氨酸合成(长的平均肽长度;高比例的的带有新生肽的核糖体)也许反映了苯丙氨酸肽的非典型特性。用TCA沉淀时，短的苯丙氨酸肽似乎比短的丝氨酸肽或短的半胱氨酸肽更容易沉淀。这也许对Phe掺入的总量相对较大有贡献，同时也可能是在多聚丝氨酸或者多聚半胱氨酸合成中，表现活性的核糖体的百分比相对较低的一个主要因素。另外一个使Phe总掺入量相对较大的因素是，在多聚苯丙氨酸形成时，保持肽合成速率基本线性的持续时间。在大多数肽(除了多聚苯丙氨酸)中观察到的肽合成速率的下降现象，也许反映了产物的反馈抑制。Spirin等((1988)Science 2421162-1164)观察到，当肽产物形成时，如果将产物从反应混合物中移去，基本线性的合成速率将持续很多小时。新生的多聚苯丙氨酸是如此难以溶解，因此，它们在反应溶液中能有效地移去。这样，导致形成与在连续流动的翻译体系中相同的情形。
在表1中显示的结果也表明，poly(U)引导的来自于合成tR-NA的多聚半胱氨酸和多聚丝氨酸的合成，对红霉素的抑制是敏感的。相反，在同样条件下，多聚苯丙氨酸合成不被这种抗菌素所抑制。这和以前的观察是一致的(G.Chinali et al.(1988)Biochem，Biochy.Acta.94971-78;T.Otaka et al(1975)Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 722649-2652;D.Vasquez(1979)Molecular Bi-ology Biochemistry and Biophysics Springer-Verlag，Berlin，vol.30，P.312)，并且支持了这样的假设对红霉素敏感性的不同，是新生的肽自身特性所导致的结果。
依赖于poly(U)的多肽合成，用Ala-tRNAAlae(AAA)和Ala-tRNAAlai(AAA)试验过。通过预先结合Ala-tRNAAlai(AAA)、Ala-tRNAAlae(AAA)和P-he-tRNA的乙酰基衍生物，协助多肽合成。氨酰-tRNA的N-乙酰化是按照Rappoport和Lapidot的方法(1974)，与氨基酸N-羟基丁二酰胺酯进行的。非酶促的tR-NA结合于核糖体是在以下条件进行的50mM Tris-HCl(pH7.5);100mM NH4Cl;15mM Mg(OAc)2;5mM2-巯基乙醇;0.2mg/ml poly(U);0.5μM核糖体和0.5μM酰基化的tRNA。多聚丙氨酸合成，除了以[14C]Ala为氨基酸来源，及以tRNAAlai(AAA)或tRNAAlae(AAA)为tRNA来源外与前面描述过的多聚苯丙氨酸和多聚丝氨酸一样起始。(W.D.Picking et al.(1991)J.Biol.Chem.2661534-1542)使用时，tRNAAlae(AAA)的终浓度为1A260单位/ml，而tRNAAlai(AAA)浓度为大约3A260单位/ml，以便在所有多聚丙氨酸分析中，使氨酰化tRNA的量的基本相同。按照以前在W.D.Picking et al(1991)所描述的，测定[14C]Ala对多聚丙氨酸的掺入。
仅有tRNAAlae(AAA)支持依赖于poly(U)的多聚丙氨酸(poly(Ala))的合成(图2)。依赖于合成延伸物tRNA的poly(Ala)的合成是线性的在37℃时超过60分钟(图2);在20℃时更长，超过2小时。(数据没有列出)。相反地，当使用tRNAAlai(AAA)时，poly(Ala)合成仅略高于背景水平(图2)。在这个体系，poly(Ala)合成的一个有趣的特征是，它对红霉素的抑制敏感(图2)。这与poly(Phe)合成对红霉素的抗性正好相反。(W.D.Picking et al(1991))。
接着进行测试以确定，是否Ac Ala-tRNAAlai(AAA)或Ac Ala-tRNAAlae(AAA)能够被非酶促地预结合于核糖体以协助poly(Ala)合成。来自Ac Ala-tRNAAlae(AAA)的Ala掺入poly(Ala)是相似的，而无论预结合于poly(U)编序的(poly(U)-pro-grammed)70S核糖体上的是Ac Ala-tRNAAlae(AAA)，Ac Ala-tR-NAAlai(AAA)还是Ac Phe-tRNA(表2)。
合成的新生的poly(Ala)链的数量是这样确定的测量来自预结合的Ac-[14C]氨酰基tRNA的放射性标记的氨基酸的掺入，然后在未标记氨基酸存在下合成poly(Ala)。通过平行确定带放射活性的Ala的掺入，和知道合成的新生肽链的数目，就有可能估计出新生poly(Ala)链的长度。
无论起始的tRNA是什么，生成的新生的肽的长度都相近(表2)。这些数据的重要特征在于，虽然tRNAAlai(AAA)对肽的延伸不具功能，但它能结合到核糖体的P位点，从而允许非酶促起始的肽合成。同样应当注意到，与起始的酰基-tRNA无关。(即使是Ac Phe-tRNA)，poly(Ala)合成被红霉素抑制。(数据没有列出)。
表2在预结合三种不同的N-封闭(N-blocked)氨酰基-tRNA之后的poly(Ala)的合成。
起始新生tRNA 掺入的Ala 起始的新生链 链长度pmol pmolAcPhe-tRNA 676 18 38AcAla-tRNAAla/AAAe626 13 52AcAla-tRNAAla/AAAi614 14 44在无放射性的Ala存在时使用Ac[14C]氨酰基-tRNA，从而确定起始的新生链的数量。[14C]Ala用来测量掺入poly(Ala)的Ala的pmol数。新生的poly(Ala)的平均长度，如方法所述，通过pmol Ala/pmol新生(肽)链而给出。
这两种氨酰化的Ala tRNA的α-氨基基团上的CPM残基的荧光特性，反映了tRNA在溶液中游离时或者结合于核糖体上时荧光基团周围的环境。CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)结合于70S核糖体时其许多特性与CPM-Phe-tRNA及合成的CPM-SerRNASer(AAA)相同，这些特性在上面讨论过并且以前已经报导过(W.D.Picking et al.(1991))。然而，对于CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)，荧光各向异性数据表明，当CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)和CPM-Ala-tR-NAAlae(AAA)在溶液中呈游离态时，前者上的荧光基团比后者上的结合更为牢固。相反地，一旦起始物tRNA的结构类似物结合于70S核糖体，其上的荧光团看出去，比在延伸物tRNA上的同种探针更容易自由地移动，另外，尽管每种荧光tRNA都结合于核糖体“P位点”，但随后它们对红霉素的结合的反应是不同的。综合这些结果从功能上来判断，当两个tRNA在“P位点”时，CPM探针和可能与之相连接的Ala并不是在相同的位置。这种与红霉素结合位点有关的结合上的差别，并没有阻止抗菌素对poly(Ala)合成的抑制，无论这种合成是通过预结合N-封闭的延伸物Ala-tRNA起始，还是通过预结合起始物Ala-tRNA或Phe-tRNA而起始。
这些功能上的差异也许反映了起始物和延伸物tRNA两者在结构上的差异。在原核的起始物tRNA上有许多强烈保护的区域，与延伸物tRNA形成对比。(B.L.Seong et al.(1987);H.Wakon et al.(1989);and C.O.Gualerzi et al.，(1990)Biochem.295881-5889)这些特征包括在残基1和72之间缺少一个Wat-son-Crick碱基对，在二氢尿嘧啶茎(D茎)上存在嘌呤11-嘧啶24碱基对，以及在反密码茎上三个连续的G-C碱基对。(B.L.Seong et al(1987))，后一特征可用来区分起始物tRNA和延伸物tR-NA，并且是特异结合于核糖体P位点所必需的。(B.L.Seong et al.(1987))。已经表明，在反密码子茎这一部分的定点突变将导致tRNAfMet的起始物功能的逐渐消失。这三个连续的G-C碱基对的出现暗示着，它给予起始物tRNA的反密码子特殊的结构特性和电磁特性。(K.A.Sharp et al(1990)Biochem.29340-346)新的新生多肽延伸的荧光测量首先，CPM-Phe-tRNA或CPM-Ser-tRNA被用来起始依赖于poly(U)的poly(Phe)、poly(Cys)和poly(Ser)的合成。酵母Phe-tRNA的α-基团的CPM标记在O.Odom等(1990)中有描述。类似地，Ser-tRNASer(AAA)在丝氨酰基部分的α-基团被标记。荧光tRNA结构类似物，按照纯化CPM-Phe-tRNA相类似的方式，在C1层析柱上用反相的HPLC纯化。
稳定态的荧光测量在来自SLM-Aminco Iustruments，Inc.(Urbana，IL)的8000-型光子计数光谱荧光仪(photon-counting spectrofluormeter)上，按照在W.Rbychlik等所描述的进行。((1983)Biochemistry 22∶85-93)。光谱数据按1nm间隔而测定，采用的扫描率(scanning rate)为0.5秒/每个波长增量。因为波长与光倍加器的灵敏度之间存在依赖关系，所以所有测量都被自动地校正。荧光测量，是在激发波长的吸收小于0.1，0.5ml体积和20℃(目的在于有意减慢延伸的速度)条件下进行的。稳定态荧光各向异性的测量，按照O.Odom所描述的进行。((1984)Bro chem-istry 2350695076)。
随着新生肽的形成，也同时测定氨基酸上CPM探针的荧光各向异性。CPM-Phe-tRNA结合于核糖体的肽酰转移酶中心时，结果导致荧光各向异性从0.18增加到0.36。这高的荧光各向异性反映了，CPM-Phe-tRNA的氨基酸在肽酰转移酶中心结合的牢固程度。(W.D.Picking et al.(1990))。最初的poly(Phe)的少量肽键的合成，导致了各向异性的下降，但接着当新生肽延伸时，各向异性又增加了。相反，依赖于poly(A)的poly(Lys)合成，当氨基未端探针从肽酰基转移酶中心延伸出来时，其各向异性将会快速的下降，并且没有随后的增加。
一旦用CPM-Phe-tRNA起始poly(Cys)或poly(Ser)的合成后，各向异性大幅度下降，其方式与前述的poly(Lys)的方式有些相似(图3)。然而，与poly(Lys)合成不同的是，这些新生肽的各向异性在短时间内持续后稳定之后再次下降(图3A)。如果两种新生肽在只有几个氨基酸时，其氨基酸未端脱离核糖体的肽酰tRNA中心，那么上述结果是可以预期的。新生的Ser肽比新生的Cys肽长(表1)，这也许是前者的最终各向异性较低的原因。这些结果及以前的结果暗示，poly(Lys)和poly(Ser)的新生多肽与poly(A)引导的新生的poly(Lys)非常相似，都是直接延伸进入周围的溶液中的。
为了进一步的证实上述的结果并不是由CPM-Phe-tRNA起始翻译造成的，用CPM-Ser-tRNA起始包括poly(Phe)在内的每种新生多肽种类。当肽延伸时发生的荧光的变化，按上面所述的进行监测。和以前看到的一样，各向异性在poly(Phe)的最初的肽键形成时减少，然后，当肽延伸时，又增大了。(图3;W.D.Picking et al(1990))。当poly(Cys)肽和poly(Ser)肽的最初的肽键形成时，CPM-Ser探针的各向异性同样大大地减少;但是，与poly(Phe)的结果相反，当多肽延伸时，各向异性没有增加。有趣的是，在几个氨基酸(估计为3或4个)加到氨基未端CPM-Ser之后，在一段短时期内各向异性的下降停止了。(图3B)。这个结果，与当肽由CPM-Phe起始时得到的结果很相近。这个结果原因尚不清楚。这也许反映了短的新生肽的构象，或者当肽开始延伸时，探针所碰到的核糖体的一种特殊的结构特征。
为了估计新的poly(Ala)链的平均长度(表2)，有必要确定上述依赖于poly(U)的多肽分析中，有活性的核糖体的数目。为此，在加入其它蛋白质合成必需组分前，通过在37℃保温15分钟，将55pmol的Ac[14C]Phe-tRNA(100Ci/mol)，Ac[14C]Ala-tR-NAAlae(AAA)或Ac[14C]Ala-tRNAAlai(AAA)(50Ci/mol)，预结合于poly(U)编序的核糖体(50pmol)上，在预结合Ac[14C]氨酰基-tRNA之后，多肽合成按前面所述的进行，除了此时使用非放射性Ala，以使掺入被TCA沉淀的物质的放射性，仅仅来自于预结合的N-封闭的氨基酸。这使得能对一些进行核糖体进行测量，这些核糖体上，来自于预结合的[14C]标记的Ac-aa-tRNA(注aa即氨基酸)的氨基酸随后被掺入到新生的poly(Ala)。当掺入到poly(Ala)中的Ala的总pmol数被测出时(前面描述过)，这个值除以有活性的核糖体数目(通过测量合成的新生肽链的数目而确定)，从而给出新生的poly(Ala)链的平均长度的估算值。
表3CPM-Ala-tRNAAla/AAAe和CPM-Ala-tRNAAla/AAAi的荧光特性。
tRNA种类位置各向异性量子产量 Emmax(nm)CPM-Ala-tR- 自由游离 0.185 0.393 479NAAla/AAAe结合(P位点) 0.346 0.503 473结合(P位点)10.312 0.472 475CPM-Ala-tR- 自由游离 0.205 0.449 478NAAla/AAAi结合(P位点) 0.310 0.516 475结合(P位点)10.208 0.466 4781在结合荧光的tRNA种类之前，脱酰基化的tRNAPhe和poly(U)编序的核糖体以1.1∶1的比率预结合。
按上面所述，再次使用来自SLM-Aminco Instruments，Inc.(Urbana，IL)的8000型光子计数光谱荧光仪，测量稳定态荧光。荧光tRNA如上所述结合于核糖体，除了这些tRNA的浓度被减小为核糖体浓度的10%左右，以保证最大量的tRNA结合。光谱的测量，采用1nm发射间隔，扫描率为0.5秒/每波长增量，激发波长385nm。各向异性和相关的强度测量，在发射波长475nm下进行。因为波长与光倍加器灵敏度之间的依赖关系，测量值自动被校正。荧光测量在体积0.6ml，20℃下进行。在激发波长的单吸收小于0.1时，得到所有测量值。荧光各向异性测量值按以前W.L.Picking et al(1991)中所述的而得到。CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的量子产量，通过与在0.5M H2SO4的硫酸奎宁相比较而得出。(后者在25℃的量子产量为0.508)。(R.A.Ve-lapold et al(1980)“A Fluorescence Standard Reference ManualQuine Sulfate Dihydrate，”National Bureau of Standards special Publication 260-64，U.S.Government Printing office，Washing-ton，D.C)。
有趣的是，这两种tRNA在测试条件下，其荧光各向异性和量子产量是不同的。自由游离的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)(0.185)的各向异性，与以前看到的天然的延伸物tRNA CPM-Phe-tRNAPhr(0.181)及人工合成的延伸物tRNA CPM-Ser-tRNASer(AAA)(0.175)，是相类似的。一旦结合于70S核糖体后，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的各向异性和量子产量，和以前研究的tRNA一样以同样的方法增加。(W.D.Picking et al.(1991);表3)相反地，与CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)在游离时(0.185)及结合于P位点时(0.346)相比，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)，游离于溶液时有较高的各向异性(0.205)，而结合于P位点时有较低的各向异性(0.310)(表3)。通过加入嘌呤霉素，已经证实，每种tRNA都与P位点结合。这导致，当每种CPM-Ala-嘌呤霉素产物形成然后从核糖体释放时，结合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)(降至0.175)和CPM-Ala-tR-NAAlai(AAA)(降至0.183)的各向异性的大幅度下降。(数据没有列出)。
当脱酰基化的tRNAPhe预结合于70S核糖体，以促进CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)结合于A位点时，并没有观察到量子产量、各向异性或发射光谱的变化。这意味着没有发生结合(表3)。实验证实在预结合脱酰化tRNAPhe之后，当反应组分在Sephacryl S-300上被胶过滤分开时，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)与核糖体组分不在一起。(数据没有列出)。相反地，用增大的各向异性(0.312)和量子产量(0.472)(表3)来判断，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)看上去结合于核糖体A位点。通常，少于10%的结合于A位点的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)与嘌呤霉素起反应。(数据没有列出)。
数据暗示，人工合成的起始物tRNA保留了天然的tRNAfMet的结合特性。这些特性与其荧光特征相一致，并使其有别于延伸物Ala-tRNA。
CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)(25pmol)，也用于检测IF-2对tRNA与30S和70S核糖体结合的影响。在纯化的IF-2(105pmol)存在和不存在情况下，在连续加入30S亚基(195pmol)和50S亚基(195pmol)之后，测量荧光各向异性和量子产量。测量在下列条件进行50mM Tris-HCl(pH7.5)，6mM Mg(OAC)2，50mMNH4Cl，1mM GTP，5mM DTT和0.2mg/ml poly(U)，终体积600μl。当测量结束后，提高Mg2+的浓度至15mM，以协助非酶促的tRNA结合，然后再次测量各向异性和量子产量。结果似乎表明用IF-2起始肽并非一定需要甲硫氨酸(Met)或AUG密码子。事实上，突变后识别UUC和GUC密码子并分别被Phe和Ala所氨酰基化的起始物tRNA，已经被表明，当mRNA在起始密码位置含有相应密码子时，能在体内酶促起始有活性的β-半乳糖苷酶。(R.Chottapadhyay et al(1990)Biochem.294263-4268)。在相似的研究中，当存在突变后识别起始琥珀密码子(UAG)的起始物tRNA时，从琥珀密码子，也许包括谷氨酰胺(Gln)密码子，可以起始有活性的氯霉素酰基转移酶。(U.Varshney et al(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.871586-1590)表4IF-2介导的CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)核糖体的结合tRNA 加入 各向异性 量子产量CPM-Ala-tRNAAla/AAAi无 0.206 0.449+30S 0.204 0.450+50S 0.238 0.453+9mMMg20.308 0.503+IF-2&30S 0.232 0.440+50S 0.300 0.5169mMMg20.306 0.512CPM-Ala-tRNAAlae/AAA 无 0.182 0.393+30S 0.187 0.389+50S 0.200 0.393+9mMMg20.340 0.483+IF-2&30S 0.188 0.393
+50S 0.197 0.3979mMMg20.343 0.488在测量荧光之前，在6mM Mg2+存在下，将IF-2和/或者30S核糖体亚基与荧光tRNA在37℃保温15分钟。随后加入各种试剂之后，反应混合物在37℃保温10分钟，然后在20℃保温15分钟(在用于荧光测量的小杯中)，然后读取荧光值。所有的反应按Meth-ods中所述的，在总体积600μl中进行。在加入核糖体之后，[Mg2+]增加9mM(达到终浓度15mM)，以利于荧光tRNA的非酶促结合的进行。随后再次测量各向异性和量子产量作为对照。
使用纯化的E.coli IF-2使tRNA结合于30S和70S核糖体(在6mM Mg2+中)，来测试tRNAAlai(AAA)在酶促起始肽合成中的功能。增加了的各向异性和量子产量表明，IF-2使CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)结合于30S亚基更易进行。(表4)。然后，当50S亚基加入到反应混合物时，根据荧光各向异性的增加，表明超过80%的CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)结合于70S核糖体(在6mM Mg2+中)。(表4)。当反应混合物中[Mg2+]增加到15mM介导tR-NA的非酶促结合时，仅观察到结合有少量的轻微增加。(表4)。用poly(U)，在6mM Mg2+，缺少IF-2时，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)并没有结合于30S核糖体亚基，与70S核糖体的结合也很少。(表4)。只有在增加[Mg2+]至15mM之后，起始物tRNA在缺少IF-2下才结合于poly(U)编序的核糖体。(表4)这些数据表明，在6mM Mg2+中IF-2特异性地介导CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)结合于30S核糖体亚基，或者结合于70S核糖体。
相反，在6mM Mg2+时，无论IF-2存在与否，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)都不结合于30S或70S核糖体。(表4)。但是，在各种情况下，一旦[Mg2+]增加至15mM，它就快速地结合。在高浓度Mg2+时，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的各向异性和量子产量，都增加到以前在核糖体结合所观察到的数值。
来自CPM的香豆素部分的荧光，对探针周围环境的疏水性、带电情况及其他因素非常敏感。和上述讨论的CPM-Ser-tRNA一样，这种环境的敏感性被用来在不同条件下比较两种CPM-Ala-tRNA。CPM-Ala-tRNAlae(AAA)和CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的荧光发射光谱在下列情形下测量游离于溶液中时，结合于poly(U)编序的核糖体时，与红霉素同时结合于核糖体时，与嘌呤霉素和稀疏霉素一起同时结合于核糖体时(图4A和4B)。本实验室研究表明，稀疏霉素结合于70S核糖体时，并不阻止嘌呤霉素的结合，但抑制嘌呤霉素与结合于P位点的N-酰基-Phe-tRNA之间的反应。(Odom and Hardestry，manuscript in prearation)。
一旦结合于核糖体，CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的发射光谱的强度便增加，同时伴随着一个相当大的蓝移(6nm)。(图4，破折线对实线)。CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的发射经过与CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)相似。虽然前者在结合于核糖体之后，伴随着较微小的蓝移(3nm)，其荧光强度只有相对较小的增加。
当红霉素结合于早已含有CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的核糖体时，相应的荧光强度增加15%，同时伴随着发射最大值的进一步蓝移(3nm)(图4，点线)。有趣的是，红霉素导致的结果是，CPM-Ala-tRNAAlai(AAA)的相应光谱强度仅增加3%，同时伴随着发射光谱的2nm蓝移。(图4B，点线)。这些观察结果表明，起始物tR-NA的CPM-Ala部分存在于核糖体上与红霉素结合位点不同的某个部位。为了探究这种可能性，在连续加入稀疏霉素和嘌呤霉素之后，测量每种tRNA的荧光(在结合于poly(U)编序的核糖体之后)。单独的稀疏霉素对两种荧光tRNA的发射光谱几乎没有影响。(数据未列出)。但是，稀疏霉素是嘌呤霉素与结合于核糖体P位点的酰基-tRNA反应的抑制物。这使检测嘌呤霉素的结合对每tRNA荧光的影响作为可能。(图4A和4B)。嘌呤霉素结合后，导致结合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的荧光强度增加26%，同时伴随着发射最大值的4nm蓝移(图4，破折/点/点线)，没有观察到各向异性的变化。这个结果证实稀疏霉素对嘌呤霉素反应性的抑制。相反地，结合嘌呤霉素后，结合的CPM-Ala-tRNAAlae(AAA)的荧光仅增加了6%，同时也伴随着4nm的蓝移。(图4B，破折/点/点线)。
使用红霉素和稀疏霉素/嘌呤霉素得到结果表明，起始物tR-NA的CPM-Ala部分与延伸物tRNA的CPM-Ala部分在核糖体上处于不同的部位。这些结果的一个令人感兴趣的特征是，不论哪种CPM-Ala-tRNA起始，poly(Ala)合成都被红霉素抑制。而且，当结合到核糖P位点时，每种N-酰基-tRNA都能与嘌呤霉素反应(在稀疏霉素不存在时)。这意味着，就稀疏霉素和嘌呤霉素的结合位点而言，起始物tRNA的CPM-Ala部分和延伸物tRNA的同样部分，存在于不同的部位，它对两种抗菌素的功能并未产生明显的影响。这种差异的潜在意义，还不清楚，但是很有可能这反映了tR-NA构象上，而不是肽酰基酶的功能上的差别。
综上所述，人工合成的tRNACys，尽管氨酰化程度比较低，能有效地用于poly(U)引导的poly(Cys)合成。合成的tRNASer(AAA)是氨酰化反应的更好的底物，同时也能有效地用于poly(U)引导的翻译体系。poly(U)引导的poly(Cys)和poly(Ser)合成的一个有趣特征是，都对预结合红霉素带来的抑制很敏感，而不论非酶促的起始，是用Ac Ser-tRNA还是用Ac Phe-tRNA。这与poly(Phe)合成正好相反，无论poly(Phe)合成由Ac Phe-tRNA还是由Ac Ser-tRNA起始，都不受红霉素的影响。这些数据意味着，红霉素的敏感性是由于新生肽的作用，而不是mRNA或tRNA的作用。
为了扩展这些数据，当形成poly(Phe)，poly(Cys)或poly(Ser)时测定了连接在Phe或Ser的氨基未端上的CPM探针的荧光特性。不管用CPM-Phe还是CPM-Ser起始，poly(Phe)的行为相同，而且似乎在肽酰基转移酶中心附近积累形成一种不溶性的物质。另一方面，无论用Ac Ser-tRNA还是Ac Phe-tRNA起始，以Cys或Ser延伸出来的新生肽，似乎是直接从肽酰基转移酶的中心脱离进入周围溶液的。这个结果与在poly(Cys)中得到的相似。
比较两种合成的Ala tRNA，延伸物tRNA(tRNAAlae(AAA)和起始物tRNA(tRNAAlai(AAA))，用体外翻译及荧光技术来判断，两者在核糖体的肽合成过程中行为不同。tRNAAlai(AAA)在依赖于poly(U)的poly(Ala)肽的延伸中不起作用，而相应的tR-NAAlae(AAA)却能有效地用于此过程。相反，在15mM Mg2+存在下，两种Ac Ala-tRNA都能非酶促结合于poly(U)编序的70S核糖体的P位点。用这种方式，当tRNAAlae(AAA)作为延伸物tRNA来源时，每一个都能用于起始poly(Ala)的合成。但是，在6mM Mg2+时，只有起始物tRNA的结构类似物才能在IF-2和GTP酶促结合。这些结果表明，tRNAAlai(AAA)保留了起始物的功能，而只有tRNAAlae(AAA)具有肽延伸功能。
本发明适合于进行所述的工作，并得到所述的结果和优点以及其他所述内容。出于示范的目的，这里描述了本发明的最佳实施例。但是，合成和使用中的大量细节可以改变，而不会背离本发明的实质及附录的权利要求书的范围。因此，应当知道，不要将本发明局限于上述的特殊形式，相反，本发明包括了所有的修饰和不同的构建以及落入本发明实质及附录的权利要求范围的相同的结果。
序列清单关于序列识别编号No.1的信息(SEQ ID NO1)(ⅰ)序列特征
(A)长度102碱基对(bp)(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构不详(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅲ)假设有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO1AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGCGCGTT AGCAAAGCGGTTCTGCAGCG GATTAAAAAT CCGTACTAGT CCGGTTCGACTCCGGAACGC GCCTCCAGGA TC关于序列识别编号No.2的信息(SEQ ID NO2)(ⅰ)序列特征(A)长度124碱基对(bp)(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构不详(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅲ)假设有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO2GAGAAGCTTT AATACGACTC ACTATAGGAG AGGTGTCCGAGTGGCTGAAG GAGCACGCCT AAAAAGTGTG TATACGGCAACGTATCGGGG GTTCGAATCC CCCCCTCTCC GCCAGGATCCGAGA关于序列识别编号No.3的信息(SEQ ID NO3)(ⅰ)序列特征(A)长度104碱基对(bp)
(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构不详(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅲ)假设有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO3AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGCTAT AGCTCAGCTGGGAGAGCGCC TGCTTAAAAC GCAGGAGGTC TGCGGTTCGATCCCGCGTAG CTCCACCAGG ATCC关于序列识别编号No.4的信息(SEQ ID NO4)(ⅰ)序列特征(A)长度106碱基对(bp)(B)类型核酸(C)链双链(D)拓扑结构不详(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅲ)假设有(ⅳ)序列描述SEQ ID NO4AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGGGGT GGAGCAGCCATGGTAGCTCG TCGGGCTAAA AACCCGAAGG TCGTCGGTTCAAATCCGGCC CCCTCTACCA GGATCC
权利要求
1.一种含合成的tRNA的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列含一个AAA反密码子；一个RNA聚合酶启动子；一个tRNA基因，所述的tRNA基因含有目的氨基酸的特定tRNA合成酶的识别位点；且至少两个限制性内切酶位点。
2.如权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括一个Hind Ⅲ位点，一个T7RNA聚合酶启动子，一个突变的大肠杆菌基因，一个Bst NI位点和一个Bam HI位点。
3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，还包括通过分别把A21和T24碱基变成C21和C24产生的一个Pst Ⅰ位点，和通过把A加到所述的DNA序列中T42和C43之间产生的Spe Ⅰ位点。
4.如权利要求3所述的DNA序列，即tRNACys(AAA)基因，其特征在于，核酸序列为AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGCGCGTT AGCAAAGCGGTTCTGCAGCG GATTAAAAAT CCGTACTAGT CCGGTTCGACTCCGGAACGC GCCTCCAGGA TC
5.一种制备权利要求4所述的tRNACys(AAA)基因的方法，其特征在于，包括制备5′-3′和3′-5′Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸及5′-3′和3′-5′Pst Ⅰ/Bam HI寡核苷酸;使所述的5′-3′和3′-5′Hind Ⅲ/Pst Ⅰ寡核苷酸，及5′-3′和3′-5′Pst Ⅰ/Bam HI寡核苷酸退火;形成所述退火的寡核苷酸和Hind Ⅲ/Bam HI消化的pUC18质粒的连接混合物;保温所述的连接混合物;用所述的保温过的连接混合物来转化大肠杆菌;把所述的转化后的大肠杆菌暴露于α-氨基苄青霉素和X-gal;筛选有插入片段，因而其质粒上携带有完整tRNACys(AAA)基因的所述的大肠杆菌转化子;并对所述的插入片段的双链进行测序。
6.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，在所述核酸序列的T环中还含有一个Bst BI限制性酶切位点。
7.如权利要求6所述的DNA序列，即tRNASer(AAA)基因，其特征在于，核酸序列为GAGAAGCTTT AATACGACTC ACTATAGGAG AGGTGTCCGAGTGGCTGAAG GAGCACGCCT AAAAAGTGTG TATACGGCAACGTATCGGGG GTTCGAATCC CCCCCTCTCC GCCAGGATCCGAGA
8.一种制备权利要求7所述的tRNASer(AAA)基因的方法，其特征在于，包括从大肠杆菌基因组复制tRNASer(GGA)基因;在所述基因中用AA替换GG，形成AAA反密码子;补平(blunting)所述的替换后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端补平的基因;将所述的消化后的基因连接到pUC18质粒上;用连接后的质粒转化大肠杆菌;筛选有插入片段，因而其质粒上携带有完整tRNASer(AAA)基因的所述的大肠杆菌转化子;并对所述的插入片段的双链进行测序。
9.如权利要求6所述的DNA序列，即tRNAAlae(AAA)基因，其特征在于，核酸序列为 AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGCTAT AGCTCAGCTGGGAGAGCGCC TGCTTAAAAC GCAGGAGGTC TGCGGTTCGATCCCGCGTAG CTCCACCAGG ATCC
10.一种制备如权利要求9所述的tRNAAlae(AAA)基因的方法，其特征在于，包括从大肠杆菌基因组复制tRNAAla(GGC)基因;用AAA替换在所述的基因的GGC形成AAA反密码子;补平替换后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端补平的基因;将所述的消化后的基因连接到pUC18质粒上;用连接后的质粒转化大肠杆菌;筛选有插入片段，因而其质粒上携带有完整tRNAAlae(AAA)基因的所述的大肠杆菌转化子;并对所述的插入片段的双链进行测序。
11.如权利要求6所述的DNA序列，即tRNAAlai(AAA)基因，其特征在于，核酸序列为AGCTTTAATA CGACTCACTA TAGGGGGGGT GGAGCAGCCATGGTAGCTCG TCGGGCTAAA AACCCGAAGG TCGTCGGTTCAAATCCGGCC CCCTCTACCA GGATCC
12.一种制备如权利要求11所述的tRNAAlai(AAA)基因的方法，其特征在于，包括从大肠杆菌基因组复制tRNAfMet(CAT)基因;用A替换所述基因反密码子中的C和T碱基，形成AAA反密码子;在所述的替换后的基因中，用G替换碱基1C和3C，用T替换碱基70G和72A;在所述的替换后的基因的碱基17C和17aT之间插入一个A;补平所述的替换后的基因的末端;用Hind Ⅲ和Bam HI消化所述的末端补平的基因;将所述的消化后的基因连接到pUC18质粒上;用所述的连接后的质粒转化大肠杆菌;筛选有插入片段，因而其质粒上携带有完整tRNAAlai(AAA)基因的所述的大肠杆菌转化子;对所述的插入片段的双链进行测序。
全文摘要
从tRNA
文档编号C12N15/09GK1086261SQ92110198
公开日1994年5月4日 申请日期1992年8月29日 优先权日1991年8月30日
发明者博伊德·哈德斯蒂, 温迪L·皮克林 申请人:发展研究基金会