专利名称：新型组织型纤溶酶原激活剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程药物，特别是涉及基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。
基因工程重组的组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator简称t-PA，下同)，可作为溶血栓药物，但有如下缺陷1、在血中半衰期甚短;2、血浆中存在t-PA的天然抑制剂-I型纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1，简称PAI-1，下同)可快速抑制t-PA活性。因此，延长t-PA半衰期、引入PAI-1抗性及进一步提高特异性活性是t-PA改构研究的重要内容。
延长t-PA半衰期的改构研究近年来主要集中在t-PA的F区，F区的去除可显著延长半衰期，但F区是介导t-PA与血栓基质纤维蛋白特异亲和的区域，F区的去除也使t-PA丧失了溶栓特异性。1990年Ahern等提出t-PA的F区中F区与E区的连接序列(42-49位氨基酸残基)改变可使t-PA半衰期延长，而对其与纤维蛋白的亲和力的影响较小，但未报道影响程序(Ahern TJ，et al.J Biol Chem 1990;2655540)。1992年有人证实P47G/K49N在中国仓鼠血中半衰期延长了10倍，但与纤维蛋白亲和力大大下降(Nelles L，Li X.-K.Thromb Haemosta(in press))。
已有人证明，去除t-PA结构中296-302位7个氨基酸残基可使t-PA抗其抑制剂PAI-1的能力大大提高(Madison EL，et al.Nature1989;339，721 X.-K.Li，et al.Blood 1992;79417)。有人研究证明，消除t-PA K1、K2区糖基化位点可提高其特异性活性、延长其半衰期(Haigwood NL，et al.Protein Engineering 1989;2611 Hotchkiss A，et al.Thromb Haemostas 1988;60255)。
目前尚未见半衰期延长、特异性活性提高、抗PAI-1等多种特性均有改善的t-PA突变体的报道。t-PA F与E区连接序列的改变虽可显著延长t-PA半衰期，但同时与纤维蛋白亲和力亦有一定程度损失。
本发明的目的是构建出半衰期延长、抗PAI-1、特异活性提高，同时与纤维蛋白亲和力不受损害的t-PA组合突变体。
本发明的主要内容是1、以纤粘蛋白I型F区间的连接序列及人凝血因子Ⅻ间I型F区间的连接序列作为t-PAF与E区间连接序列(44-50位的HSVPVKS)替换物，用DNA定位突变技术构建出置换突变体FR，以期在不影响t-PA与纤维蛋白亲和力的同时延长半衰期。
2、用DNA定点突变技术去除t-PAI-1结合位点(K296-G302)，构建出PAI-1结合位点缺失突变体△(296-302)，作为抗PAI-1的手段。
3、将K1、K2区的糖基化位点Asn117和Asn184同时突变为Gln117和Gln184，构建去糖基化的突变体N117Q/N184Q，以提高t-PA的特异活性。
4、为了将内容1、2、3、中的三个单突变体的特性融于一身，用分子剪裁技术进一步构建了三者的组合突变体-FR/N117Q/N184Q/△(296-302)。
本发明得到了能够显著延长半衰期、提高特异活性、具有PAI-1抗性同时与纤维蛋白亲和力不受影响的组合突变体，从而得到了多种特性均有改善的新型t-PA溶栓剂候选株。
图1的说明1、图1为野生t-PA一级结构及功能区示意图。
t-PA是由F区(1-50)、E区(51-87)、K1区(88-176)、K2区(177-275)及蛋白酶功能区P(276-527)组成。
2、本发明所构建的t-PA组合突变体-FR/N117Q/N184Q/△(296-302)与野生t-PA比有如下改变A t-PAF区与E区的连接序列(H44-S50)被置换成人纤粘蛋白I型F区间的连接序列及人凝血因子Ⅻ间I型F区间的连接序列，如ESKPEAEE，在不影响与纤维蛋白亲和力的同时延长半衰期。
B K1及K2区中的糖基化位点N117及N184同时被突变为Q117及Q184，以消除糖基化位点，增强特异活性。
C 缺失了296-302位共7个氨基酸残基，以引入PAI-1抗性。
实施例利用定位突变技术及分子剪裁技术等构建了t-PA F与E区连接序列H44SVPVKS50突变成纤粘蛋白I型F区间的连接序列ESKPEAEE的置换突变体FR1、PAI-1结合位点K296-G302 7个氨基酸残基缺失的突变体△(296-302)、K1、K2区去糖基化的突变体N117Q/N184Q。在此基础上构建了三者的组合突变体FR1/N117Q/N184Q/△(296-302)。将此组合突变体的cDNA序列组入了真核细胞表达载体，并在COS-7细胞及CHO细胞中成功地进行了表达，并对表达出的突变体蛋白的特性进行了研究。
结果如下1、以大白鼠为药代动力学模型，经尾静脉注入5000IU的此组合突变体，在给药0-30分钟内7次从颈静脉插管中抽取血样，以间接显色法测血中t-PA变化，并绘制药一时曲线，从曲线中得知，此突变体的半衰期为28.0分钟(3只动物的结果)。同样方法测得的野生t-PA半衰期为1.7分钟(2只动物的结果)。可见半衰期延长了15倍。
2、此突变体的酶活性(12IU/ml)不被PAI-1(12AU/ml)抑制，而等量的野生t-PA活性却被PAI-1完全抑制，可见此组合突变体获得了PAI-1抗性。
3、以纤维蛋白琼脂糖平板法测得的t-PA活性值(IU)与用ELISA法测得含量值(μg)的比值(IU/μg)作为t-PA特异活性值，三次测定结果平均值为野生t-PA 250IU/μg，组合突变体364IU/μg，可见组合突变体的特异活性提高了46%。
3、根据文献Hitoshi Yahara，et al.Thrombosis Haemostasis 1992;68672提供的方法测定了此组合突变体及野生t-PA与纤维蛋白的亲和力，此组合突变体与纤维蛋白的亲和力略高于野生t-PA。
根据以上结果可以认为t-PA突变体FR1/N117Q/N184Q/△(296-302)显著延长了半衰期、具有PAI-1抗性、特异活性提高了46%，同时与纤维蛋白亲和力未受影响且略有升高，是一株新型t-PA溶栓剂候选株。
权利要求
1.一种基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。其特征是将天然组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator即t-PA)的F与E区的连接序列为44-50位的HSVPVKS共7个氨基酸残基置换、改变t-PA结构中296-302位7个氨基酸残基、并将其结构中K1、K2区去糖基化。
2.根据权利要求1所述的组织型纤溶酶原激活剂。其特征是F与E区的连接序列为44-50位的HSVPVKS共7个氨基酸残基被下述替换物所置换，其序列为ESKPEAEE;TIANR;KPIAEK;TSRNR;ERHTSVQT;YAYSQLRDQ;DPVDQ;QPLQTYPSS;DSSRW;DPHEAT;DNCRRPG;QRLASQA。
全文摘要
本发明构建了一种基因工程重组的新型组织型纤溶酶原激活剂。将天然组织型纤溶酶原激活剂(tis-sue plasminogen activator即t-PA)的F与E区的连接序列为44—50位的HSVPVKS共7个氨基酸残基置换、去除t-PA结构中296—302位7个氨基酸残基，并将其结构中K1、K2区去糖基化。得到了能够显著延长半衰期、提高特异活性、具有PAI-1抗性，同时与纤维蛋白亲和力不受影响的组合突变体，以得到多种特性均有改善的新型t-PA溶栓剂候选株。
文档编号C12N15/58GK1082111SQ9310923
公开日1994年2月16日 申请日期1993年8月6日 优先权日1993年8月6日
发明者刘士辉, 黄培堂, 黄翠芬 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所