生产重组人体乳铁蛋白的制作方法

专利名称：生产重组人体乳铁蛋白的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及结合铁的糖蛋白领域。更具体地，涉及生产重组人体乳铁蛋白。
人体乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是结合铁的单体糖蛋白中转铁蛋白家族的一员。它最初在牛奶中发现，在初乳中的含量可达7克/升。此后，在其他外部液体中，例如眼泪、唾液以及粘液分泌物都检测到LF，它还存在于分叶核白细胞的次级颗粒中。
LF是分子量为78千道尔顿(KDa)的糖蛋白，具有二叶瓣结构，C末端和N末端有很大程度的同源性，该同源性无论从氨基酸顺序还是三维结构水平上看，都是很明显的。每一叶瓣都能高亲和性地与一个三价铁离子可逆结合，这种结合同时伴随着碳酸氢根(bicarbonate)的结合。已提出的乳铁蛋白的生物学功能包括抵抗微生物感染、增强婴幼儿对铁的肠吸收、促进细胞生长、调节骨髓生成以及调节炎症应答。
丝状真菌已被成功地作为宿主用于工业生产胞外糖蛋白。某些工业用菌株能分泌数以克计的糖蛋白。此外，丝状真菌能正确地进行真核蛋白翻译后的修饰，而且许多菌株已获美国食品和药物管理局(FDA)的许可。更进一步，大规模发酵技术和下游加工技术都是具备的。
现在，还没有有效而经济的方法生产人体LF。所以，随着有效的生产人体乳铁蛋白的方法上的进展，使乳铁蛋白应用于营养和药物以及进一步研究工作以阐明其作用机理，将能解决本技术领域长期存在的需要，并描述有关的生产乳铁蛋白的方法。
在一个实施例中，本发明提供了含有人体乳铁蛋白cDNA的重组质粒。本发明的该质粒适合在真核细胞中表达，并且含有人体乳铁蛋白cDNA在该真核细胞中表达所必需的调控因子。
在另一个实施例中，本发明提供了含有重组质粒的转化的真核细胞。真核细胞选自包括曲霉属(Aspergillus)在内的一组丝状真菌。该质粒含有一个质粒载体，其中插有编码人体乳铁蛋白的多聚脱氧核糖核苷酸片段。
在本发明的另一个实施例中，提供了产生重组人体乳铁蛋白的方法。该方法包括培养真核细胞的转化株，该转化的真核细胞含有重组质粒。该质粒含有一个质粒载体，其中包含编码人体乳铁蛋白的多聚脱氧核糖核苷酸片段。在适宜的营养培养基上培养直至形成人体乳铁蛋白，随后分离人体乳铁蛋白。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种重组表达载体。该载体含有一个转录单位，包括下列元件(1)一个或多个在基因表达中具调控作用的遗传因子;(2)编码人体乳铁蛋白的cDNA;(3)合适的转录和翻译的起始及终止序列;和(4)一个遗传因子，该因子用于将那些被载体转化的曲霉属孢子筛选出来。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生具有生物学活性的重组乳铁蛋白的方法。该方法包括合成一段序列，该序列含有一个可供选择的标记基因，一个启动子，一个转录终止序列和一个接头序列;克隆所述的序列，形成质粒;用限制性核酸内切酶消化该质粒;将编码乳铁蛋白的cDNA插入限制性位点;和用能表达乳铁蛋白cDNA的质粒转化真核细核。
为了能详尽地理解并获得上面提及本发明的特征、优点和目的，以及更好地理解其它事宜，可以对照本发明的实施例参见前面曾简要概括的本发明的更具体的描述，那些实施例在附图中有阐述。这些附图是本说明书的一部分。必须注意，尽管如此，附图阐述的只是本发明的较佳实施例，因此不能被用来限定本发明的范围。其他相同的有效等价的实施例也被本发明承认。


图1米曲霉(Aspergillusoryzae)表达载体(pAhlfg.)的简图示意图。
图2转化的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株的Southern印迹分析。
图3转化菌株相对对照的A07的RNA分析。
图4重组的LF的分泌和纯化的银染SDS-丙烯酰胺凝胶分析。
图5重组人体LF的特征。
图6编码人体LF的cDNA序列。
出于本申请的目的，术语“转铁蛋白的家族”意指包括血清转铁蛋白、卵转铁蛋白和乳铁蛋白在内的一族铁转递蛋白。这些蛋白质都是结构上相关的。
出于本申请的目的，术语“载体”意指能允许乳铁蛋白cDNA插入，增殖和表达的质粒运载工具。
出于本申请的目的，术语“宿主”意指任何一种真核细胞，只要它能允许乳铁蛋白表达质粒整合到它的基因组中。
出于本申请的目的，术语“启动子”意指控制乳铁cDNA转录的DNA调控序列。
现于本申请的目的，术语“多克隆盒”意指一段DNA片段，该DNA片段含有多种限制性内切酶切点，从后允许插入不同的cDNA。
出于本申请的目的，术语“转化”意指质粒被有关的真核细胞摄入。
出于本申请的目的，术语“结合铁能力”意指结合59Fe的能力。功能完整的乳铁蛋白。每分子LF能结合两个铁原子。
出于本申请的目的，术语“生物活性(的)”意指以其结合铁的能力为度量的乳铁蛋白的生物活性。乳铁蛋白起铁传递蛋白的作用，必须结合铁才具有生物活性。
在本说明书中引用的所有文献在此处统一以参考形式表达。
给出下列实施例的目的在于阐述本发明的不同的实施，并不意味着以任何形式作为本发明的限制(因素)。
实施例1真菌菌株及转化用于研究的pyrG突变菌株是从A.oryzae(A07 11488)衍生而来的。来自A.oryzae的pyrG基团用4-硝基喹啉-1-氧化进行诱变。根据Osmani，et al.，J.Cell.Biol.1041495-1504(1987)的转化程序略作改进，转化曲霉。将分生孢子(1×106/ml)接种于50ml含5mM尿嘧啶和10mM尿嘧啶核苷的YG培养基(0.5%酵母提取物，2%葡萄糖)。32℃生长14-16小时直至看见萌发管。发芽的分生孢子通过离心方式收获，然后再悬浮于40ml的溶菌混合液中[含有0.4M(NH4)2SO4，50mM柠檬酸钾(pH6.0)，0.5%酵母提取物，0.12g novozyme，0.1g Driselase，100μl β-葡糖苷酸酶，0.5%蔗糖和10mM MgSO4]。在32℃和150rpm下原生质体化2-3小时。在原生质体化之后，有必要用无菌的米拉布(miracloth)进行过滤，以去除所有未消化的菌丝。原生质体通过离心收获并在4℃用10毫升的0.4M(NH4)2SO4，1%蔗糖和50mM柠檬质钾(pH 6.0)洗涤两次，接着再悬浮于1毫升的0.6M KCl;50mM CaCl2;10mM Tris-HCl(pH 7.5)中，并置于冰上。在原生质体的制备之后，立刻进行转化。原生质体(100μl)加入3μg DNA和50μl的40%聚乙二醇(PEG)6000，50mMCaCl2，0.6M KCl和10mM Tris-HCl(pH 7.5)。样品在冰上保温15分钟后，再加入1ml PEG溶液，然后在室温继续保温30分钟。上述混合物分成小份，分置于3ml 0.7%半固体基本培养基中，添加0.4%硫酸铵，倒平板于含同样成分但用2%琼脂固化的固体培养基平板上。随后，所有的平板在32℃培养。
实施例2质粒构建表达质粒的简要图解见图1。编码人体LF的完整的cDNA用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行修补，然后亚克隆入经AccⅠ消化并补平的pGEM4质粒，从而产生质粒pGEMhLFc。为了去除LF的信号(肽)序列(Signalsequence)和产生一个与α-淀粉酶序列同框架的5′末端，用聚合酶链反应(PCR)扩增pGEMhLFc质粒DNA，从而获得一段252碱基对(bp)的含有HindⅡ/AccⅠ末端的乳铁蛋白片段。使用的寡聚核苷酸引物如下5′末端的寡核苷酸，如序列识别编号No.1中所示(SEQ.ID.No.1)(CTGGGTCGACGTAGGAGAAGGAGTGTTCAGTGGTGC)3′末端的寡核苷酸，如序列识别编号No.2中所示(SEQ.ID.No2)(GCCGTAGACTTCCGCCGCTACAGG).
PCR扩增的片段用HindⅡ和AccⅠ消化，再亚克隆入HindⅡ/AccⅠ消化的pGEMhLFc，产生pGEMhLF。编码启动子，信号肽序列和位于成熟的α-淀粉酶Ⅱ基因起始处的丙氨酸残基的带有Asp718/PvuⅡ末端的681bp的α-淀粉酶片段，是用PCR扩增A.oryzae基因组DNA而得到的。寡聚核苷酸引物如下5′末端的寡核苷酸，如序列识别编号No.3中所示(SEQ.ID.No3)(GAGGTACCGAATTCATGGTGTTTTGATCATTTTAAATTTTTATAT)3′末端的寡核苷酸，如序列识别编号No.4中所示(SEQ.ID.No4)(AGCAGCTGCAGCCAAAGCAGGTGCCGCGACCTGAAGGCCGTACAG).
扩增得到的DNA用Asp 718和PvuⅡ消化，并在克隆到Asp718/HindⅡ消化的pGEMhLF。构成的质粒pGEMAhLF用EcoRⅠ消化，得到的2.8Kb的α-淀粉酶-乳铁蛋白片段亚克隆到pAL3的唯一的EcoRⅠ位点，由此产生pAhLF＊。用人工合成的寡核苷酸提供在pAhLF＊中缺失的乳铁蛋白羧基末端的最后5个密码子(核苷酸2138-2153);同样用人工合成的寡核苷酸提供源自黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基团的3′端不翻译序列中前180bp。构成的质粒pAhLFG用来转化米曲霉(A.oryzae)的pyrG突变菌株。
参见图1，米曲霉(Aspergillusoryzae)表达质粒pAhLFG含有A.oryzaeAMYⅡ基因序列的681bp5′一旁侧序列，该序列包括信号肽序列和成熟的α-淀粉酶的第一个密码子。编码成熟的人体乳铁蛋白的cDNA亚克隆在这些序列的下游同一框架中，从而可以通过在培养基中加入淀粉而产生重组蛋白。黑曲霉(Aspergillusniger)的葡糖淀粉酶的3′端非翻译区域提供转录终止子和多聚腺苷化信号。该质粒还含有粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)pyr4选择标记以及氨苄青霉素抗性基因。
用于表达人体乳铁蛋白的质粒构件pAhLFG，包含一个681的片段，该片段编码米曲霉的α-淀粉酶Ⅱ基因(AMYⅡ)的启动子和分泌信号肽。信号序列还含有一个位于成熟α-淀粉酶蛋白质的起始处的丙氨酸(Ala)密码子，从而形成信号肽序列切除位点，该位点(LeuAlaAla)可被内源的α-淀粉酶肽酶识别。编码成熟的蛋白质的人体乳铁蛋白cDNA被亚克隆入紧挨着AMYⅡ基因的下游的同一框架中，使之处在高效的可用淀粉诱导的启动子的控制下。为了稳定转录的人体LFmRNA，将编码黑曲霉(Aspergillusmiger)的葡糖淀粉酶基因的3′端不翻译区域的180bp的片段连接入多克隆盒的单一BamHⅠ位点，紧挨着人体LFcDNA的下游，从而提供转录终止子和聚腺苷化的信号。该质粒还含有粗糙链孢霉pyr4选择标记。pyr4与A.oryzae的pyrG营养缺陷突变互补，从而可以通过在缺乏尿嘧啶核苷时的生长，将那些被质粒转化的孢子选出。
实施例3基因组DNA的操作A.oryzae DNA，按照Rafmussen，et al.，J.Biol.Chem.，26513767-13775(1990)所描述的方法，从200mg冷冻干燥的菌丝中分离得到。DNA用EcoRⅠ消化，片段大小在0.8%琼脂糖凝胶上分级分开，再转移到硝酸纤维素上。用于Southern印迹分析的硝酸纤维素滤膜的预杂交和杂交在6×SSC，0.1% SDS和0.5%干牛奶中，65℃进行16小时。杂交溶液含有1×107cpm32P-标记的乳铁蛋白cDNA探针(2.1kb)。滤膜在2×SSC，0.5% SDS中，室温下洗涤30分钟，接着在0.5×SSC，0.5%SDS中68℃洗涤两次各30分钟。滤膜经干燥，通过放射自显影术，于-70℃曝光两小时，然后显影。
参见图2，Southern印迹分析是用转化的米曲霉菌株进行的。来自各个转化子和作对照的A07的基因组DNA与放射性标记的hLFcDNA探针(2.1kb)进行杂交。箭头所指的是放射性标记的片段(2.8kb)。该片段是EcoRⅠ消化表达质粒产生的。存在于所有的转化子中(＃1-9)但是在对照的非转化的A07中不存在。噬菌体λ经HindⅢ消化的片段的分子量列于左边。
实施例4Northern印迹分析用购得的RHazolB(BiotecxLaboratories，INC，Houston，TX)，并依照厂商的说明书，将RNA从200mg冰冻干燥的菌丝中分离出来。20μg总RNA在含2.2M甲醛的0.8%琼脂糖凝脂中电泳。接着RNA被转移到硝酸纤维素上并和2.1kb的乳铁蛋白cDNA杂交或者和与α-淀粉酶Ⅱ基因的编码区域相对应的1.8kb的基因组α-淀粉酶片段杂交。探针是用缺口翻译法用32p标记的(比活2×108cpm/μg)。杂交用2×106cpm探针/毫升，在2×SSC，0.5%干牛奶中，65℃进行。
洗涤的方式和前面用于Southern印迹分析的洗涤方式相同。滤膜经干燥，于-70℃曝光2小时，然后放射性自显形。RNA点印迹用硝酸纤维素膜和多用途点印迹体系(manifolddotblotsystem)进行。杂交和洗涤的条件与前面Souethern印迹分析中描述的相同。放射性计数采用β粒子印迹分析仪(betagonblotanalyzer)。
重组乳铁蛋白的产生已经在它的最佳实施例中描述过了。但是，重组产物也可从其他许多来源得到，例如采用真菌来源，比如酸洒酵母或巴斯德毕赤酵母，或者昆虫细胞，比如SF9。
参见图3，列出了转化子相对对照的A07的RNA印迹分析。图3A，对照A07和转化子＃1的RNA(20μg)与放射性标记的人体LFcDNA的杂交的Northern印迹分析。人体LFmRNA(2.3kb)可在转化子＃1中检测到，但在对照未转化的A07中没有。28s和18srRNA的位置列于左边。图3B，对照A07对转化子＃1的RNA(5和10μg)的点印迹，采用放射性标记的α-淀粉酶基因组DNA探针。图3C，对照A07对转化子＃1的RNA(5μg和10μg)的点印迹，采用说明过的放射性标记的人体LFcDNA探针。
进行Northern印迹分析以确定，在我们的表达质粒的调控因子的控制下，乳铁蛋白mRNA是否在A.orzyae中正确且高效地转录。来自转化子＃1和对照的未转化的孢子(1×106/ml)被接种在真菌培养基上，真菌培养基含1.5%的葡萄糖作为碳源。于30℃小摇瓶中培养48小时。培养物经洗涤，再接种于真菌培养基，该培养基含3%的淀粉以诱导人体LFmRNA的转录。24小时后，收获细胞并分离RNA。总RNA(20μg)在含2.2M甲醛的1.0%琼脂糖凝脂上分级，然后印迹在硝化纤维上。
用32P标记的人体LF cDNA(2.0kb)探针检测人体LF mRNA。与放射性标记的人体LFcDNA探针的杂交检测到一条特异的放射性标记的条带，对应于转化子的LF mRNA(2.3kb)的正确位置，但在对照的未转化菌株中却没有(图3A)。用点分析定量分析mRNA表明对照的A07与转化子＃1的内源的α-淀粉酶mRNA的表达水平基本相同(图3B)。此外，在转化子＃1可以看到α-淀粉酶和人体LF mRNA的表达水平大致相等(图3B和3C)。
实施例5重组人体LF的纯化从生长培养基中纯化LF采用CMSephadexC50，基本上按照Stowell，etal.，BilochemJ.，276349-59(1991)所述的方法。层析柱用500ml0.025MTrisHCl，pH7.50，1MNaCl预平衡。在上柱(预平衡的)之前，培养基的pH调整至pH7.4。层析柱用500ml平衡缓冲液洗涤，随后用盐梯度线性从0.1增至1.1MNaCl洗涤。分部洗涤液(共7ml)用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)和银染法分析乳铁蛋白的含量和纯度。含有LF的分部用0.025MTrisHCl，pH7.5/0.1MNaCl透析，并冰冻干燥。
实施例6人体LF的定量重组乳铁蛋白的定量采用ELISA分析，基本上按照Viljaetal.，J.Immunol.Methods，7673-83(1985)所描述的方法。使用非竞争性的抗生物素蛋白-生物素分析，灵敏度可达5ng乳铁蛋白。以从乳奶中分离的人体LF(Sigma公司的)作为标准。生物素化的人体乳铁蛋白Ⅰg得自JacksonImmunoresarchlaboratiories，WestGrove，PA。
实施例7N-末端测序5μg纯化的重组人体LF经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，然后按制造厂商的说明书(AppliedBiosystems.(注公司名称))，将其转移到Problott，一种聚偏二氟乙烯型膜(AppliedBiosystems产品)。人体LF用考马斯亮蓝染色检测，然后脱色。切下人体LF条带，用蒸馏水充分洗涤，风干。人体LF的N-末端的最初十个氨基酸的顺序，用自动的Edman降解程序测出，使用AppliedBiosystems的脉冲-液相测序仪(Model477A)。
参见图4，图4A显示重组人体LF分泌和纯化的银染SDS-聚丙烯酰酸凝胶分析结果。道1含乳奶人体LF作为标准(500ng)。道2和3分别含有来自经诱导的对照A07和转化子＃1的生长培养基样品(40μg)。道4-8含有各从100μl的洗脱分部(分别为＃25，30，35，40和45)，洗脱分部是从转化子＃1的生长培养基，在CM-Sephadex上纯化重组LF时收集到的。分子量标记(BioRad laboratories Richmond，CA)的位置列于左侧。分子量大小以千道尔顿计。图4B显示了与图4A相同的样品的Western免疫印迹分析结果，采用特异的针对人体LF的多克隆抗体，该抗体可用125Ⅰ标记的蛋白质A检测出。图4C显示＃6重组人体LF的N-末端氨基酸序列。重组人体LF从N-末端开始10个残基被测序，并且证实与乳奶人体LF的相同，除了额外的丙氨酸。这个丙氨酸存在于我们的构建中，提供α-淀粉酶信号肽序列的切除位点。
实施例8去糖基化去糖基化用N-糖苷酶F(BoehringerMannheim)进行。含有0.5μg乳铁蛋白的A.oryzae生长培养基，在0.01%SDS的存在下，于100℃变性3分钟。从人奶中得到的标准LF同样处理。样品随后置于冰上5分钟。N-糖苷酶F反应在下列条件进行0.4M磷酸钠，(pH6.8);0.08%Triton;0.1%β-巯基2醇和1单位的酶，37℃保温16小时。用特异性针对人体LF的IgG进行PAGE和Western印迹分析，从而检定消化过的样品在迁移率方面的增加。
参见图5，重组人体LF的特性。图A显示了LF的去糖基化。采用特异性的针对人体LF的多克隆抗体，该抗体能用125I-蛋白质A检测出，进行糖基化和去糖基化的乳铁蛋白的Western印迹分析。第一张图为真乳奶人体LF(500ng)，包括未用N-糖苷酶F处理(-)和用N-糖苷酶F处理的(+)。第二张图为纯化的重组人体LF(500ng)包括未用N-糖苷酶F处理(-)和用N-糖苷酶F处理的(+)。糖基化的人体LF的分子量大小用箭头标出。图B显示了重组LF在结合铁的能力方面的功能测试。图A和图B分别显示了完全相同的真乳奶人体LF和纯化的人体LF样品的59Fe滤膜结合分析，按图中标明的浓度进行。两张图的第一道(lane)都含BSA(5μg)作为阴性对照。
乳铁蛋白含有两个N-乙酰乳糖胺型聚糖，它们通过N-糖苷键连接。为了确定重组LF是否正确糖基化，用N-糖苷酶F处理重组乳铁蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺电泳上分离，转移到硝酸纤维素膜，用针对人体LF的特异性的IgG作为探针检测(图5A)。N-糖苷酶F在糖胺键(glycosylaminelinkage)处的水解产生一个分子量较小的不含糖类的多肽。比较重组LF和从人奶中纯化的LF，可以看出两种蛋白用N-糖苷酶F消化后共同迁移，这意味着重组蛋白具有与天然LF相似的糖基化模式。
乳铁蛋白具有二叶瓣结构，每一个叶瓣具有牢固且可逆地结合一个3Fe3+离子的能力。乳铁蛋白结合铁的特性对于其功能是很关键的。为了测试在A.oryzae中表达和分泌的重组人体LF是否具有与真的LF相似的结合铁的能力，发展了一种59Fe微滤膜结合分析技术。从转化子＃1的生长培养基中分离得到的纯化的人体LF用0.1M柠檬酸(pH2.0)渗析，产生脱辅基-人体LF。来自人奶的天然LF同样处理。加入过量的59Fe(0.2mCi)于两种样品中(样品溶于相同体积的1M碳酸氢盐中)，接着在37℃保温30分钟。样品随后转移到硝酸纤维素膜上，用碳酸氢盐溶液洗涤数次。滤膜经放射性自显影，接着用β粒子印迹分析仪定量分析铁的结合量。如图5B所示，在所有测试的浓度下，重组LF和天然LF的结合铁的水平相似。结果表明，重组人体LF在结合铁的能力方面与天然人体LF没有区别。
参见图6，显示了人体乳铁蛋白的完整的cDNA序列，编码乳铁蛋白的cDNA被用来构建质粒，转化真核细胞和产生乳铁蛋白。
用于本发明的曲霉属菌株是营养缺陷突变型，它们含有缺陷的pyr4基因，因而不能合成乳清酸核苷5′-磷酸(OMP)脱羧酶。该酶是尿嘧啶核苷合成所必需的。因而缺陷型菌株不能在缺乏尿嘧啶核苷的培养基上生长。质粒含有可供选择的标记基因，即编码OMP脱羧酶基因的序列。因此曲霉属菌摄入这种质粒就能因为能在缺乏尿嘧啶核苷的培养基上生长而选择出。用这种质粒转化曲霉属菌，使之可以在缺乏尿嘧啶核苷的培养基上生长。
在本发明的一个实施例中，产生了具生物学活性的重组乳铁蛋白。该方法包括合成一段序列，该序列含有一个可供选择的标记基因，一个启动子，一个转录终止序列和一个接头序列;随后将该序列克隆形成一质粒，并用限制性核酶内切酶消化该质粒;将编码乳铁蛋白的cDNA插入限制性酶切位点;然后用表达乳铁蛋白cDNA的质粒转化真核细胞。
用于本发明方法的可供选择用的标记基因可以是任何一种基因，只要它能将用LFcDNA质粒转化的细胞分离出来。较佳地，可供选择用的标记基因选自pyr4，pyrG，argB，trpC和andS。
用于本发明的启动子可以是任何一种启动子，只要它能允许进行LFcDNA的转录的调节，较佳地，启动子选自乙酵脱氢酶，argB，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
用于本发明的转录终止序列可以是任何一种转录终止序列，只要它能稳定LFmRNA。较佳地，转录终止序列是从α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶或benA衍生而来。
用于本发明方法的接头序列可以是任何一种接头序列，只要它含有一个翻译起始密码子，一个分泌信号和一个限制性酶切位点。较佳地，接头序列从α-淀粉酶，葡糖淀糖酶或乳铁蛋白衍生而来。
用于本发明的真核细胞可以是任何一种真核细胞，只要它能被含有LFcDNA的质粒整合并且表达LFcDNA。较佳地，真核细胞是真菌细胞或昆虫细胞。诸如SF9之类的昆虫细胞能用于本发明方法。更佳地，真菌细胞是酵母细胞。最佳地，用于本发明的真核细胞是曲霉属菌株，例如米曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)，构巢曲霉(A.nidulans)和阿瓦莫利曲霉(A.awamori)。
综上所述，可以看出，此处公开的本发明及实施例能很好地用来实现发明目的，并且获得在本申请中规定的结果。在方法和设备方面能作某些变动，而不违离本发明的精髓，也不超出本发明的范围。应该意识到这些变动是可能的。更深入地，应该意识到，在此申请的任一权利要求中的每一个因素或步骤，都应被理解为包括了所有的等价因素或步骤，这些等价因素或步骤以本质上相同或等价的方式完成本质上相同的结果。本发明的原则，不论以任何形式应用，都可以预期只是更广泛地应用本发明而已。因此，本发明能出色地实现发明目的并获得提及的结果和好处，以及其他内部固有的结果和好处。
权利要求
1.一种产生具生物学活性的重组乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤合成一段序列，该序列含有一个可供选择用的标记基因，一个启动子，一个转录终止序列和一个接头序列；克隆所述的序列，形成一质粒；用限制性核酸内切酶消化所述的质粒；将编码乳铁蛋白的cDNA插入限制性酶切位点；和用所述的表达乳铁蛋白cDNA的质粒转化真核细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可供选择用的标记基因选自pyr 4，pyr G，and S，arg B和trp C。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞表达乳铁蛋白。
4.一种乳铁蛋白，其特征在于，用如权利要求2所述的方法产生。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子选自乙醇脱氢酶，arg B，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和ben A。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转录终止序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶和ben A。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接头序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和乳铁蛋白。
8.一种用于在真核细胞中表达的质粒，其特征在于，含有图6所示的cDNA以及cDNA在真核细胞中表达所必需的调控因子。
9.被称为pAhLFG的质粒。
10.一种含有如权利要求8所述的质粒的真核细胞。
11.如权利要求10所述的真核细胞，其特征在于，所述的真核细胞选自真菌或昆虫细胞。
12.如权利要求11所述的真核细胞，其特征在于，所述的昆虫细胞是SF9。
13.如权利要求11所述的真核细胞，其特征在于，所述的真菌细胞是酵母。
14.如权利要求13所述的真核细胞，其特征在于，所述的酵母细胞是一种曲霉。
15.如权利要求14所述的真核细胞，其特征在于，所述的曲霉是选自米曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)，构巢曲霉(A.nidulans)和阿瓦莫利曲霉(A.awamori)。
16.一种生产乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括在合适的培养基上培养含有重组质粒的转化的真核细胞直至形成乳铁蛋白，所述的质粒含有一质粒载体，该载体带有编码乳铁蛋白的聚脱氧核糖核苷酸;以及分离人体乳铁蛋白。
17.一种重组表达载体，其特征在于，所述的载体含有一个转录单位，该单位由以下一系列组成(1)一个或多个在基因表达中起调控作用的遗传因子;(2)编码人体乳铁蛋白的cDNA;和(3)合适的转录及翻译的起始和终止序列。
18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述的遗传因子是启动子。
19.如权利要求18所述的载体，其特征在于，所述的启动子选自乙醇脱氢酶，arg B，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和benA。
20.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述的转录终止序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶和ben A。
21.一种用如权利要求16所述的方法生产的蛋白质产物。
全文摘要
本发明提供全新的质粒和转染的真核细胞，以及产生这些质粒及转染的真核细胞的方法。新的质粒含有人体乳铁蛋白的cDNA。同时提供了在A.oryzae中产生人体乳铁蛋白的方法。从而，本发明提供了产生重组人体乳铁蛋白的有效而经济的途径。
文档编号C12N15/80GK1079780SQ93105290
公开日1993年12月22日 申请日期1993年4月24日 优先权日1992年4月24日
发明者奥尔拉·莫伊利奥萨·康尼利, 丹尼斯·罗伯特·黑登, 伯特·威廉·奥马利, 格雷戈里·斯图尔特·梅 申请人:贝勒医学院