修饰的人粒细胞巨噬细胞—集落刺激因子基因及其表达的制作方法

专利名称：修饰的人粒细胞巨噬细胞—集落刺激因子基因及其表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“hGM-CSF”)基因和其表达;具体地说涉及一种用于在酵母中大量生产hGM-CSF的修饰的hGM-CSF，一种含该基因的表达载体，一种用所述的表达载体转化的酵母细胞以及用这种酵细胞生产所述的hGM-CSF的方法。
集落刺激因子(CSF)为一族淋巴液(lymphokines)，它诱导远祖(progenitor)细胞分化成成熟血细胞的特殊型细胞。来源于远祖细胞的特殊类型的成熟血细胞取决于现存的CSF的类型。已知的CSF类型包括G-CSF(Nicolaet al.，J.Biol.Chem.2589017-9021(1983))，M-CSF(Standley et al.，J.Biol.Chem.252，4045-4052(1977))，GM-CSF(Burgess et al.，J.Biol.Chem.252 1991-2033(1977))和multi-CSF(Burgess et al.，Biochem.J.185，341-343(1980))。
已知刺激粒细胞-巨噬细胞集落生成的GM-CSF可在各种细胞中产生，这类细胞包括诸如上皮细胞，巨噬细胞和淋巴细胞，并且用于造血细胞的再生，治疗外源性感染和骨髓样白血病。
1985年，用鼠GM-CSF cDNA(Michael et al.，P.N.A.S.82 6250-6254(1984))从HUT-102动物细胞的T-淋巴细胞中分离得到的mRNA制备的全部cDNA克隆中选择得到cDNA克隆编码hGM-CSF。用含有α因子启动子和α因子前导(leader)序列的酵母表达体系，从一种酵母细胞中分泌表达出hGM-CSF。
同时，Nicholas等和Gordon等也分别报道了在COS-1动物细胞中表达hGM-CSF基因的结果(Nicholas et al.，EMBO4，645-653(1985);and Gordon et al，Science 228，810-815(1985))。
另外，GM-CSF包括两N-连锁的糖基化识别位点，即天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸(Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是任何氨基酸)，因此，它可以糖基化形式产生在分子量介于35至100Kd的动物细胞或者酵母细胞内，这是由于异源性的N-糖基化作用的原因。(Joachim et al.，Bil/Technology5，831-834(1987))。
从而，很难纯化动物或酵母细胞中产生的糖基化的GM-CSF;因此产量低。
另外，据报道鼠的GM-CSF基因同人类GM-CSF约50%的核苷酸序列相同，但也包括编码两个N-连锁的糖基化识别位点的密码子，这种基因已在大肠杆菌中表达出来，并具有同天然鼠GM-CSF相同的生物活性，尽管制备出的GM-CSF不被糖基化。(DeLamarter et al.，EMBO4，2575-2581(1985))。
然而，同酵母做为宿主细胞相比，大肠杆菌有不足之处，即在大肠杆菌中制备的hGM-CSF可能会被大肠杆菌天然蛋白如内毒素污染，尽管是纯化后，也有可能。而酵母不产生任何对人体有害的物质，事实证明酵母在食品加工业中已被使用了几个世纪。因此，在酵母中大量产生无-N-糖基化的hGM-CSF是理想。
按照本发明，发现在酵母中可以表达一种修饰后的hGM-CSF基因，以制备具有几乎相同分子量的高产率的hGM-CSF。修饰后的hGM-CSF基因的核苷酸序列被修饰成具有优选酵母(yeast-preferred)的密码子，这种密码子倾向于强烈表达的酵母基因，诸如，甘油醛-3-磷酸(酯)脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因(Bennetzen，J.M.&Hall，B.D.，J.Biol.Chem.257，3026(1982))而不改变其中的氨基酸序列，并通过氨基酸取代灭活N-糖基化位点，同时保持所述的hGM-CSF的生物活性。
因此，本发明的目的在于提供一种有效的修饰后的hGM-CSF基因，它可用于在酵母中大量制备无-N-糖基化的hGM-CSF。
本发明的另一目的在于提供一种含有所述hGM-CSF基因的表达载体，和用表达载体转化的酵母细胞。
本发明的进一步目的在于提供一种用酵母转化株生产无-N-糖基化hGM-CSF的方法。
因此，本发明一方面提供一种具有如

图1-a或图1-b中所示的核苷酸序列的hGM-CSF基因，用这种基因来在酵母中制备大量的无-N-糖基化的hGM-CSF。
另一方面，提供一种含有所述hGM-CSF基因的表达载体，和一种用这种载体转化后的酵母细胞。
本发明的再一方面是提供一种在适当的表达hGM-CSF的培养条件下，在含有培养该酵母转化株的酵母中，大量制备无-N-糖基化的hGM-CSF的方法。
附图简要说明图1-a和1-b表示本发明修饰的hGM-CSF基因的核苷酸序列和来源的氨基酸序列。
图2描述了编码α因子前导序列的核苷酸序列和其来源的氨基酸序列。
图3表示构建含有hGM-CSF基因，以在酵母中表达修饰的hGM-CSF基因的表达载体的设计图(Strategy)。
图4表示在表达hGM-CSF基因的适当条件下，培养酵母转化株的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
本发明所述的修饰的hGM-CSF基因被设计成具有优选酵母的密码子(yeast-preferred codons)，并灭活两个N-连锁的糖基化识别位点，这种基因具有如图1-a或图1-b的核苷酸序列，这一序列可以用DNA合成仪或者通过位点直接致突变(Kunkel，T.A.，P.N.A.S.82 488(1985))，采用已经克隆的hGM-CSF基因来化学合成。
例如，可用M13 mp18-GM-CSF载体(KFCC-10711;See Korean Patent Appln.No.90-21308)制备修饰后的hGM-CSF基因。这种载体含有修饰成具有酵母优选的密码子的hGM-CSF基因(Bennetzen J.M.and Hall B.D.J.of Bio.Chem.257 3026-3031(1982))。采用位点直接致突变技术，用其它氨基酸密码子取代位点上的密码子来灭活hGM-CSF的两个N-连锁糖基化识别位点，随后再用适当的限制性内切酶消化得到的修饰后的hGM-CSF基因，制成修饰后的hGM-CSF。
用于表达所述的hGM-CSF基因的本发明表达载体可以通过使用能在酵母中操作的各种表达体系进行制备。按照本发明优选的实施方案，经含有A/G杂种启动子的载体中克隆修饰后的hGM-CSF(见Korean Patent appln.No.89-20200，本申请人的申请案)制备表达载体，其中，在制备过程中，将GAPDH(甘油醛-3-磷酸(酯)脱氢酶)启动子的“TATA box”，最强的一个酵母启动子，和ADH2(乙醇脱氨酶2)的上游激活序列(the upstream activation sequence，“UAS”)连锁。
优选的是，修饰后的hGM-CSF基因可以同编码一个α因子前导序列的DNA片段相连锁，因为在先所述hGM-CSF前面的α因子前导序列使hGM-CSF被分泌到培养基内，在分泌之前，所述的前导序列(leader sequence)被切断，从而在培养基中可容易地纯化出hGM-CSF。
例如，表达所述的本发明之修饰后的hGM-CSF的表达载体可经下述方法制备合成两个引物AL1和AL2，以制备在酵母中产生的蛋白分泌系统中的编码α因子前导序列的DNA片段。引物AL1被设计成具有限制性内切酶Bst BI识别位点，以连接位于杂种A/G启动子3′-端的Bst BI识别位点;而引物AL2被设计成具有一个限制性内切酶XbaI识别位点;它位于远离从前导序列至同其它DNA片段连接的3′-端的10个碱基对。采用上述的引物AL1和AL2，从全部酵母核酸放大成具有约240个碱基对的α因子前导序列。(见Janet Kurjan and Ira Herskowitz，Cell 30，933-943(1982))。
经过限制性内切酶Bst BI消化后的A/G启动子3′-端区和编码所述的α因子前导序列的5′-端区相连锁，获得一个约1300个碱基对的(片段A)片段，这个片段然后被限制性内切酶BamHI和XbaI消化。
另一方面，被经特别的致突变作用修饰成灭活两个N-糖基化识别位点的M13mp18-GM-CSF用内切酶XbaI和SalI消化，获得一修饰的hGM-CSF基因片段。
含有A/G启动子和α因子前导序列的片段A被限制性内切酶BamHI和pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC 74071)，一种酵母表达载体的SalI的识别位点之间克隆，以制备含有修饰后的hGM-CSF基因。
采用常规方法(Beggs，Nature 275，104(1978);and Hinnen et al.，Proc.Natl.Aca.Sci.U.S.A.75，1929(1978))用本发明的表达载体转化酵母细胞。
按照本发明，得到一个表达载体，它含有如图1-a所示的修饰后的hGM-CSF基因，这个载体被称为LUCK-GM-CSF-1Y，用酿酒酵母菌LUCK-GM-CSF-1Y转化后的酵母菌已于1993年6月24日保藏在中国武汉CCTCC，保藏号为93031。另外在1990年12月12日也保藏在韩国微生物培养保藏机构(Korean Federation of Culture Collectionsof Microorganisms)。其保藏号是KFCC-10716，另外，又于1992年5月20日将该菌株转送到国际专利程序中涉及的微生物保藏的布达佩斯条约认可的保藏，其保藏号是KCCM-10028。
用含有修饰后的hGM-CSF基因的表达载体转化的酵母细胞，在可能表达该基因的条件下培养，这种条件取决于载体和其宿主酵母细胞的特征。在酵母转化株产生的或分泌到培养基内的无-N-糖基化的hGM-CSF可被分离出来，并用常规的各种方法纯化之，例如，细胞破裂法，离心法，渗析法，盐析法，色谱法，凝胶过滤法，电泳法和电洗脱法(electroelution)。
制成的hGM-CSF的生物活性可采用ELISA(enzyme linked immunoad sorbent assay)法进行测定。
修饰后的hGM-CSF的产率为每毫升细胞培养液的上清液中含有约50μg，这比现有技术中已知的产率都高。
以下的实施例用于特别说明本发明，并非限制其范围;实施例中采用的实验方法可见下述的参考例。
除非有特殊说明者除外，下述的固体与固体混合物，液体与液体和固体与液的百分比均为wt/wt，vol/vol，wt/vol。
参考例1 用限制性内切酶消化DNA本例中采用的限制性内切酶和反应缓冲液均从NEB(New England Biolabs.U.S.A.)处购得。
通常在1.5ml的消毒过的Eppendorf试管中进行反应，其反应容积为50-100μl，37℃1至2个小时。随后，65℃加热处理反应混合物15分钟(或者用苯酚提取或者在耐热性内切酶中用乙醇沉淀)以灭活限制性内切酶。
用以限制性内切酶反应的10X反应缓冲液具有下列组份1 10X NEB反应缓冲液1∶100mM bis Tris丙烷-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH7.0;
2 10X NEB反应缓冲液2∶100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mM NaCl，10mM DTT，pH7.0;
3 10X NEB反应缓冲液3∶100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，pH7.0;
4 10X NEB反应缓冲液4∶100mM Tris-乙酸，100mM乙酸锰，500mM乙酸钾，10mM DTT，pH7.0。
参考例2 苯酚提取和乙醇沉淀酶反应完成后，用苯酚提取反应混合物，其目的是为了灭活酶，或回收反应混合物中的DNA，其中，用含有10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA缓冲液再平衡的苯酚。强烈摇动混合相同容积的样品和苯酚来进行苯酚提取;15，000rpm，5分钟离心所述的混合物;将水层转移到一个新的试管内。上述的步骤反复两或三次。
然后，再用相同容积的氯仿溶液(氯仿异戊醇＝24∶1)提取水层，再分离水层;加入0.1(容积)的3M乙酸钠和2.5容积的乙醇;并在-70℃存放30分钟或者放置-20℃下12小时后，以15，000 rpm4℃转速下离心该混合物20分钟，从中回收核酸。
参考例3 连接反应(Ligation Reaction)采用T4DNA连接酶和10x连接反应缓冲液(0.5M Tris-HCl，0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mM ATP，0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA))均从NEB购买的试剂进行DNA连接。反应容积一般为20μl，从10单位的T4连接酶用于连接DNA的粘性末端，而用100单位的T4连接酶来连锁DNAs的钝性末端。
在16℃下，反应5小时，或在4℃下，反应14小时以上;反应结束后，以65℃加热该反应混合物15分钟，以灭活T4DNA连接酶。
参考例4 大肠杆菌的转化用于本发明实施例的大肠杆菌菌株包括E.coli HB101(ATCC 33694)，E.coli W3110(ATCC 27325)，和E.coli JM105(ATCC 47016)。
在100ml的LB液态培养基(1%细菌胰化胨(Bacto typtone)，0.5%细菌酵母提取物(Bacto yeast extract)，0.5% NaCl)中培养宿主细胞，培养温度为37℃，一直到在650nm处达到约0.25-0.5之间的适当的光密度值(O.D)。离心分离细胞培养物，然后用50ml 0.1M MgCl2溶液冲洗。经离心得到的细胞小片(cell pellet)被加入50ml的0.1M CaCl2和0.05M MgCl2的溶液，然后冰浴中静置30分钟。用离心分离细胞，然后将其悬浮在5ml的0.1M CaCl2和0.05M MgCl2溶液中。上述所用的反应剂的材料在使用前要冷却至0℃。
向0.2ml的细胞悬液中加入10μl的连接反应混合物;0℃静置该反应混合物40分钟，然后42℃加热1分钟。向其中加入2.0ml的LB液态培养基;37℃下培养如此处理过的细胞1小时。然后将培养物移入含有LB固体培养基的培养皿(Petri dish)中，这种培养基中含有适当的抗生素，如氨苄青霉素，37℃下过夜培养得到转化株集落。
在用M13载体转化大肠杆菌时，向M13载体DNA(连接基因的)加入100μl的JM105细胞悬液，15μl的10mM异丙基β-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl β-thioglacto-pyranoside)，25μl 4% X-Gal和3ml 2xXYT软固体培养基(1%NaCl，10%酵母提取物，1.6%细菌胰化胨(Bacto tryptone)，0.7%细菌琼脂(Bacto agar)，上述成分均预先加热到培养基38℃。搅拌该混合物，再转入2xYT固体培养基(1% NaCl，1%酵母提取物，1.6%的细菌胰化胨，1.5%的细菌琼脂)，并37℃培养过夜，获得菌斑。
参考例5 寡聚核苷酸的合成用自动固相磷酰胺化学DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.，380B，U.S.A)合成寡聚核苷酸。
用变性的聚丙烯酰胺凝胶(2M 尿素，12%丙烯酰胺和bis丙烯酰胺(29∶1)，50mM Tris，50mM硼酸，1mM EDTA-Na2)电泳和用乙腈和水(50∶50)混合物做为清脱剂的SEP-PAK柱层色谱(Waters Inc.，U.S.A)，纯化合成后的寡聚核苷酸。经测定260nm处的O.D.值来判断其数量。
实施例1hGM-CSF基因的直接位点致突变步骤1引物的构建hGM-CSF(Asn-Leu-Thr and Asn-Glu-Ser)的两个N-连锁糖基化位点位于下述的hGM-CSF的第23至42氨基酸序列，它被编码在下述的相应核苷序列 为了灭活两个N-连锁糖基化位点，制备两个具有下述编码下列氨基酸序列的引物CSF1和CSF2CSF1引物(用于用Ala分别取代两个糖基化位点的Ser和Thr)
CSF2引物(用于用Ala分别取代两个位点的Asn) 步骤2直接位点致突变采用两个引物CSF1和CSF2，进行如下的直接位点致突变在20ml LB液体含30μg/ml的氯霉素的培养基中接种1μl的大肠杆菌CJ236(Cat＃170-3571，Bio-Rad Lab.USA)，并37℃培养6小时。将108M13mp18-CM-CSF M13噬菌体接种到该培养物中，进一步37℃培养过夜。用离心培养物去除细胞片后，向获的上清液内加入100μg的RNaseA;生成物继续反应30分钟。五分之一容积的20%PEG(polyethylene glycol)溶液被加入到沉淀物M13噬菌体中;将沉淀物溶解在100μl TE溶液中(10mM Tris-HCl 1mM EDTA，pH7.5)。用苯酚或苯酚/氯仿提取得到的溶液，然后乙醇沉淀，得含噬菌体单链核酸的水相。向得到的约100ng的核酸混合物，2到3皮摩尔(pmoles)的引物CSF1或CSF2以及1μl的10x缓冲液(200mM Tris-HCl，pH7.4，20mM MgCl2，500mM NaCl)中加入蒸馏水制成10μl容积;将反应混合物在70℃下加热5分钟，然后逐渐冷却至30℃。
向反应混合物中加入1μl的10x缓冲液(每种各5mM(dATP，dCTP，TTP和dGTP，100mM Tris，pH7.4，5mM MgCl2，20mM DTT)和1μl的T4DNA聚合酶(1单位/ml);得到的混合物在冰浴中以下述程序反应5分钟，25℃反应5分钟，37℃反应90分钟。
反应完成后，加入90μl的保持在90℃的TE溶液并将该混合物-20℃下保存。
按本发明参考例4中所述的方法，用2-3μl的生成物混合物转化大肠杆菌JM105。
第二天，选择在YT培养基上出现的白斑，并在YT肉汤培养基(YT broth medium)上培养;从中分离复制的(双链)DNA并用限制性内切酶PstI消化之，然后电泳证实消化的DNA片段的大小。选择含约300bp长度的DNA片段的斑块获得经过引物CSF1和CSF2修饰过的CM-CSF基因的转化株，该转化株被称为mGM-CSF1和mGM-CSF2。
用Sanger's dideoxy method(P.N.A.S.74 5463(1977))测定其核苷序列，其结果见图1-a和图1-b。
本方法使用的试剂，酶和细胞均来自从BIO-RAD Lab购入的直接位点致突变药盒(Cat.＃170-3571)。
实施例2全部酵母核酸的分离在50ml的YEPD培养基(1%酵母提取物，2%蛋白栋，2%葡萄糖)中培养酿酒酵母DCO4(Yeast Genetic Stock Center，University of California，Berkeley，CA，U.S.A)24小时用Dynatec Clinical离心机，以5000rpm离心5分钟沉淀细胞。将沉淀的细胞溶解在10ml的1M山梨糖醇中，然后以5000rpm离心5分钟获得细胞。向沉淀物中加入5ml的SD溶液(1M山梨糖醇，50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5和5μl的1M DTT。均匀混合反应物;再向其中加入1mg的消解酶(zymolase)(Miles Inc.，U.S.A)。得到的混合物在30℃下保留30分钟，再以16，000 x G离心5分钟，获得细胞沉淀物。
生成的细胞沉淀物溶解于5ml的TE缓冲液(1mM Tris，pH7.5，1mM EDTA)，然后加入0.5ml的0.5M EDTA和0.25ml的10%SDS。反应混合物保持在65℃，30分钟，然后向其中加入1ml的5M醋酸钾。生成的混合物在冰浴中反应1小时，再20，000x G离心25分钟分离上清液。乙醇沉淀上清，得全核酸沉淀物。
干燥沉淀物并再将其溶于50ml的TE缓冲液中。向得到的溶液中加入20μl的RNase I(10mg/ml，BRL，U.S.A)，37℃保持该混合物30分钟。
用苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1容积比)提取反应混合物两次;向上清液中加入2个容积的乙醇，沉淀出全部的核酸。
得到的沉淀物溶于0.5ml的TE缓冲液以进一步使用。
实施例3编码α因子前导序列和A/G杂种启动子的DNA用PCR方法合成已知的α因子前导序列，该序列涉及酵母细胞向细胞外分泌蛋白(见Cell30933-943(1982))。
合成具有下列核苷酸序列的引物AL1，以将α因子前导序列连锁在具有限制性内切酶Bst BI识别位点(5’-TTCGAA-3')的杂种A/G启动子的3’-端处。
合成具有下列核苷酸序列的引物AL2至23-mers上，该23mers含有一限制性内切酶XbaI识别位点以及α因子前导序列编码基因的3’-端。
引物AL1Bst BI5' -AGT-TTCGAA-TAAACACACATAAACAAACACC-ATGAGATTTCCTTCAATTT-3'3'-end of GAPDH promoter 5'-end of alpha factor引物AL2:
5' -TCTCTTA-TCTAGA-GATACTTCTT-3'Xba I向1μl的来自实施例2中的酵母DNA中加入10μl的10x Taq缓冲液(100mM Tris，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1%明胶)，10μl的dNTP's(1.25mM的下述各个物质dGTP，dATP，TTP和dCTP)，2μg的引物AL1，2μg的引物AL2，68.5μl的蒸馏水和0.5μl的Ampli Taq DNA聚合酶(5单位/μl);充分混合制成的溶液。在加入50μl的矿物质油之后，以热周期进行25次PCR反应，温度为95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，反应在72℃再继续反应10分钟。用苯酚/氯仿提取PCR产物，乙醇沉淀;生成的沉淀物溶于20μl的TE缓冲液。所得的核酸片段被称之为“片段A”。
实施例4从酵母中分泌GM-CSF的表达载体的制备<步骤1>
同时用限制性内切酶Bst BI和XbaI，在NEB缓冲溶液4中消化经实施例3得到约1μg的片段A，分离称之为“片段A-B/X”的较大片段。
另外，用限制性内切酶XbaI和SalI消化实施例1中得到的含有mGM-CSF1(或mGM-CSF2)的M13mp18 DAN，以分离出约410 bp的片段，其中13bp编码羧基端区的α因子被连锁至mGM-CSF1(或mGM-CSF2)上，这个片段被称之为“片段mGM-CSF1-X/L(或mGM-CSF2-X/L)”<步骤2>
用限制性内切酶PstI和SalI消化质粒pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC 74071)，获得含有甘油醛-3-磷酸酯脱氨酶的终端信号序列的9750bp的片段，该片段称之为“片段PL”。用限制性内切酶PstI和Bst BI来消化所述的质粒，获得称之为“片段PB”的3400bp的片段。
上述的两个片段按下述方法连接向2μl的10x连接缓冲液(60mM Tris，pH7.5，10mM DTT，100mM MgCl2)，2μl的10mM ATP，1单位的T4DNA连接酶和100ng的mGM-CSF1-X/L(或mGM-CSF2-X/L)和经步骤1获得片片A-B/X组成的混合物中加入蒸馏水制成总容积20μl。
反应混合物16℃静置6小时。随后，按参考例4采用该连接混合物进行大肠杆菌HB101(ATCC33694)的转化。在含氨苄青霉素的琼脂板中选择转化株，从此分离含有α因子前导序列的表达载体以及修饰后的hGM-CSF基因。该载体被称之为“LUCK-GM-CSF-1Y(或LUCK-GM-CSF-2Y)。
用Sanger's dedioxy序列测定分离出的载体的核苷酸序列。所有构建上述表达载体的设计图如图3所示。
实施例5用表达载体转化酵母以及经SDS-聚丙烯酰凝胶测定其表达。
根据Hinnen等人(P.N.A.S79，1929(1978))披露的方法，用经实施例4得到的表达载体转化酿酒酵母DC04(Saccharomyces cerevisiae DC04，Yeast Genetic Stock Center，University of California，Berkeley，CA，USA)。
在亮氨酸缺乏的琼脂板(6.7g无氨基酸酵母氮硷(yeast nitrogen base without amino acid)，182g山梨糖醇，2%葡萄糖，0.25%Leu氨基酸补体，20g细菌琼脂)选择转化株，并将其接种至20ml的YEPD培养基(2%蛋白栋，1%酵母提取物，2%葡萄糖)，30℃培养3天。
当650nm处O.D值达约25时，取1ml的培养物，离心去除酵母细胞。向培养基中加入250μl5倍浓缩蛋白沉淀溶液(50%三氯乙酸和2%脱氧胆酸);制成的混合物在冰浴中静置10分钟，以20，000x G离心10分钟。用1ml丙酮洗脱得到的沉淀物，再20，000x G离心10分钟，然后再用丙酮洗两次。沉淀物溶于20μl的TE缓冲液中(10mM Tris-Cl，pH7.5，1mlEDTA);将得到的混合物倒入10μl的3倍浓缩的Laemmli样品缓冲液(Laemmli D.K.，Nature 227，680(1970))，100℃沸煮3分钟。制成的混合物用15%SDD.聚丙酰胺凝胶电泳测定，其结果见附图4。
在图4中，泳道1示出标准蛋白大小的标记(Bio-Rad Lab.USA)，它表示分子量从上至下分别为43，000;29，000;18，400;14，300;6，200和3，000道尔顿，泳道2示出含表达载体LUCK-GM-CSF-1Y的酵母细胞培养物的培养基;泳道3示出含表达载体LUCK-GM-CSF-2Y的酵母细胞培养物的培养基;泳道4示出含表达载体LUCK-GM-CSF-1Y的酵母细胞提取物;泳道5表示含表达载体LUCK-GM-CSF-2Y的酵母细胞的提取物。
其泳道2和3的结果中显示上一条暗黑色的对应于分子量为14，000的条带，经证实，这是在酵母细胞中表达并分泌到培养基(每毫升培养基约50μghGM-CSF)中的，具有几乎相同分子量的hGM-CSF蛋白。从泳道4和5中得出的结果显示，证明在酵母细胞中还保留有少量产生的hGM-CSF蛋白。
因此，本发明的GM-CSF蛋白可被表达，以及分泌出酵母细胞，比原有的hGM-CSF基因具有更高的产率。
进一步用ELISA方法证实从酵母中分泌出的hGM-CSF的生物活性。
在阐述本发明涉及的上述实施方案的同时，应当认识到对于本领域技术人员可以对其进行各种改进和改变，但也是落于本发明权利要求的范围之内。
权利要求
1.一种人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，它的核苷酸序列被修饰成具有优选酵母菌的密码子以及具有灭活两个N-连锁的糖基化识别位点，该位点位于人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子中，所述基因具有如下核苷酸序列mGM-CSF1·· 30 · ·5′-ATGGCTCCAGCTAGATCTCCATCTCCATCTACTCAACCTTGGGAACACGTTAAC60GCTATC·· 90 ··CAAGAAGCTAGAAGATTGTTGAACCTAGCAAGAGACACTGCTGCTGAAATGAAC120GAAGCT·· 150 ··GTTGAAGTTATCTCTGAAATGTTCGACTTGCAAGAACCAACTTGTTTGCAAACT180AGATTG·· 210 ··GAGCTCTATAAGCAAGGTTTGAGAGGTTCATTGACTAAGTTGAAGGGTCCATTG240ACTATG·· 270 ··ATGGCTTCTCACTACAAGCAACACTGTCCACCAACTCCAGAAACTTCTTGTGCT300ACTCAA·· 330 ··ATCATTACTTTCGAATCTTTCAAGGAAAACCTAAAAGACTTCTTGTTGGTTATT360CCATTC·· 390GACTGTTGGGAACCAGTTCAAGAATAATAG-3′或mGM-CSF2·· 30 · ·5′-ATGGCTCCAGCTAGATCTCCATCTCCATCTACTCAACCTTGGGAACACGTTAAC60GCTATC·· 90 ··CAAGAAGCTAGAAGATTGTTGGCCCTAGCAAGAGACACTGCTGCTGAAATGGCC120GAAGCT·· 150 ··GTTGAAGTTATCTCTGAAATGTTCGACTTGCAAGAACCAACTTGTTTGCAAACT180AGATTG·· 210 ··GAGCTCTATAAGCAAGGTTTGAGAGGTTCATTGACTAAGTTGAAGGGTCCATTG240ACTATG·· 270 ··ATGGCTTCTCACTACAAGCAACACTGTCCACCAACTCCAGAAACTTCTTGTGCT300ACTCAA·· 330 ··ATCATTACTTTCGAATCTTTCAAGGAAAACCTAAAAGACTTCTTGTTGGTTATT360CCATTC·· 390GACTGTTGGGAACCAGTTCAAGAATAATAG-3′
2.一种含有如权利要求1中所述的可在酵母细胞中操作的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，它的启动子为含有GAPDH的TATA box启动子和ADH2启动子的UAS序列的杂种启动子。
4.如权利要求3所述的表达载体，该表达载体是LUCK-GM-CSF1Y或者LUCK-GM-CSF-2Y。
5.一种用权利要求3或4所述的表达载体转化过的酵母细胞。
6.如权利要求5所述的酵母细胞，该酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LUCK-GM-CSF-1Y(CCTCC No.930031)或者LUCK-GM-CSF-2Y。
7.一种人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生产方法，包括培养如权利要求5或6所述的酵母细胞。
全文摘要
本发明涉及一种修饰过的人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基团，它用于在酵母中大量生产hGM-CSF；含所述的基因的表达载体；用所述载体转化的酵母细胞以及用这种酵母细胞生产hGM-CSF的方法。修饰后的hGM-CSF基因具有优选酵母的密码子并能灭活存在于天然GM-CSF中的两个N-连锁糖基化识别位点。
文档编号C12N15/27GK1097218SQ9310768
公开日1995年1月11日 申请日期1993年7月7日 优先权日1993年7月7日
发明者曹重明, 朴荣祐 申请人:株式会社乐喜