专利名称：一种人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及人肿瘤坏死因子衍生物及其生物工程制备方法。人肿瘤坏死因子α是一种具有生物活性的细胞毒蛋白，它能直接引起某些体外培养的肿瘤细胞发生裂解并抑制增殖，使体内一些肿瘤发生出血性坏死。国外自1985年起已开始用生物工程技术获得的重组人肿瘤坏死因子α，rhTNFα治疗癌症病人，每名癌症病人治疗一个疗程一般需要毫克级的hTNFα。纯度95%以上，比活为2×107单位/毫克蛋白质的rhTNFα售价为每10微克250美元，一个患者一个疗程需耗资几千或上万美元，代价十分昂贵。另外hTNFα是一种对酸敏感的可溶性蛋白质，它在血浆中的半衰期不到30分钟，在临床应用中发现在疗效有效的剂量范围内会引起毒副反应，从下表中可见hTNFα在治疗多种疾病时产生的利弊治疗效果 毒副作用1、抗肿瘤免疫监测作用 1、介导内毒素休克2、抗寄生虫和病毒 2、打乱代谢而导致恶形质3、抗细菌 3、活化某些病毒(如HIV)4、嗜中性细胞、巨噬细胞和 4、关节炎炎症内皮细胞中激活炎症活性 5、与器官移植引起的疾病有关5、预防自体免疫糖尿病 6、软骨中蛋白糖苷的再吸收由此看来，减低毒性，提高有效活性，制备一种高效低毒的hTNFα是人们寻求的目标。
本发明的目的是用一种成本不高的基因工程方法制备hTNFαDa，一种高效低毒的hTNFαDa。
人肿瘤坏死因子α衍生物有多种，本发明的一种命名为a(hTNFαDa，humantumor necrosis factor α derivative a)，它是以人肿瘤坏死因子α为原型，根据分子设计和剪裁改建成的一种新型蛋白质分子。本发明的hTNFαDa的结构与人肿瘤坏死因子α即hTNFα比较，有如下的特点N端缺失7个氨基酸;C端第8、9、10位氨基酸由原来hTNFα的Pro-Ser-Asp改为Arg-Lys-Arg;第157位氨基酸由原来Leu改为Phe。这种基因工程产物，是自然界原先不存在的，可作为抗肿瘤药物。
hTNFα活性状态是三聚体，单体由157个氨基酸组成，分子量是17，356道尔顿。hTNFα的N端处于游离状态，N端即使减少8个氨基酸，也不会丧失生物学活性。但抗N端15个氨基酸的抗体能中和hTNFα的活性。C端与三聚体的形成有关，hTNFα完整的C端序列对保持其活性是不可少的，与细胞毒活性直接有关的是第29～35位氨基酸，第84～91位氨基酸和第143～148位氨基酸。本发明考虑到hTNFα作为药物引起的毒副反应，改造了hTNFα分子结构，以TNFα为原型构建了hTNFαDa分子结构，经生物学性质测定，说明hTNFαDa是符合预期目标的衍生物。
hTNFαDa N端12个氨基酸序列经测定，Net，Arg，Lys，Arg，Lys，Pro，Val，His，Val，Val，Ala完全符合原设计的结构。
hTNFαDa的编码序列经测定，也完全符合原设计的DNA序列。
hTNFα与hTNFαDa编码序列比较如下
hTNF α 5' CAT ATG GTT GGT TCT TCT TCT CGT ACC CCG AGT GACPro Ser AsphTNF α Da 5' CAT ATG CGC AAA CGTdeletion Arg Lys ArghTNF α AAG CCG GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAhTNF α Da AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAhTNF α TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG TGA GGA GGA CGAleuhTNF α Da TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC TGA 3'phehTNF α Da TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC TGA 3'phehTNF α ACA TCC AAC CTT 3'SDS-PAGE电泳结果，显示hTNFαDa的分子量小于hTNFα。人肿瘤坏死因子α衍生物a的制备方法，hTNFαDa是以人肿瘤坏死因子hTNFα为原型，根据分子设计和剪裁改建成的一种新型蛋白质分子，这种衍生物是一种基因工程产物，它的制备方法包括从人基因组文库中分离肿瘤坏死因子α基因，构建hTNFαcDNA，hTNFαDa一级结构设计，PCR引物设计，表达载体的构建，表达发酵及分离纯化。从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，以此为模板，设计PCR引物，体外扩增hTNFαDa cDNA;PCR引物设计为5′GCC ATA TGC GCA AAC GTA AGC CTG TAG CCC ATG TTG TAG CAA ACC CTCA3′5′CCG GAA TTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC AAA GTA3′将构建成的hTNFαDa cDNA插入表达载体pJLA503在大肠杆菌中表达发酵及蛋白的分离纯化。
本发明方法制备的hTNFα衍生物是hTNFα衍生物的一种，本发明中命名其为衍生物a，hTNFαDa。扩增模板是本发明自行构建的表达hTNFα的重组质粒pRL hTNF(5.5kb)，该质粒中插入的hTNFαcDNA是从人基因组文库中分子克隆hTNFα基因，切出第4外显子的大部分序列，再接上人工合成的寡聚核苷酸片断，组成能编码成熟的hTNFα的cDNA。人工合成的0.13kb寡聚核苷酸序列如下1↓5'A GCT TTC CAT ATG GTT GGT TCT TCT TCT CGT ACC CCG AGT GACAAG GTA TAC CAA GCA AGA AGA AGA GCA TGG GGC TCA CTG↑6 NdeI ↑5HindIII2↓AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAGTTC GGA CAT CGG GTA CAA CAT CGT TTG GGA GTT CGA CTC CCC GTC↑43↓CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCT GCA-3'GAG GTC ACC GAC TTG GCG GCC CGG TTA CGG GAG GAG CGBg1I ↑PstI该hTNFαcDNA作为PCR扩增TNFα衍生物acDNA的模板。PCR扩增引物设计如前所述。扩增后的hTNFαDa c DNA插入表达载体pJLA503后在大肠杆菌中表达。
hTNFαDa工程菌30℃过夜培养物按1∶100接种在含氨苄青霉素培养液内，25～30℃振荡培养2～3小时，至菌体浊度为klette读数90时，30秒～1分钟时间内迅速升温至40～42℃，继续培养3～4小时。然后，4℃，4000～6000rpm离心收集菌体。菌体悬浮于10倍体积的菌体破碎液，超声破碎后离心，取上清液保存备用。也可以制成40～60%的饱和硫酸铵沉淀，供分离纯化hTNFαDa用。
本发明制得的hTNFαDa毒副反应减小，而治疗活性大大提高，虽然有报导几种具有较高体外抗肿瘤活性的新型hTNFα分子是N端缺失4个或7个氨基酸，第10位氨基酸Asp改为Arg或第157位Leu改为Phe，但是它们的抗肿瘤活性升高幅度不大。本发明制备的hTNFαDa，经一系列测试表明是一种高效低毒的抗肿瘤药物，下面列出一些测试结果细胞毒活性测定小鼠L929细胞株，是已转化的小鼠成纤维细胞素系，用作测活标准，以杀死50%细胞时所用TNF的量定为一个活性单位，则它们的比活性(单位/毫克蛋白质)hTNFα为1.6×107，hTNFαDa为5.0×1010。
hTNFαDa的急性毒性试验，小鼠半致死剂量的测定结果按给药单位计算 按给药重量计算单位/kg体重 毫克/kg体重hTNFα1.4×1070.91hTNFαDa1.9×10100.38hTNFαDa引起肿瘤出血性坏死测试结果，以小鼠为试验材料处理条件 动物数(只) 剂量(mg/小鼠) 坏死情况生理盐水 10 0. +++ ++ + -0 0 1 9hTNF α 10 0.25 0 7 2 1hTNF αDa 10 0.25 4 6 0 0本发明设计的PCR引物改造了hTNFα的一级结构，制得了高效低毒的hTNFαDa。制备过程中所用的PCR扩增模板是半合成人TNFαcDNA的制备方法，即利用一部分天然的编码序列，再接上一部分人工合成的核苷酸序列，这比全合成cDNA省时省钱，避免寡聚核苷酸合成和拼接时容易出现的差错，且又考虑到目的蛋白cDNA在细菌中表达所必需的SD区序列、表达载体与cDNA的拼接、编码目的蛋白头几个氨基酸的密码子改变同最终产量密切有关等几个因素。
本发明的hTNFαDa按每毫升发酵液的L929细胞毒单位数、菌体超声液的比活性，以及每毫升发酵液估算可得的hTNF蛋白量，都不低于其它方法，主要得助于我们选用的表达载体，因为该载体由PR，PL串联启动子起动，PRPL启动子效率高于Trp，PL。
用高压液相色谱仪分离纯化hTNFαDa，冻干后得白色粉剂，测定这种hTNFαDa的氨基端的12个氨基酸序列，与原设计完全相同，纯度达95%。
hTNFαDa可通过直接的细胞毒性抑制细胞分裂，使肿瘤血管凝结导致坏死，并能激活宿主的免疫反应以达到治疗肿瘤的目的。它也可用于治疗由细菌、病毒和寄生虫引起的一些疾病。
图1是构建hTNFαDa的过程示意图。
实施例从人基因组文库中分离淋巴毒素基因同时，克隆肿瘤坏死因子(TNFα)，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，以hTNFαcDNA为模板，用前述设计的PCR引物作体外扩增后，在大肠杆菌表达载体中表达。
工程菌发酵试验，保种菌株是大肠杆菌OH5(E、COLiOH5)，表达菌株是大肠杆菌JNO5(E、COLiJN103)hTNFαDa工程菌30℃过夜培养物按1∶100接种在含氨苄青霉素50μg/ml的31LB培养液内，用51罐美New Brunswich公司)发酵，30℃培养至菌体浊度为Klette读数90(绿色滤光片)时，10min内升温至42℃，继续培养3-4h，4℃，6000r/min离心收集菌体，-70℃储存备用，菌体悬浮于10倍体积的菌体破碎液(0.2mol/L·NaCl，0.1mol/LTris，50mmol/LEDTApH8)。超声破碎后4℃，12000r/min离心5min，上清液用于L929细胞毒活性测定，或者超声上清液加固体硫酸铵至40%饱和度，置冰上1小时，10000rpm离心15分钟。取上清液加固体硫酸铵至60%饱和度，置冰上1小时，10000rpm离心，留沉淀。4℃透析浓缩，柱层析分离。
产品经SDS-PAGE薄层扫描纯度测定，活性测定，蛋白质定量测定，hTNFαDa急性毒性动物试验及hTNFαDa引起肿瘤出血性坏死试验。
权利要求
1.一种人肿瘤坏死因子α衍生物a(hTNF α Da)的抗肿瘤药，是改变人肿瘤坏死因子α一级结构得到的一种药物，与人肿瘤坏死因子hTNF α比较，hTNF α Da的特征在于(1)N端缺失7个氨基酸；(2)C端第8、9、10位氨基酸由原来的Pro-Ser-Asp改为Arg-Lys-Arg；(3)第157位氨基酸由原来的Leu改为Phe；(4)hTNF α Da共150个氨基酸。
2.人肿瘤坏死因子α衍生物a的制备方法，包括从人基因文库中分离肿瘤坏死因子α基因、PCR引物设计、定点诱变表达载体的构建和表达、发酵及分离纯化，其特征在于(1)从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，作PCR扩增TNFα衍生物acDNA的模板;(2)PCR引物设计为5′GCC ATA TGC GCA AAC GTA AGC CTG TAG CCC ATG TTG TAG CAA ACC CTCA3′5′CCG GAA TTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC AAA GTA3′(3)将构建成的hTNFαDa cDNA插入表达载体pJLA503在大肠杆菌中表达;(4)hTNFαDa工程菌的发酵，产物的分离纯化。
3.根据权利要求1所述的hTNFαDa的制备方法，其特征在于工程菌发酵、分离纯化更佳条件(1)工程菌单菌落活化后接种TB培养液，25～30℃振荡培养2～3小时，30秒～1分钟内升温至40～42℃，继续培养3～4小时，然后4000～6000rpm离心，超声破菌;(2)取上清液加固体硫酸铵40～60%(重量百分比)，离心，留沉淀。
全文摘要
一种人肿瘤坏死因子α衍生物a及其制备方法。人肿瘤坏死因子α即hTNFα来源于人体内，难以获得足够数量的天然来源TNF供临床使用，基因工程的hTNFα其价格也十分昂贵，并有较大毒副反应，影响疗效。本发明的hTNFαDa是以hTNFα为原型进行结构改造而获得的基因工程产物。原型hTNFα基因是从人基因文库中与淋巴毒素基因同时克隆的。将该基因的第4外显子切出一部分与人工合成的寡聚核苷酸连接成hTNFαcDNA，设计PCR引物，以hTNFαcDNA为模板体外扩增获hTNFαDa cDNA转入大肠杆菌中表达。本发明的hTNFαDa，制备方法和成本合理，表达高效，产品高效低毒。
文档编号C12N15/28GK1100464SQ9411217
公开日1995年3月22日 申请日期1994年5月19日 优先权日1994年5月19日
发明者赵寿元, 李昌本, 蔡武城, 常金丽 申请人:复旦大学