专利名称：分支杆菌蛋白质、其产生菌和作为疫苗和检测结核病的用途的制作方法
技术领域：
本发明的目的是分支杆菌蛋白质和产生它们的微生物。
本发明还涉及这些蛋白质在疫苗或用于检测结核病中的用途。
结核病一直是世界范围内的公共健康问题。每年因结核病导致的死亡量为约3百万，而结核病的新发病人数为约1千5百万。因结核病导致的死亡数甚至在发达国家中也很高；例如在法国，每年为1500，如果考虑在官方数字和全身尸检结果之间Roujeau估计的差异，这个数字肯定被低估了2或3倍。最近，结核病的增加或至少这种病的发病率没有降低可能是与HIV/AIDS的传播有关。总之，在法国和发达国家，就发病率而言，结核病仍是主要的感染性疾病，而在发展中国家，结核病仍是与单种疾病有关的人口损失的主要原因。
目前，通过从患者取样，培养其中的细菌而进行的明确诊断不到结核病的一半。甚至占结核病80-90％的、通过检测细菌最容易诊断的肺结核病，咳出物检测阳性不到病例的一半。
更敏感技术，如PCR(聚合酶链反应)的发展总是要遇到如何得到样品的问题。妇女和儿童不能正常刺穿，而婴幼儿的样品经常需要相对特殊的医学介入(例如神经节活检或通过头脊柱液的腰穿刺取样)。
在其它方面，PCR反应本身存在抑制，使得该技术对于一些样品是不可行的，因为不能控制其来源。
最后，由于其敏感性的限制(在样品中的量在104-105个细菌范围内)，经典细菌学诊断，显微镜检查和培养要求已经有相当量的细菌，并因而病情有相当发展。
因此，检测抗结核分支杆菌的特异性抗体有助于诊断检测细菌本身很困难或不可能的常见的疾病形式。
几代研究人员的不断努力已经发展了一种完善的结核病血清学诊断技术。
综合该领域中所完成的研究，需要提及PCT申请WO-92/21758。
因此，在现有技术中报道的技术大部分是以开始分离蛋白质到检测其生物化学特性为基础的。在所述分离前，作者就已试验了这些蛋白质检测患结核病的个体的能力。
PCT申请WO-92/21758描述了用源自患结核病的患者或活细菌免疫的豚鼠的血清，清楚筛选结核感染代表性抗原的方法。与现有技术描述的大部分试验不同，用该方法分离了分子量在44.5-47.5KD之间的牛分支杆菌蛋白质。
确定这些蛋白质之一的N-末端的17个氨基酸，而且所述氨基酸如下ALA-PRO-GLU-PRO-ALA-PRO-PRO-VAL-PRO-PRO-ALA--1 2 3 4 5 6 78 9 10 11ALA-ALA-ALA-PRO-PRO-ALA12 13 14 15 16 17ROMAIN等人的文章(1993，感染和免疫，61，742-750)基本上说明了在该国际申请中所述的结果。它更具体地描述了使用通过免疫兔得到的抗上述45-47KD蛋白质复合物的兔多克隆免疫血清的竞争性ELISA试验。
同时，JACOBS等人(1991，酶学方法，204，537-557)构建了结核分支杆菌的基因文库。
该文库含大量不同的克隆。
WIELES等人(1994，感染和免疫，62，252-258)鉴定并测序了来自另一分支杆菌种，麻风分支杆菌的蛋白质。称为43L的该蛋白质，从核苷酸序列推导的分子量为约25.5kDa。其N末端与在牛分支杆菌BCG中鉴定的45-47KDa复合物(上文给出了其N末端的17个氨基酸序列)有47％的同源性。
如上所述，在人类医学中从治疗和诊断方面看，精确鉴定由分支杆菌，特别是由结核分支杆菌生产的蛋白质是非常有意义的。
实际上存在并尚未解决的问题是如何得到对抗大量疾病的疫苗。
另一问题是如何检测由分支杆菌引发的疾病，如结核病。
因此，本申请人努力确定一种结核分支杆菌蛋白质的序列，该蛋白质可能在免疫应答中起重要作用。
本申请人证明相当于上述45-47KD复合物的蛋白质组由一种相同的基因编码，因为其Pro丰富，所以计算的分子量不同于在聚丙烯酰胺凝胶上估计的分子量。
因此，本发明的目的是提供至少有下列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3之一部分的蛋白质SEQ ID N2Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys GlyArg Leu Ala Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser AlaSer Leu Val Thr Val Ala Val Pro Ala Thr Ala Asn AlaAsp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala AlaSer Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro AlaThr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn ThrPro Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro ProPro Ala Asp Pro Ash Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile AlaPro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg Ile Asp Asn Pro ValGly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp Val GluSer Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu LeuSer Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln ProPro Pro Val Ala Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly ArgLeu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ala Thr AspSer Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp Met Gly GluPhe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln GluThr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser AlaSer Tyr Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys ProAsn Gly Gln Ile Trp Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro AlaAla Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro Gln Arg Trp PheVal Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp LysGly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro LeuVal Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala GluPro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala ProThr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln Arg Thr Leu Pro Ala
SEQ ID N3Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala AlaSer Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro AlaThr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn ThrPro Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro ProPro Ala Asp Pro Asn Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile AlaPro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg Ile Asp Asn Pro ValGly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp Val GluSer Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu LeuSer Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln ProPro Pro Val Ala Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly ArgLeu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ala Thr AspSer Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp Met Gly GluPhe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln GluThr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser AlaSer Tyr Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys ProAsn Gly Gln Ile Trp Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro AlaAla Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro Gln Arg Trp PheVal Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp LysGly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro LeuVal Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala GluPro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala ProThr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln Arg Thr Leu Pro Ala本发明还涉及具有序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3至少一部分的杂合蛋白质和能够在人和动物中诱导免疫应答的肽或蛋白质序列。
抗原决定簇最好能够诱导体液和/或细胞应答。
所述决定簇可以是不同性质的，而且特别是抗原蛋白质(最好是糖蛋白)片段，用于得到能够诱导合成抗多表位之抗体的致免疫组合物。
这些杂合分子可以部分由携带SEQ ID NO2或SEQ ID NO3并与特别是白喉毒素、破伤风毒素、HBV病毒的HBS抗原、脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或任何其它毒素或病毒抗原部分(尤其是表位)结合的分子组成。
合成杂合分子的方法包括用在遗传工程中所用的方法生产编码所需蛋白质或肽序列的杂合DNA。
本发明还包括与含有序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的蛋白质或与含至少部分这些序列的杂合蛋白质相比，在氨基酸序列中含有次要差异或有限的变异而不改变功能的蛋白质。
应当注意，本发明揭示了序列SEQ ID NO3蛋白质的计算重量(28799Da)和所述复合物用SDS凝胶估算的重量(45-47KD)在分子量上的重大差异。这种差异可能归因于在所述多肽链中的高频Pro(21.7％)。
本发明的其它方面是编码所述蛋白质的寡核苷酸、RNA或DNA。一种所述核苷酸有利地有至少部分下列SEQ ID NO1序列GT GCTCGGGCCC AACGGTGCGG GCAAGTCCAC CGCCCTGCATGTTATCGCGG GGCTGCTTCG CCCCCGACGC GGGCTTGGTA CGTTTGGGGGACCGGGTGTT GACCGACACC GAGGCCGGGG TGAATGTGGC GACCCACGACCGTCGAGTCG GGCTGCTGTT GCAAGACCCG TTGTTGTTTC CACACCTGAGCGTGGCCAAA AACGTGGCCT TCGGACCACA ATGCCGTCGC GGGATGTTTGGGTCCGGGCG CGCGCTAGGA CAAGGGCGTC GGCACTGCGA TGGCTGCGCGAGGTGAACGC CGAGCAGTTC GCCGACCGTA AGCCTCGTCA GCTATCCGGGGGCCAAGCCC AGCGCGTCGC CATCGCGCGA GCGTTGGCGG CCGAACCGGATGTGTTGCTG CTCGACGAGC CGCTGACCGG ACTCGATGTG GCCGCGGCCGCGGGTATCCG TTCGGTGTTG CGTAGTGTCG TCGCGAGGAG CGGTTGCGCGGTAGTCCTGA CGACCCATGA CCTGCTGGAC GTGTTCACGC TGGCCGACCGGGTATTGGTG CTCGAGTCCG GCACGATCGC CGAGATCGGC CCGGTTGCCGATGTGCTTAC CGCACCTCGC AGTCGTTTCG GAGCCCGTAT CGCCGGAGTCAACCTGGTCA ATGGGACCAT TGGTCCGGAC GGCTCGCTGC GCACCCAGTCCGGCGCCCAC TGGTACGGCA CCCCGGTCCA GGATTTGCCT ACTGGGCATGAGGCAATCGC GGTGTTCCCG CCGACGGCGG TGGCGGTGTA TCCGGAACCGCCGCACGGAA GCCCGCGCAA TATCGTCGGG CTGACGGTGG CGGAGGTGGATACCCGCGGA CCCACGGTCC TGGTGCGCGG GCATGATCAG CCTGGTGGCGCGCCTGGCCT TGCCGCATGC ATCACCGTCG ATGCCGCCAC CGAACTGCGTGTGGCGCCCG GATCGCGCGT GTGGTTCAGC GTCAAGGCGC AGGAAGTGGCCCTGCACCCG GCACCCCACC AACACGCCAG TTCATGAGCC GACCCGCGCCGTCCTTGCGT CGCGCCGTTA ACACGGTAGG TTCTTCGCCA TGCATCAGGTGGACCCCAAC TTGACACGTC GCAAGGGACG ATTGGCGGCA CTGGCTATCGCGGCGATGGC CAGCGCCAGC CTGGTGACCG TTGCGGTGCC CGCGACCGCCAACGCCGATC CGGAGCCAGC GCCCCCGGTA CCCACAACGG CCGCCTCGCCGCCGTCGACC GCTGCAGCGC CACCCGCACC GGCGACACCT GTTGCCCCCCCACCACCGGC CGCCGCCAAC ACGCCGAATG CCCAGCCGGG CGATCCCAACGCAGCACCTC CGCCGGCCGA CCCGAACGCA CCGCCGCCAC CTGTCATTGCCCCAAACGCA CCCCAACCTG TCCGGATCGA CAACCCGGTT GGAGGATTCAGCTTCGCGCT GCCTGCTGGC TGGGTGGAGT CTGACGCCGC CCACTTCGACTACGGTTCAG CACTCCTCAG CAAAACCACC GGGGACCCGC CATTTCCCGGACAGCCGCCG CCGGTGGCCA ATGACACCCG TATCGTGCTC GGCCGGCTAGACCAAAAGCT TTACGCCAGC GCCGAAGCCA CCGACTCCAA GGCCGCGGCCCGGTTGGGCT CGGACATGGG TGAGTTCTAT ATGCCCTACC CGGGCACCCGGATCAACCAG GAAACCGTCT CGCTCGACGC CAACGGGGTG TCTGGAAGCGCGTCGTATTA CGAAGTCAAG TTCAGCGATC CGAGTAAGCC GAACGGCCAGATCTGGACGG GCGTAATCGG CTCGCCCGCG GCGAACGCAC CGGACGCCGGGCCCCCTCAG CGCTGGTTTG TGGTATGGCT CGGGACCGCC AACAACCCGGTGGACAAGGG CGCGGCCAAG GCGCTGGCCG AATCGATCCG GCCTTTGGTCGCCCCGCCGC CGGCGCCGGC ACCGGCTCCT GCAGAGCCCG CTCCGGCGCCGGCGCCGGCC GGGGAAGTCG CTCCTACCCC GACGACACCG ACACCGCAGCGGACCTTACC GGCCTGACC
本发明还涉及生产上述蛋白质之一的微生物，特别是分泌一种所述蛋白质的微生物。
所述微生物优选是细菌，如牛分支杆菌BCG。已经在人中使用了这些细菌以便得到抗结核病的免疫力。
用牛分支杆菌BCG生产本发明杂合蛋白有特别的优点。实际上，牛分支杆菌BCG是广泛用于疫苗目的并被认为对人是无害的菌株。注射到人体后，它在15天到1个月的时间内缓慢发育，这使所述抗原得到良好的呈现，这样会使所述生物产生所需的抗该抗原的应答。
另一方面，人们对麻风分支杆菌(是人麻风病病因)了解极少。该细菌到目前为止，还不能在培养基中培养，而且与牛分支杆菌相比，生长期很长。
此外，其强致病性是其不能用于疫苗目的的明显原因。
含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的蛋白质具有可被结核病患者身体中抗体所识别的优点，因此，它是一种先天强免疫原性抗原。
所述蛋白质源自与牛分支杆菌很接近的结核分支杆菌，这两种细菌分别在人和牛中引起结核病。
因此源自结核分支杆菌的蛋白质能够在牛分支杆菌中表达并在具有信号肽的细胞中被分泌到培养基中。
由于牛分支杆菌有用于人接种的上述优点，而且由于相当于SEQ IDNO2和SEQ ID NO3序列的蛋白质在人中诱导强免疫应答，因此，在牛分支杆菌中生产携带源自结核分支杆菌的部分蛋白质的杂合蛋白质特别有利。
熟知，要研究疫苗来对抗的致病微生物抗原只能在人中诱导很弱的反应，除非它们以特殊方式递呈。
本发明用两种方法解决了该问题-一方面通过将杂合蛋白呈现在牛分支杆菌BCG的表面，和/或由所述细菌分泌，和-另一方面是通过将已知诱导强免疫反应的抗原决定簇，即具有SEQ IDNO2或SEQ ID NO3蛋白质之一的抗原决定簇与单独注射时诱导弱应答的抗原决定簇组合。
与蛋白质SEQ ID NO2或SEQ ID NO3之一的抗原决定簇结合可以增强对杂合蛋白质第二抗原决定簇的免疫应答。这种现象可能可以与半抗原载体效应相比。
显然，用源自麻风分支杆菌的蛋白质(如Wie1es等人(1994，同上文)文章中描述的)不能进行这样的操作，一方面是因为结核分支杆菌和麻风分支杆菌有很大的差别，不能适当表达所述蛋白质，而且对由所述麻风分支杆菌蛋白质诱导的免疫应答不了解。另外，导入来自致病种的蛋白质以用于接种目的会给人的健康构成潜在的危险，而这是药物工业所不能接受的。
所有这些理由都成为序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的蛋白质和由Wieles等人(1994，同上文)描述的麻风分支杆菌蛋白质之间的差异，尽管它们有明显的序列同源性(见下文
图17)。
本发明还涉及含前述至少一种蛋白质或微生物的疫苗或药物。
可以用含非杂合蛋白质的疫苗免疫个体抵御结核病。可以将携带源自牛分支杆菌以外的生物体的表位的杂合蛋白质用于免疫以抵御其它疾病。
作为说明，可以以每剂量1-500μg蛋白质/个体或103-107重组细菌/个体的量皮内使用。
本发明的另一目的是含药物有效量的至少一种前述蛋白质或微生物和可药用稀释剂或佐剂的药物组合物。
本发明的另一目的是检测特异性结核病抗体的方法，其中为了检测是否存在所述抗体，将生物液与如上所述蛋白质接触。
将所述蛋白质固定在载体上较为有利。
这种检测特别可通过Western印迹(免疫印迹)、通过酶免疫方法(ELISA)或放射性免疫检测方法(RIA)进行，利用含所述蛋白质，以及可使免疫反应进行的特定缓冲液的检测试剂盒，如果需要，该试剂盒还可以含使形成的抗体-抗原复合物显示的物质。
以不受下列实施例和附图的任何限制的方式说明本发明，其中图1是在下述条件下不滞留在离子交换柱上的结核分支杆菌分子过滤物(Si300)流份在240nm的光密度图(0D)。
图2表示从前述分子过滤流份1中的分子，在高压离子交换柱(DEAE)上的分离物在220nm的光密度图。
图3表示前述离子交换层析中的流份1的反相柱层析，在220nm的光密度图。
图4A-4E是分别用下列物质显色的PVDF膜的照片-转移到PVDF膜上的分子染色剂(4A)。Aurodye染色(Amersham)；-用活(4B)或死(4C)细菌免疫的豚鼠的血清混合物；-用从BCG纯化的抗原(感染和免疫(1993)61742-750)免疫的兔的血清(4D)；-单克隆抗体I-1081(4E)。
这些PVDF膜预先接受在低压离子交换柱上分离的或在丙烯酰胺凝胶上电泳上分离的流份分子。0道是粗起始材料，1道是非保留流份，2道是保留的流份。
图5A-5E表示相应于在Si300凝胶过滤柱上得到的5个流份(1到5)和从低压DEAE柱的非保留流份(0)迁移后得到的凝胶的PVDF膜。PVDF膜上的相同凝胶转移后，利用蛋白质染色剂〔Aurodye，Amersham(5A)〕或用活(5B)或死(5C)细菌免疫的豚鼠血清或兔的血清(5D)或单克隆抗体(5E)显色。
图6A-6E表示在高压离子交换柱上得到的流份(1-3)和用分子筛过滤得到的流份1(0孔)迁移得到凝胶的PVDF膜，用下列方法使所述膜显色-用蛋白质染色剂(6A)，-用来自分别用活(6B)或死(6C)细菌免疫的豚鼠血清的抗体，-用兔血清(6D)，-用单克隆抗体(6E)。
图7A-7D表示在离子交换柱上得到的流份1(0)和用反相层析得到的流份(1-5)迁移后，在膜上的凝胶印迹，用与6A-6B，6D-6E编号相同的相同试剂显色。
图8表示在耻垢分支杆菌中，筛选用于表达结核分支杆菌H37Rv的基因文库。在不同的稀释度检测了牛分支杆菌BCG、未转化的耻垢分支杆菌和用表达或不表达抗体识别重组蛋白质之重组克隆转化的耻垢分支杆菌的上清液。
图9表示电穿孔在大肠杆菌中并用碱裂解提取的从所述文库中筛选的三个粘粒，在琼脂糖凝胶中的迁移。
图10表示从大肠杆菌NM554中提取的、用BamHI(a)，SmaI(b)，HpaI(c)，NotI(d)，SspI(e)，EcoRI(f)和HindIII(g)消化的pLA1粘粒DNA在凝胶上的迁移。
图11说明45/47kDa蛋白质在分支杆菌中的表达。洗涤7天细菌培养的上清液，在Amicon PM10上浓缩，冻干，然后作免疫印迹分析。用稀释到1/500的兔血清的多克隆抗体显示所述蛋白质。
培养孔分别含(1)0.25μg来自牛分支杆菌BCG的纯化的45/47kDa蛋白质，(2)5μg用pLA1转化的耻垢分支杆菌mc2155的上清液，(3)5μg来自未转化的耻垢分支杆菌mc2155的上清液，(4)5μg牛分支杆菌BCG的上清液。
图12说明45/47kDa蛋白在分支杆菌中的表达。洗涤细菌培养的上清液，在Amicon PM10上浓缩，冻干，然后用竞争性ELISA检测分析。用1/8000稀释的兔多克隆血清显示不同浓度的冻干上清液，然后将该混合物转移到已经固定有纯化蛋白质的孔中。
图13A和13B是通过将pLA1粘粒的BamHI消化片段连接在pUC18中而得到的质粒图(13A)和不同pUC18结核分支杆菌H37Rv重组克隆的BamHI限制图(13B)。该图表示所研究的36个克隆中的21个克隆。孔“p”对应于参考载体pUC18，孔“m”为大小标记，所述标记是Pvu II裂解的pKN质粒片段。
图14是可以在大肠杆菌中表达45/47kDa蛋白质的插入片段的限制图谱。通过在两个方向含3kb插入片段的pLA34和pLA4中缺失得到一组克隆。箭头表示通过“正”和“反”引物从这些克隆测列的方向。B，BamHI S，Sma I E，EcoRI K，Kpn IH，HindIII Sa，Sal I Sp，Sph I图15说明45/47kDa蛋白质在大肠杆菌中的表达。通过免疫印迹分析细菌培养裂解物。
用在DEAE上纯化然后吸附在大肠杆菌裂解产物上的兔多克隆抗体显示蛋白质，所述裂解产物固定在用溴化氰激活的Sepharose-4B柱上。
所述孔分别含(1)0.2μg纯化的45/47kDa蛋白质，(2)25μg用pLA34-2转化的大肠杆菌XL-Blue，(3)25μg用pLA34转化的大肠杆菌XL-Blue，(4)25μg未转化的大肠杆菌XL1-Blue。
图16说明45/47kDa蛋白质在大肠杆菌中的表达。以粗品形式使用经竞争性ELISA分析的细菌培养裂解物。
图17是本发明SEQ ID NO2序列和麻风分支杆菌蛋白质序列(mln431)的比较。
图18序列SEQ ID NO2蛋白质的疏水性图。实施例1纯化结核分支杆菌抗原的方法1)抗原的获取按照有关BCG培养的常规技术(Gheorghiu等，Bull.InstitutPasteur 1983，81281-288)，在含130ml Sauton合成培养基的烧瓶中进行结核分支杆菌(菌株H37Rv)的培养。37℃20天后收集培养基，轻轻倒出上清液，然后在室温过滤(0.22μm)。为了安全，在手套箱中完成这些操作。在用于下列操作之前，在安全罩下，在0.22μm过滤器上再过滤培养基在2巴和4℃下，置于Amicon(PM10)膜上后，用含4％丁醇的反渗透(retro-osmosed)水剧烈洗涤所述培养基，然后将原体积浓缩10-20倍。将含有Amicon PM10膜不能除去之分子的该浓缩培养基冻干，称重，然后于-20℃作为粉末贮存。从70升培养基中得到12g用于下列纯化方法的起始物质。纯化方案2)低压离子交换柱
用约240ml Triacyl M凝胶(SEPRACOR)装填高300mm直径为32mm的低压制备性离子交换柱。用含4％丁醇的缓冲盐溶液(10mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝7，10mM NaCl)平衡。
溶解(在所述缓冲盐溶液中)前步制备的浓缩且冻干的物质，然后以40000 G超离心120分钟。只收集离心溶液的上层部分(4/5)，然后上样于蠕动泵控制下的离子交换柱上。收集柱不滞留的第一主流份。用缓冲盐溶液(10mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH＝7.5，10mM NaCl)洗脱后，得到第二流份。在2巴的压力下加到Amicon PM10膜上后，用含4％丁醇的反渗透水剧烈洗涤各流份，然后浓缩约15倍。在柱上不滞留的流份含2.9g物质，其主要分子在以后步骤中纯化。在柱上滞留，然后用盐溶液洗脱的流份含约1.01g物质。3)凝胺过滤用含4％丁醇的缓冲盐溶液(50mM Na2HPO4，用KH2PO4将pH调到7.5)平衡高压制备性Si300柱，3μm，50×750mm(SERVA)；已预先在膜(0.22μm)上过滤了该溶液。将柱流速调到1.25ml巴/分；没有达到设在45巴的最大压。
在缓冲液/丁醇溶液中制备50mg/ml浓度的待注射到该柱上的物质。制备10ml样品，然后于-20℃冷冻。融解后再过滤并注射到柱上的各份10ml样品含约500mg的粗物质。图1列出了典型分离程序在240nm的光密度图。4℃下浓缩以该图为基础而选择的5个主要流份，在Amicon PM10膜上，用含4％丁醇的反渗透水剧烈洗涤。将各浓缩流份冷冻干燥，称重，然后于-20℃贮存。从该步骤得到的流份1含有主要分子，这些分子被用活细菌免疫的豚鼠的抗体或来自结核病人的抗体所识别。只将该流份用于下述步骤。4)离子交换柱用含4％丁醇的缓冲盐溶液(10mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH-7.5和10mMNaCl)平衡DEAE-TSK 5PW制备性柱，21.5×150mm(LKB)。6ml/分流速的最大压力小于30巴。洗脱缓冲液只改变NaCl的浓度(1M)。在注射了共含100mg上述物质的4ml样品后，按照图2所示的程序用线性梯度洗脱。根据240nm的光密度图收集主要流份。浓缩这些流份，用含4％丁醇的反渗透水在Amicon PM10膜上洗涤，然后冻干。称重后，将各流份于-20℃贮存。这一步骤中，只有流份1含有被来自活细菌免疫的豚鼠之抗体识别的主要分子；然后将其用于下列分离步骤。5)反相柱以最大压115巴下2ml/分的流速，用0.22μm过滤的乙酸铵缓冲液(20mM NH4COOCH3)平衡4.6×250mmRP 300C810μm(Aquapore Brownlee lab.)柱。在注射了1ml体积中的10mg样品后，根据图3所示的图，使用含90％乙腈的洗脱缓冲液。220nm的光密度图中分离了5个主要流份，然后在40℃真空蒸发所示流份，然后冻干。6)抗原的免疫检测按照Laemmli(自然，1970，277，680-685)的常规技术，制备10％聚丙烯酰胺0.1％SDS变性凝胶。将10μl含5％巯基乙醇、3％SDS和痕量溴酚蓝的缓冲液中的含10-2μg物质(根据纯化阶段而不同)的样品加在凝胶各泳道中。电泳到达蓝色迁移极限后，用中度电场转移过夜，将样品中的分子转移到PVDF膜(Millipore)上(Harlow和Lane，抗体实验室手册。冷泉港实验室编，#1988)。
用考马斯蓝溶液将PVDF片染色不到1分钟，然后脱色，可以辨出分子量标记，用铅笔将其形状画出。完全脱色后，在室温用PBS+Triton×1003％洗涤所述片30分钟，然后用PBS单独洗涤3次计5分钟。接着在37℃，用含5％脱脂奶粉的PBS饱和该片，然后用PBS+吐温20(0.2％)洗涤3次。
与在PBS+吐温20缓冲液(0.2％)+奶粉(5％)中稀释1/20倍的抗血清在37℃保温1小时，同时定时搅拌。在与用碱性磷酸酶标记的抗免疫球蛋白抗体保温前，用PBS+吐温再洗涤3次。以在PBS+吐温20(0.2％)+奶(5％)中1/2500的终稀释度使用经磷酸酶(Biosys)标记的人和豚鼠抗免疫球蛋白抗体。37℃保温1小时30分钟后，用PBS+吐温洗涤PVDF片3次，然后在含BCIP和NBT的显色缓冲液(Harlow and Lane，上文引述的)中于室温保温5-10分钟。终止反应，在该片干燥后照相。7)氨基酸组成在巴斯德研究所有机化学部分析了各层析流份的总氨基酸组成。使用Beckman LS 6300分析仪。
表示为氨基酸频率的45-47kD蛋白质总组成如下ASN/ASP10.4％；THR5.7％；SER5.6％；GLN/GLU6.3％；GLY7.1％；ALA19.3％；VAL6.2％；ILE2.2％；LEU4.4％；TYR2.2％；PHE2.4％；LYS2.7％；ARG2.7％；PRO20.9％。实施例2测定结核病分支杆菌蛋白质和蛋白质流份的免疫特异性并分离被来自活细菌免疫的豚鼠抗体识别的抗原12-15只豚鼠的实验组(在试验开始时，Hartley雌性为250-300g)要么接受活分支杆菌(两次真皮内注射0.1ml盐溶液中的2×107活单位的BCG)，要么肌肉内接受0.5ml盐溶液不完全弗氏佐剂乳液(1/1)中的2mg热灭活(120℃，30分钟)的相同菌株的分支杆菌。在免疫后7-12个月，取各细豚鼠的血清样品，过滤(0.22μm)，然后分成小体积，随后冷冻并于-20℃贮存。对各组的抗血清(用活细菌免疫后5组，用灭活的细菌免疫后6组)进行了试验。用代表各免疫类型的血清组得到了所报道的结果；相同免疫方法的组之间的差异很小。1)在低压离子交换柱上的分离步骤将培养液(洗涤，并用Amicon PM10膜浓缩，然后冻干)超离心，然后负载到低压离子交换柱上。收集得到两个流份，一个是柱不滞留的，另一个是用高摩尔的缓冲溶液洗脱的，收集后洗涤并用Amicon PM10膜浓缩，然后冻干。
将各流份(10μg)加在SDS凝胶道上，电泳程序后，转移到PVDF膜上并进行免疫检测，鉴定含有与不同血清反应的主分子的流份。
图4表示用转移蛋白质染色(Aurodye-Amersham)(4A)或用活细菌(4B)或死(4C)细菌免疫的豚鼠血清显示的相同凝胶的免疫印迹。免疫印迹4D和4F分别是用抗BCG分子(感染和免疫，1993，61，742-750)的兔血清和生产单克隆抗体的I-1081杂交瘤(保藏于巴斯德研究所微生物全国保藏中心，Collection nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)at the Institut Pasteur)上清液显示的免疫印迹。只有不在柱上滞留的流份含有被活或死细菌免疫的豚鼠血清识别的或被上述杂交瘤上清液识别的45/47kDa分子。2)在Si300上的分子过滤步骤以含500mg物质的10ml样品体积，将上步非滞留流份注射到Si300柱上。根据图1所示的图谱分离流份1-5，将连续注射的产物合在一起，然后洗涤，浓缩并冻干。
将各流份(10μg)置于SDS凝胶道上；在电泳程序后，转移到PVDF膜上并进行免疫检测，鉴定含与不同血清反应的主蛋白的流份。
图5是通过蛋白质染色(Aurodye-Amersham)或通过用活(5B)或死(5C)细菌免疫的豚鼠血清显示的相同凝胶的免疫印迹。分别用从BCG纯化的抗这些分子的兔血清和I-1081单克隆抗体显示免疫印迹5D和5E。
流份1中的45和47KD抗原基本被用活细菌免疫的动物抗体或多克隆兔血清或单克隆抗体识别。选该流份用于第二步纯化。3)离子交换柱分离步骤将100mg上述流份的样品负载到DEAE-TSK制备柱上，然后用NaCl梯度洗脱。洗脱分子的220nm图分成三个主要流份(图2)。收集在一起后，洗涤通过连续注射物质而得到的各流份，浓缩并冻干。
5μg的上述各流份在SDS凝胶上电泳后，通过蛋白质染色(Aurodye)(图6A)、用活(图6B)或死(6C)细菌免疫之豚鼠的血清、兔血清(6D)或单克隆抗体(图6E)显示PVDF片上的免疫印迹。流份1-DEAE只含很少的由死细菌免疫的动物抗体识别的抗原。另一方面，该流份1-DEAE含有被活细菌免疫的豚鼠抗体、以及兔血清和单克隆抗体强烈识别的45/47kD双峰。选该流份1-DEAE用于下列纯化步骤。4)反相柱步骤用乙酸铵缓冲液(20mM)平衡的10μm RP300柱接受最多含5-10mg上述流份1-DEAE的1ml样品。按照图3的曲线，用0-90％的乙腈梯度洗脱可以回收5个主流份。40℃真空浓缩这些流份以除去大部分乙腈，然后冻干。
流份4(30-50％乙腈梯度)含大部分由用活细菌免疫之动物的抗体或兔血清中存在的抗体或单克隆抗体识别的分子，用Aurodye将蛋白质染色后显示这些分子(图6)。实施例3在耻垢分支杆菌和大肠杆菌中克隆并表达结核分支杆菌的45/47kD蛋白质1)材料和方法1.1细菌菌株和生长条件，上清液以及细菌提取物的制备37℃下在Sauton合成培养基中培养牛分支杆菌BCG(菌株1173P2)7天，然后在0.22μm膜上过滤上清液。接着，在存在4％丁醇的条件下贮存这些粗制上清液，或在Amicon-PM膜上浓缩并冻干。
37℃下在7H9+OADC液体培养基中培养耻垢分支杆菌mc2155(Sanpper等，1990，分子生物学，4，1911-1919)7天。存在25mg/ml卡那霉素的条件下，培养用pYUB18结核分支杆菌文库的粘粒转化的各耻垢分支杆菌mc2155克隆。然后将培养物以5000rpm离心15分钟，分离培养物的上清液并在4℃及4％丁醇存在的条件下贮存。将这些制剂用于ELISA检测，其中培养基的组成不妨碍。在SDS-PAGE凝胶上分析克隆培养物的上清液时，将其在Sauton合成培养基中37℃下培养7天，在0.22μm膜上过滤培养上清液，然后在Amicon-PM膜上浓缩并冻干。
37℃下在固体或液体Luria-Bertani(LB)培养基中培养大肠杆菌NM554和XL1-Blue菌株。存在25μg/ml氨苄青霉素的条件下，培养用pUC18质粒转化的大肠杆菌XL1-Blue的克隆。
通过在-70℃和+60℃迅速冷冻/融化培养过夜(16小时)后得到的细菌来制备大肠杆菌XL1-Blue的和用重组pUC18结核分支杆菌质粒转化的各克隆的细菌培养裂解产物。将裂解产物离心，分离上清液，然后于-20℃贮存。用BCA(Pierce)技术分析来自这些制剂的蛋白质。1.2克隆戴体用Stewart Cole的方法在耻垢分支杆菌mc2155中电穿孔得到所用结核分支杆菌的基因文库(Jacobs等，1991，上文引述的)。本申请人有400个重组克隆。
在一粘粒即穿梭载体pYUB18中构建文库。该粘粒衍生于pYUB12质粒(Snapper等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，856987-6991)，其中已经插入了λ噬菌体的Cos序列，使得能够扩增并以噬菌体裂解物的形式良好地保留文库中的重组粘粒。用下列方法产生该文库在可以得到最大为35kb-45kb片段的条件下，用酶Sau3a部分消化结核分支杆菌菌株H37Rv的基因组DNA。纯化这些片段，然后连在用限制性内切酶BamHI消化并去磷酸化的pYUB18中。
pUC18质粒载体(Yanisch-Perron等，基因1985，33103-119)用于在大肠杆菌XL-Blue中亚克隆。该多拷贝质粒携带衍生于大肠杆菌lac操纵子的、编码β-半乳糖苷酶氨基末端片段的DNA片段。该片段是异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导的，而且能够与大肠杆菌XL1-Blue宿主菌株编码的缺陷型β-半乳糖苷酶形式建立α-互补。因此，插入外源DNA会使α-互补遭到破坏。与用pUC18质粒转化的细菌所呈现的蓝色菌落相比，当将重组质粒转化在宿主菌株中时，通过白色菌落可以对其进行鉴定。存在IPTG和X-Gal酶底物的条件下进行筛选。1.3分子生物学技术1.3.1提取耻垢分支杆菌mc2155粘粒用经修改适用于耻垢分支杆菌的破性裂解技术(Jacobs等，1991，上文引述的)来提取重组pYUB18结核分支杆菌粘粒。在培养第5天(指数生长期末)收集细菌，以5000rpm离心10分钟。将细菌沉淀物(3ml)重悬在5ml溶液A(50mM葡萄糖，25mM Tris Hcl pH8，10mM EDTA，溶菌酶10mg/ml)中，并在37℃保温20分钟。然后加入2体积(10ml)的溶液B(0.2NNaOH，1％SDS)，并倒置混合。将混合物在65℃保温30分钟，然后在4℃再保温15分钟。最后加入1.5体积(7.5ml)的溶液C(5mM酸钾，11.5％乙酸)并倒置混合。将混合物在4℃保温30分钟。4℃下将制品以13000rpm离心15分钟，回收上清液，测量并用相同体积50/50酚/氯仿处理。
提取后，将试管以4000rpm离心10分钟。将水相转移到一干净试管中，加入2体积的贮存于-20℃的乙醇。倒置后，将其在-20℃保持至少1小时，然后以12000rpm离心30分钟。最后用于-20℃保存的1体积70％的乙醇洗涤沉淀物，然后用Speed-Vac干燥5分钟。取干残留物放在500μ1蒸馏水中，然后于-20℃贮存。1.3.2提取并纯化大肠杆菌质粒用碱性裂解技术(Birnboim等，核酸研究，1979，71513)迅速提取pYUB18粘粒和pUC18重组质粒。
在存在溴化乙锭的条件下，在氯化铯梯度上超离心来纯化碱性裂解步骤后的相关粘粒和重组质粒(Maniatis等，纽约冷泉港；冷泉港实验室出版社，1982)。1.3.3转化技术用氯化钙的化学方法按常规技术，用pUC18重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue。首先制备感受态细菌用1/100过夜预培养物接种20ml2YT培养基。37℃下振动培养细菌2小时直到OD＝0.6，然后在4℃下以4000rpm离心10分钟。将沉淀重悬在8ml 100mM CaCl2中，在融冰上保持15分钟，然后再以4000rpm4℃下离心10分钟。最后将沉淀重悬在1.6ml 100mM CaCl2中，在融冰上保持30分钟。
将由此制备的感受态细菌直接用于转化或可在4℃下贮存数天。在转化时，将200μl的感受态细菌与2μl的DNA混合。将混合物在融冰上保持45分钟，然后在42℃热休克2分钟。加入800μl 2YT培养基，接着，在37℃搅拌下将制品保温1小时，然后再以每盘50-200μl铺到ML-氨苄青霉素平皿上。第二天对菌落计数，并计算转化效率。电穿孔物理方法该技术用于用大载体转化大肠杆菌已用大于50kb的重组pYUB18粘粒电穿孔大肠杆菌NM554菌株。制备新鲜的感受态细菌用1/100过夜预培养物接种200ml 2YT培养基；将细菌在37℃培养3小时，然后以6000rpm离心10分钟。4℃下将沉淀置于10ml无菌水中，然后再放在4℃的190ml无菌水中。6000rpm再离心10分钟，再用4℃10ml无菌水洗涤。最后将沉淀物重悬于400μl10％甘油中。
在Bio-Rad基因脉冲仪上完成电穿孔。将100μl细菌与1-4μl的DNA在一0.4mm小池中混合。混合物经电冲击(2500瓦，25μF)，然后迅速加入1ml 2YT培养基。整个转移到一试管中，在37℃搅拌下保温1小时。保温后，将培养物以每盘50-200μl铺到ML-氨苄青霉素平皿上。第二天对菌落计数，并计算转化效率。1.3.4克隆的酶消化片段用BamHI限制核酸内切酶消化待克隆的DNA。用相同的方法消化pUC18质粒。将得自所需pYUB18重组粘粒的片段通过T4 DNA连接酶(Amersham)连接在质粒中。在20μl体积中16℃过夜连接。用全部的连接混合物转化大肠杆菌XL1-Blue。表型表达后，将所有细菌铺在含氨苄青霉素25mg/ml、IPTG、X-Gal的ML平板上。不再能进行α-互补的重组克隆通过白色菌落显示出来。
通过克隆纯化后，研究重组克隆。用碱性裂解法提取质粒DNA，然后用限制核酸内切酶BamHI消化前或后，在0.8％琼脂糖凝胶上进行分析。1.3.5限制图谱的产生用在pUC18多位点接头(多接头)中有位点的不同限制核酸内切酶消化pLA34和pLA4重组质粒，它们在两个方向均含有克隆的3kbBamHI-BamHI插入片段。用限制核酸内切酶BamHI，HindIII，SphI，XbaI，SalI，KpnI，EcoRI和SmaI完成单和双消化，然后在0.8％琼脂糖凝胶上分析。用溴化乙锭将DNA染色后，根据与标记(一种实验室内标，用pvuII消化的pKN质粒)相比的迁移距离确定不同片段的大小。1.4蛋白质的检测方法1.4.1 ELISA技术用多克隆血清进行竞争性ELISA试验，测定45/47kDa蛋白质在从细菌培养物得到的不同制品中的浓度(Romain等，1993，上文引述的)。
用常规免受技术得到抗45/47蛋白质的多克隆兔血清注射50μg在不完全弗氏佐剂中的纯化蛋白质，一个月后，注射25μg。
用在碳酸盐缓冲液中浓度为1μg/ml的纯化蛋白质溶液或浓度为10μg/ml的15天牛分支杆菌BCG上清液覆盖第一微培养板的孔。37℃经1小时完成抗原固定，然后用PBS将所述微平板洗涤5次。在第二次保温中，用含0.5％明胶、4％丁醇的PBS溶液37℃下将孔饱和1小时。然后用PBS-吐温0.1％将微平板洗涤5次。
按如下完成试验在第二微平板中，在含吐温0.1％、0.25％明胶、4％丁醇的PBS中不同稀释度(纯的，1/2，1/4，1/8等)的待分析上清液50μl，和用含吐温0.1％、0.25％明胶、4％丁醇的PBS 1/4000稀释度制备的50μl的兔血清在37℃保温1小时，然后将混合物转移到第一微平板上，并在37℃保温1小时。用PBS-吐温0.1％将微平板洗涤10次。最后，将用含吐温0.1％、0.25％明胶、4％丁醇的PBS以1/4000稀释度制备的碱性磷酸酶标记的抗IgG H+L抗-兔结合抗体(Biosys)于37℃保温1小时。用PBS-吐温0.1％将微平板洗涤10次。
最后在NaHCO3，MgCl2，pH9.6缓冲液中以40mg/24ml的浓度保温酶底物对-硝基苯基磷酸盐(pNPP)1小时或过夜。用Titerteck Twinreader读数器读取414nm和690nm处的OD值。1.4.2免疫印迹技术使用在变性SDS-PAGE凝胶上的常规凝胶-电泳技术(Laemmli，自然，1970，277680-685)，然后电转移到PVDF膜上(Towbin等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，1979，764350-4354；Pluskal等，生物技术，1986，4272-283)。
定量测量凝胶上所分析的样品耻垢分支杆菌上清液的冻干物(上样5μg)的μg数和大肠杆菌裂解物(上样25μg)的μg数。
以每道0.25μg蛋白质的浓度，将纯化牛BCG蛋白质载于凝胶上。
对于分支杆菌中表达的蛋白质，用稀释度为1/500的兔多克隆血清显示转移到膜上的蛋白质。
为了显示大肠杆菌中的重组蛋白质，在DEAE(TrisacrylD)柱上纯化这些多克隆抗体，所得免疫球蛋白然后吸附在固定于通过溴化氰激活的Sepharose-4B柱(Pharmacia)(Maniatis等，1982)上的大肠杆菌裂解物上。于4℃贮存不滞留的抗体，然后用于以1/100的稀释度显示转移到膜上的蛋白质。
一种用碱性磷酸酶标记的、种特异性的抗Ig-H+L结合物(Bio-Sys)以1/3000用于显示上述抗体。最后用两种人工产色底物显示碱性磷酸酶活性四唑蓝和5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯。1.5DNA测序用通过两个克隆pLA34和pLA4的不同缺失而得到的一组克隆完成核苷酸测序。根据确定的限制图谱选择这种缺失。
从双链质粒DNA基质测序。用T7测序试剂盒(Pharmacia)和35S ATP按Sanger技术进行。
借助于不同缺失克隆和pUC18质粒的通用引物(正向和逆向引物)，然后用合成的寡核苷酸得到所述序列。
建立了两条互补链的序列。
利用含7-脱氮dGTP(dGTP的化学类似物)的T7脱氮G/A测序试剂盒(Pharmacia)测定因结核分支杆菌基因组DNA中高百分比GC(65％)而产生的压缩区的序列。1.6序列分析借助Unix上的STADEN程序比较并组装所得的连续序列。用GCG的FASTA和T-FASTA程序在EMBL和Gen-Bank数据库中进行序列同源性检索。2)结果2.1在耻垢分支杆菌中克隆并表达结核分支杆菌的45/47kDa蛋白质2.1.1筛选用于在耻垢分支杆菌中表达结核分支杆菌的基因文库通过克隆40kb的片段而产生所用的基因文库(Jacobs等，1991，上文引述的)，该片段得自用限制核酸内切酶Sau 3a部分消化的pYUB18粘粒载体的基因组。用4200kb的脉冲场电泳估计基因组的大小为含约100-150个克隆。
用竞争性ELISA试验确定液体培养基中的蛋白质(Romain等，1993，上文引述的)。该试验能够检测并确定45/47kDa蛋白质在牛分支杆菌BCG7天培养物上清液中的量(图8)。
该试验有下列优点良好的敏感性，即用稀释到1/8000的多克隆血清，可以检测液体培养基中1ng/ml的蛋白质(Romain等，1993，上文引述的)，就迅速筛选系列样品而言，很容易操作。
筛选电穿孔在耻垢分支杆菌中的400个pYUB18结核分支杆菌H37Rv重组克隆系列。
为此，将不同克隆在7H9+OADC培养基中培养7天。分析离心培养物后得到的上清液来研究重组蛋白质。
发现三个克隆能够表达被牛分支杆菌BCG45/47kDa蛋白质特异性的多克隆抗体识别的蛋白质(图8)。在所述第一次筛选过程中，用其中45/47kDa蛋白质占总量2％的牛分支杆菌BCG培养上清液覆盖微滴定板的孔。在用纯化45/47kDa蛋白质覆盖微滴定板孔的第二个试验中，证实了所选的三个克隆。2.1.2所选重组粘粒的遗传分析为了研究所选的不同粘粒，用改进的碱性裂解方法提取耻垢分支杆菌DNA后，将其电穿孔在大肠杆菌NM554中。事实上，分支杆菌染色体外DNA很难得到，一方面是因为细胞壁的复杂性而难于裂解，而且因为载体的拷贝数低，平均每个细菌3-10个。在ML-卡那霉素平皿中分离转化到大肠杆菌NM554中的所述三个克隆，在0.8％琼脂糖凝胶上分析用碱性裂解法提取的粘粒DNA。
所述三个克隆的DNA大于50kb。用限制核酸内切酶BamHI消化以区分这三个所选粘粒的图谱。图谱表明是相同的(图9)。图谱表明有一个相应于pYUB18载体的12kb的带，以及一系列相应于克隆DNA片段的低分子量带(约40kb)。考虑到所得带的数量和其在凝胶上的位置，可以认为分离的这些粘粒是相同的。
用在G+C富集的DNA中有高或低频切割位点的限制核酸内切酶分别对pLA1粘粒进行不同的消化以区分中等长度、足以含45/47kDa蛋白质结构基因并足以进行其亚克隆的片段(图10)。2.1.3在耻垢分支杆菌中表达结核分支杆菌的45/47kDa蛋白质含约40kb插入片段的pLA1粘粒可以在耻垢分支杆菌中表达重组蛋白质，用多克隆抗体检测培养上清液。
为了确定所表达蛋白质的大致大小，用免疫印迹分析7天培养物的冻干上清液。在耻垢分支杆菌中表达的重组蛋白质有显然与牛分支杆菌BCG中表达的相同的两个分子量45/47kDa蛋白质(图11)。
在另一试验中，将这些重组蛋白质在耻垢分支杆菌中的表达水平与牛分支杆菌BCG中的进行比较。在用竞争性ELISA试验测定的过程中，使用定量的冻干上清液蛋白。用1/8000稀释度的兔多克隆血清显示冻干上清液的不同浓度。重组耻垢分支杆菌可以以比牛分支杆菌BCG高5倍的量表达所述蛋白质(图12)。
进行了该插入片段的亚克隆和在异源宿主(大肠杆菌)中的重组蛋白质分析，以确定编码这些蛋白质的基因数量。2.2在大肠杆菌中克隆并表达结核分支杆菌的45/47kDa蛋白质2.2.1在大肠杆菌中亚克隆并表达45/47kDa蛋白质当pLA1被转化在异源宿主大肠杆菌NM554中时，在细菌培养物上清液或裂解产物中没有检测到重组蛋白。为了有利于表达这些蛋白质，将得自BamHI消化的粘粒片段亚克隆到pUC18质粒(Yanisch-Perron等，基因，1985，33103，119)中。
通过宿主细菌不表达β-半乳糖苷酶来筛选转化在大肠杆菌XL1-Blue中的pUC18结核分支杆菌重组质粒。用碱性裂解和限制核酸内切酶BamHI消化来制备每个“白色”克隆(来自36个克隆)的质粒DNA。
在琼脂糖凝胶中观察到的所得质粒的大小有数个图谱，表明重组质粒是不同的(图13A)。
在琼脂糖凝胶中观察到的克隆插入片段的大小也有不同的限制图谱(图13B)。这些图谱均有相应于pUC18载体的2.8kb片段，和相应于克隆插入片段的不同大小的系列片段。
单独克隆所有的消化片段，两三个一起，除12kb片段之外，因为该片段太大而很难克隆。
针对诱导大肠杆菌XL1-Blue中重组蛋白质的表达能力筛选所选36个克隆。用与前述相同的竞争性ELISA试验进行该试验。
在细菌上清液中未检测到重组蛋白质。另一方面，在含至少一个3kb插入片段的克隆的细菌裂解物中检测到了重组蛋白质。
在该试验中测量的蛋白质的表达水平似乎受质粒大小的影响。在所研究的36个克隆中，发现2个克隆可以表达，即分别含3kb和7kb插入片段的pLA34和pLA35。如在表1(见下文)结果中所示，pLA34表达水平高些。2.2.2 pLA34和pLA34-2克隆的限制图谱确定在pUC18多位点接头(多接头)中存在的现有限制核酸内切酶的不同裂解位点建立pLA34质粒的限制图谱(图14)。一个单-EcoRI限制位点将3kb的插入片段分成2kb和1kb的两个片段。
通过缺失从上述克隆产生含有2kb BamHI-EcoRI插入片段的pLA34-2克隆。该克隆也可以表达在细菌裂解物中检测到的重组蛋白质(图15)。
细菌裂解产物的免疫印迹分析表明有分子量为45和47kDa的蛋白质，显然与在牛分支杆菌BCG中表达的天然蛋白质相同(图16)。2.2.3分析编码结核分支杆菌H37Rv45/47kDa蛋白质的核苷酸序列在序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中列出了编码45/47kDa蛋白质之基因的完整核苷酸序列、上游序列和推导的氨基酸序列。可以表达蛋白质双峰的单基因在核苷酸序列的位置1082和2056(包括)之间含有975个碱基对。
在基因上游鉴定了固定核糖体的保守序列(Shine Dalgarno)。
与结核分支杆菌65％的GC相比，该基因的GC百分比高达69.4％。
从该基因推导的蛋白质有一典型的信号序列，该序列含有信号肽酶的ANA裂解位点。
该基因编码有325个氨基酸，包括39个氨基酸的信号序列的蛋白质。
通过牛分支杆菌BCG和结核分支杆菌纯化蛋白质的氨基酸组成的生物化学分析结果与推导的蛋白质序列相比，有良好的一致性(表2)。得出这样的结论，有一个可以在耻垢分支杆菌和大肠杆菌中表达两种分子量蛋白质的单一基因。2.2.4蛋白质序列分析和序列比较从推导的氨基酸序列计算的分子量为28.7kDa。
计算的等电点为4.36。这一结果也与用生物化学方法对纯化牛分支杆菌蛋白质测定的等电点有良好的一致性。
推导的氨基酸序列表明有高百分比Pro和Ala(21.8％和19.1％)。
完整序列与最近描述的麻风分支杆菌蛋白质有同源性。在图17中比较了这两个序列。两种蛋白质之间的同源性为65.4％。所报道的该麻风分支杆菌的蛋白质也有一分泌蛋白的典型信号序列。
已建立了本发明主题物结核分支杆菌的推导蛋白(SEQ ID NO.2)的疏水性图谱。示于图18中。表1 允许在大肠杆菌中表达重组蛋白质的3kb插入片段在pUC18中的克隆
表2结核分支杆菌和牛分支杆菌BCG45/47kDa蛋白质和麻风分支杆菌27/32kDa蛋白质的氨基酸组成残基 推导序列(mol％) 化学分析(mol％)麻风分支杆菌 结核分支杆菌 结核分支杆菌 牛分支杆菌BCGA＝Ala 13.3 18.5 19.2 19.2B＝Asx -- 10.4 10.5C＝Cys 0.4 0＜0.5＜0.5D＝Asp 4.8 5.2 - -E＝Glu 4.8 3.1 - -F＝Phe 2.0 2.5 2.4 2.2G＝Gly 8.0 7.0 7.1 7.4H＝His 0.8 0.3 0.4 0.4I＝Ile 5.2 2.5 2.2 2.3K＝Lys 2.8 2.5 2.7 2.9L＝Leu 6.8 4.2 4.4 4.7M＝Met 0.8 0.7 0.5 0.5N＝Asn 4.0 4.5 - -P＝Pro 13.3 21.7 20.9 21.9Q＝Gln 3.2 2.8 - -R＝Arg 2.8 2.8 2.7 2.5S＝Ser 9.6 5.9 5.6 5.0T＝Thr 4.8 6.3 5.7 5.4V＝Val 8.0 5.9 6.2 5.8W＝Trp 1.2 1.4 N.D. N.D.Y＝Tyr 2.8 2.1 2.2 2.2Z＝Glx -- 6.3 6.0*Asx＝Asp+AsnGlx＝Glu+Gln序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称Institut Pasteur(B)街道Docteur Roux大街28号(C)城市巴黎(E)国家法国(F)邮政编码75724(G)电话45688000(H)传真43069835(I)电传2506097F(ii)本发明题目分支杆菌蛋白质，其产生菌和作为疫苗和检测结核病的用途(iii)序列数目3(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(OEB)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度2061个碱基对(B)类型核苷酸(C)链数双链(D)构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iv)反义无
(ix)特征(A)名称/关键字CDS(B)位置1082..2057(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGCTCGGGC CCAACGGTGC GGGCAAGTCC ACCGCCCTGC ATGTTATCGC GGGGCTGCTT60CGCCCCCGAC GCGGGCTTGG TACGTTTGGG GGACCGGGTG TTGACCGACA CCGAGGCCGG120GGTGAATGTG GCGACCCACG ACCGTCGAGT CGGGCTGCTG TTGCAAGACC CGTTGTTGTT180TCCACACCTG AGCGTGGCCA AAAACGTGGC CTTCGGACCA CAATGCCGTC GCGGGATGTT240TGGGTCCGGG CGCGCGCTAG GACAAGGGCG TCGGCACTGC GATGGCTGCG CGAGGTGAAC300GCCGAGCAGT TCGCCGACCG TAAGCCTCGT CAGCTATCCG GGGGCCAAGC CCAGCGCGTC360GCCATCGCGC GAGCGTTGGC GGCCGAACCG GATGTGTTGC TGCTCGACGA GCCGCTGACC420GGACTCGATG TGGCCGCGGC CGCGGGTATC CGTTCGGTGT TGCGTAGTGT CGTCGCGAGG480AGCGGTTGCG CGGTAGTCCT GACGACCCAT GACCTGCTGG ACGTGTTCAC GCTGGCCGAC540CGGGTATTGG TGCTCGAGTC CGGCACGATC GCCGAGATCG GCCCGGTTGC CGATGTGCTT600ACCGCACCTC GCAGTCGTTT CGGAGCCCGT ATCGCCGGAG TCAACCTGGT CAATGGGACC660ATTGGTCCGG ACGGCTCGCT GCGCACCCAG TCCGGCGCCC ACTGGTACGG CACCCCGGTC720CAGGATTTGC CTACTGGGCA TGAGGCAATC GCGGTGTTCC CGCCGACGGC GGTGGCGGTG780TATCCGGAAC CGCCGCACGG AAGCCCGCGC AATATCGTCG GGCTGACGGT GGCGGAGGTG840GATACCCGCG GACCCACGGT CCTGGTGCGC GGGCATGATC AGCCTGGTGG CGCGCCTGGC900CTTGCCGCAT GCATCACCGT CGATGCCGCC ACCGAACTGC GTGTGGCGCC CGGATCGCGC960GTGTGGTTCA GCGTCAAGGC GCAGGAAGTG GCCCTGCACC CGGCACCCCA CCAACACGCC1020AGTTCATGAG CCGACCCGCG CCGTCCTTGC GTCGCGCCGT TAACACGGTA GGTTCTTCGC1080C ATG CAT CAG GTG GAC CCC AAC TTG ACA CGT CGC AAG GGA CGA TTG1126Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys Gly Arg Leu1 5 10 15GCG GCA CTG GCT ATC GCG GCG ATG GCC AGC GCC AGC CTG GTG ACC GTT 1174Ala Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser Ala Ser Leu Val Thr Val20 25 30GCG GTG CCC GCG ACC GCC AAC GCC GAT CCG GAG CCA GCG CCC CCG GTA 1222Ala Val Pro Ala Thr Ala Asn Ala Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val35 40 45CCC ACA ACG GCC GCC TCG CCG CCG TCG ACC GCT GCA GCG CCA CCC GCA 1270Pro Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala50 55 60CCG GCG ACA CCT GTT GCC CCC CCA CCA CCG GCC GCC GCC AAC ACG CCG 1318Pro Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro65 70 75AAT GCC CAG CCG GGC GAT CCC AAC GCA GCA CCT CCG CCG GCC GAC CCG 1366Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro80 85 90 95AAC GCA CCG CCG CCA CCT GTC ATT GCC CCA AAC GCA CCC CAA CCT GTC 1414Asn Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val100 105 110CGG ATC GAC AAC CCG GTT GGA GGA TTC AGC TTC GCG CTG CCT GCT GGC 1462Arg Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly115 120 125TGG GTG GAG TCT GAC GCC GCC CAC TTC GAC TAC GGT TCA GCA CTC CTC 1510Trp Val Glu Ser Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu130 135 140AGC AAA ACC ACC GGG GAC CCG CCA TTT CCC GGA CAG CCG CCG CCG GTG 1558Ser Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val145 150 155GCC AAT GAC ACC CGT ATC GTG CTC GGC CGG CTA GAC CAA AAG CTT TAC 1606Ala Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr160 165 170 175GCC AGC GCC GAA GCC ACC GAC TCC AAG GCC GCG GCC CGG TTG GGC TCG 1654Ala Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser180 185 190GAC ATG GGT GAG TTC TAT ATG CCC TAC CCG GGC ACC CGG ATC AAC CAG 1702Asp Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln195 200 205GAA ACC GTC TCG CTC GAC GCC AAC GGG GTG TCT GGA AGC GCG TCG TAT 1750Glu Thr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr210 215 220TAC GAA GTC AAG TTC AGC GAT CCG AGT AAG CCG AAC GGC CAG ATC TGG 1798Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp225 230 235ACG GGC GTA ATC GGC TCG CCC GCG GCG AAC GCA CCG GAC GCC GGG CCC 1846Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro Ala Ala Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro240 245 250 255CCT CAG CGC TGG TTT GTG GTA TGG CTC GGG ACC GCC AAC AAC CCG GTG 1894Pro Gln Arg Trp Phe Val Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val260 265 270GAC AAG GGC GCG GCC AAG GCG CTG GCC GAA TCG ATC CGG CCT TTG GTC 1942Asp Lys Gly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro Leu Val275 280 285GCC CCG CCG CCG GCG CCG GCA CCG GCT CCT GCA GAG CCC GCT CCG GCG 1990Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ala290 295 300CCG GCG CCG GCC GGG GAA GTC GCT CCT ACC CCG ACG ACA CCG ACA CCG 2038Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro305 310 315CAG CGG ACC TTA CCG GCC T GACC 2061Gln Arg Thr Leu Pro Ala320 325(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度325个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys Gly Arg Leu Ala1 5 10 15Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser Ala Ser Leu Val Thr Val Ala20 25 30Val Pro Ala Thr Ala Asn Ala Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro35 40 45Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro50 55 60Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro Asn65 70 75 80Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Asn85 90 95Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg100 105 110Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp115 120 125Val Glu Ser Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu Ser130 135 140Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val Ala145 150 155 160Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala165 170 175Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp180 185 190Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln Glu195 200 205Thr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr210 215 220Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp Thr225 230 235 240Gly Val Ile Gly Ser Pro Ala Ala Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro245 250 255Gln Arg Trp Phe Val Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp260 265 270Lys Gly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro Leu Val Ala275 280 285Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro290 295 300Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln305 310 315 320Arg Thr Leu Pro Ala325(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度286个氨基酸(B)类型氨基酸(D)构型线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO3Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro1 5 10 15Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro20 25 30Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn35 40 45Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Asn Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile50 55 60Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly65 70 75 80Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp Val Glu Ser Asp Ala Ala His85 90 95Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro100 105 110Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val Ala Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu115 120 125Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser130 135 140Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro145 150 155 160Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln Glu Thr Val Ser Leu Asp Ala Asn165 170 175Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro180 185 190Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro Ala195 200 205Ala Asn Ala Pro Asp Ala G1y Pro Pro Gln Arg Trp Phe Val Val Trp210 215 220Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp Lys Gly Ala Ala Lys Ala Leu225 230 235 240Ala Glu Ser Ile Arg Pro Leu Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro245 250 255Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala260 265 270Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln Arg Thr Leu Pro Ala275 280 28权利要求
1含有下列序列SEQ ID NO3至少一部分的蛋白质Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala AlaSer Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro AlaThr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn ThrPro Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro ProPro Ala Asp Pro Asn Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile AlaPro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg Ile Asp Asn Pro ValGly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp Val GluSer Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu LeuSer Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln ProPro Pro Val Ala Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly ArgLeu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ala Thr AspSer Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp Met Gly GluPhe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln GluThr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser AlaSer Tyr Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys ProAsn Gly Gln Ile Trp Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro AlaAla Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro Gln Arg Trp PheVal Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp LysGly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro LeuVal Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala GluPro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala ProThr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln Arg Thr Leu Pro Ala
2根据权利要求1的蛋白质，其特征在于它至少含有下列序列SEQ ID NO2的一部分Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys GlyArg Leu Ala Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser AlaSer Leu Val Thr Val Ala Val Pro Ala Thr Ala Asn AlaAsp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro Thr Thr Ala AlaSer Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro AlaThr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn ThrPro Asn Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro ProPro Ala Asp Pro Asn Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile AlaPro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg Ile Asp Asn Pro ValGly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp Val GluSer Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu LeuSer Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln ProPro Pro Val Ala Ash Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly ArgLeu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala Ser Ala Glu Ala Thr AspSer Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp Met Gly GluPhe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln GluThr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser AlaSer Tyr Tyr Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys ProAsn Gly Gln Ile Trp Thr Gly Val Ile Gly Ser Pro AlaAla Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro Gln Arg Trp PheVal Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp LysGly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro LeuVal Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala GluPro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala ProThr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln Arg Thr Leu Pro Ala
3一种含有权利要求1和2之一的至少序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的一部分和能够诱导免疫应答之肽或蛋白质序列的杂合蛋白质。
4根据权利要求3的蛋白质，其特征在于所述免疫应答是体液应答和/或细胞应答。
5根据权利要求3和4之一的蛋白质，其特征在于所述肽或蛋白质是白喉毒素、破伤风毒素、HBV病毒HBS抗原或脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或任何其它毒素或病毒抗原的部分，特别是表位。
6编码权利要求1-5中任一蛋白质的寡核苷酸。
7根据权利要求6的DNA，其特征在于它至少含有下列SEQ ID NO1序列的一部分GT GCTCGGGCCC AACGGTGCGG GCAAGTCCAC CGCCCTGCATGTTATCGCGG GGCTGCTTCG CCCCCGACGC GGGCTTGGTA CGTTTGGGGGACCGGGTGTT GACCGACACC GAGGCCGGGG TGAATGTGGC GACCCACGACCGTCGAGTCG GGCTGCTGTT GCAAGACCCG TTGTTGTTTC CACACCTGAGCGTGGCCAAA AACGTGGCCT TCGGACCACA ATGCCGTCGC GGGATGTTTGGGTCCGGGCG CGCGCTAGGA CAAGGGCGTC GGCACTGCGA TGGCTGCGCGAGGTGAACGC CGAGCAGTTC GCCGACCGTA AGCCTCGTCA GCTATCCGGGGGCCAAGCCC AGCGCGTCGC CATCGCGCGA GCGTTGGCGG CCGAACCGGATGTGTTGCTG CTCGACGAGC CGCTGACCGG ACTCGATGTG GCCGCGGCCGCGGGTATCCG TTCGGTGTTG CGTAGTGTCG TCGCGAGGAG CGGTTGCGCGGTAGTCCTGA CGACCCATGA CCTGCTGGAC GTGTTCACGC TGGCCGACCGGGTATTGGTG CTCGAGTCCG GCACGATCGC CGAGATCGGC CCGGTTGCCGATGTGCTTAC CGCACCTCGC AGTCGTTTCG GAGCCCGTAT CGCCGGAGTCAACCTGGTCA ATGGGACCAT TGGTCCGGAC GGCTCGCTGC GCACCCAGTCCGGCGCCCAC TGGTACGGCA CCCCGGTCCA GGATTTGCCT ACTGGGCATGAGGCAATCGC GGTGTTCCCG CCGACGGCGG TGGCGGTGTA TCCGGAACCGCCGCACGGAA GCCCGCGCAA TATCGTCGGG CTGACGGTGG CGGAGGTGGATACCCGCGGA CCCACGGTCC TGGTGCGCGG GCATGATCAG CCTGGTGGCGCGCCTGGCCT TGCCGCATGC ATCACCGTCG ATGCCGCCAC CGAACTGCGTGTGGCGCCCG GATCGCGCGT GTGGTTCAGC GTCAAGGCGC AGGAAGTGGCCCTGCACCCG GCACCCCACC AACACGCCAG TTCATGAGCC GACCCGCGCCGTCCTTGCGT CGCGCCGTTA ACACGGTAGG TTCTTCGCCA TGCATCAGGTGGACCCCAAC TTGACACGTC GCAAGGGACG ATTGGCGGCA CTGGCTATCGCGGCGATGGC CAGCGCCAGC CTGGTGACCG TTGCGGTGCC CGCGACCGCCAACGCCGATC CGGAGCCAGC GCCCCCGGTA CCCACAACGG CCGCCTCGCCGCCGTCGACC GCTGCAGCGC CACCCGCACC GGCGACACCT GTTGCCCCCCCACCACCGGC CGCCGCCAAC ACGCCGAATG CCCAGCCGGG CGATCCCAACGCAGCACCTC CGCCGGCCGA CCCGAACGCA CCGCCGCCAC CTGTCATTGCCCCAAACGCA CCCCAACCTG TCCGGATCGA CAACCCGGTT GGAGGATTCAGCTTCGCGCT GCCTGCTGGC TGGGTGGAGT CTGACGCCGC CCACTTCGACTACGGTTCAG CACTCCTCAG CAAAACCACC GGGGACCCGC CATTTCCCGGACAGCCGCCG CCGGTGGCCA ATGACACCCG TATCGTGCTC GGCCGGCTAGACCAAAAGCT TTACGCCAGC GCCGAAGCCA CCGACTCCAA GGCCGCGGCCCGGTTGGGCT CGGACATGGG TGAGTTCTAT ATGCCCTACC CGGGCACCCGGATCAACCAG GAAACCGTCT CGCTCGACGC CAACGGGGTG TCTGGAAGCGCGTCGTATTA CGAAGTCAAG TTCAGCGATC CGAGTAAGCC GAACGGCCAGATCTGGACGG GCGTAATCGG CTCGCCCGCG GCGAACGCAC CGGACGCCGGGCCCCCTCAG CGCTGGTTTG TGGTATGGCT CGGGACCGCC AACAACCCGGTGGACAAGGG CGCGGCCAAG GCGCTGGCCG AATCGATCCG GCCTTTGGTCGCCCCGCCGC CGGCGCCGGC ACCGGCTCCT GCAGAGCCCG CTCCGGCGCCGGCGCCGGCC GGGGAAGTCG CTCCTACCCC GACGACACCG ACACCGCAGCGGACCTTACC GGCCTGACC
8产生权利要求1-5中任一蛋白质的微生物。
9根据权利要求8的微生物，其特征在于所述蛋白质至少部分呈现在其表面上。
10根据权利要求9的微生物，其特征在于它是细菌。
11根据权利要求8-10中任一项的微生物，其特征在于它是分支杆菌，特别是牛分支杆菌BCG。
12含有效量权利要求1-5之一的蛋白质或权利要求8-10之一的微生物以及可药用稀释剂或佐剂的药物组合物。
13含权利要求1-5之一的蛋白质或权利要求8-10之一的微生物的药物或疫苗。
14检测特异性结核病抗体的方法，其中将可能含所述抗体的生物液体与权利要求1-5任一项的蛋白质接触。
15根据权利要求14的方法，其特征在于所述蛋白质固定在载体上。
16实施权利要求14或15方法的检测试剂盒，其包括至少一种权利要求1-5中任一项的蛋白质的制剂和用于实施所述方法的缓冲液。
17权利要求16的试剂盒，其特征在于它包括用于显示所形成的抗体-蛋白质复化物的试剂。
18与权利要求1-5任一项的蛋白质特异性反应的抗体。
全文摘要
分子量为28779Da的结核分支杆菌蛋白和含有至少部分其序列的杂合蛋白质。这些蛋白质可特别用于疫苗或用于检测特异性结核病抗体。
文档编号C12N15/62GK1177980SQ9619221
公开日1998年4月1日 申请日期1996年1月31日 优先权日1996年1月31日
发明者A·拉奎尔埃里, G·马查尔, P·派施尔, F·罗马恩 申请人:巴斯德研究所