专利名称：Exserohilum monoceras的新菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Exserohilum monoceras的一种新菌株、一种含有该菌株的杂草控制剂以及使用该杂草控制剂的杂草控制方法。
为使粮食产量稳定，需要在农田中使用农药。但是，由于长期将大量的含有非天然产生的物质的合成农药施加到土地上，这些物质会产生有害作用。最严重的问题是其直接影响人及家畜，并且破坏生态系统。近年来，由于极大改进用于杂草、有害昆虫和病菌的农药的特异性，已减少其对人及家畜的有害作用。但是，联系到使用农药时高的农药浓度，仍然应对这些有害作用给予足够的关注。而且，对用于杂草、有害昆虫及病菌的农药的浓度的选择不必高，高的浓度往往会导致对生态系统的破坏。
为解决这一问题，需要研制出一些除草剂来保护环境。这些除草剂不会对靶种类之外的其他种类有不利影响。上述除草剂的一个例子就是使用杂草病原体的除草剂。某些杂草病原体在杂草中是普遍存在的，并且已知可将这些病原体用于除草剂中，该除草剂几乎不损伤人、家畜以及包括鱼类、昆虫等在内的小型生物，对植物的药害小。此外，将病原体用于靶杂草的该除草剂的特异性是如此强，以致其选择性相当高，几乎不破坏生态系统。目前，从市场上可购得的使用杂草病原体的除草剂的例子是将棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)用于Stranglervine的除草剂Devine、将盘长孢状毛盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)的变种aeschynomene 用于 Northernjointvetch的除草剂Collego以及将盘长孢状毛盘孢的变种malvae用于圆叶锦葵的除草剂BioMal。
将杂草病原体用来控制稻田中最严重的杂草稗(Echinochloa spp.)的除草剂的例子是Cochliobolus lunatus(AnamorphCurvularia lunata)[“杂草研究”(Weed Research)，27，43-47，(1987)和日本专利申请公开No.284,963/93]、Ustilago trichophora[WO93/05656]以及Drechslera monoceras(Exserohilummonoceras的异名)[日本专利申请公开系列219,883/91，226,905/92，360,678/92，370,090/92，277,042/94，329,513/94以及247,822/94]。
但是这些常规的除草剂是有缺限的例如，Cochliobolus lunatus充分显示其作用需要有18小时以上的浸润期；Ustilago trichophora在喷施后到充分显示其作用需4至5周；并且Drechslera monoceras产生少量的孢子。因此，使用这些真菌的除草剂还未进入到实际应用中。
本发明的目的在于提供既具有足够的除草作用又有高的产生孢子的性能的微生物。
发明人筛选了对稗有致病性的菌株，得到一种具有强的除草作用的菌株，并且发现一类既具有强的除草作用又具有高的产生孢子的性能的菌株。此外，发明人检测了这些菌株的酯酶酶谱类型，发现该类菌株表现有相似的酯酶酶谱类型，该酶谱类型与已知菌株的所有酯酶酶谱类型都不相似。根据这些发现，本发明人完成了以下发明本发明是Exserohilum monoceras的一种菌株，其表现有
图1所示的酯酶酶谱类型。
另外，本发明是一种杂草控制剂，其含有作为活性成份的所述菌株。
此外，本发明是一种控制杂草的方法，其包括使用所述的杂草控制剂。
在下文中，对本发明作详细描述。
本发明的菌株是由染病的稗分离的，并且该真菌的特征如下其为需气生物，在马铃薯蔗糖琼脂培养基平板上形成深灰或黑色菌落。可以观察到白色或灰色的气生菌丝体。该真菌具有大量的深色分生孢子，每一孢子具有2-8隔，为纺缍形，中部最宽，向端部变窄。在基部末端突出有一个门。分生孢子的大小为约40～150×10～25μm。
由以上(观察)结果，尤其是其菌落的形成和形状以及其分生孢子的形态学，通过参考A.Sivanesan“Bipolaris属、弯孢属(Curvularia)、Drechslera属、Exserohilum属的草栖种类及其变种”(Graminicolous Species ofBipolaris、Curvularia、Drechslera、Exserohilum and Their Telemorphs)(“真菌学论文”(Mycological Papers)，No.158，P.261，Nov.1987)第201-237页，发明人将所述菌株鉴定为Exserohilum monoceras。
对该真菌属的命名“Exserohilum”是按照A，Sivanesan的分类方法。Luttrell(“真菌学评论”(Revue de Mycologie)，41，271-279，(1977))和Alcom(“真菌分类学”(Mycotaxon)，8,411-414，(1978)也支持这一分类方法。在另一方面，Ellis(Dematioceous Hyphomycetes，CMI，Kew，608(1971))曾将Exserohilum属和Bipolaris属归为Drechslera属，并且只用Drechslera属。不过，近年来，除Ellis外，没有任何研究者不赞同有Exserohilum和Bipolaris种，因而，认为采用Exserohilum种是合适的。由于已知Exserohilum种的变形状态为Setosphaeria种，也可以将归为Setosphaeria种的微生物包括在本发明的范围之内。
本发明的菌株具体为JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803以及JTB-808。已将JTB-012保藏为FERM BP-5271，JTB-013为FERM BP-5272，JTB-799为FERM BP-5273，JTB-803为FERMBP-5274，JTB-808为FERM BP-5275，所有菌株均于1995年10月27日保藏于工业科学和技术署，国立生命科学和人体技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology(1-3，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan)。
如图2中所示，这些菌株表现出一种酯酶酶谱类型，该酶谱类型与Exserohilum monoceras的已知菌株IFO9800、IMI125854、IMI125855、ATCC2464l和ATCC58346的酶谱类型不同。
可以以和用于Exserohilum monoceras的已知菌株的方式相同的方式而勿需特殊的方法，来培养本发明的菌株。就适当地含有可同化的碳源和氮源和无机物以及必需的生长促进剂而论，培养基可以是任何合成的或天然的培养基。培养基的例子为燕麦蔗糖琼脂培养基、燕麦琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基、V-8汁液琼脂培养基、Czapek-Dox琼脂培养基等。在培养中，将培养基保持在15-30℃的温度下，优选在20-25℃下，并且将培养基保持在pH3-9，优选在pH5-8。于上述条件下培养7-14天后，在培养基平板上形成足够数量的孢子。
本发明的杂草控制剂是通过将表面活性剂等加入到作为活性成份的所述孢子中来制备的。可以于能显示除草作用的范围内随意地决定孢子密度，在这个范围内可以适当使用102-106孢子/ml的密度，优选103-105孢子/ml的密度。
对于将本发明的杂草控制剂用于实际田间，优选用109-1010孢子/1000m2的密度。
用本发明的杂草控制剂处理的杂草包括稗，但不限于此。
实施例[实施例1]稗(Echinochloa crus-galli)的控制实验从日本各地收集Echinochloa spp.的染病植株。切除其侵噬斑，并于25℃潮湿条件下培养，由此形成分生孢子。用针将分生孢子刮下，并接种到马铃薯蔗糖琼脂培养基平板上，以分离单个孢子。将所有菌株接种至燕麦蔗糖琼脂培养基平板上，并于25℃下培养14天以形成分生孢子。然后，以每5ml有103、104和105个孢子的密度将分生孢子悬浮于0.02％的吐温20(Tween 20)的水溶液中。
于一个100cm2的盆中分别将稗培养至1.5叶时期，注水至大约5cm深。向每个盆中一滴滴地加入5ml的每一所述孢子悬液，并使之于温室中保持3周，检测其除草效率。如下测定其对稗的除草效率除草效率＝[1-(存活的个体数目/20)]×100表1.菌株及其对稗的除草效率菌株除草效率103104105JTB-0123895100JTB-013357095JTB-79947100 100JTB-80335100 100JTB-80832100 100IMI-125855 0 2 25未处理0[实施例2]分生孢子的繁殖力实验将每一菌株接种到燕麦蔗糖琼脂培养基平板上，并于25℃下静止培养14天。然后通过将分生孢子悬浮于0.1％的Tween 20中来回收培养基平板上的分生孢子。产生的分生孢子的量见表2。
表2.菌株及其分生孢子产量菌株 分生孢子产量/cm3JTB-012 4.4×105JTB-013 4.5×105JTB-799 7.5×105
JTB-803 8.6×105JTB-808 6.6×105IFO-9800 ＜2.4×103IMI-125854 ＜2.4×103IMI-125855 4.0×104ATCC-24641 ＜2.4×103ATCC-58346 ＜2.4×103JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808这类菌株至少以4.4×105分生孢子/cm3的产量产生分生孢子。在另一方面，IMI-125855，即在已知菌株中产生分生孢子的能力最大的菌株，以4.4×104分生孢子/cm2的产量产生分生孢子。由其他所有已知菌株产生的分生孢子的量低于检测限度，这表明由这类菌株的每一菌株产生的分生孢子的量比每一已知菌株的要高10倍。[实施例3]酯酶酶谱分析将JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803、JTB-808、IFO-9800、IMI-125854、IMI-125855、ATCC-24641以及ATCC-58346这10个菌株用作样品。通过于日本专利申请公开No.329,513/94中描述的方法，从每一菌株制备粗酶溶液。
于25℃下、黑暗中、在马铃薯蔗糖液体培养基中将每一菌株静止培养7-10天以形成真菌丛。用蒸留水将该真菌丛洗涤几次，于-80℃下冰冻，并冻干。
把该真菌丛于50mM Tris-HCl缓中液(pH7.4)中匀浆，通过滤纸过滤，并于10,000r.p.m.离心滤液。把上清液用作样品。通过Lowry方法定量检测样品蛋白质的浓度。于一个大的平板凝胶电泳槽中，用丙烯酰胺凝胶(浓缩胶，4.5％；分离胶，10％)将每一样品(大约50μg蛋白)于30mA下电泳2个小时。
电泳后，进行酯酶活性染色。将40mg乙酸萘酯溶于50％丙酮的水溶液中，向其中加入200mg固紫B盐和200ml 50mM Tris-HCl缓冲液，并将所得的溶液用作染色液。将胶浸没于染色液中，并轻微振荡30分钟，进行染色。然后，用蒸馏水洗涤凝胶，检测每条带中的迁移率。
结果如图1和2中所示，JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808显示出有相似的酯酶酶谱类型，因此，显然JTB-012、JTB-013、JTB-799、JTB-803和JTB-808菌株属于同一类中。由于这类菌株的酯酶酶谱类型和日本专利申请公开No.329,513/94中所述的已知的IFO-9800、IMI-125854、IMI-125855、ATCC-24641、ATCC-58346以及Drechsrela monoceras var.。microsporus菌株的不同，同样显然的是这类菌株是与所知菌株不同的一类新菌株。[制剂的例子]例1(于水中形成的乳剂)把Exserohilum monoceras的2×109个分生孢子以及4g Tween 80加入20L无菌水中，将其混合制成液体制剂。例2(可湿性粉剂)把分生孢子(JTB-803)悬浮于9％麦芽糖、1％粘土和90％水组成的混合物中，制成每ml中含有107个分生孢子的悬液。把悬液风干，将干燥的产物研磨，制成可湿性粉剂。例3(可湿性粉剂)把分生孢子(JTB-012)悬浮于9％乳糖、1％沸石和90％水组成的混合物中，制成每ml含107个分生孢子的悬液。把悬液风干，研磨干燥的产物，制成可湿性粉剂。例4(可湿性粉剂)把分生孢子(JTB-808)悬浮于15％硅藻土、77％高岭土以及8％聚乙烯烷基苯基醚组成的混合物中，制成每ml中含107个分生孢子的悬液。把悬液风干，研磨干燥的产物，制成可湿性性粉剂。例5(可湿性粉剂)把分生孢子(JTB-799)悬浮于33％硅藻土、0.33％羧甲基纤维素和66.67％水组成的混合物中，制成每ml含107个分生孢子的悬液。把悬液干燥，研磨干燥的产物，制成可湿性粉剂。例6(粉剂)把分生孢子(JTB-012)与一种混合物混合，该混合物含有14％羟丙基-β-环糊精，12％白碳黑和74％粘土，制成每g中含107个分生孢子的混合物，把混合物干燥，均匀研磨，制成粉剂。例7(颗粒剂)
把分生孢子(JTB-808)和一种混合物揉捏，该混合物含15％β-环糊精、2％淀粉、18％皂土、36％碳酸钾和29％水，制成每g中含107个分生孢子的混合物，然后将其于成粒机中粒化，干燥，制成颗粒剂。例8(可乳化的浓缩物)把分生孢子(JTB-799)均匀悬乳于一种混合物中，该混合物中含18％聚氧乙烯壬基苯基醚磷酸铵、6％聚氧乙烯壬基苯基醚、29％磷酸三乙酯和47％的磷酸三丁酯，制成每ml含107个孢子的乳剂。例9(油剂)把分生孢子(JTB-803)悬浮于一种混合物中，该混合物含有95％锭子油、4％蓖麻油和1％硅氧烷油，制成每ml中含107个孢子的油剂。例10(干的流动剂)把分生孢子(JTB-013)悬浮于一种组合物中，该组合物含12％烷基苯磺酸钠和88％聚乙烯乙二醇醚，制成每ml中含107个分生孢子的干的流动剂。例11(微囊剂)将分生孢子(JTB-803)悬浮于一种混合物中，该混合物含0.7％8藻酸钠、5％高岭土、15％甘油和79.3％水，制成每ml含107个分生孢子的悬液。把悬液滴加到0.2M乙酸钙上，以产生微囊化产物。把产物切碎、过筛并风干，制成微囊剂。例12(微囊剂)把分生孢子(JTB-013)悬浮于一种混合物中，该混合物含0.7％藻酸钠、5％高岭土、15％甘油和79.3％水，制成每ml含107个分生孢子的悬液。把悬液一滴滴地加到0.2M氯化钙上，产生微囊化产物。把产物切碎、过筛并风干，制成微囊剂。
本发明提供了Exserohilum monoceras的一个新菌株。与Exserohilummonoceras的常规菌株相比，该菌株有很好的除草效果和孢子繁殖力，其具有作为菌菌除草剂的成份合适性能。
附图的简要描述图1是本发明的新菌株的酯酶酶谱2是本发明的新菌株和常规菌株的酯酶酶谱图。
权利要求
1.Exserohilum monoceras的一种菌株，该菌株表现有图1中所示的酯酶酶谱。
2.如权利要求1的菌株，该菌株为Exserohilum monoceras JTB-012、Exserohilum monoceras JTB-013、Exserohilum monoceras JTB-799、Exserohilum monoceras JTB-803或Exserohilum monoceras JTB-808。
3.一种用于控制杂草的制剂，该制剂包含有作为活性成份的权利要求1或2的菌株。
4.如权利要求3的制剂，其中该杂草是稗(Echinochloa spp)。
5.一种用于控制杂草的方法，该方法包括使用权利要求3的制剂。
6.一种如权利要求5的方法，其中该杂草为稗(Echinochloa spp)。
全文摘要
使用Exserohilum monoceras的一个菌株的一种除草剂和一种除草方法,该菌株表现有和常规微生物的酯酶酶谱类型不同的酯酶酶谱类型,并且有强的形成孢子的能力。
文档编号C12R1/645GK1177375SQ9619233
公开日1998年3月25日 申请日期1996年11月19日 优先权日1995年11月20日
发明者本浩史, 高林美千代, 稗田忠治, 乡原雅敏 申请人:日本烟草产业株式会社