专利名称：通过遗传修饰的细菌定居于粘膜而防止病毒感染的方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及对通常无害地定居在粘膜表面上的细菌群进行的操作，以干扰感染过程。具体地，本发明提供了对非致病性菌群细菌的修饰，从而赋予它们结合于特异的病毒(并使病毒失去功能)的能力。尽管所公开的描述了一种防止病毒(它通过粘膜表面而感染)感染的方法，但是熟练技术人员会认识到，本发明可应用于任何一种在粘膜表面感染的病原体，其中包括细菌、真菌和寄生虫。
2.信息公开在20多年来，用细菌在胞质中表达异源蛋白质已经被广泛实践。然而，表达特异性地位于细菌外表面上异源蛋白质还仅仅是在过去几年中才做到。用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的表面表达系统是已知的，如美国专利5,348,867和WO93/18163。
发明概述本发明提供了一种防止动物免受病毒感染的方法，它包括用一定量足以定居于粘膜表面并保护动物免受病毒感染的转化细菌与宿主的粘膜表面接触，该细菌已经用遗传物质进行转化过从而赋予细菌结合于病毒的能力。更具体地，本发明提供了转化的细菌，该细菌可用作为遗传物质产物的天然存在的受体、受体结合域或抗病毒抗体来结合病毒或其他病原体。
优选的宿主是人。在天然存在的受体是已知的场合下，可用编码这些受体的基因来转化细菌。当特异性的病毒/宿主受体是未知的，这可用编码抗病毒抗体或其片段的基因来转化细菌。例如，对于被人类白细胞抗原(HLADR)所覆盖的逆转录病毒，可使用针对这些抗原的抗体。因此，使用能结合于这些病毒各自衣壳上的保守决定簇的细菌，本发明可用于对付轮状病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒、人免疫缺陷病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、副流感病毒和单纯疱疹病毒。
细菌还可被修饰以表达特异性的碳水化合物分子，该分子位于其正常表面蛋白质上，作为病毒的受体。例如，细菌可遗传物质进行转化，从而造成产生额外的唾液酸，这允许细菌结合于流感病毒。
细菌还可被修饰，以形成细菌膜和病毒包膜(如果存在)的融合。一个例子是，转化细菌使其能够与结合的病毒颗粒通过融合结构域而融合，其中该融合结构域被改造作为病毒结合多肽的一部分。
定居于粘膜是本发明的关键因素，较佳的是转化的细菌被赋予足够的选择优势，从而使其能够与已有的细菌有效地竞争，使该转化的细菌能够成功地无定限地定居并存活于选定的粘膜表面上。一种选择优势是，更强的通过异源蛋白结构域而粘附于宿主粘膜表面上的能力，其中该结构域结合选定的粘膜表面上的决定簇。通过使用对抗生素有抗性的转化细菌并同时施用抗生素和转化细菌，也可以赋予选择优势。其他优势包括施用降解粘膜生物膜的产物。这样的产物包括DNA酶、肽酶和透明质酸酶。
优选的粘膜表面是在下列器官中的鼻咽、口咽、食道、小肠、大肠、直肠、阴道和阴茎。
转化的细菌可通过使用液体溶液、泡沫、栓剂、海绵或胶囊而被施用于粘膜表面。当目标粘膜层是在阴道中时，可转化细菌以针对性传播病原体如(但并不限于)HIV、HPV、HSV、淋病、梅毒和衣原体。非杀菌性杀精子剂可以与细菌一起施用。
本发明还包括一种用转化的细菌来防止病毒性病原体从受感染个体传播给其他个体的方法，它包括施用一定量的、足以定居于受感染个体的粘膜表面上的转化细菌，其中该细菌可与存在于受感染宿主中的感染性病毒颗粒结合并使其失活。修饰和靶目标如上所述。
细菌的转化可以在体外或体内进行，通过将遗传载体直接引入居住的微生物群落细菌中，而用所需的外来遗传物质转化宿主的定居粘膜细菌群，其中该载体赋予细菌与宿主病原体结合并使其失活的能力，从而保护宿主免受病毒病原体的感染。载体的例子包括复制缺陷型噬菌体。
本发明还包括通过添加能够结合特定病毒并不可逆地使其灭活的工程菌，而使可疑水源中感染性的病毒颗粒灭活的方法。
除了这些方法，本发明还包括物质组合物，它包括一定量的足以与靶病毒结合并使其失活的细菌，该细菌因其能定居于宿主的粘膜而被选择，并且被转化从而表达对位于细胞表面上的靶病毒特异的宿主受体或抗体。优选的组合物是如上所述用于各种方法的。
附图简述
图1显示了ViroShieldTM概念。病毒一般通过结合于宿主细胞表面上表达的特异性受体而进入宿主。在位于粘膜上的细菌表面表达相同的受体会导致大多数病毒结合于细菌，在此处它们在功能上被失活，从而防止感染下面的宿主细胞。
详细描述
A.引言大多数病毒通过粘膜感染。该过程的总结可在Murray，P.R.等人，医学微生物学(Medical Microbiology)，第二版(以下简称Murray等人，1994)。通过已被转化从而可以与病毒结合并使其失活的细菌的定居，而在粘膜表面形成封阻病毒的细菌群是特别有利的。定居于粘膜层是很普通的事件。大多数粘膜一般都充满着细菌，在菌群变化成致病的细菌感染然后施用抗生素都是很常见的事件。在粘膜表面上的发生菌群改变的常规特性是本发明的一个重要的有利因素。下面的论述提供了提高转化细菌在粘膜层上定居的能力的手段。
B.通用方法用聚合酶链反应(PCR)扩增遗传序列、切割并剪接DNA入质粒、用质粒转化细菌、以及分析抗体的结合等技术都是众所周知的生物技术方法，这些方法的细节可在许多文献中找到，如Protocols in Molecular Biology，Molecular Biology ofthe Cell和Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York 1989。
C.病毒靶目标下面是病毒靶目标的清单。根据它们各自进入的器官而被分类。
1.上呼吸道(URT)。
大量病毒或者通过空气飞沫或者通过直接接触而感染鼻咽和口咽。其中包括人鼻病毒(HRV)、腺病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒。
2.胃肠(GI)道这些病毒包括轮状病毒、诺沃克病毒(Norwalk agent)、甲肝(HAV)、脊髓灰质炎病毒和其他的小核糖核酸病毒。
3.阴道人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)2型、CMV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)。
D.病毒受体病毒必须进入宿主细胞才能复制。为了进入细胞，病毒需要宿主细胞上的表面受体(Murray等人，1994)。更具体地，病毒必须先结合于靶细胞表面上的某个分子。近年来，已经确定了大量病毒的受体。下面是一个代表性的清单，但它并不对本发明起限制作用。
1.HRV，主基团-＞ICAM-1，结构域1和2(Lineberger，D. W.等人，病毒研究，24(2)173-86，1992)
2.流感病毒-＞唾液酸3.HIV-＞CD4，结构域1和24.脊髓灰质炎病毒-＞PVR(脊髓灰质炎病毒受体，一种免疫球蛋白超家族的蛋白质)5.EBV-＞CD21(补体受体2，针对C3d的受体)6.HSV-＞硫酸肝素7.HBV-＞IgA受体8.腺病毒-＞玻连蛋白(vitronectin)受体。
E.粘膜表面一般被细菌群所占据(Murray等人，1994)上呼吸道(URT)由鼻咽、口咽(口腔和喉)、鼻旁窦、和中耳构成。鼻旁窦和中耳一般是无菌的。然而，鼻咽和口咽的复层鳞状上皮布满了各种微生物菌群。鼻子的微生物群主要由凝固酶阴性葡萄球菌、和一些类白喉菌(需氧的和厌氧的)、以及非溶血性链球菌构成。口和咽的菌群中最主要的成员是α链球菌。还可发现某些革兰氏阴性厌氧微生物(尤其是类杆菌属(Bacteriodes))和其他的球菌。
结肠含有人体任何粘膜表面上最大群的细菌。据估计，在每个健康人中存在＞1011细菌/克结肠内含物，其中有400种以上的品种。厌氧细菌的数目超过需氧细菌的数目，因子为100-1000。类杆菌属是主要的种类。双歧杆菌属、肠杆菌属、链球菌属和乳杆菌属也是主要的。小肠由细菌构成类似于结肠的生物体所占据，但是数目少得多。胃和近端小肠处几乎是无菌的，而远端小肠含有结肠细菌含量的约1/10。
阴道粘膜也被大量细菌所占据。乳杆菌属是正常经初期阴道微生物群中主要的品种，在几乎100％正常妇女中都存在。乳杆菌属是兼性好氧菌，并且产生大量乳酸作为糖酵解终产物。这样形成了一个不适合许多细菌品种生长的酸性环境。
F.ViroShieldTM防止病原体结合于宿主细胞可以防止感染因为为了感染，病毒需要结合于靶细胞表面上的受体，所以抑制病毒与宿主受体的相互作用的策略可有效地防止感染。在粘膜表面使用细菌屏障来对付病毒病原体被称为ViroShieldTM。
ViroShieldTM型细菌的概念可用造成一般感冒的病毒剂(viral agent)来解释。一般感冒的病毒剂主要由鼻病毒主基团(它与人的ICAM-1受体结合)构成。已发现，通过重组DNA技术而表达的可溶性ICAM-1分子可有效地抑制HRV结合于易感细胞，从而防止感染(Martin，S.等人，Antimicrob Agents Chemother，37(6)1278-84，1993，以下简称Martin等人，1993)。
约60个ICAM-1分子可结合于一个HRV病毒颗粒(Hoover-Litty，H.和Greve，J.M.J.Virol.67(1)390-7，1993)。这与一个事实是相符的，即HRV衣壳是由60个拷贝的各种病毒外被蛋白构成的二十面体的复合结构(Smith，T.J.等人，J.Virol，67(3)1148-58，1993)。已发现，HRV衣壳上的真正受体结合位点是X光晶体衍射图中的表面凹陷或“峡谷”(Oliveira，M.A.等人，Structure，1(1)51-68，1993)。该峡谷的尺寸足够小，所以抗体分子不能进入。这就是人为什么容易受到HRV的反复感染的一个原因，因为在这个关键的中和位点上病毒对抗体结合有抗性。
在结合于ICAM-1之后，会诱导衣壳发生构象变化，这导致释放出病毒RNA进入宿主细胞(Martin等人，1993)。可溶性ICAM-1分子在诱导衣壳发生构象变化进而在功能上使病毒颗粒失活方面较不有效(Martin等人，1993，和Crump，C.E.等人，AntimicrobAgents Chemother 38(6)1425-7，1994，以下简称Crump等人，1994)；然而，将ICAM-1的HRV结合结构域(1和2)与免疫球蛋白(Ig)分子(IgA、IgG或IgM)的恒定区合并而得的嵌合分子有某些效果。这种效果被认为是因为嵌合分子能够通过Ig结构域的缔合而二聚化(IgA和IgG)或多聚化(IgM)。多聚体受体能更接近地模仿细胞表面上的自然状态，而结合于病毒颗粒的数个固定化的受体可以诱导衣壳的构象扭曲，从而释放出病毒RNA。
在粘膜细菌的外表面上表达ICAM-1是多聚体分子策略的一种延伸，它具有重要的额外优点。因为细菌比病毒颗粒大得多，所结合的HRV会轻易地固定在细菌表面上。本发明的一个重要优点是，只需结合少量ICAM-1受体便可有效地固定或中和病毒颗粒，而使用可溶性ICAM-1分子的策略可能必须覆盖所有60个结合位点才能保证完全中和掉一个病毒颗粒。此外，细菌表面上的ICAM-1分子可有效地诱导衣壳构象变化，因为固定在细菌表面上的数个ICAM-1分子同时结合于病毒衣壳的数个面时，会扭曲病毒衣壳的几何结构，导致构象变化，从而过早释放出病毒RNA。
释放进入细菌的病毒RNA会被细菌胞质中丰富的核酸酶轻易地降解。这导致病毒颗粒被不可逆地失活，这是本发明的重要的优点，因为结合本身是一个可逆的过程，而可溶性ICAM-1分子、嵌合分子或其他针对HRV的药物的结合不能在功能上使其失活，这样会使相当一部分病毒颗粒可以自由地在任何给定的时间内与宿主细胞结合。使用ViroShieldTM型粘膜细菌，每个细菌都可以不可逆地使大量病毒颗粒失活，这确保了绝大多数病毒接种物在能够感染下面的宿主细胞之前被清除掉。
如前所述，可溶性CD4也已表明在体外结合并防止HIV对靶细胞的感染方面是有效的(Orloff，S.L.等人，J.Virol，67(3)1461-71，1993)。但是，静脉注射可溶性CD4分子的临床试验的结果令人失望(Moore，J.P.等人，Aids Res Hum Retroviruses 9(6)529-39，1993)。其原因并不是因为HIV的初分离物vs实验室分离物与可溶性CD4的低结合亲和力，而是因为在与可溶性CD4结合后初分离物更不易被失活(Ashkenzai，A.等人，美国科学院院报，887056-7060，1991和Turner，S.等人，美国科学院院报，89(4)1335-9，1992)。
在细菌表面表达CD4有助于不可逆地使所有的HIV株失活。具体地，在位于阴道粘膜上乳杆菌属的表面表达CD4，可有效地防止通过阴道性交而进行的HIV感染。类似地被转化的大肠杆菌可有效地防止通过直肠性交而传播HIV。
应牢记的重要一点是感染与临床疾病之间的区别。对于任何病原体，存在一个导致从感染发展到临床症状而所需的最小接种剂量。暴露于低于该剂量的接种物下，一般不会导致临床疾病。因此，为了成功地防止疾病，所采用的策略不需要使一定接种量的病毒中的每个颗粒都失活，而只需将活病毒颗粒的数目降至最小感染剂量之下。
因为ViroShieldTM法的目的是防止病毒性病原体进入宿主，所以它不仅可预防临床疾病，而且还可同时防止感染。标准的疫苗不能防止病毒性病原体进入宿主。这是至关重要的，因为已知某些病毒会在某些宿主中触发自身免疫过程，而不论它们是否会造成临床感染。
潜在应用病毒 受体进入的入口 合适的细菌宿主HRVICAM-1 URT URT菌群-Strept gordonii或流感 唾液酸 URT/LRT Staph xylosus腺病毒 玻连蛋白URT Strept或StaphHIVCD4 阴道粘膜乳杆菌属HSV2 硫酸肝素阴道乳杆菌属G.在它们的感染位置上游中和病原体相对无细菌定居的唯一粘膜表面是胃、上小肠和下呼吸道的粘膜。少数重要的病毒感染上小肠，其中最主要的是轮状病毒和脊髓灰质炎病毒(Murray等人，1994)。因为在该区域的细菌计数低，所以即使所有的这些细菌都表达针对病毒的受体，也不可能完全使这种接种剂量的病毒失活。然而，为了达到小肠，病毒颗粒必须首先进入口腔，然后通过食管-这两者都被大量细菌占据着。因此，可以使口咽/食道粘膜表面上的、表达病毒受体的细菌吸附/失活足够的病毒颗粒，从而大大减少达到小肠的感染性接种物。
感染下呼吸道的病毒包括流感、副流感、和RSV(Murray等人，1994)。通过飞沫而被吸入呼吸道的病毒颗粒会沿呼吸粘膜的各部分而沉积下来，这取决于病毒颗粒、飞沫、和气流的物理性质。位于上呼吸道病毒路径上的工程菌会吸附/失活足够数目的病毒颗粒，从而将达到下呼吸道的接种剂量降至导致临床疾病所需的最小剂量之下。
H.防止病原体的排出以感染其他未感染的宿主本发明还提供了一种防止病毒从受感染的宿主中排出的方法。防止病原体从受感染的宿主中排出意味着防止病原体向大量未感染个体的传播，这从公共卫生的观点看是非常重要的。病原体的快速传播会在第三世界国家中横扫整个村庄。通过吸附/失活正从宿主中排出的病毒颗粒，ViroShieldTM甚至可用于早已被感染的宿主。即使出于上述论述的原因(章节G)，ViroShieldTM不能防止轮状病毒或脊髓灰质炎病毒的感染，但是在结肠中的工程菌仍然可以在病毒颗粒离开宿主之前吸附/失活它们。
I.在可能被污染的水中使用工程菌以灭活病毒颗粒在第三世界国家中，病毒可通过未经充分处理的水源而快速地传播。通过粪便-口而传播的病毒如轮状病毒，在被一个受感染个体污染后，会以低滴度存在于村庄的饮水中，从而继续感染大量的未感染个体。可以在可疑水源中加入非致病性的、表达轮状病毒受体的细菌，以便在这些地方吸附/灭活病毒颗粒，只要摄入这些工程菌对宿主无害。这种方法是在第三世界国家中快速控制口传播病毒的有效的和经济的方法。
J.赋予结合病毒能力的基因源至少可以用3种方法来赋予细菌结合病毒的能力。第一种方法是使细菌在其表面表达正常的针对病毒的宿主受体，如针对HRV(主基团)的ICAM-1以及针对HIV的CD4。这些是正常的人蛋白质，许多这些基因的完整序列已经被确定并储存在数据库GeneBank中。该方法的一个优点是，不容易被病毒变异所失效。如果病毒突变从而不再结合细菌上表达的受体，那么它也失去了结合于靶细胞的能力，因而不再是感染性的。
第二种方法是在细菌表面上表达针对病毒表面保守性决定簇的抗体片段(或任何能结合病毒表面特异性靶目标的肽)，如针对脊髓灰质炎病毒上的VP4或HIV上的gp120。针对几乎任何抗原的抗体片段(和肽)现在可以从噬菌体展示文库中选择出(Marks，J.D.等人，J.Biol Chem，267(3)16007-10，(1992)).
一旦发现了合适的克隆，可用分离出编码该抗体片段的基因并加以利用。此外，最近发现有包膜的病毒，在从宿主细胞中出芽的过程中，会在其包膜上携带某些宿主表面蛋白，如HIV上的HLA DR(Arthur等人，科学，258(5090)1935-1938，(1992))。因此，人HLADR分子是HIV包膜上一种正常的组分。针对HLADR分子的保守性表位的抗体片段能够结合所有的HIV分离株，因而当其在阴道粘膜上的细菌表面表达时，可特别有效地防止男女间HIV传播，或者当工程菌被施用于直肠时可有效地防止肛门性交的HIV传播。
第三种用细菌结合病毒的方法是通过在细菌表面上表达某些碳水化合物分子。大量的病毒使用碳水化合物分子作为它们进入宿主细胞的受体。一个显著的例子是流感病毒结合于唾液酸。可使细菌在其胞质中产生酶-唾液酸转移酶，这会导致在正常的表面蛋白上增加唾液酸残基，从而导致流感病毒结合于这些细菌。许多细菌碳水化合物转移酶的完整基因序列是已知的并且列在文献中。
K.用于在细菌中表面表达的表达系统在细菌表面上表达异源蛋白一般利用细菌的正常表面蛋白。已知蛋白质中的某些序列会引导它们从细菌胞质中被输出，而另一些则协助它们锚定在细胞膜上。可产生杂合蛋白，其中异源蛋白质序列置换了正常表面蛋白的外露部分，而不改动定位信号序列。已经将数个外膜蛋白质用作使异源蛋白定位的导向载体，其中包括大肠杆菌外膜蛋白质麦芽糖孔蛋白(LamB)、大肠杆菌菌毛蛋白K88ac和K88ad、大肠杆菌外膜蛋白PhoE、OmpA和OmpC、以及鼠伤寒杆菌(S.typhimurium)的鞭毛蛋白和TraT脂蛋白(美国专利No.5,348,867)。
在革兰氏阴性细菌表面进行蛋白质表面表达的更详细的论述，可在美国专利5,348,867中找到。对于革兰氏阳性细菌，可参见PCTWO93/18163。
1.构建载体质粒是通常在细菌中发现的环化的DNA分子。通过复制起点(ori)位置，它们可以独立于细菌宿主基因组而进行复制。插入在质粒中的基因可方便地被转录，如果它被置于合适的启动子序列的下游。存在某些启动子序列，它们受外部因素如IPTG分子的调控。大量的质粒已经被优化以用于各种细菌宿主菌株，最著名的是大肠杆菌。已经构建了用于在大肠杆菌(如pTX101，如美国专利5,348,867中所述)、Streptococcus gordonii(如pVMB20-GP232转化系统，如在PCT/US94/02355中所述)和其他宿主中表面表达异源蛋白的质粒。两个系统都含有将多肽导向细胞表面的信号序列，并有供所需的异源基因插入的插入位点以及用于帮助选择转化细菌的抗生素抗性基因。其他合适的链球菌包括已经被广泛转化的乳酸链球菌(De Vos，FEMS Microbiology Reviews，46281-295(1987))。
从对于每种选定细菌宿主而言合适的载体质粒开始，可以用合适的限制性酶消化质粒以暴露出克隆位点。然后将所需的异源基因连入质粒。
2.转化细菌细胞根据各种病原体、异源蛋白质或分子、粘膜表面和表达质粒等综合因素，选择合适的细菌宿主株。细菌宿主可用标准技术使其成为转化感受态，如用氯化铷法。一旦被含有所需异源基因的重组质粒转化，细菌可以在合适的培养基(如含有0.2％葡萄糖的LB培养基)上生长。转化的细菌可通过加入抗生素而加以选择，其中质粒含有对该抗生素的抗性基因，从而只有转化的细菌才能存活。
3.在细菌表面表达所需异源分子的显示表达异源基因可以是组成型的或通过刺激其所连的启动子(如用IPTG)而加以诱导。异源分子的表面表达可以用荧光标记的、针对所需分子的抗体来染色细菌，然后寻找表面荧光而加以证实。此外，靶病原体被转化细菌所结合，可以这样来显示将转化细菌固定在载玻片上，与靶病原体一起孵育，然后用一种颜色(如红色)的、针对靶病原体的荧光抗体染色，然后用另一种颜色(如绿色)的、针对转化细菌的荧光抗体染色，并显示靶病原体(红色)与转化细菌(绿色)密切相关。
L.不可逆地灭活被结合的病毒为了确保灭活与转化细胞结合后的病毒，结合过程必须同时引发病毒遗传物质的释放。由此，细菌的核酸酶能够降解病毒的遗传物质，从而不可逆地灭活病毒。许多病毒，例如HRV，在与固定化的靶细胞表面受体结合后通过病毒衣壳的构象改变来释放遗传物质(Martin等，1993)。应该通过表达细菌表面受体对这种情况成功地加以模仿。有些病毒，例如HIV和流感病毒，在它们的外被蛋白中含有在结合后促进其遗传物质释放的融合区(Murray等，1994)。在细菌中构建不同的机制以确保遗传物质的释放，并由此不可逆地灭活特异性病毒。
M.工程菌的成功定居非重组细菌在粘膜上的定居是众所周知的。最理想的是通过同时使用抗生素和抗这种抗生素的细菌(Freter R.等，传染与免疫(Infection and Immunity)，39(2)686-703，1993)。在一般条件下，中断抗生素后1至2周内，定居现象消失，驻留微生物群自身恢复和重建(Bennet等，1992)。为了加强定居，建议使用以下三种方法。
第一种方法是重复选择在动物或人粘膜上快速定居的细菌。例如，可以在粘膜表面使用野生型菌株，重复分离并体外培养细菌，每一次都返还到粘膜表面。最后，可获得强化的定居菌株。
第二种方法是令重组细菌在其表面表达融合蛋白，其中包括一个病毒结合域和一个宿主结合域。宿主结合域允许细菌高亲和性地与特定宿主粘膜表面的特定决定簇结合(蛋白质或糖)，由此使细菌比驻留微生物群略具存活优势。该方法的另一优点在于确保了病毒结合域的连续共表达，否则，细菌不具有内在的生存优势，其表达会因此而随时间衰退。
第三种方法是利用噬菌体引入基因来诱导已经驻留的微生物群自身表达病毒结合蛋白。噬菌体早已被成功用于在细菌中引入遗传物质。已开发出了许多针对不同细菌的噬菌体载体。乳酸杆菌(Lactobacillus)可能是阴道粘膜最适合的菌株，在本发明中最适合乳酸杆菌的噬菌体载体是可以得到的。最近，以温和噬菌体adh为基础开发了一种Lactobacillus gasseri的噬菌体载体(Raya，R.R.等，细菌学杂志(J Bacteriology)，174(17)5584-5592，1992和Fremaux，C.等，基因(Gene)，12561-66，1993)。该载体在确定的噬菌体(attP)和细菌(attB)结合位点整合到宿主的染色体内。或者，可将融合基因在载体中置于最适合乳酸杆菌的强启动子控制下，同时在诱导型启动子下有一“自杀”基因。
在单位剂量的细菌中还可以加入某些试剂以帮助定居。粘膜表面的许多细菌会分泌荚膜物质，这些物质汇聚成覆盖整个粘膜表面的生物膜。较好的是加入能够消化这种生物膜的酶，从而促进工程菌渗透到生物膜内更成功地定居。这些酶包括DAN酶、肽酶、胶原酶、透明质酸酶以及其它糖类降解酶。可以加入抗生素(对工程菌非易感)来减少粘膜表面的驻留菌，以为工程菌留出空间。
N.异源蛋白的持续表达如前所述，理论上，对细菌无用的外源蛋白的表达会随时间衰退，最终，外源基因丢失(Cardenas，L.和Clements，L. D.，疫苗(Vaccine)，11(2)126-135，1993)。为了加强异源蛋白构建物的持续表达，可以为细菌表达该基因创造某种动机。一种方法如上文所述产生具有病毒结合域和宿主结合域的融合蛋白，使得与宿主结合的能力使细菌具有选择性优势，从而确保融合蛋白的持续表达。另一种方法可以是产生对异源蛋白的内在需求，使得终止表达这种蛋白的转化细菌会死亡。
O.传递/用药方式的媒剂工程菌向所需粘膜表面的传递依赖于区域的可接近性和局部条件。可将工程菌加在盐溶液中向鼻粘膜和口咽粘膜传递，或加在泡沫剂中向阴道粘膜或直肠粘膜传递。较难接触到的粘膜表面，例如食管粘膜和气管粘膜，可能需要能够在沿管道下行时促进对内层包被的更粘稠的媒剂例如甘油或糖。与小肠和结肠接触需要能够耐受胃的酸性条件、胰脏分泌的水解酶和胆汁的抗微生物作用。有人建议保护性胶囊保护细菌通过上胃肠运输(Henriksson，A.等，应用环境微生物学(ApplEnviron Microbiol)，57(2)499-502，1991，以下简称Henriksson等，1991)。已发现，结肠生物群中的某些细菌固有地能够在这些条件下存活，因而适合用于胃肠道。
细菌进行自我复制，因此在理论上，如果有一个工程菌在粘膜表面定居成功，它将无限定地持续生存。但是，许多因素可能限制工程菌种群在给定粘膜表面的无限定地生存，最重要的因素是任何粘膜表面大量不同细菌间激烈的空间竞争。所以，预期在粘膜表面使用工程菌需要规律性的重复；最佳用药间隔是通常需要考虑的，但随不同的粘膜环境和细菌种类而不同。用药间隔从每日一次至每2至4周一次不等。口服108至1011活菌产生了在结肠粘膜上的临时定居(Henriksson等，1991)。预计，URT和阴道粘膜上的定居需要较少的活菌，可低至106，因为这些表面可以更直接地接触到，而且没有上胃肠道那样的酸性或其它苛刻条件。
为了将基因直接引入粘膜表面的已驻留菌，使用特异性感染选定细菌的噬菌体作为载体。噬菌体即感染细菌的病毒。其实例包括λ噬菌体、M13和T7，它们都感染大肠杆菌，以及感染Lactobacillus gasseri的adh。可操作选定噬菌体的核酸，使异源基因取代编码噬菌体外被蛋白的基因，使噬菌体成为复制缺陷型。将这些重组DNA分子加入含有功能性噬菌体蛋白质的细胞裂解液中，将组装成带有异源基因的功能性噬菌体颗粒。然后可将这些复制缺陷型噬菌体颗粒引到所需的粘膜表面以感染选定的菌群。用于粘膜表面的典型剂量是108至1012pFU/ml。溶液与处理表面之比约为0.1至10ml/cm2粘膜表面。媒剂与前文用于细菌的媒剂类似。
P.特别适合本发明的情况1.防止无有效疫苗的病毒的感染HIV、HPV、HSV、甲型肝炎病毒，水痘带状疱疹病毒(水痘)、轮状病毒等。
2.希望尽可能降低其接触病毒性URI/流感危险性的个体，尤其是经常旅行，在公共场所工作(医护人员，学校教师)、有年幼小孩、和因近期有重要事务而不能患病的那些个体。
3.免疫抑制的个体，因为ViroShieldTM在粘膜表面提供了一层完全附加性的保护层，它不依赖于正常的免疫系统功能，但实际上其作用与免疫系统有关。
4.使用疫苗可能较困难而且不可靠的第三世界国家；在这些国家，抗轮状病毒的ViroShieldTM尤其有用。
5.对疫苗制剂中某些成份例如流感疫苗制剂中的卵清蛋白有过敏反应的个体。
6.到有地区性流行病毒例如甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒流行的第三世界国家旅行的个体。
7.具有性传播疾病高发危险性因素的个体。
8.保护家畜免受病毒感染。
Q.定义细菌归入低级原生动物类的微小的、单细胞原核生物。它们可以是人或其它动物、植物或其它生物的共生体、寄生体或病原体。大多数人及其它动物的粘膜表面大量定居着多种微生物，它们为宿主提供了许多有益的功能。
生物膜不同细菌和细菌分泌的胞外基质物质构成的复合网络，在许多粘膜表面汇合成膜。
定居用于菌群时指细菌无害地在宿主的粘膜表面居留的状态。居留时间可能是两天至永远，但通常是一周至一个月。
保守决定簇蛋白质中在其不同变体中保持相同的部分。这对病毒很重要，因为某个病毒通常具有大量的毒株，每种的病毒蛋白略有不同。在该病毒的所有毒株中，病毒蛋白上被称为表位的保守决定簇都相同。
疾病用于病毒感染时指由病毒引起的立即(例如高烧、寒战、疼痛等)或长期(例如乙型和丙型肝炎病毒引起的慢性肝炎和肝细胞癌)对宿主有害作用的状态。
融合在本文中指两膜的合并，使得两者的组成合并成单个单元。
遗传物质通常指包含至少一个基因和一个影响其表达的调控元件的DNA。
宿主受体宿主细胞(靶细胞)表面的分子，病毒为了进入宿主细胞而与之结合。
宿主宿主包括人和动物。本发明可用于保护包括哺乳类和鸟类在内的家畜。
灭活使感染性物质不再具有感染宿主的能力的过程。
粘膜表面体内表面与环境之间的上皮细胞膜，包括呼吸道、胃肠道和生殖泌尿道。
受体用于病毒受体时包括原生蛋白和某些功能域，这些功能区提供特异性的结合特性从而将这些蛋白质定义为病毒结合受体。
就其在粘膜层定居的能力进行选择用于细菌时指，通过选择压力或特定的遗传转化以加强其在粘膜表面定居能力的细菌。这种能力按绝对数量或驻留时间计，定义为至少是野生型的定居能力的两倍。
选择性优势某些特征，将它们赋予细胞后使它们更适于在某特定环境中生存，使得它们在此环境中比相同环境中的其它细菌具有更大的生存和繁殖机会。
转化用于细菌时指，为了使所述细菌表达外源基因而将外源遗传物质引入细菌。
病毒感染在宿主或宿主细胞中引入病毒。这不一定意味宿主受到伤害，因此需区别于临床疾病。这是一个重要的概念，因为ViroShieldTM提供了完全防止感染的方法，而标准疫苗实际上不防止感染但能够防止疾病。
病毒一种感染性物质，由蛋白质和遗传物质DNA或RNA构成，两者都按有序方式排列，有时被包膜包裹。病毒通常比细菌小，是基因水平的专性胞内寄生体；它利用细胞机制产生由病毒核酸限定的病毒产物。根据病毒核酸的类型可将它们分为5类(ssDNA，dsDNA，dsRNA，+链RNA，-链RNA)，以及能将+RNA逆转录为DNA的第6类(逆转录病毒，例如HIV)。
本文中引用参考的所有出版物和公开专利均在此单独具体加以引用参考。
实施例以下实施例只用于说明而不进行限定。熟练技术人员不难认识到，许多非关键性参数经改变或修改其产生的结果基本相司。
A.以下实施例说明HRV病毒主基团的受体ICAM-1在金黄色葡萄球菌表面的表达和人鼻病毒的中和1.利用质粒pSEBsp-X(Olaf Schneewind，UCLA)在金黄色葡萄球菌表面表达ICAM-1结合域。
通过生成具有274aa的葡萄球菌蛋白A(SP)跨膜细胞壁分选信号片段的融合蛋白，在金黄色葡萄球菌表面表达ICAM-1的结构域1和结构域2(HRV主基团的极限受体)。从包含全长人ICAM-1cDNA的质粒CD1.8(T. A. Springer，HarvardBlood Center)中，利用聚合酶链反应(PCR)扩增ICAM-1的结构域1和结构域2。将PCR引物设计为在ICAM-1 aa1-188的5’端引入一个框内KpnI限制性位点，在3’端引入一个HindIII限制性位点。目标产物的长度是597bp。引物序列如下5’端引物TGG GTA CCT GCC CAG ACA TCT GTG TCC CCC TC3’端引物CAC AAG CTT TGG GGG AGT CGC TGG CAG GAC使用标准PCR条件(94℃-1’，65℃-1’，72℃-1’，循环30次)。PCR完成后，将一部分PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检验一～600bp片段的扩增成功。用TA克隆试剂盒(InVitrogen)将其余的PCR产物与克隆载体连接。挑选白色菌落(具有插入片段)，用肉汤培养扩大，用Qiagen质粒制备试剂盒纯化质粒。用KpnI、HindIII、KpnI/HindIII和EcoRI消化这些质粒，以证明引入的正确限制性末端的～600bp的ICAM-1插入片段克隆成功。
质粒pSEBsp-X包含了葡萄球菌内毒素B(SEB)、SEB信号肽、信号肽酶、葡萄球菌蛋白A(SPA)跨膜区和分选酶的序列。目的基因(两侧为KpnI-HindIII)被插入在信号肽酶和SPA跨膜蛋白之间，形成允许表面表达目的基因产物的融合蛋白。该质粒含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的ori序列(复制起始序列)、大肠杆菌内有效的抗氨苄青霉素基因和在金黄色葡萄球菌内有效的抗氯霉素基因。用KpnI和BamHI将该载体消化成线性。将消化产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，切取7kb的条带，用GeneClean试剂盒洗脱DNA片段，由此纯化线性载体。
为了确保ICAM各结构域的正确折叠，我们引入了一段SPA跨膜长片段。通过EcoRI和KpnI消化从载体pSEBsp-Fab CWS250-524中释放出该长SPA跨膜信号片段。消化产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，切取～0.9kb的条带。使用GeneClean试剂盒从凝胶条中纯化DNA片段。
使用1∶1∶1的摩尔比，在三元连接反应中将线性载体，跨膜片段和ICAM-1插入片段连接在一起。连接反应在室温下进行过夜，然后利用电穿孔法转移到感受态的DH5α(大肠杆菌)中。由于载体含有在大肠杆菌内有效的抗氨苄青霉素基因，可在含有氨苄青霉素的平板上挑选出转化菌落。用选出的菌落进行质粒的少量制备，并用KpnI、HindIII、KpnI/HindIII和EcoRI消化，直至找到含有正确插入片段的菌落。在肉汤培养中扩大含有连接成功的产物的菌落，使用Qiagen大量制备来纯化质粒。
2.在体外试验中，转化细菌中和人肺成纤维细胞(MCR-5)的HRV感染通过细胞的病理性变化可容易的测出HRV对MRC-5细胞的感染。HRV贮存物得自ATCC，进行连续滴定，测出用1∶1000的稀释液在第4天产生～50％的病理变化(CPE)。表达pSEBsp-ICAM的OS2生长至OD6601.0，将1cc细菌与20μl1∶10(有效稀释比为1∶500)的HRV贮存物混合。1小时后，在室温下温和振荡，离心(1000rpm)沉淀细菌。上清液经22μm的滤膜过滤，并稀释至1∶2(总稀释比为1∶1000)。取0.25cc加入含有MRC-5的各试管。24小时后更换生长培养基，然后进行感染(CPE级数从-至+4)，以后每天对细胞进行显微镜检。
第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天 第七天OS2(非转化)-- -- 1+ 2+ 4+4+ 4+OS2/pSEBsp-ICAM-- -- -- -- ---- --OS2/pSEBsp-X -- -- 1+ 2+ 3+4+ 4+单独的HRV(1∶1000) -- -- 1+ 2+ 3+4+ 4+单独的MRC-5-- -- -- -- ---- --(无HRV)这样，表达pSEBsp-ICAM的OS2成功地体外完全中和了HRV。
B.以下实施例说明在大肠杆菌表面表达HRV主基团的受体ICAM-1。
1.利用质粒pTX101在大肠杆菌表面表达ICAM-1结构域。
利用美国专利5,348,867中的系统生成含一般表面蛋白LPP的aa1-9和OmpA的aa46-159的融合蛋白，由此在大肠杆菌表面表达ICAM-1的结构域1和结构域2。利用聚合酶链反应(PCR)，使用在ICAM-1的aa1-168两侧引入框内EcoRI限制性位点的引物，扩增ICAM-1结构域1和结构域2的DNA片段。
美国专利5,348,867中描述的质粒TX101含有剪接入EcoRI位点的β-内酰胺酶基因，其可通过EcoRI消化及琼脂糖电泳中线性质粒和β-内酰胺酶基因分离而被去除。将PCR扩增的ICAM-1基因片段与纯化的质粒连接。利用氯化铷法使大肠杆菌株JM109成为感受态，利用电穿孔法以pTX101-ICAM构建物转化。
Lpp-OmpA-ICAM构建物在强Ipp启动子调控下，该启动子可由IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导。这样，IPTG刺激将导致融合蛋白的高水平表达。转化细菌在24℃生长，因为该表达系统在此温度最有效(最高水平的表面表达)。
2.验证ICAM-1的表面表达，以及证明HRV结合利用免疫荧光法验证ICAM-1在细菌表面的正确表达。将转化细菌涂在玻片上，用乙醇固定。用抗ICAM-1的鼠mAb处理玻片，彻底洗涤，然后用偶联了罗丹明的山羊抗鼠IgG处理。
在Confocal Fluorescence Imaging System MRC-500 Bio-Rad显微镜下观察荧光。为了证明HRV与转化细菌结合，将固定有细菌的玻片与HRV一起孵育，然后彻底洗涤，用偶联了罗丹明的山羊抗鼠IgG处理玻片，然后如前文所述进行观察。
3.在体外试验中，转化细菌中和HeLa细胞的HRV感染通过Northern印迹分析来检测被感染的HeLa细胞内的HRV mRNA，由此监测HRV在体外对HeLa细胞的早期感染。在组织培养皿中，将孔径足以允许HRV通过而不允许细菌或HeLa细胞通过的半透膜放在单层HeLa细胞上。将转化的或非改性的细菌铺在半透膜上，然后在细菌上加HRV，并感染下面的HeLa细胞。
感染适当时间(2-6小时)后，去除细菌和半透膜，彻底洗涤HeLa细胞。然后裂解细胞，分离出其全部的RNA用于Northern试验，该试验是用于检测作为感染标志的HRV mRNA的标准方法。
4.将转化细菌配制在合适的媒剂(泡沫剂，DNAse等)中以用于动物或人宿主的方法转化细菌被配制在大量用于动物的媒剂中。为了用在鼻咽中，可将细菌配制在盐水中以鼻喷剂的形式使用。将细菌加入盐水，浓度为106至108细胞/ml，每天使用两次，每次直接喷洒0.1ml溶液/cm2鼻粘膜。
C.在Streptococcus gordonii表面表达病毒受体以下实施例说明在革兰氏阳性菌的表面表达ICAM-1，因为革兰氏阳性菌是鼻咽生物群的主要成员。表达系统以PCT/US93/02355中所述的为基础。虽然本文实施例使用的是Streptococcus gordonii，但由于供体基序LPXLGX，可以使蛋白锚定在几乎所有革兰氏阳性菌表面，所以也可以使用其它革兰氏阳性菌。
1.在Streptococcus gordonii表面表达ICAM-1使用的是Fischetti等在WO93/18163中使用的Streptococcus gordonii菌株GP232。该菌株中，编码化脓链球菌表面蛋白M6的基因(包含LPXTGX基序)、emm-6.1和被一个cat(氯霉素乙酰基转移酶)基因中断的ermC基因(抗红霉素)被插入在GP232染色体一个强染色体启动子的下游。GP232在其表面表达M6，对红霉素敏感。Fischetti等构建的整合载体pVMB20可将异源DNA插入到emm-6.1中。pVMB20含有功能性(不中断的)ermC基因，而且是在Streptococcus gordonii中不复制的6.3kb的大肠杆菌质粒。pVMB20可被KpnI和HindIII消化而释放出一段538kb的KpnI/HindIII片段，其中包含emm-6.1，并保持LPXTGX基序完好。特别设计能获得包含ICAM-1的结构域1和结构域2的框内KpnI/HindIII插入片段的扩增引物，利用该引物通过PCR扩增ICAM-1基因。然后将该插入片段连接到消化后的载体中。
对pVMB20ICAM-1构建物的核苷酸序列分析证实了正确的(框内)插入。利用标准方法将该质粒线性化并用于转化GP232。在GP232染色体和质粒中都发生的emm-6.1基因的5’端与ermC基因3’端的同源重组使得ICAM-1基因和功能性ermC基因整合到GP232的染色体中。
通过在含有5μl/ml红霉素的培养基中筛选红霉素抗性挑选出转化体。
2.验证ICAM-1的表面表达，证明HRV的结合如实施例2所述，用ICAM-1的特异性抗体，通过免疫荧光法证实ICAM-1的表面表达。同样，如实施例2所述证明HRV的结合。
3.在体外试验中，转化细菌中和HeLa细胞的HRV感染如实施例A3所述证明转化的GP232对HeLa细胞的HRV感染的中和。
D.在大肠杆菌上的抗体表达以下实施例说明在大肠杆菌表面表达抗HLADR分子保守性决定簇的抗体片段。由于HIV包膜被发现包含约375份拷贝的来自其宿主的HLADR分子(Arthur，L. O.等，科学(Science)，258(5090)1935-8，1992)，抗HLA DR上保守性决定簇的抗体片段将与所有HIV分离物结合。
有一种噬菌体展示系统可快速筛选出针对几乎任何靶目标的抗体片段(Marks，J.D.等，生物化学杂志(J Biol.Chem.)，267(23)16007-10，1992)，利用该系统来选择具有高亲和性的抗HLADR上保守性决定簇的抗体片段。
1.筛选具有高亲和性的抗HLADR上保守性决定簇的抗体片段使用一噬菌体文库，该文库由约1014噬菌体构成，分别在其表面展示一种特有的抗体片段(scFv)(E.g.，G.Winters，MRC，Cambridge，UK)。活化T细胞表达HLADR，而静止T细胞不表达，利用该现象来挑选与HLADR结合的噬菌体。然后，在该群体中挑选出所有与活化T细胞结合的噬菌体，去除与静止T细胞结合的噬菌体。该方法有效地分离出结合HLADR的噬菌体亚群，和少量T细胞活化标记。B细胞组成性地表达HLADR。将该噬菌体亚群与B细胞反应，只挑选出抗HLADR噬菌体，因为B细胞不表达T细胞活化标记。
筛选针对不同HLADR特异性的B细胞的HLADR亚群，并只挑选与每一种B细胞特异性结合的克隆，由此在结合HLADR的噬菌体中挑选出与保守性决定簇结合的噬菌体。如果鉴定出一个以上克隆，使用亲和性最高的那个。较好的是，结合亲和性超过10-8至10-12。
2.利用质粒pTX101在大肠杆菌表面表达抗HLADR上保守性决定簇抗体片段的方法使用合适的引物克隆选定的scFv的VH和VL区，该引物被设计成可在VH的N端和VL的C端引入框内EcoRI限制性位点。将PCR扩增的基因片段连接到pTX101的EcoRI位点。如实施例1所述，用质粒转化JM109细菌并且在20℃用IPTG诱导隔合蛋白的表面表达。
3.证实抗体片段表面表达和证明HIV结合的方法进行免疫荧光法来证实抗DRscFv在细菌表面的正确表达。将转化细菌涂在玻片上并用乙醇固定。用可溶性人HLADR分子处理玻片，洗涤，用抗HLA DR的鼠mAb处理，洗涤，然后用偶联了罗丹明的山羊抗鼠IgG处理。在ConfocalFluorescence Imaging System MRC-500 Bio-Rad显微镜下观察荧光。为了证明HIV与转化细菌的结合，将固定有细菌的玻片与HIV一起孵育，彻底洗涤，然后与抗HIV外被蛋白gp120的鼠mAb反应。洗涤后，用偶联了罗丹明的山羊抗鼠IgG处理玻片，并如前文所述进行观察。
4.体外试验中，转化细菌对T细胞HIV感染的中和通过检测感染细胞内的反转录酶活性来监测HIV对CEM细胞(一种实验室T细胞系)的体外早期感染。将孔径大小足以使HIV通过而不能使细菌或CEM细胞通过的半透膜放在组织培养皿中的CEM细胞之上。在半透膜上铺一层转化的或非改性的细菌，然后在细菌上加入感染性的HIV并感染下面的CEM细胞。在感染合适的时间后，(即2至6小时)，去除细菌和半透膜，彻底洗涤CEM细胞。裂解这些细胞分析其胞质成份的反转录酶活性，以此作为HIV早期感染的标志。
5.将转化细菌配制在合适的媒剂(泡沫剂，DNAse等)中用于动物或人宿主的方法用于胃肠道时，培养转化的大肠杆菌，将其加入直肠制剂中常用的多种脂肪酸混合物中例如氢化椰子油、甘油、氢化棕榈核油，或其它适用于直肠制剂的原料。细菌加入赋形剂的浓度为每毫克赋形剂106至108个细胞。每个栓剂在3至8g之间。
虽然，为了理解清楚，以上通过说明和实施例对本发明进行了具体的描述，但是，对本领域一般技术人员来说显而易见的是，根据本发明的说明，可以进行某些改动和修改，这仍在后文权利要求限定的本发明精神和范围之内。
权利要求
1.一种保护动物免受病毒感染的方法，其特征在于，它包括用一定量足以定居于粘膜表面并保护动物免受病毒感染的转化细菌与宿主的粘膜表面接触，该细菌已经用遗传物质进行转化过从而赋予细菌结合病毒的能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的细菌在其表面表达多肽，该多肽作为病毒的宿主受体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达蛋白质的遗传物质转化，该蛋白质含有ICAM-1结构域，而且该病毒是人轮状病毒，而宿主是人。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达蛋白质的遗传物质转化，该蛋白质含有CD4受体，而且该病毒是人免疫缺陷病毒，而宿主是人。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达蛋白质的遗传物质转化，该蛋白质含有脊髓灰质炎病毒受体，而且该病毒是脊髓灰质炎病毒，而宿主是人。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达蛋白质的遗传物质转化，该蛋白质含有人补体受体2，而且该病毒是EB病毒，而宿主是人。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的细菌在其表面表达针对病毒保守决定簇的抗体片段。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对人HLADR分子的单态决定簇，而且该病毒是人免疫缺陷病毒，而宿主是人。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对轮状病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是轮状病毒，而宿主是人。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对单纯疱疹病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是单纯疱疹病毒，而宿主是人。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对人乳头瘤病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是人乳头瘤病毒，而宿主是人。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对腺病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是腺病毒，而宿主是人。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对呼吸道合胞病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是呼吸道合胞病毒，而宿主是人。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对冠状病毒外被蛋白的保守决定簇，而且该病毒是冠状病毒，而宿主是人。
15.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该细菌用诱导表面表达抗体片段的遗传物质转化，该抗体片段针对选自下组的病毒的衣壳上的保守决定簇巨细胞病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、甲型肝炎病毒和副流感病毒。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该转化的细菌可添加特异性的碳水化合物分子，作为在其正常表面蛋白质上的病毒受体。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该细菌被遗传物质所转化，该遗传物质造成在其正常表面蛋白上添加唾液酸残基，该病毒是流感病毒，而宿主是人。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细菌有细胞膜而病毒有包膜，其中转化的细菌造成其细胞膜与病毒包膜之间的融合。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，通过构建在与病毒结合的多肽中的融合结构域，转化的细菌与所结合的病毒颗粒发生融合。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的细菌被赋予足够的优于其他定居细菌的选择优势，从而使该转化细菌可成功地无定限地定居和存活于选定的粘膜表面上。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，通过异源蛋白上的某结构域，该结构域结合于选定的粘膜表面上的决定簇，而赋予转化细菌更强的粘附于宿主粘膜表面的能力。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，粘膜表面是鼻咽、口咽、食道、小肠、大肠、直肠、阴道和阴茎。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化细菌与增强该转化细菌定居作用的抗生素一起施用。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化细菌与降解粘膜表面从而增强转化细菌定居作用的酶一起施用。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，该酶是DNA酶、肽酶、胶原酶、透明质酸酶和其他降解碳水化合物的酶。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的细菌通过使用液体溶液、泡沫、栓剂、海绵或胶囊而施用。
27.一种防止妇女免受通过阴道性交而传播的感染的方法，其特征在于，它包括在性交时将转化细菌施入阴道穹窿中，该转化细菌可结合于感染原并使其失活。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，该细菌使选自下组的病原体失活HIV、HPV、HSV、淋病、梅毒和衣原体。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，转化细菌以阴道泡沫或海绵地形式施用，而且可以与其他试剂如非杀菌性的杀精子剂一起使用。
30.一种防止病毒性病原体从受感染个体传播给其他个体的方法，其特征在于，它包括施用一定量的、足以定居于受感染个体的粘膜表面上的转化细菌，其中该细菌可与存在于受感染宿主中的感染性病毒颗粒结合并使其失活。
31.一种对宿主的粘膜细菌群进行操作的方法，其特征在于，通过载体将所需外源遗传物质直接引入居住的微生物群落细菌中，其中该载体赋予细菌与宿主的病毒病原体结合并使其失活的能力，从而保护宿主免受病毒病原体的感染。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，该载体是是复制缺陷型噬菌体。
33.一种使可疑水源中感染性病毒颗粒失活的方法，其特征在于，它包括加入能够与特定的病毒结合并不可逆地使其失活的工程菌。
34.一种物质组合物，其特征在于，它含有一定量的、足以与靶病毒结合并使其失活的细菌，该细菌因其能定居于宿主的粘膜而被选择，并且被转化从而表达对位于其细胞表面上的靶病毒特异的宿主受体或抗体。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，该细菌表达宿主受体。
36.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，靶病毒选自下组腺病毒、人免疫缺陷病毒、轮状病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、甲型肝炎病毒、和副流感病毒。
全文摘要
本发明涉及在宿主的粘膜表面上使用遗传修饰过的、非致病性的细菌,以抑制特定病毒在粘膜表面上的感染。更具体地,修饰非致病性的细菌,使之获得与特定病毒结合并使其在功能上失活的能力。还设计了其他的操作,以保证该细菌在所需的宿主粘膜表面上永久地定居。该细菌结合于病原体的能力可通过在细菌表面上表达特异性地结合于靶病毒上某分子的某分子,如多肽或者是碳水化合物分子。这种能力可通过遗传操作而赋予该细菌。对细菌进行的遗传操作可以在体内或体外进行,遗传工程改造的细菌可施用于宿主的粘膜表面。或者通过载体,将遗传物质直接引入早已占据在所需的宿主粘膜表面上的细菌中。
文档编号C12N1/20GK1177909SQ96192391
公开日1998年4月1日 申请日期1996年3月8日 优先权日1995年3月8日
发明者彼得·P-H·李 申请人:彼得·P-H·李