抗cd6的单克隆抗体和它们的用途的制作方法

专利名称：抗cd6的单克隆抗体和它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学技术领域，特别是获得药物组合物(这种药物组合物含有识别CD6白细胞分化抗原的单克隆抗体)的免疫学技术领域。
现有技术的描述单克隆抗体(mAb)具有在细胞表面表达的生理重要性分子的特征。在免疫系统细胞中限定为“白细胞分化群”或抗原(CD)(Scholossman，S.F.等(1994)当今免疫学15(3)98)。CD在淋巴细胞分化和成熟的个体发育方面、在细胞识别和附着的机制方面、在免疫应答期间的激活和增殖机制方面作用的限定使他们各自的mAb在诊断和免疫治疗中具有使用前景(Dantal，J.等(1991)免疫学新见解3740)。
直接针对在人类T-淋巴细胞细胞膜上表达的分子的鼠mAb有助于改进存在这些细胞机能障碍的临床实体的诊断。并且，在移植排斥、移植物抗宿主疾病(GvHD)和自身免疫病的情况下，使用它们探讨新的治疗途径以调整它们的机能活性(Waldman，T.A.(1991)科学2521657；Waldman，T.A.(1992)免疫学年度综述10675)。
CD6不是十分典型的分子。已知它是一种糖蛋白，以动力平衡中保持的两种分子形式存在，这两种形式只在磷酸化度上不同。在其它的T淋巴细胞中，它是105kDa的磷酸化分子；而在激活的细胞中它是130kDa磷酸化形式(Cardenas，L.at al.(1930)免疫学杂志1451450；Swack，J.A.等(1991)细胞化学杂志2667137)，作为膜受体家族的成员和具有特征结构的分泌蛋白质(Kodama，T.等(1990)自然343531；Aruffo，A.等(1991)实验医学杂志174949)。它在成人胸腺细胞表面、在外围血液的T淋巴细胞中(CD3+组细胞群体的大多数)、在亚型B淋巴细胞中及在人脑皮层的神经元中表达。在外围血液的T淋巴细胞中，它参与细胞激活机制(Reinhertz，E.L.at al.(1982)细胞30735；Kamoun，M.et al(1981)免疫学杂志12787；Maye，B.等(1990)神经免疫学杂志29193；Rasmussen，R.A.等(1994)免疫学杂志152527)。
CD6分子在T淋巴细胞个体发育中的作用以及其在不同病原学疾病的生理病理学方面之可能的作用是未知的。
最近鉴定了CD6配体，其在正常的组织(如胸腺、脾、淋巴结和皮肤)具有广泛的细胞分布(Dhava Ikumar，D.P.等(1995)实验医学杂志1811563)。这种分子，由于其在激活的T和B淋巴细胞以及单核细胞中表达而命名为ALCAM(激活的白细胞-细胞附着分子)，是分子量为100kDa的具有5个细胞外结构域(和免疫球蛋白的结构域相似)的I型膜糖蛋白。这种分子存在取决于二价阳离子的不同的激活水平并且能介导异嗜性和同嗜性的相互作用(Bowen，M.A.等(1995)实验医学杂志1812213)。
已经在器官移植中防止排斥危机的临床研究中使用了不同的抗CD6mAb(Kirkman，R.L.等(1983)移植36620)，同时为了消除来源于淋巴细胞的骨髓移植体以防止移植物抗宿主疾病(GvHD)(Soiffer，R.J.等(1992)临床肿瘤学杂志101191)。这种ior t1在II期临床试验中用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(Garcia，L.A.等(1990)生物工程应用(biotecnologia Aplicada)7(2)176；Faxas，M.E.et al(1993)生物工程应用10(1)20)。
IgG2a同种型的iro t1单克隆抗体在维也纳细胞分化抗原IV国际研讨会(1989)上分类作为抗CD6 mAb。这种mAb规定具有不同于由其它抗CD6 mAb识别的表位。这种表位具有稳定的构象并对还原剂不敏感，其可能定位于CD6分子的一级结构上(Osorio，L.M.等(1994)细胞免疫学154123)。
和其它健康供体外围单核细胞的CD6 mAb相比，这种单克隆抗体具有较低的识别能力。在T淋巴细胞起源的人类细胞培养系中这种ior mAb识别模式在Jurkat细胞中占47％、在Molt-4细胞中占23％，而在CCRF-CEM细胞中没有识别；在B淋巴细胞起源的人类细胞培养系中这种ior mAb识别模式在Raji中占9％；在成红细胞起源的人类细胞培养系中这种ior mAb识别模式在K-562中占12％；在脊髓单核细胞起源的人类细胞培养系中这种ior mAb识别模式在U-937中占9％。其也识别B淋巴细胞白血病的外围单核细胞(89+/-4％)(Garcia C.A.等1992生物工程应用9(1)70)以及皮肤T细胞淋巴瘤患者的皮损伤淋巴细胞(Rodriguez，T.等(1985)干扰素生物工程2(1)41)。这种iro t1 mAb不抑制体外特异性细胞毒性抗原(Faxas，M.E.等(1993)生物工程应用10(1)47)。它具有激活健康供体体外外围血液T淋巴细胞的能力。在OKT3(抗CD3)次适宜浓度下，和iro t1交联能比其它的CD6 mAb诱导更高级的反应(Osorio，L.M.等(1994)细胞免疫154123)。
牛皮癣是一种生理病理学还不明确的疾病(Hunziker，T.等(1993)Ther.Umsch.50(2)110；Elder，J.T.等(1994)皮肤医学研究杂志102(6)24S)。其特征在于在具有激活的T淋巴细胞CD4+和CD8+表型优势的靶器官中存在炎症性的渗入物(Chang，J.C.C.等(1994)美国国家科学院会议录919282)、以及T细胞受体强大的寡克隆性(olygoclonality)，这些细胞似乎存在迁移至皮肤的趋势(回家)(Baker，J.N.et al(1992)皮肤病学讨论杂志127205；Menssen，A.等(1995)免疫学杂志.1554078；Valdimarsson，H.等(1995)当今免疫学16(3)145)。
如果皮肤中T细胞数量减少，可以预料牛皮癣的自发缓解。这样，它们通过释放能诱导角质形成细胞(在对疾病的临床表现起作用)增值的可溶性免疫反应介质而在疾病的持续性方面起重要作用。
下列事实支持这些观点，如异基因骨髓移植后疾病的治疗、可能的HLA和类固醇特别是和免疫抑制因子(如环孢菌素)结合的改进以及临床的改进，尽管可逆的，和抗T细胞治疗的单克隆抗体结合(Griffiths，C.E.M.等(1992)springer Semin病理学13441；Nanney，L.B.等(1986)J.Invest.Dermatol.86(3)260；Picassia，D.D.等(1987)美国皮肤病学学院杂志17)3408；Schopf，R.E.等(1986)古代皮肤病学研究279(2)89；van de Kerkhof，F.C.等(1987)皮肤病学174(5)224)。
用单克隆抗体进行免疫治疗的成功依赖靶分子的选择，这种靶分子参与重要的细胞功能或mAb的选择(Dantal，J.等(1991)免疫学新观点.3740)。在牛皮癣中评价所用的针对CD3(Weinshenker，B.G.等(1989)美国学院皮肤病杂志201132)和CD4(Poizot-Martin，I.等(1991)Lance t3371477；Print J.等(1991)Lancet338320；Nicolas，J.F.等(1991)Lancet338321)的mAb在多次高剂量的静脉注射后对患者已经产生了临床改进效果，都出现了短期缓解并且在所有的病例中此种疾病症状及病症都很早复发。
多种剂量鼠mAb的治疗施用出现一些负作用，同时限制了这种施用在患者中的临床效用，这些和诱导人抗小鼠抗体反应(HAMA)的鼠蛋白的异源性(xenogenicity)有关；由蛋白质工程产生的人源化抗体减少了免疫原性，且改进药物动力学和临床使用(winter，G.等(1993)药学科学发展趋势14(5)139)。
迄今为止描述CD6分子在牛皮癣皮肤炎症性渗入物的T淋巴细胞中的表达及这种分子和疾病发展过程的可能结合之研究未见报道。另外以前从未评价过抗CD6 mAb在这种疾病中的治疗用途。
本发明的新颖性在于提供了包含抗CD6单克隆抗体的局部和全身性药物组合物和获得了人源化抗CD6之单克隆抗体在普通牛皮癣(PsoriasisVulgar)患者上以不同的施用路线和在这种疾病的不同的临床形式上应用。
发明详述单克隆抗体的获得可以通过蛋白质A琼脂糖凝胶从腹水液体纯化抗CD6的单克隆抗体(mAb)，用等体积的甘氨酸缓冲液1.5M，NaCl 3M pH值8.9稀释，用同样的缓冲液平衡基质。以流速50毫升/小时使用等体积的腹水和缓冲液洗脱液。使用同样的缓冲液过夜洗涤柱子直至基线为零。
之后，用0.1M pH6的柠檬酸缓冲液以50毫升/小时的流速(2倍和5倍柱体积，大约2小时)洗脱柱子直至基线为零，以除去IgG1免疫球蛋白。利用0.1M pH5的柠檬酸缓冲液以除去IgG2a免疫球蛋白(ior t1)。
鼠单克隆抗体的人源化利用遗传工程方法可以从此种鼠抗体的轻链和重链的可变区构建抗CD6鼠mAb的变体，如嵌合体和人源化的抗体(Takashi，N.等(1982)细胞29718；Hieter，P.A.等(1980)细胞29718)。
鼠单克隆抗体人源化的方法描述从分泌亲本鼠ior t1A的杂交瘤细胞中获得ior t1A亚克隆，其识别CD6分子上的相同抗原表位。
修饰ior t1A目的是降低其在一种方法(专利#0699755欧洲公告)中的免疫原性，当全面保存其配体结合特性时，其同时降低啮齿动物(rodent)单克隆抗体的免疫原性。由于免疫球蛋白的抗原性依赖于序列上存在的T-细胞抗原肽，通过替换包含在这种T-细胞抗原序列的残基(其不同与在另一个哺乳动物种抗体中发现的那些)可以降低异种异型(xenogenic)或同种异型抗体的免疫原性。当然，这些替换的残基不包含和规范结构及游标区(Vernier zone)相关的那些残基。碱基的谨慎替换不影响结构决定簇或区域间的接触，这样，由于限制在可变区构架残基的替换，没有影响配体结合性质。
可变区同源性分析本方法利用了能得到的人类抗体可变区序列数据(Kabat等编辑的“免疫兴趣蛋白序列”第15版，Bethesda，马里兰；国家健康研究所，1994)。
在第一步，把鼠ior t1重链或轻链的可变区和人类序列相应的可变区比较。
通过自动计算机化的方法进行这种比较。把最同源的人类可变区和相应鼠区进行残基对残基的比较。这将确定每个鼠序列最相近的人类亚组。
-T-表位的预测在第二步，分析鼠和人类的两个同源可变区序列以预测T-抗原序列。
AMPHI算法(algorithm)(Bersofsky，(1987)免疫学杂志1382213)预测了螺旋序列。SOHHA算法可预测螺旋疏水性的带(Elliott等，免疫学杂志(1987)1382949)。这些算法预测了存在抗原蛋白质片段的T-细胞。
-免疫原性降低的分析用存在于人类相对应部位的残基替换鼠构架中不同于人类相对应部分的残基。这些转换只对T抗原序列中的残基发生。
最后，在规范结构及和游标区相关残基上起作用的替换可能对三级结构有重要影响。因此，这些不包括在替换中。有关建议的替换对三级结构和结合位点之影响的其它信息可以从可变区的分子模型获得。
-构建和表达改变的抗体的方法利用下列方法制备重组DNA序列，这种方法是把鼠mAb的轻链和重链CDRs掺入到人类的构架上，可以用这种构架转染哺乳动物的细胞以表达免疫原性较少且具有该动物单克隆抗体的抗原特异性之重组抗体。
a)包含CDRs和FRs的可变区结构域的诱变和组装。优选采用PCR-诱变方法(Kamman等，(1989)核酸研究175404)以在不同的位点引入变化。
b)制备一种包含一个可变区和相应人类恒定区的表达载体，这种载体一转染到细胞就能引起足以用于亲和性和特异性测定之蛋白质的分泌。
c)把重链和轻链的表达载体共转染到适当的细胞系。
大约2周后，通过ELISA分析细胞上清液以确定人类IgG的产生。然后通过任何用于鉴定能够结合特异性抗原的人类IgG之方法分析这种样品。
用于进行体外和体内诊断研究的制剂抗CD6 mAb可以用于不同临床形式牛皮癣的体外和体内诊断、在局部或全身治疗后监测患者、以及预测疾病的复发。
可以用纯化的和溶解在含有叠氮化钠(0.01-0.2％)和牛血清清蛋白(0.05-0.2％)的缓冲液(pH值7.0+/-0.5)中的mAb，通过将50至200ml这种样品和10至30ml浓度为0.1和3mg/ml的mAb一起在4℃下培养20至30分钟，来定性生物体液(如血液、ephaloraquidium液体、synovial液体)中的CD6+T淋巴细胞和/或这种分子在淋巴细胞表面的表达。接下来用缓冲液洗涤，并和与荧光物质(如荧光素、藻红蛋白)接合的另一种动物种的免疫球蛋白一起培养。抗CD6 mAb可以以不同的方法直接和荧光物质接合(Coligan，J.E.等编辑，免疫学目前方案，国家健康研究所，vol.I5.3.2.Wiley Interscience)并且以5和30mg/ml的浓度用于前面描述的相似目的。
牛皮癣患者损伤的免疫组织化学评价普通牛皮癣患者皮肤损伤和其它受影响组织(如关节)的免疫组织化学研究可以在组织冷冻切片(如皮肤)上进行(用冷丙酮固定或不固定)，培养溶解在含有叠氮化钠(0.01-0.2％)和牛血清清蛋白(0.05-0.2％)的缓冲液(pH值7.0+/-0.5)中的抗CD6 mAb30分钟。接下来把组织切片和生物素酰抗鼠免疫球蛋白(来源于羊，DAKO)及亲和素生物素过氧化物酶复合物(即DAKO)在室温下培养30分钟。最后以3-氨基-9-乙基-carbazole作为色原(Sigma)使反应继续进行(Hsu，S.M.等(1981)组织化学细胞化学杂志29577)。活组织必须经过两个专家检查，并且评价的CD6应调整至点的大小小于10％(+/-)，10-25％(+)，25-50％(++)，50-90％(+++)，90-100％(++++)。
可以使用针对T淋巴细胞的不同抗体(抗CD3(ior t3)，抗CD4(iort4)，抗CD8(ior t8)抗和CD45(ior L3))，以抗表皮生长因子受体mAb(ioregf/r3)为角质形成细胞激活标记(Mozzanica，N.等(1994)Acta Derm.Venereol.Suppl.Stockh.186171)，这种标记物使得在这种疾病的治疗期间能够评价损伤炎症性渗入物的细节特征。
治疗患者损伤的组织化学监测用抗CD6单克隆抗体治疗的患者在治疗期间对其治疗前已发生的损伤以及治疗结束后在最初活组织检查的邻近部位进行活组织检查以评价局部或全身使用的这种组合物的治疗效力。分类治疗反应的指标可以被百分定量并且通过每次活组织检查评价的CD6+细胞占CD45+细胞总数的指数确定。
CD3+细胞、CD4+细胞和CD+8细胞的指数也可以有占CD45+细胞总数的指数确定，并且CD4+和CD8+的指数可以有占CD6+细胞总数的指数确定。
治疗患者的免疫组织化学监测评价抗CD6 mAb治疗效果的另一种形式是可以在用和放射性同位素(如Technetiun)接合的(用如Mathers，S.J.等(1990)核酸医学杂志31(5)692.描述的类似方法接合)1和5mg同样的mAb的治疗期间，在患者的表达和分布CD6的细胞中进行免疫闪烁照相术研究。
局部和全身用途的治疗制剂的获得抗CD6 mAb可以治疗不同临床形式的牛皮癣，使用用于局部和全身的制剂，以单一或多种剂量，按照疾病的严重程度进行一种或多种治疗周期。
CD6 mAb局部治疗制剂可以由一相或两相的半固体系统组成，主要由亲水的制剂组成，这种亲水的制剂使得溶解在无菌缓冲液(pH7.0+/-0.5)中的mAb(以每克产品中含有0.1mg和5mg剂量)接合。可以把此种制剂连同一种液态基质(如水)制成凝胶、胶冻、软膏、洗液和乳油(由明胶、羟甲基纤维素或类似的含有甘油、钙的物质及基质制成)；此外，这种，组合物可以含有防腐剂(如p-hydroxibenzoate)以避免污染。pH值必须是生理性的以不影响mAb在皮肤中的释放和穿透能力。
对覆盖的或没覆盖的损伤每天应使用一到三次局部治疗，并且局部治疗可以和同样的mAb的全身应用(主要是静脉内)配合，全身应用的剂量为每千克患者体重0.1到1mg之间。静脉内使用应该用生理溶液稀释并且慢慢施用。静脉内治疗可以独立于局部施用。
临床跟踪治疗的患者损伤的临床评价可以作为治疗效果评价的主要标准。
用于测量治疗效果的主要反应变量可以是损伤临床特征(渗入物、规模、红斑)的改进和损伤面积的减少。
病症的严重程度可以规定为0-1-2几个值。
0-没有病症。
1-轻度表现。
2-严重表现。
也可以考虑治疗的损伤大小的扩充，测量2个损伤的直径，用半径(以厘米表示)乘以p(3.14)计算损伤区域的面积。损伤规模的尺寸在0时间时为100％，在后来的评价中，损伤大小的百分数按比例确定。
和PASI(牛皮癣面积和严重度指数)相似的牛皮癣严重值(PSS)(Fredriksson，T.等(1978)皮肤病学157238)用下列公式得到渗透(0-2)+大小(0-2)+红斑(0-2)×％感染区根据完成多次评价时PSS的变化对治疗反应分级。规定下列各项(Perkins，w.等(1993)英国皮肤病学杂志129584)-清除(PSS＞90％的改进)-响应者(PSS＞50％的改进)-非响应者(PSS＜50％的改进或更坏)-恶化(PSS＞50％的增加)反应评价时间可一直到自起始治疗的12周(预处理，周数1，2，3，4，6，8，12)。
实施例1鼠单克隆抗体ior t1A可变区DNA序列从大约106个T1杂交瘤细胞中提取细胞质RNA(如Faloro，J.等在酶学方法65718所描述的)。
cDNA合成反应包含5ug RNA、50mM Tris-HCl(pH值7.5)、75mM KCl、10mM DTT、3mM MgCl2、25pmol重链可变区CG2AFOR引物(5GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3)或轻链可变区CK2FOR引物(5GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3)、dATP，dTTP，dCTP，dGTP各250μM、15μ核糖核酸酶抑制剂(保护RNA、Pharmacia)，总体积50μl。
把样品加热到70℃，持续10分钟，然后在30分钟的时间内缓慢冷却至37℃。然后，加入100单位的MMLV逆转录酶(BRL)并在37℃下继续培养1小时。
利用如Orlandi等描述的方法用PCR扩增VH和VK cDNA(Orlandi，R.等美国科学院学报863833-3837，(1989))。
对于VH的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CG2AFOR(5 GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3)和VH1 BACK引物(5(AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3)组成。
对于VK的PCR扩增，DNA/引物混合物由5μl cDNA、25pmoles CK2FOR(5 GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3)和VK10BACK(5TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA 3)引物组成。
向混合物加入dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5Mm、10X缓冲液噬热菌蛋白酶(thermolase)成分5μl和1单位的Thermolase(IBI)，最终体积50μl。对样品进行循环变温加热，94℃25秒；50℃30秒；72℃1分钟；最后在72℃培养5分钟。扩增的VH和VK DNA用Prep.A Gene纯化试剂盒(BioRad)纯化。
把纯化的VH和VK DNA在M13载体上克隆。用T7 DNA Pol(Pharmacia)通过双脱氧法对克隆进测序。参见

图1和2。
实施例2修饰ior t1鼠单克隆抗体可变区序列以便人源化已预测的抗原序列分析用于T细胞抗原序列的ior t1之重链和轻链可变区序列。利用计算机算法AMPHI进行这种分析，预测到11个氨基酸长度的序列区段具有一个两亲性螺旋结构，即一侧疏水，一侧和MHC II分子结合的亲水螺旋。
在重链可变领域序列上预测到了3个区段，它们是(使用了Kabat s计数)1.FR1在氨基酸2-21之间。
2.CDR1和FR2在氨基酸29-43之间。
3.CDR3和FR4在氨基酸95-111之间。
图1示相应的重链序列。
把鼠序列和包括在基因库和EMBL数据库中的免疫球蛋白比较。确定最同源的人类可变区序列及人类亚组(限定了和这种亚群最紧密相似的鼠序列)。在这种情况下，所发现的人类序列是属于Kabat亚群III的IgM。
把人类和鼠两者的可变区序列进行残基对残基比较，并在FR区选择不在游标区或与规范结构无关的残基。因此这些残基可以和人类序列上相同位置的残基交换。由于氨基酸Lys在属于相同亚群的其它人类免疫球蛋白中存在于相同的位置，所以位置13和19没有改变。
对于鼠ior t1A的重链提出了4种替换1. 40位的THR由ALA替换2. 42位的GLU由GLY替换。
3. 108位的THR由LEU替换4. 109位的LEU有VAL替换。
对于轻链(图2)运用同样的方法在第2位氨基酸到第69位氨基酸之间提出了一套重叠区段。
分析后，我们在FRs1和2的3，11，12，15，17，41和43位上提出了7种替换。
1. 3位的LYS由GLN替换2. 11位的MET由LEU替换3. 12位的TYR由SER替换4. 15位的LEU由VAL替换5. 17位的GLU由ASP替换6. 41位的TRP由GLY替换7. 43位的SER由ALA替换实施例3通过PCR诱变构建突变的ior t1轻链和重链可变区利用PCR诱变构建突变的轻链和重链可变区的氨基酸变化(Kammann，M.等(1989)美国科学院学报，864220)。
简言之两次PCR扩增反应混合物是0.5μl在M13中克隆的单链DNA VH上清液、25pmoles诱变寡核苷酸1或2引物、25pmoles诱变寡核苷酸3或4引物(引物序列见下文)。向这两种混合物中加入dATP，Dttp，dCTP，和dGTP各2.5mM、5μl10倍的Vent聚合酶缓冲液成分(NEB)和1单位的Vent DNA聚合酶(NEB)，最终体积为50μl。对样品进行循环变温加热，94℃30秒；50℃30秒；75℃1分钟；最后在75℃培养5分钟。只利用外部引物(3和4)在第二次PCR连接两次PCRs的产品。扩增的VH DNA用Prep基因纯化试剂盒(BioRad)纯化。
对于重链在FR1的5、7、11、12位的变化，所用的引物是引物15 TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG AGG CTG GAG 3.
引物35 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3这些引物在一个PCR组合。
引物25′CTC CAG CCT CTT CCC CGG AGC CTG GCG AAC CCA 3′.
引物45′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′.
这些引物在一个PCR中组合。然后，两种PCRs产物在使用3和4引物的一个PCR中组合。
对于108和109位的变化，设计的引物是引物15′GGC CAA GGC ACC CTT GTC ACC GTC TCC 3′.
引物35′GTA AAA CGA CGG CCA GT 3′.
这些引物在一个PCR中结合。
引物25′GGA GAC GGT GAC AAG GGT GCC TTG GCC 3′.
引物45′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′.
这些引物在一个PCR中组合。然后，两种PCRs产物在使用3和4引物的一个PCR中组合。
在轻链中，对于FR1在3，11，12，15，17位残基的变化，设计的引物为引物15′TGT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCGCAT CGG TGG GAG ACA GAG TCA CC 3′引物35′GTA AAA CGA CGG CCA GT 3′这些引物在一个PCR中组合。
引物25′GGT GAC TCT GTC TCC CAC CGA TGC AGA CAG GGA GGA TGG Ar，A CTrGGT CAT CTG GAT GTC ACA 3′引物45′ACT GGC CGT CGT TTT TAC 3′这些引物在一个PCR中结合。
两种PCRs产物在使用3和4引物的一个PCR中组合。
对于在FR2中残基41和43的变化，引物为引物1
5′CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG ACC CTG 3′引物35′GTA AAA CGA CGG CCA T 3′这些引物在一个PCR中结合。
引物25′CAG GGT CTT AGG AGC TTT CCC TGG TTT CTG 3′引物45′ACT GGC CGT CGT TTT TAC 3′这些引物在一个PCR中组合。
两种PCRs产物在使用3和4引物的一个PCR中组合。
实施例4主要用于普通牛皮癣患者皮肤损伤的药物制剂纯化这种ior t1 mAb，并将其(50.00mg)溶解在含有4.50mg磷酸二氢钠、18.00mg磷酸一氢钠、86.00mg氯化钠、1.852mg聚山梨醇酯80、注射用水的无菌缓冲液中(10ml pH7.0+/-0.5)。将含有mAb的溶液加入到凝胶基质中。
用含有与上面描述的用于mAb的缓冲液相似成分的缓冲液制备治疗胶冻。
实施例5普通牛皮癣患者皮肤损伤的组织学研究普通牛皮癣患者皮肤损伤的组织化学研究在皮肤组织的冷冻切片上进行，用mAb iro t1和直接针对T淋巴细胞CD的不同mAb比较。使用了mAbior t3(抗CD3)、ior t4(抗CD4)、ior t8(抗CD8)、ior L3(抗CD45)和DAKO CD6(抗CD6，作为对照)、以及ior egf/r3(抗表皮生长因子受体)。接着把组织切片连同生物素酰化的抗小鼠免疫球蛋白(即来源于羊，DAKO)以及亲和素生物素过氧化物酶复合物(即DAKO)一起培养。最后以3-氨基-9-乙基-carbazole作为色原(Sigma)使反应继续进行。活组织必须经过两个专家检查，并且评价的CD6应调整至点的大小小于10％(+/-)，10-25％(+)，25-50％(++)，50-90％(+++)，90-100％(++++)。
对利用抗CD6单克隆抗体治疗的患者在开始治疗前进行损伤的活组织检查，并在治疗的第三周末在邻近初始活组织检查的区域进行活检。分类治疗反应的尺度是百分定量的并由CD6+细胞占全部CD45+细胞的指数确定，在每次活组织检查中进行评价。测定了抗表皮生长因子受体在不同皮肤层的表达百分率以及典型疾病的组织学特征的变化。
*在炎症性渗入物中，发现代表普通牛皮癣的特征是存在CD6+淋巴表型的重要表达。
*CD3+淋巴细胞代表大约100％的CD45+细胞。
*CD6+细胞代表60％至高于90％的CD3+细胞。
*CD6+细胞(ior t1)代表大约30％至50％的CD6+细胞(DAKO CD6)。
*提高了EGF-R在角质形成细胞中的表达，显示网状模式。
CD6分子在炎症性渗入物的T淋巴细胞表达的优先性明显，因为它是代表激活的T淋巴细胞的分子。这使我们相信可以构建由于外源抗原或修饰的自身抗原的侵入而在皮肤中起始激活的T淋巴细胞的leukocitary附着分子。在对所说的抗原反应期间，这对激活的皮肤特异细胞决定簇间的相互作用是必要的。
实施例6普通牛皮癣患者对使用ior t1 mAb进行局部治疗的临床反应对诊断为普通牛皮癣的患者在代表这种疾病特征的损伤复发时进行了临床试验。研究在根据所接收的局部治疗用胶冻(ior t1 mAb或赋形剂)限定的两组中安排(每组十四个患者)。局部治疗制剂适合胶冻基质或赋形剂(羧甲基纤维素钠V/V，丙二醇，对羟基苯甲酸甲酯，三乙醇胺)，在其中mAb能掺入。在21天中，每天应用两次治疗，接收治疗的损伤没有闭合。
用ior t1 mAb治疗的所有患者牛皮癣噬斑损伤变白(图4)。这种结果和起始治疗的21天进行的治疗后活组织检查一致。观察到了T淋巴细胞渗入物减少、角质形成细胞中EGF-R的表达减少以及代表这种疾病的组织症状的减退。
实施例7脱落后用ior t1单克隆抗体局部治疗普通牛皮癣患者的临床反应在19个受感染的皮肤多于10％但不到25％确定为长期普通牛皮癣患者身上进行试点临床试验。由6，7和6个患者组成的三不同组接收分别含有0.3，1和3mg的ior t1A mAb/克胶冻的治疗局部制剂，赋形物胶冻中由羧甲基纤维素钠V/V，丙二醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯和三乙醇胺组成。在21天的治疗期间，对患者每天局部治疗2次。
评价和分析了PASI(牛皮癣区域和严重度指数)并在患者血清中研究了人类抗小鼠抗体(HAMA)反应。和临床反应(PASI)及无疾病间隔(diseasefree interval)有关的最好结果是在用较低剂量的ior t1 mAb(0.3mg)治疗的组中得到，并且在那个组中，HAMA(人类抗小鼠抗体)滴度和患者(按组计算)产生它的数量也较高。此外，用阻断ELISA(酶联免疫吸附测定)法研究了患者血清中抗独特型抗体的存在，并且在用每克胶冻0.3mg较低剂量治疗的患者中FACS(荧光激活细胞分选仪)的检出值经常出现并且较高。
实施例8具有扩散牛皮癣严重形式的一个患者对用ior t1 mAb进行静脉内治疗的临床反应女性患者，56岁，具有牛皮癣历史，即在大约17年以前诊断的牛皮癣性关节病。在最近的5年，患者一直遭受频繁和严重的危象，导致经常住院。危象由erithema tosquamous大面积损伤、关节和肌肉疼痛、发烧、大面积水肿和不适开始。这种通常的状态持续并在21天后有新的损伤出现在腋区、颈项、胸部周围，同时有由发烧伴随的溃疡和传染的血清标分泌。由于对这种疾病迟钝的评价和其对所有包括甾类化合物乳油的先前治疗的耐性，需要用氨甲蝶呤治疗，施用3个周期总剂量15mg。没有观察到临床反应。
ior t1 mAb单独静脉内施用剂量为每千克体重0.6mg，缓慢施用，在200ml 0.9％盐溶液中稀释。
同时，在2天内每天对所有的损伤同时施用包含ior t1 mAb的治疗胶冻(浓度为每克胶冻含3mg)。
约在治疗的第6天，患者开始改进她的通常状态和皮肤学图像。在21天完成评价时，60％的身体表面没有损伤并且皮肤的其余部分显示这种疾病临床症状的改善。患者称关节部位的症状改善，具有好的通常状态，正常的重要标志和常规实验室检验值。
30天后，病人仍保持疾病症状的完全消退。
附图简要描述图1和2对通过ior t1A单克隆抗体重链和轻链可变区的人源化方式而发生的修饰进行分析。
图1鼠ior t1A单克隆抗体重链可变区序列。
图2鼠ior t1A单克隆抗体轻链可变区序列。
Aior t1A鼠mAb重链或轻链可变区序列。
B最同源的人类免疫球蛋白可变区序列。
Cior t1A修饰的可变区序列。
阴影(shading)预测的T细胞抗原序列。
下划线的氨基酸残基和三级结构相关的氨基酸。
黑体字互补决定区。
框中的氨基酸残基提出的替换。
对轻链和重链两部分的描述同上。
图3显示了CD6抗原在普通牛皮癣患者皮肤损伤特征性炎症性渗入物淋巴细胞中的表达结果。评价是在定位于上和/或下肢和/或胸-腹部的斑损伤影响的活组织检查的皮肤冷冻切片上进行。在组织化学研究之前进行了组织学评价。
图4在考虑到下列变化的条件下，进行了抗CD6 mAb用于治疗牛皮癣的治疗效能的评价损伤区的渗入物、规模、红斑、和大小。规定严重程度在0-1-2之间。治疗斑的扩展通过测量其直径而确定。获得了类似于PASI(牛皮癣面积和严重性指数)的牛皮癣严重值(PSS)，并根据在指定的评价时间末PSS的变化情况对治疗反应分级。规定了下列各项消除、响应者、非响应者和恶化。
图5由PASI(牛皮癣面积和严重性指数)评价了用局部制剂(每克胶冻中分别含有0.3，1或3mg的ior t1A mAb)治疗之患者的临床反应，也研究了人类抗小鼠抗体(HAMA)在这些患者血清中的反应。和临床反应(PASI)及无疾病间隔有关的最好结果在用较低剂量的ior t1 mAb(0.3mg)治疗的组中得到，并且在那个组中，HAMA(人类抗小鼠抗体)滴度和患者(按组计算)产生它的数量也较高。此外，在用每克胶冻0.3mg较低剂量治疗的患者中，患者血清中抗遗传型抗体经常存在且量较多。
图6对一位56岁具有牛皮癣历史的患者(其在大约17年以前诊断为牛皮癣性关节病)用ior t1 mAb施用静脉治疗。当时其具有扩散牛皮癣的严重形式，特征为erithematosquamous大面积损伤、关节和肌肉疼痛、发烧、大面积水肿和不适。症状通常的状态对包含氨甲蝶呤的治疗无反应。以iort1 mAb单独静脉内施用进行治疗，剂量为每千克体重0.6mg，缓慢施用，在200ml 0.9％盐溶液中稀释。同时，在2天内每天对所有的损伤同时施用包含ior t1 mAb的治疗胶冻(浓度为每克胶冻含3mg)，所用治疗胶冻总量为224克。每周对临床反应和免疫组织化学的实验结果进行评价。图6提供了治疗前一天和治疗后的21天拍摄的评价皮肤损伤的照片。
权利要求
1.识别人类CD6的单克隆抗体，其在诊断和治疗牛皮癣中有用。
2.按照权利要求1的识别人类CD6的单克隆抗体，其是命名为ior t1和ior t1A的鼠单克隆抗体的亚克隆以及从它们得到的任何人源化变体。
3.按照权利要求1和2的识别人类CD6的单克隆抗体，其中所说的由同名杂交瘤(保藏号待定)得到的ior t1A亚克隆具有以下重链可变区序列GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VALLYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALASER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRPVAL ARG GLN THR PRO GLU LYS ARG LEU GLU TRP VALALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYRPRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARGASP THR SER SER ASN THR ALA TYR MET GLN LEU SERSER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYSALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SERTRP GLY GLN GLY THR THR LEU THR VAL SER SER和以下轻链可变区序列ASP ILE LYS MET THR GLN SER PRO SER SER MET TYRALA SER LEU GLY GLU ARG VAL THR ILE THR CYS LYSALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYRGLN GLN LYS PRO TRP LYS SER PRO LYS THR LEU ILETYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SERARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SERLEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALATHR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHETHR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARGALA
4.按照权利要求1-3的识别人类CD6的单克隆抗体，其是亚克隆iort1A的人源化变体，且其重链可变区具有以下序列GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VALLYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALASER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRPVAL ARG GLN ALA PRO GLY LYS ARG LEU GLU TRP VALALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYRPRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARGASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SERSER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYSALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SERTRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SER SER其轻链可变区具有以下序列ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SERALA SER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS LYSALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYRGLN GLN LYS PRO GLY LYS ALA PRO LYS THR LEU ILETYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SERARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SERLEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALATHR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHETHR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARGALA
5.按照权利要求1-4的单克隆抗体，其在人类CD6分子中识别稳定构象的和对还原剂不敏感的表位。
6.按照权利要求1-3的单克隆抗体，其是IgG2a的同种型。
7.按照权利要求5的人源化单克隆抗体，其是IgG1的同种型。
8.按照权利要求1-4的单克隆抗体在制造对治疗牛皮癣有用之药物上的用途。
9.按照权利要求1-4的单克隆抗体在制造对体外和体内诊断牛皮癣有用之反应剂上的用途。
10.用于治疗牛皮癣的药物组合物，其包含按照权利要求1-4的单克隆抗体。
11.用于诊断牛皮癣的反应剂，其包含权利要求1-4的单克隆抗体。
全文摘要
识别CD6抗原的单克隆抗体、识别CD6抗原且对不同临床类型的牛皮癣患者具有临床和组织学有效性的药物组合物。<DEL/>
文档编号C12P21/08GK1175957SQ96192098
公开日1998年3月11日 申请日期1996年11月18日 优先权日1995年11月17日
发明者J·E·蒙特罗卡斯米罗, J·劳巴德罗瓦拉达里斯, R·派里兹罗德里古兹, P·希拉布拉奎兹, B·R·托莫布拉沃 申请人:分子免疫中心