新型蛋白质及其制备方法

专利名称：：新型蛋白质及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及显示抑制破骨细胞分化和/或成熟的活性的新型蛋白质、即破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor；OCIF)及其制备方法。
背景技术：
：人的骨胳是不断反复地吸收与再形成的，在此过程中起核心功能的细胞是起骨形成作用的成骨细抱和起骨吸收作用的破骨细胞。因与这些细胞有关的骨代谢的异常而发生的疾病可列举骨质疏松症为代表。这种疾病是由破骨细胞引起的骨吸收超过成骨细胞引起的骨形成而导致的疾病，然而，关于这种疾病的发生机制，目前仍未完全阐明。这种疾病发生骨痛，而由于骨脆弱成为骨折的原因。因而，随着高龄人口的增加，这种疾病成为因骨折而卧床的老人的发生原因，也已成为社会问题，其治疗药的开发正成为当务之急。这样的骨代谢异常所致骨量减少症，期望通过抑制骨吸收、促进骨形成或改善它们的平衡而加以治疗。与骨形成有关的细胞的增殖、分化或激活的促进，或对与骨吸收有关的细胞的增殖，分化或激活的抑制，可望促进骨形成。近年来，对具有这种生理活性的蛋白质(细胞因子)的关注增多，并进行了集中精力的研究。有人报导了促进成骨细胞增殖或分化的细胞因子有成纤维细胞生长因子系列(fibroblastgrowthfactor；FGFRodanS.B.etal.，Endocrinologyvol.121，p1917，1987)、胰岛素样生长因子-I(insulinlikegrowthfactor-I；IGF-I；HockJ.M.etal.，Endocrinologyvol.122，p254，1988)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II；McCarthyT.etal.，Endocrinologyvol.124，p301，1989)、激活素A(ActivinA；CentrellaM.etal.，Mol.Cell.Biol.vol.11，p250，1991)、转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β；NodaM.，TheBone，vol.2，p29，1988)パスキュロトロピソ(Vasculotropin；VaroniqueM.etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.199，p380，1994)、和骨形态发生蛋白系列(bonemorphogeneticprotein；BMP；BMP-2；Yamaguchi，Aetal.，J.CellBiol.Vol.113，p682，1991，OP-1SampathT.K.etal.，J.BiolChem.vol.267，p20532，1992、KnutsenR.etal.，Biochem，Biophys.Res.Commun.vol.194，p1352，1993)等细胞因子。另一方面，作为抑制破骨细胞形成即破骨细胞的分化和/或成熟的细胞因子，据报告有转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β；ChenuC.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vos.85，p5683，1988)及白介素-4(interleukin-4；KasanoK.etal.，Bone-Miner.，vol.21，p179，1993)等。而抑制因破骨细胞所致骨吸收的细胞因子，据报告有降钙素(calcitonin；Bone-Miner.，vol.17，p347，1992)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor；HattersleyG.etal.J.Cell.Physiol.vol.137，p199，1988)、白介素-4(Watanabe，K.etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.172，p1035，1990)、及γ-干扰素(interferon-γ；GowenM.etal.，J.BoneMiner.Res.，vol.1，p469，1986)等。这些细胞因子可望成为通过促进骨形成和抑制骨吸收作用而改善骨量减少症的药物。胰岛素样生长因子-I和骨形态发生蛋白系列的细胞因子等，就上述细胞因子的一部分而言，作为骨代谢改善剂，正在进行临床试验。而降钙素作为骨质疏松症的治疗药和镇痛药已有市售。目前，作为治疗与骨有关的疾病及缩短治疗周期的医药品，在临床上使用的有活性型维生素D3、降钙素及其衍生物、雌二醇等激素制剂、依普黄酮(ipriflavone)、维生素K2(menatetrenone)或钙制剂等。然而，采用这些药品的治疗法，其效果和治疗结果是不能令人满意的，期望开发代替这些医药品的新治疗药。如上所述，骨代谢是由骨形成和骨吸收的平衡来调节的，抑制破骨细胞的分化·成熟的细胞因子可望成为骨质疏松等骨量减少症的治疗药。发明的揭示本发明从这样的观点出发，以提供新的破骨细胞形成抑制因子(OCIF)及高效制备方法为研究的课题。本发明者们鉴于这样的现状进行锐意探索的结果，发现在人胎儿肺成纤维细胞IMR-90(保藏于ATCC-保藏号CCL186)的培养液中存在具有抑制破骨细胞形成作用即抑制破骨细胞分化·成熟的作用的蛋白质OCIF。又使用氧化铝陶瓷片作为细胞培养的载体，发现在培养液中积聚高浓度的本发明的破骨细胞形成抑制因子OCIF。可高效地加以精制。本发明者进而将上述培养液用离子交换柱、亲和柱和反相柱依次进行处理，反复进行吸附和洗脱，确立了上述蛋白质OCIF的高效精制方法。接着，本发明者们基于所得的天然型OCIF蛋白质的氨基酸序列的信息，成功地进行了编码此蛋白质的cDNA的克隆化。本发明者们进而用此cDNA、以遗传工程的方法确立了具有破骨细胞分化和/或成熟抑制活性的蛋白质的生产方法。本发明涉及的蛋白质特征在于来自人胎儿肺成纤维细胞；在还原条件下，在SDS-PAGE中分子量约为60kD，在非还原条件下，在SDS-PAGE中分子量约为60kD和120kD；对阳离子交换剂和肝素柱具有强的亲和性；70℃加热处理10分钟，或56℃加热处理30分钟，抑制破骨细胞分化·成熟的活性即降低。90℃加热处理10分钟则失去抑制破骨细胞分化·成熟的活性。本发明的蛋白质OCIF的氨基酸序列与已知的破骨细胞形成抑制因子明显不同。本发明还涉及蛋白质OCIF的制备方法，其特征在于培养人成纤维细胞，将培养液通过肝素柱处理，洗脱吸附部分，将此部分上阳离子交换柱进行吸附、洗脱，再用亲和柱、反相柱精制，收集上述蛋白质。本发明中的柱处理不只是使培养液等在肝素琼脂糖柱等中流下，而且分批将培养液与肝素琼脂糖等混合可得与柱处理同样的效果。本发明中使用的亲和柱可举出肝素柱和蓝染料柱。蓝染料柱尤以Cibacroneblue柱为佳。此Cibacroneblue柱的填充剂为例如以亲水性合成高分子为载体，结合了色素Cibacroneblue-F3GA的物质，此柱通常称作蓝染料柱。本发明进而涉及氧化铝陶瓷片作载体进行细胞培养的高效的上述蛋白质的制备方法。本发明的蛋白质OCIF可从人成纤维细胞培养液中高效、高收率地分离精制。从此原料分离精制本发明的蛋白质OCIF，采用来自生物试料的蛋白性物质的精制上广泛使用的常规方法，可按照利用目的物OCIF的物理、化学性质的各种精制方法来进行。作为浓缩方法，可列举超滤、冷冻干燥和盐析等常规生化处理方法；作为精制方法，可将离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、疏水性层析、反相层析、制备用电泳等常规的蛋白性物质精制上利用的各种方法组合起来加以使用。特别令人满意的是可用人胎儿肺成纤维细胞IMR-90(ATCC-CCL186)作为用作原料的人成纤维细胞。且，作为原料的人胎儿肺成纤维细胞IMR-90的培养，可将人胎儿肺成纤维细胞IMR-90吸附在氧化铝陶瓷上，用添加了5％小牛血清的DMEM培养基作为培养液，在滚瓶中静置培养一周至十日，将所得的培养液加以使用。在进行精制处理中，以添加0.1％CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate，作为表面活性剂进行精制为好。本发明蛋白质OCIF的精制方法为先将培养液上肝素柱(肝素琼脂糖CL-6B，Pharmacia公司制)，用含2MNaCl的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)洗脱，得到肝素吸附性OCIF部分，将此部分上Q阳离子交换柱(HiLoad-Q/FF，Pharmacia公司制)，收集其非吸附部分，可得到肝素吸附性碱性的OCIF部分。所得的OCIF活性部分可用S阳离子交换柱(HiLoad-S/HP，Pharmacia公司制)、肝素柱(Heparin-5PW，TOSOH公司制)、Cibacroneblue柱(Blue-5PWTOSOH公司制)，反相柱(BU-300C4，Perkin-Elmer公司制)进行分离精制，此物质按上述性质进行鉴定。本发明进一步涉及根据如此得到的天然型OCIF蛋白质的氨基酸序列，将编码此蛋白质的cDNA克隆化，用此cDNA，以遗传工程方法得到具有破骨细胞分化和/或成熟抑制活性的蛋白质OCIF的方法。实施发明的最佳方案以下列举实施例更详细地说明本发明。然而，它们仅仅是示例，本发明并不受其限制。实施例1人成纤维细胞IMR-90培养液的配制人胎儿肺成纤维细胞IMR-90(ATCC-CCL186)在滚瓶(490cm2，110×171cm，Coning公司制)中，附着于80g的氧化铝陶瓷片(氧化铝99.5％，东芝陶瓷公司制)上进行培养。培养中使用60个转滚瓶，每个滚瓶中用添加10mMHEPES缓冲液的DMEM培养基(GibcoBRL公司制)500ml，缓冲液中加有5％小牛血清，在5％CO2存在下于37℃静置培养7-10天。培养后回收培养液，添加新的培养基，每次培养得到30升IMR-90培养液。所得的培养液作为试料1。实施例2破骨细胞形成抑制活性的测定按久米川正好等的方法(蛋白质、核酸、酵素Vol.34p999(1989))和TakahashiN.等的方法(EndocrinologyVol.122p1373(1988))，进行本发明的蛋白性破骨细胞形成抑制因子的活性测定。即采用从出生后约17天的小鼠分离出的骨髓细胞，以耐酒石酸的酸性磷酸酶活性的诱导作为指标，试验在活性型维生素D3存在下破骨细胞的形成，进行其抑制活性的测定。即在96孔微量培养板上，加入以含2×10-8M活性型维生素D3和10％胎牛血清的α-MEM培养基(GiboBRL公司制)稀释的样品100μl，将得自出生后约17天的小鼠的骨髓细胞3×105个悬浮在含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl中进行接种，于5％CO2、37℃和100％湿度条件下培养一周。在培养第3天和第5天时，弃去培养液160μl，添加含1×10-8M活性型维生素D3和10％胎牛血清的α-MEM培养基稀释的样品160μl。培养7天后，用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液将细胞室温固定1分钟，用酸性磷酸酶活性测定盒(酸性磷酸酶、白细胞、目录No.387-A，Sigma公司制)，通过染色检出破骨细胞的形成。以酒石酸存在下酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少作为OCIF的活性。实施例3OCIF的精制i)用肝素琼脂糖CL-6B(HeparinSepharoseCL-6B)精制将约90升IMR-90培养液(试料1)用0.22μm滤膜(亲水性Milidisk，2000cm2，Millipore公司制)过滤后，分3次上肝素琼脂糖CL-6B柱(5×4.1cm，凝胶容量80ml)，该柱用含0.3MNaCl的10mMTris-HCl缓冲液(下称作Tris-HCl，)(pH7.5)平衡过。以流速500ml/小时的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，用含2MNaCl的10mMTris-HCl(pH7.5)洗脱，得肝素琼脂糖CL-6B吸附部分900ml，所得组分作为试料2。ii)用HiLoad-Q/FF精制将肝素琼脂糖吸附部分(试料2)对10mMTris-HCl(pH7.5)进行透析后，加CHAPS使成0.1％，于4℃放置一夜，分2次上用含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)平衡过的阴离子交换柱(HiLoad-Q/FF，2.6×10cm，Pharmacia公司制)，得非吸附部分1000ml。所得部分作为试料3。iii)用HiLoad-S/HP精制将HiLoad-Q非吸附部分(试料3)上以含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)平衡过的阳离子交换柱(HiLoad-S/HP，2.6×10cm，Pharmacia公司制)。用含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在100分钟内，用NaCl0-1M的线性梯度，以8ml/分的流速进行洗脱，按12ml/流分进行收集。将流分1-40汇集成4个部分，每个部分10个流分，各用100μl测定OCIF活性，在流分11-30发现有OCIF活性(图1图中，++表示抑制破骨细胞形成80％以上的活性；+表示抑制破骨细胞形成30-80％的活性；-表示未检出活性)。以比活性较高的流分21-30作为试料4。iv)用亲和柱(肝素-5PW)精制将120ml试料4用240ml含0.1CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)稀释后，上以含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)平衡过的亲和柱(肝素-5PW，0.8×7.5cm，TOSOH公司制)。用含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在60分钟内，以NaCl0-2M的线性梯度、0.5ml/分的流速进行洗脱，按0.5ml/流分进行分取。各流分用50μl测定OCIF活性，得到约0.7-1.3MNaCl洗脱的OCIF活性部分10ml，作为试料5。v)用亲和柱(Blue-5PW)精制将10ml试ou5用190ml含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)稀释后，上以含0.1CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)平衡过的亲和柱(Blue-5PW，0.5×5.0cm，TOSOH公司制)。用含0.1％CHAPS的50mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在60分钟内，以NaCl0-2M的线性梯度、0.5ml/分的流速进行洗脱，按0.5ml/流分进行分取。各流分用25μl测定OCIF活性，得到用约1.0-1.6MNaCl洗脱的OCIF活性流分49-70(图2，图中++表示抑制破骨细胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨细胞形成30-80％的活性)。vi)用反相柱精制在所得的流分49-50ml中，加入25％TFA(三氟乙酸)10μl，然后上以含0.1％TFA的25％乙腈平衡过的反相柱(BU-300，C4，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在60分钟内，用乙腈以0-55％的线性梯度、0.2ml/分的流速进行洗脱，分取各峰(图3)。用各峰流分100μl测定OCIF活性，在峰6和峰7检出浓度依赖性的活性。结果见表1。表1从反相柱洗脱的OCIF活性</tables>(表中，++表示抑制破骨细胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨细胞形成30-80％的活性，-表示未检出活性。)实施例4OCIF分子量的测定用检出OCIF活性的峰6和峰7各40μl，在还原或非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。即取各峰流份每份20μl各置2个试管中，减压浓缩后，溶解于含1mMEDTA、2.5％SDS和0.01％溴酚蓝的10mMTris-HCl(pH8)1.5μl中，分别在非还原条件下及还原条件下(存在5％巯基乙醇)于37℃放置过夜后，各取1μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用10-15％丙烯酰胺梯度凝胶(Pharmacia公司制)，用Phast系统电泳装置(Pharmacia公司制)进行电泳。用磷酸化酶b(94kD)牛血清白蛋白(67kD)、卵白蛋白(43kD)、碳酸酐酶(30kD)、胰蛋白酶抑制剂(20.0kD)、α-乳白蛋白(14.4kD)作为分子量标志。电泳结束后，用Phast凝胶银染试剂盒(Pharmacia公司制)，进行银染。结果见图4。其结果，对于峰6，在还原条件下、非还原条件下检出约60kD的蛋白带，对于峰7，在还原条件下检出约60kD、在非还原条件下检出约120kD的蛋白带。从而，认为峰7是峰6的蛋白质的同源二聚物。实施例5OCIF的热稳定性试验从Blue-5PW流份51-52混合后所得的样品中取若干份，各20μl，加入10mM磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)30μl后，于70℃和90℃进行10分钟热处理，或于56℃进行30分钟热处理。用此样品按实施例2所述方法测定OCIF的活性。结果见表2。表2OCIF的热稳定性(表中，++表示抑制破骨细胞形成80％以上的活性，+表示抑制破骨细胞形成30-80％的活性，-表示未检出活性。)实施例6内部氨基酸序列的确定取Blue-5PW流份51-70，将每2个流份混合成1ml，在各个试样中加入10μl的25％TFA后，将1ml分10次上以含0.1％TFA的25％乙腈平衡过的反相柱(BU-300，C4，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在60分钟内用乙腈以0-55％的线性梯度、以0.2ml/分的流速进行洗脱，收集峰6和峰7。所得的峰6和峰7的一部分分别用蛋白质序列分析仪(PROCISE494型，Perkin-Elmer公司制)，进行N末端氨基酸序列分析，不能分析提示这些蛋白质的N末端可能被保护。另外，解析这些蛋白质的内部氨基酸序列。即将峰6和峰7流份分别离心浓缩后，各加入100μg二硫苏糖醇、含10mMEDTA、7M盐酸胍和1％CHAPS的0.5MTris-HCl(pH8.5)50μl，室温下放置4小时进行还原后，加入0.2μl4-乙烯基吡啶，在室温暗处放置一夜，进行吡啶基乙基化。在这些样品中加入25％TFA1μl，用含0.1％TFA的20％乙腈平衡过的反相柱(BU-300，C4，2.1×30mm，Perkin-Elmer公司制)，在30分钟内用乙腈以浓度0-50％的线性梯度、以0.3ml/分的流速进行洗脱，得到还原吡啶基乙基化的OCIF样品。将还原吡啶基乙基化的OCIF样品分别离心浓缩，用含8M尿素和0.1％吐温-80的0.1MTris-HCl(pH9)25μl溶解后，用0.1MTris-HCl(pH9)73μl稀释，加入0.02μg的AP1(赖氨酰内切蛋白酶，和光纯药社制)，37℃反应15小时。在反应液中加入25％TFA1μl，上以0.1％TFA平衡过的反相柱(BU-300，C8，2.1×220mm，Perkin-Elmer公司制)，在70分钟内用乙腈以0-50％的线性梯度、以0.2ml/分的流速进行洗脱，得到肽碎片(图5)、对所得的肽碎片(P1-P3)用蛋白质序列分析仪进行氨基酸序列分析。结果见序列表序列1-3。实施例7cDNA序列的确定i)从IMR-90细胞分离聚(A)+RNA用快速痕迹mRNA分离试剂盒(Invitrogen制)按照其手册所述进行分离。用此方法，从约1×108个IMR-90细胞获得约10μg聚(A)+RNA。ii)混合引物的制备以前面所得的肽(序列表序列2和3)的氨基酸序列为基础，合成了2种混合引物。即合成了具有可编码肽P2(序列2的肽)的第6(Gln)至第12位(Leu)氨基酸序列的全部碱基序列的寡核苷酸的混合物(混合引物No.2F)。又合成了与可编码肽P3(序列3的肽)的第6(His)至第12位(Lys)氨基酸序列的全部碱基序列互补的寡核苷酸的混合物(混合引物No.3R)。所用的混合引物的碱基序列见表3。表3＝No.2F＝5’-CAAGAACAAACTTTTCAATT-3’GGGCCGCAG＝No.3R＝5’-TTTATACATTGTAAAAGAATG-3’CGCGGCTGACGTiii)OCIFcDNA片段用PCR扩增将实施例7-i)中所得的聚(A)+RNA1μg作为模板，用SuperScriptIIcDNA合成试剂盒(Gibco公司制)，按该公司的方案合成单链cDNA，用此cDNA和实施例7-ii)所述的引物进行PCR，得到OCIFcDNA片段。以下列出条件。10xExTaq缓冲液(宝酒造社)5μl2.5mMdNTP4μlcDNA溶液1μlExTaq(宝酒造社)0.25μl蒸馏水29.75μl40μM引物No.2F5μl40μM引物No.3F5μl将上述溶液在微量离心管中混合后，按以下条件进行PCR。于95℃进行3分钟预处理后，将95℃30秒、50℃30秒、70℃2分钟的3阶段反应重复进行30次，然后于70℃保温5分钟。将反应液的一部分进行琼脂糖电泳，确认得到约400bp的均一的DNA片段。实施例8PCR扩增所得的OCIFcDNA片段的克隆化及碱基序列测定将实施例7-iii)中所得的OCIFcDNA片段按Marchuk，D等的方法(NucleicAcidRes.，Vol.19，p1154，1991)，用DNA连接试剂盒Ver.2.(宝酒造社制)插入质粒pBluescriptIISK-(Strategene公司制)中，使大肠杆菌DH5α(GibcoBPL社)进行转化。让所得的转化株增殖，将插入了约400bp的OCIFcDNA片段的质粒按常规方法进行精制。将此质粒命名为pBCOCIF，将此质粒中插入的OCIFcDNA的碱基序列用Taq双脱氧链终止循环测序试剂盒(TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingkit；Perkin-Elmer公司制)进行测定。此OCIFcDNA的长度为397bp。在由从此碱基序列预测的132个氨基酸组成的氨基酸序列中，用于混合引物设计的OCIF的内部氨基酸序列(序列表中序列2和3)可分别见于N末端和C末端。OCIF的内部氨基酸序列(序列1)还可见于此132个氨基酸组成的氨基酸序列之中。从以上结果可确认克隆化的397bp的cDNA为OCIFcDNA的片段。实施例9DNA探针的制备将实施例8所制得的插入了397bp的OCIFcDNA片段的质粒作为模板，在实施例7-iii)的条件下进行PCR，将此OCIFcDNA的片段扩增。用琼脂糖电泳将397bp的OCIFcDNA片段分离后，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)进行精制。将此DNA用MegaprimeDNA标记试剂盒(Amersham公司制)以[α32P]dCTP标记，用作筛选全长OCIFcDNA的探针。实施例10cDNA文库的制备以实施例7-i)所得的聚(A)+RNA2.5μg为模板，用GreatLengthscDNA合成试剂盒(Clontech公司制)，按该公司的方案用寡(dT)引物进行cDNA合成、与EcoRI-SalI-Not-I衔接头相连接、按cDNA大小分级，用乙醇沉淀后，溶于10μlTE缓冲液。用T4DNA连接酶将所得的与衔接头连接的cDNA0.1μg插入预先用EcoRI切断的1μg的λZAP表达载体(Stratagene公司制)中。将如此所得的cDNA重组噬菌体DNA溶液用GigapackGoldII(Stratagene公司制)供体外包装反应，制成λZAP表达重组载体噬菌体。实施例11重组噬菌体的筛选将实施例10所得的重组噬菌体于37℃感染大肠杆菌XLl-BlueMRF′(Stratagene公司制)15分钟，然后加入加温至50℃的含0.7％琼脂的NZY培养基，流入NZY琼脂培养基平板。于37℃培养过夜，在产生噬菌斑的平板上以HybondN(Amersham公司制)接触30秒。将该滤膜按常规方法进行碱变性后，中和，浸入2×SSC溶液后用UV交联剂(Stratagene公司制)将DNA固定在滤膜上。将所得的滤膜于65℃在含100μg/ml的鲑精子DNA的杂交缓冲液(Amersham公司制)中浸渍4小时进行预处理后，移入加有经热变性的上述DNA探针(2×105cpm/ml)的上述缓冲液中，于65℃进行一夜杂交。反应后，滤膜于65℃下用2×SSC洗2次、0.1×SSC和0.1％SDS溶液各洗2次，每次10分钟。将所得的几个阳性克隆再按这样的方法筛选2次进行纯化。将其中具有约1.6kb的插入片段的克隆用于下面的步骤。此纯化的噬菌体称作λOCIF。将纯化的λOCIF按λZAP表达克隆化试剂盒(Stratagene公司制)的方案感染大肠杆菌XLl-BlueMRF′，然后用辅助噬菌体ExAssist(Stratagene公司制)进行多重感染，将其培养上清液感染大肠杆菌XLOLR(Stratagene公司制)，然后通过选择卡那霉素耐性株，得到具有在pBKCMV(Stratagene公司制)中插入上述1.6kb插入片段的质粒pBKOCIF的转化株。此转化株称作pBK/01F10，保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所，保藏号FERMBP-5267(1995年10月25日根据布达佩斯条约将FERMP-14998原保藏物移存)。使具有此质粒的转化株增殖，按常规方法精制质粒。实施例12编码OCIF全氨基酸序列的cDNA碱基序列的确定用Taq双脱氧链终止循环测序试剂盒(TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingkit；Perkin-Elmer公司制)测定实施例11所得的OCIFcDNA的碱基序列。所用的引物为T3、T7引物(Stratagene公司制)及基于OCIFcDNA的碱基序列设计的合成引物，其序列见序列表序列16-29。确定的OCIF碱基序列及从该序列推断的氨基酸序列分别见序列6和序列5。实施例13用293/EBNA细胞制备重组OCIFI)OCIFcDNA表达质粒的构建将实施例11得到的插入约1.6kb的OCIFcDNA的质粒pBKOCIF以限制酶BamHI及XhoI消化，切出OCIFcDNA，经琼脂糖电泳分离后，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)。该OCIFcDNA用连接试剂盒Ver.2(宝酒造社制)插入预先以限制酶BamHI及XhoI消化的表达质粒pCEP4(Invitrogen公司)，使大肠杆菌DH5α(GibcoBRl公司)进行转化。让所得的转化株增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司)精制插入了OCIFcDNA的表达质粒pCEPOCIF。以乙醇沉淀OCIF表达质粒pCEPOCIF后，以无菌蒸馏水溶解后，用于以下操作。ii)OCIFcDNA的瞬时表达及其活性测定用实施例13-i)所得的OCIF表达质粒pCEPOCIF，以如下所述方法表达重组OCIF，并测定其活性。用含10％胎牛血清(GibcoBRL公司)的IMDM培养基(GibcoBRL公司)在6孔微量培养板的各孔中接种8×105个293/EBNA细胞(Invitrogen公司)，次日除去培养基后，以无血清IMDM培养基洗涤细胞。按添加转染用试剂Lipofectamine(GibcoBRL公司制)的方案，将预先以OPTI-MEM培养基(GibcoBRL公司制)稀释的pCEPOCIF与Lipofectamine混合后，将此混合液加到各孔的细胞中。所用的pCEPOCIF及Lipofectamine的量各为3μg及12μl。38小时后，除去培养基，加入1ml新的OPTI-MEM培养基，再经30小时后，回收培养基，将它作为测定OCIF活性用的样品。OCIF的活性测定按如下方法进行。用耐酒石酸的酸性磷酸酶活性的诱导，试验出生后约17日的小鼠骨髓细胞在活性型维生素D3存在下的破骨细胞的形成，测定其活性的抑制，作为OCIF的活性。即在96孔微量培养板上加入以含2×10-8M活性型维生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培养基(GibcoBRL公司)稀释的样品100μl，取出生后约17日的小鼠骨髓细胞3×105个悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl中，进行接种，在5％CO2中于37℃、温度100％条件下培养一周。于培养第3日及第5日，弃去培养液160μl，加入以含1×10-8M活性型维生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培养基稀释的样品160μl。培养7日后，以磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，用乙醇/丙酮(1∶1)溶液将细胞于室温固定1分钟，用酸性磷酸酶活性测定试剂盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目录No.387-A，Sigma公司)用染色法检出破骨细胞的形成。将酒石酸存在下酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少作为OCIF活性。结果如表4所示，确认该培养液与以前由IMR-90的培养液得到的天然型OCIF具有同样的活性。表4293/EBNA细胞表达的培养液中的ICIF活性稀释度1/201/401/801/1601/3201/6401/1280OCIF引入基因+++++++++++-引入载体-------未处理-------(表中，++表示抑制破骨细胞形成达80％以上的活性，+表示抑制破骨细胞形成达30～80％的活性，-表示活性未检出。)iii)来自293/EBNA细胞的重组OCIF的精制按实施例13-ii)所述大量培养293/EBNA细胞所得到的培养液1.8L，加CHAPS使成为0.1％，经0.22μm的滤器(SteribecsGS，Millipore公司制)过滤后，上以10mMTris-HCl(pH7.5)平衡的50ml肝素琼脂糖CL-6B柱(2.6×10cm、Pharmacia公司)。以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在100分种内用NaCl以0～2M的线性梯度、4ml/分的流速洗脱，按8ml/流分进行收集。各流分用150μl按实施例2的方法测定OCIF的活性，得到以约0.6～1.2MNaCl洗脱的OCIF活性部分112ml。所得的OCIF活性部分112ml以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)稀释成1000ml后，上以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)平衡的亲和柱(肝素-5PW，0.8×7.5cm、ト-ソ-社)。以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在60分钟内用NaCl以0～2M的线性梯度、0.5ml/分的流速进行洗脱，按0.5ml/流分进行收集。所得的流分各取4μl按实施例4的方法，在还原及非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。其结果，流分30～32在还原条件下仅检出约60kD、在非还原条件下仅检出约60kD及约120kD的OCIF带，收集流分30～32，作为纯的来自293/EBNA细胞的重组OCIF(rOCIF(E))部分。以BSA作标准，用Lowry法对蛋白质进行定量的结果，表明得到535μg/ml珠rOCIF(E)1.5ml。实施例14用CHO细胞制备重组OCIFi)OCIF表达质粒的构建实施例11所得的插入约1.6kb的OCIFcDNA的质粒pBKOCIF以限制酶SaLI及EcoRV消化，切出约1.4kb的OCIFcDNA片段，经琼脂糖电泳分离后，以QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制。另外，表达载体pcDL-SR2296(MolecularandCellularBiology，Vol.8，pp466-472，1988)用限制酶PstI及KpnI消化，经琼脂糖电泳分离约3.4kb的表达载体DNA片段后，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制。用DNA平端化试剂盒(宝酒造社)，使这些经精制的OCIFcDNA片段与表达载体DNA片段的末端平滑化。然后，用连接试剂盒Ver.2(宝酒造社)。将OCIFcDNA片段插入已经平滑化的表达载体DNA片段，使大肠杆菌DH5α(GibcoBRL公司)进行转化，得到含有OCIF表达质粒pSRαOCIF的转化株ii)表达质粒的制备分别用常法使实施例13-i)所得的含有OCIF表达质粒pSRαOCIF的转化株以及WO92/01053号公报所揭示的含有小鼠DHFR基因表达质粒pBAdDSV的转化株增殖，按Maniatis等(Molecularcloning，第2版)的方法用碱法及聚乙二醇法处理，以氯化铯密度梯度离心法精制。iii)以不含蛋白质的培养基驯化CHOdhFr-细胞用含10％胎牛血清(GibcoBRL公司)的IMDM培养基(GibcoBRL公司)继代培养的CHOdhFr-细胞(ATCC-CRL9096)，以无血清培养基EX-CELL301(JRHBioscience公司)驯化后，再以不含蛋白质的培养基EX-CELLPFCHO(JRHBioscience公司)驯化。iv)将OCIF表达质粒和DHFR表达质粒导入CHOdhFr-细胞用实施例14-ii)制备的OCIF表达质粒pSRαOCIF和DHFR表达质粒pBAdDSV，以下述电穿孔法使实施例14-iii)制备的CHOdhFr-细胞转化。将pSRαOCIF质粒200μg和pBAdDSV质粒20μg以无菌操作溶解于含10％胎牛血清(GibcoBRL公司)的IMDM培养基(GibcoBRL公司)0.8ml后，取其0.8ml悬浮2×107个CHOdhFr-细胞。将此细胞悬液加入样品池(Bio-Rad公司)，用基因脉冲发生器(Bio-Rad公司)，在360V、960μF的条件下以电穿孔法进行转化。将已完成电穿孔的细胞悬液移入已加10mlEX-CELLPFCHO培养基的细胞悬浮用的T形瓶(住友べ-クラィト社)，在CO2培养箱中培养2日。用EX-CELLPFCHO培养基以5000个细胞/孔的浓度接种于96孔微量培养板，培养约2周。由于EX-CELLPFCHO培养基不含核酸，亲株CHOdhFr-在此培养基中不能增殖，所以只有表达DHFR的细胞株被选择出来。由于OCIF表达质粒的用量为DHFR表达质粒的10倍，所以表达DHFR的细胞株大部分能表达OCIF。用实施例2所述测定方法，从所得到的表达DHFR的细胞株中筛选出培养上清液中OCIF活性高的细胞株。对所得到的OCIF高产株，采用EX-CELLPFCHO培养基，以有限稀释法进行细胞克隆，对所得的克隆，筛选培养上清液中OCIF活性高的细胞株，得出OCIF高产克隆5561。v)重组OCIF的制备为制备重组OCIF(rOCIF)，在3升EX-CELL301培养基中接种转化的CHO细胞(5561)，使浓度为1×105个细胞/ml，用旋动烧瓶于37℃培养4～5日。至细胞的浓度约为1×10-6个细胞/ml时，回收约2.7升培养基。加入约2.7升EX-CELL301培养基，反复培养。用3个旋动烧瓶，采取约20升培养液。vi)来自CHO细胞的重组OCIF的精制在实施例14-v)所得到的培养液1升中加入CHAPS，使成0.1％的浓度，经0.22μm滤器(SteribecksGS，Millipore公司)过滤后，上以10mMTris-HCl(pH7.5)平衡的50ml肝素琼脂糖FF柱(2.6×10cm，Pharmacia公司)。此含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在100分钟内用NaCl以0～2M的线性梯度、4ml/分的流速洗脱，按8ml/流分进行收集。各流分取150μl按实施例2的方法测定OCIF活性，得到以约0.6～1.2M洗脱的OCIF活性部分112ml。将所得的OCIF活性部分112ml用含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)稀释成1200ml之后，上以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)平衡的亲和柱(蓝染料-5PW，0.5×5cm，ト-ソ-社)。以含0.1％CHAPS的10mMTris-HCl(pH7.5)洗涤后，在90分钟内用NaCl以0～3M的线性梯度、0.5ml/分的流速洗脱，按0.5ml/流分进行收集。所得流分各取4μl按实施例4的方法在还原及非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。其结果，流分的30～38在还原条件下仅检出约60kD、在非还原条件下仅检出约60kD与约120kD的OCIF带，故合并流分30～38，作为精制的来自CHO细胞的重组OCIF(rOCIF(C))部分。以BSA作标准，按Lowry法定量蛋白的结果，表明得到113μg/ml的rOCIF(C)4.5ml。实施例15重组OCIF的N-末端结构解析取3μg精制rOCIF(E)及rOCIF(C)，用ProSpin(Perkin-Elmer公司)固定于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以20％甲醇洗涤后，用蛋白质测序仪(PROCISE492型，Perkin-Elmer公司)进行N-末端氨基酸序列测定。结果见序列表第7号序列。搞清了rOCIF(E)及rOCIF(C)的N-末端的氨基酸是序列表序列5所记载的氨基酸序列的翻译起始点Met起第22号的Glu，从Met至Gln的21个氨基酸是信号肽。而自IMR-90培养液精制得到的天然型OCIF的N-末端氨基酸序列不能分析，认为是因N-末端的Glu在培养时或精制时转变成了焦谷氨酸之故。实施例16重组(r)OCIF及天然型(n)OCIF的生物活性I)由维生素D3诱导的小鼠骨髓细胞株破骨细胞形成的抑制在96孔微量培养板上，加入以含2×10-8M活性型维生素D3及10％胎牛血清的α-MEM培养基(GibcoBRL公司)自250ng/ml开始连续二倍稀释的精制rOCIF(E)及nOCIF100μl。将出生后约17日的小鼠骨髓细胞3×105个悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl中，接种于各孔，在5％CO2中于37℃、温度100％培养一周。培养7日后，按实施例2的方法用酸性磷酸酶测定试剂盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目录No.387-A，Sigma公司)进行染色，检出破骨细胞的形成。将酒石酸存在下酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少作为OCIF活性。酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少率，从已染色细胞的色素的溶解、其吸光度的测定进行计算。即在细胞已固定并染色的各孔中加入0.1N氢氧化钠-二甲亚砜混合液(1∶1)100μl后充分振荡。色素充分溶解后，用微量培养板读数仪(ImmunoreaderNJ-2000，InterMed公司)于测定波长590nm、对照波长490nm测定吸光度。而用未加维生素D3的孔，作为测定吸光度时的空白孔。将未加OCIF孔的吸光度值作为100，用百分率表示结果，见表5。表5由OCIF引起的小鼠骨髓细胞株破骨细胞形成的抑制(维生素D3)OCIF浓度(ng/ml)2501256331160rOCIF(E)0036280100nOCIF00272775100rOCIF(E)与nOCIF同样，在16ng/ml以上的浓度时出现剂量依赖性的破骨细胞形成抑制活性。ii)基质细胞与小鼠脾脏细胞共同培养体系中由维生素D3诱导的破骨细胞形成的抑制维生素D3诱导的基质细胞与小鼠脾脏细胞共同培养体系中破骨细胞形成的试验，按宇田川等的方法(Endocrinology，Vol125，p1805-1813，1989)进行。即在96孔微量培养板上，加入以2×10-8M活性型维生素D3、2×10-7M地塞米松及10％胎牛血清的α-MEM培养基(GibcoBRL公司)连续稀释的精制rOCIF(E)、rOCIF(C)及nOCIF100μl。将来自小鼠骨髓的基质细胞株ST2细胞(RIKENCellBankRCB0224)5×103个以及出生后约8周的ddy小鼠脾脏细胞1×105个悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl中，接种于各孔，于5％CO2中于37℃及湿度100％培养5日。培养5日后以磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液将细胞室温固定1分钟，用盐酸磷酸酶活性测定试剂盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目录No.387-A，Sigma公司)染色，检出破骨细胞的形成。将酒石酸存在下酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少作为OCIF活性。而酸性磷酸酶活性阳性细胞数的减少率，按实施例16-i)记载的方法使已染色细胞的色素溶解，进行计算。用rOCIF(E)及rOCIF(C)试验的结果分别列于表6及表7。表6基质细胞与小鼠脾脏细胞共同培养系统中由OCIF引起的破骨细胞形成的抑制OCIF浓度(ng/ml)50251360rOCIF(E)3228380100rOCIF(C)13197096100表7基质细胞与小鼠脾脏细胞共同培养系统中由OCIF引起的破骨细胞形成的抑制OCIF浓度(ng/ml)25063160rOCIF(E)72737100nOCIF132340100可见rOCIF(E)及rOCIF(C)与nOCIF一样，在6～16ng/ml以上的浓度都具有剂量依赖性的破骨细胞形成抑制活性。iii)对PTH诱导的破骨细胞形成的抑制PTH诱导破骨细胞形成的试验，按高桥等的方法(Endocrinology，Vol122，p1373-1382，1988)进行。就是以含2×10-8MPTH及10％胎牛血清的α-MEM培养基(Gibco公司)从125ng/ml起连续稀释nOCIF及精制rOCIF(E)，在96孔微量培养板上各加入100μl。将出生后约17日的小鼠骨髓细胞3×105个悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl，接种于各孔，在5％CO2中于37℃及湿度100％培养5日。培养5日后，以磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，然后以乙醇/丙酮(1∶1)溶液将细胞于室温固定1分钟，用酸性磷酸酶活性测定试剂盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目录No.387-A，Sigma公司)染色，检出破骨细胞的形成。将酒石酸存在下酸性磷酸酶活性阳性细胞的减少作为OCIF活性。而酸性磷酸酶活性阳性细胞数的减少率按实施例16-i)记载的方法，使已染色细胞的色素溶解进行计算。结果如表8所示。表8OCIF引起的小鼠骨髓细胞系破骨细胞形成的抑制(PTH)OCIF浓度(ng/ml)12563311680rOCIF(E)658585388100nOCIF1847535691100可见rOCF(E)与nOCIF一样，在16ng/ml以上的浓度存在着剂量依赖性的破骨细胞形成抑制活性。iv)对IL-11诱导的破骨细胞形成的抑制IL-11诱导的破骨细胞形成试验，按田村等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol90，p11924～11928，1993)进行。即在96孔微量培养板上，加入以含20ng/mlIL-11和10％胎牛血清的α-MEM培养基(GibcoBRL公司制)稀释的nOCIF及精制rOCIF(E)100μl。将来自新生小鼠头盖骨的成脂细胞株MC3T3-G2/PA6细胞(RIKENCellBank-RCB1127)5×103个以及出生后约8周的ddy小鼠脾脏细胞1×105个悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养基100μl，接种于各孔，于5％CO2中37℃、湿度100％培养5日。培养5日后以磷酸盐缓冲生理盐水洗涤，用乙醇/丙酮(1∶1)溶液将细胞于室温固定1分钟，用酸性磷酸酶活性测定试剂盒(AcidPhosphatase，Leucocyte，目录No.387-A，Sigma公司)染色，检出破骨细胞的形成。对酒石酸存在下的酸性磷酸酶活性阳性细胞进行计数，将其减少作为OCIF活性。结果如表9所示。表9IL-11诱导的酒石酸存在下的酸性磷酸酶活性阳性细胞数浓度(ng/ml)500125317.82.00.50nOCIF0014134931rOCIF(E)0013103731可见nOCIF以及rOCIF(E)在2ng/ml以上的浓度均存在着剂量依赖性的IL-11诱导的破骨细胞形成抑制活性。在利用如上种种靶细胞的破骨细胞形成试验系统中，发现OCIF对维生素D3、PTH以及IL-11等破骨细胞形成诱导因子引起的破骨细胞形成几乎在相同浓度下均有抑制作用。因此提示OCIF对上述种种骨吸收促进物质诱导的不同类型的骨量减少症的治疗，均有可能有效地加以使用。实施例17单体型和二聚物型OCIF样品的制备在分别含rOCIF(E)及rOCIF(C)100μg的样品中加1/100体积的25％TFA(三氟乙酸)后，上以含0.1TFA的30％乙腈平衡的逆相柱(PROTEIN-RP，2.0×250mm，YMC公司)，在50分钟内用乙腈以0～55％的线性梯度、0.2ml/分的流速进行洗脱，分得各OCIF峰。将所得的峰部分冷冻干燥，得到单体型OCIF以及二聚物型OCIF。实施例18重组OCIF的分子量测定按实施例3-vi)的方法用反相柱精制的单体型及二聚物型nOCIF，以及按实施例17记载的方法精制的单体型及二聚物型rOCIF，各取约含1μg的样品减压浓缩。这些样品用实施例4的方法SDS处理、SDS-聚丙烯酰胺电泳以及银染色。非还原条件下以及还原条件下电泳的结果分别示于图6及图7。其结果，在非还原条件下，任一单体型样品都检出60kD的蛋白质带，而任一二聚物型样品都检出120kD的蛋白质带。而且在还原条件下任一样品都只能检出约60kD的蛋白质带。因此，说明来自IMR-90细胞的nOCIF、来自293/EBNA细胞的重组OCIF以及来自CHO细胞的重组OCIF的各单体型和各二聚物型其分子量几乎相同。实施例19来自IMR-90细胞的天然型OCIF以及重组OCIF的N-结合型糖链的除去及分子量测定按实施例3-vi)的方法用反相柱精制的单体型和二聚物型nOCIF，以及按实施例17记载的方法精制的单体型和二聚物型rOCIF，各取约含5μg的样品，减压浓缩。在这些样品中，加入已加有100mM2-巯基乙醇的50mM磷酸盐缓冲液(pH8.6)9.5μl，使其溶解，再加入250U/mlN-聚糖酶溶液(生化学工业社)0.5μl，于37℃放置1日。在这些样品中加入含2mMMEDTA、5％SDS以及0.02％溴酚蓝的20mMTris-HCl(pH8.0)10μl，于100℃加热5分钟。按实施例4的方法取这些样品各1μl进行SDS-聚丙烯酰胺电泳后，进行银染色。结果如图8所示。结果表明，用N-聚糖酶处理而除去N-结合糖链的OCIF蛋白质在还原条件下的分子量均约为40kD。未进行去糖链处理的来自IMR-90细胞的nOCIF、来自293/EBNA细胞的rOCIF以及来自CHO细胞的rOCIF各自在还原条件下的分子量均为约60kD，说明这些OCIF均为其分子内含有N-结合糖链的糖蛋白。实施例20OCIF变异体cDNA的克隆及碱基序列的测定如实施例10及11所示，从几个纯化的阳性噬菌体之一，得到了具有OCIFcDNA插入pBKCMV(Stratagene公司)所得质粒pBKOCIF的转化株，这时从其他几个阳性噬菌体还得到具有插入了不同长度插入片段的质粒的转化株。使具有这些质粒的转化株增殖，并用常法精制质粒。这些插入片段DNA的碱基序列用TaqDyeDeoxyTerminaterCycleSequencing试剂盒(Perkin-Elmer公司)确定。所用的引物是T3、T7引物(Stratagene公司)及根据OCIFcDNA的碱基序列设计合成的引物。除原型OCIF之外，共存在4种OCIF变异体(OCIF2、3、4、5)。由已确定的序列8的OCIF2cDNA的碱基序列推断的氨基酸序列以序列9表示。已确定的OCIF3cDNA的碱基序列以序列10表示，由该序列推断的氨基酸序列以序列11表示。已确定的OCIF4cDNA的碱基序列以序列12表示，由该序列推断的氨基酸序列以序列13表示。已确定的OCIF5cDNA的碱基序列以序列14表示，由该序列推断的氨基酸序列以序列15表示。这些OCIF变异体结构特征将根据图9～12以及下面的叙述简单加以说明。OCIF2OCIFcDNA碱基序列(序列6)的第265位乌嘌呤至第285位乌嘌呤共21bp缺失，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)的第68位谷氨酸(Glu)至第74位谷氨酰胺(Gln)共7个氨基酸缺失。OCIF3OCIFcDNA的碱基序列(序列6)第9位的胞嘧啶被乌嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)的-19位天冬酰胺(Asn)被赖氨酸(Lys)替代。但这是信号序列中氨基酸的替换，据认为对分泌的OCIF3没有影响。OCIFcDNA碱基序列(序列6)的第872位乌嘌呤至第989位乌嘌呤共缺失117bp，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第270位苏氨酸(Thr)至第308位亮氨酸(Leu)39个氨基酸缺失。OCIF4OCIFcDNA的碱基序列(序列6)第9位的胞嘧啶被乌嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)-19位的天冬酰胺(Asn)被赖氨酸(Lys)替代。另外，第22位的乌嘌呤被胸腺嘧啶替代，氨基酸序列中OCIF氨基酸序列(序列表序列5)-14位的丙氨酸(Ala)被丝氨酸(Ser)替代。但这些是信号序列中的氨基酸替换，据认为对分泌的ICOF4设有影响。OCIFcDNA碱基序列(序列6)第400位与第401位之间插入约4kb的内含子2，开放阅读框架在这中间停止。氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第112位的丙氨酸(Ala)之后增加由21个氨基酸组成的新氨基酸序列。OCIF5OCIFcDNA的碱基序列(序列6)第9位胞嘧啶被乌嘌呤替代，氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)-19位天冬酰胺(Asn)被赖氨酸(Lys)替代。但这是信号序列中的氨基酸替换，据认为，对分泌的ICIF5没有影响。OCIFcDNA的碱基序列(序列6)的第400位与第401位之间插入约1.8kb的内含子2的后半部分，开放阅读框架在这中间停止。氨基酸序列中OCIF的氨基酸序列(序列表序列5)第112位的丙氨酸(Ala)之后增加了由12个氨基酸组成的新氨基酸序列。实施例21OCIF变异体的产生I)OCIF变异体cDNA表达质粒的构建在实施例20所得的OCIF变异体cDNA中，OCIF2、3的cDNA所分别插入的质粒pBKOCIF2、pBKOCIF3用限制酶XhoI及BamHI(宝酒造社)消化，分别切出OCIF2及3的cDNA，用琼脂糖电泳分离后用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIGEN公司)精制。用连接试剂盒Ver.2(宝酒造社)将上述OCIF2及3的cDNA插入预先用限制酶XhoI及BamHI(宝酒造社)消化的表达质粒pCEP4(Invitrogen公司)，进行大肠杆菌DH5α(GibcoBRL公司)的转化。另将实施例20得到的OCIF变异体cDNA中的OCIF4的cDNA所插入的质粒pBKOCIF4用限制酶SpeI及XhoI(宝酒造社)消化。经琼脂糖电泳分离后，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIGEN公司)精制。用连接试剂盒Ver.2(宝酒造社)将这一OCIF4的cDNA插入预先用限制酶NheI及XhoI(宝酒造社)消化的表达质粒pCEP4(Invitrogen公司)，进行大肠杆菌DH5α(GibcoBRL公司)的转化。另外，将实施例20得到的OCIF变体cDNA中的OCIF5的cDNA所插入的质粒pBKOCIF5用限制酶HindIII(宝酒造社)消化，切出OCIF5cDNA的编码区的5’区，用琼脂糖电泳分离后，以QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制。将实施例13-i)得到的OCIF表达质粒pCEPOCIF用限制酶HindIII(宝酒造社)消化，除去OCIFcDNA的编码区的5’区，用琼脂糖电泳将含pCEP质粒与OCIFcDNA的3’区的DNA片段pCEPOCIF-3’分离后，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制。用连接试剂盒Ver.2(宝酒造社)将该OCIF5cDNA的HindIII片段插入pCEPOCIF-3’，进行大肠杆菌DH5α(GibcoBRL公司)的转化。使所得到的转化株增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司)精制OCIF2、3、4、5的cDNA所插入的表达质粒pCEPOCIF2、3、4、5。用乙醇使OCIF变异体表达质粒沉淀，然后用无菌蒸馏水溶解，用于以下操作。ii)OCIF变异体cDNA的瞬时表达及其活性测定用实施例21-i)得到的OCIF变异体表达质粒pCEPOCIF2、3、4、5，按实施例13-ii)所述的方法使OCIF变异体瞬时表达，测定其活性。其结果，发现这些OCIF变异体具有弱的活性。实施例22OCIF变异体的制备I)OCIF变异体cDNA亚克隆化用的质粒载体的制备实施例11记载的质粒载体5μg用限制酶BamHI及XhoI(宝酒造社)切断。切断的DNA供制备性琼脂糖凝胶电泳使用。分离含OCIFcDNA全长、约1.6kb的DNA片段，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制，溶于20μl灭菌蒸馏水，得DNA溶液1。然后用限制酶BamHI及XhoI(宝酒造社)将pBluescriptIISK+(Stratagene公司)3μg切断。切断的DNA供制备性琼脂糖凝胶电泳使用。分离约3.0kb的DNA片段，用QIAEX凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司)精制，溶解于20μl灭菌蒸馏水，得DNA溶液2。将1μl的DNA溶液2与4μl的DNA溶液1混合，加DNA连接试剂盒Ver.2I液(宝酒造社)5μl，混合后，于16℃保温30分钟，进行连接反应。还有，以下的连接反应均在16℃保温30分钟的条件下进行。用此连接反应液，按以下的条件进行大肠杆菌的转化。以后的大肠杆菌转化也按以下的条件进行。将此连接反应液5μl与大肠杆菌DH5α感受态细胞(GibcoBRL公司)100μl在15ml灭菌试管(岩城玻璃公司)中混合，于冰水中放置30分钟。于42℃保温45秒后，加250μl培养基(1％胰酶解胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)于37℃搅拌培养。将50μl菌液涂布在含50g/ml氨苄青霉素的2mlL琼脂培养基上。于37℃培养一夜，将繁殖成的6种集落在2ml的L氨苄青霉素液体培养基中再培养一夜，检查各株所包含的质粒的结构。得到的质粒(以后称pSK+-OCIF)具有这样的结构，即在pBluescriptIISK+的BamHIXhoI切断部位插入了含有OCIFcDNA全长的约1.6kbDNA片段。ii)Cys被Ser替换的变异体的制备(1)变异的导入制造了序列表序列4记载的氨基酸序列中，第174、181、256、298及379位Cys残基被Ser替换的变异体。分别命名如下174Cys被Ser替换的变异体称为OCIF-C19S，181Cys被Ser替换的变异体称为OCIF-C20S，256Cys被Ser替换的变异体称为OCIF-C21S，298Cys被Ser替换的变异体称为OCIF-C22S，379Cys被Ser替换的变异体称为OCIF-C23S2。为制备变异体，首先将编码各Cys残基的碱基序列替换成编码Ser残基的碱基序列。变异体的导入通过两步聚合酶链反应(PCR)进行。下面称两步PCR反应。第一步由2个PCR反应组成(PCR1及PCR2)。PCR1反应液10xExTaq缓冲液(宝酒造社)10μl2.5mMdNTP溶液8μl实施例11记载的质粒载体(8ng/ml)2μl灭菌蒸馏水73.5μl20μM引物-15μl100μM引物-2(导入变异用)1μlExTaq(宝酒造社)0.5μlPCR2反应液10xExTaq缓冲液(宝酒造社)10μl2.5mMdNTP溶液8μl实施例11记载的质粒载体(8ng/ml)2μl灭菌蒸馏水73.5μl20μM引物-35μl100μM引物-4(异入变异用)1μlExTaq(宝酒造社)0.5μl导入各变异时，仅改变引物的种类，其他反应组成相同。各反应所用的引物列于表10，在序列表中序列20、23、27、30～40表示了这些序列。将PCR1反应液与PCR2反应液分别加入不同的微量离心管混合后，按以下条件进行PCR。于97℃处理3分钟，于95℃1分钟、55℃1分钟、72℃3分钟3步反应共反复25次，之后于70℃保温5分钟。反应液的一部分供琼脂糖电泳，确认有所需长度的DNA片段被合成。第一步PCR反应结束后，用Amiconmicrocon(Amicon公司)从反应液中除去引物，用灭菌蒸馏水调节最终液量为50μl，使用所得的DNA片段，再进行第2步反应(PCR3)。PCR3反应液10xExTaq缓冲液(宝酒造社)10μl2.5mMdNTP溶液8μlPCR1所得的DNA片段5μlPCR2所得的DNA片段5μl灭菌蒸蒸馏水61.5μl20μM引物-15μl20μM引物-35μlExTaq(宝酒造社)0.5μl表10变异体名称引物-1引物-2引物-3引物-4OCIF-C19SIF10C19SRIF3C19SFOCIF-C20SIF10C20SRIF3C20SFOCIF-C21SIF10C21SRIF3C21SFOCIF-C22SIF10C22SRIF14C22SFOCIF-C23SIF6C23SRIF14C23SF上述溶液加入微量离心管中混合后，与PCR1、PCR2在同样条件下进行PCR。反应液的一部分提供琼脂糖(1％或1.5％)电泳，确认所需长度的DNA片段已被合成。用乙醇使PCR所得的DNA沉淀，在真空中干燥，并溶解于40μl灭菌蒸馏水。称含C19S变异体DNA片段的溶液为溶液A、称含C20S变异体DNA片段的溶液为溶液B、称含C21S变异体DNA片段的溶液为溶液C。称含C22S变异体DNA片段的溶液为溶液D、称含C23S变异体DNA片段的溶液为溶液E。用限制酶NdeI及SphI(宝酒造社)切断溶液A20μl中的DNA片段。用制备性电泳分离、精制约400bp的DNA片段，并溶解于20μl蒸馏水(DNA溶液3)。然后用限制酶NdeI及SphI(宝酒造社)切断2μg的pSK+-OCIF，用制备性电泳分离、精制约4.2kb的DNA片段，溶解于20μl灭菌蒸馏水(DNA溶液4)。将2μl的DNA溶液3与3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl，使大肠杆菌DH5α转化。从所得到的具氨苄青霉素耐药性的转化细胞，通过DNA结构的解析选出具目标质粒DNA的细胞株。DNA的结构，通过测定经限制酶酶切所得到的片段的长度并确定碱基序列，而进行解析。所得的目标质粒DNA称为pSK-OCIF-C19S。用限制酶NdeI及SphI(宝酒造社)切断溶液B20μl中的C20S变异体DNA片段。用制备性电泳分离、精制约400bp的DNA片段，溶解于20μl蒸馏水(DNA溶液5)。将2μl的DNA溶液5与3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl，使大肠杆菌DH5α转化。从所得的耐氨苄青霉素的转化细胞中，通过DNA结构解析，选出具有目标质粒DNA的细胞株。通过测定用限制酶酶切所得片段的长度并确定碱基序列对DNA结构进行解析。所得的目标质粒DNA称为pSK-OCIF-C20S。用限制酶NdeI及SphI(宝酒造社)切断溶液C20μl中的DNA片段。通过制备电泳分离、精制约400bp的DNA片段，溶解于20μl的蒸馏水(DNA溶液6)。将2μl的DNA溶液6与3μl的DNA溶液4混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl，使大肠杆菌DH5α转化。从所得到的耐氨苄青霉素的转化细胞中，通过DNA结构的解析，选出具有目标质粒DNA的细胞株。通过测定用限制酶酶切所得片段的长度并测定碱基序列，对DNA的结构进行解析。所得的目标质粒DNA称为pSK-OCIF-C21S。用限制酶NdeI及BstPI(宝酒造社)切断溶液D20μl中的DNA片段。用制备性电泳分离、精制约600bp的DNA片段，并溶解于20μl蒸馏水(DNA溶液7)。然后用限制酶NdeI及BstPI(宝酒造社)切断2μg的pSK+-OCIF，经制备性电泳分离、精制约4.0kb的DNA片段，溶解于20μl蒸馏水(DNA溶液8)。将2μlDNA溶液7与3μlDNA溶液8混合，再加DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl，使大肠杆菌DH5α转化。从所得的耐氨苄青霉素的转化细胞中，通过DNA结构的解析选出含有目标质粒DNA的细胞株。通过测定限制酶酶切所得片段的长度并确定碱基序列对DNA结构进行解析。所得的目标质粒DNA称为pSK-OCIF-C22S。用限制酶BstpI及EcoRV(宝酒造社)切断溶液E20μl中的DNA片段。通过制备性电泳分离、精制约120bp的DNA片段，并溶解于20μl灭菌蒸馏水(DNA溶液9)。然后用限制酶BstEII及EcoRV(宝酒造社)切断2μgpSK+-OCIF，经制备性电泳分离、精制约4.5kb的DNA片段，并溶解于20μl蒸馏水(DNA溶液10)。将2μlDNA溶液9与3μlDNA溶液10混合，再加DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl，使大肠杆菌DH5α转化。从所得的耐氨苄青霉素的转化细胞中，通过DNA结构的解析选出含目标质粒DNA的细胞株。通过测定经限制酶酶切所得片段的长度并确定碱基序列对DNA的结构进行解析。所得和目标质粒DNA称为pSK-OCIF-C23S。(2)突变体表达载体的构建用限制酶BamHI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切所得的目标质粒DNA(pSK-OCIF-C19S，pSK-OCIF-C20S，pSK-OCIF-C21S，pSK-OCIF-C22S，pSK-OCIF-C23S)，分离、纯化含OCIFcDNA全长的约1.6kb的DNA片段(也含目标突变)，溶解在灭菌蒸馏水20μl中。分别命名为C19SDNA溶液、C20SDNA溶液、C21SDNA溶液、C22SDNA溶液、C23SDNA溶液。然后，用限制酶BamHI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切表达载体pCEP4(Invitrogen公司产品)5μg，分离、纯化约10kb的DNA，溶解在灭菌蒸馏水40μl中(pCEP4DNA溶液)。将pCEP4DNA溶液1μl分别与C19SDNA溶液、C20SDNA溶液、C21SDNA溶液、C22SDNA溶液、C23SDNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA连接试剂盒ver.2I液，进行连接反应。反应结束后，用7μl反应液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞液100ml。从所得耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有在pCEP4的BamHI-XhoI部位上插入了约1.6kb的各DNA片段的目标结构的质粒DNA的菌株共5种。分别命名为pCEP4-OCIF-C19S、pCEP4-OCIF-C20S、pCEP4-OCIF-C21S、pCEP4-OCIF-C22S、pCEP4-OCIF-C23S。ii)缺失结构域的突变体的制备(1)缺失结构域的突变的导入制备分别缺失了序列No.4所记载的氨基酸中2位Thr至42位Ala、43位Pro至84位Cys、85位Glu至122位Lys、123位Arg至164位Cys、177位Asp至251位Gln、253位Ile至326位His的各突变体。将分别缺失了2位Thr至42位Ala、43位Pro至84位Cys、85位Glu至122位Lys、123位Arg至164位Cys、177位Asp至251位Gln和253位Ile至326位His的各突变体命名为OCIF-DCR1、OCIF-DCR2、OCIF-DCR3、OCIF-DCR4、OCIF-DDD1和OCIF-DDD2。缺失结构域的突变的导入也按实施例22-ii)中记载的二步PCR法进行。各突变导入反应中使用的引物见表11，其序列见序列表中的序列No.19、25、40-53和54。表11突变体名引物1引物2引物3引物4OCIF-DCR1XhoIFDCR1RIF2DCR1FOCIF-DCR2XhoIFDCR2RIF2DCR2FOCIF-DCR3XhoIFDCR3RIF2DCR3FOCIF-DCR4XhoIFDCR4RIF16DCR4FOCIF-DDD1IF8DDD1RIF14DDD1FOCIF-DDD2IF8DDD2RIF14DDD2F用乙醇使由PCR得到的DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在40μl的灭菌蒸馏水中。将含DCR1突变DNA片段的溶液、含DCR2突变DNA片段的溶液、含DCR3突变DNA片段的溶液、含DCR4突变DNA片段的溶液、含DDD1突变DNA片段的溶液和含DDD2突变DNA片段的溶液分别命名为溶液F、溶液G、溶液H、溶液I、溶液J和溶液K。将溶液F20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约500bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液11)。然后，用限制酶NdeI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切2μg的pSK+OCIF，通过制备性电泳将约4.0kb的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液12)。将2μl的DNA溶液11和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出OCIFcDNA中具有导入了目标突变的质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得的目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DCR1。将溶液G20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约500bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液13)。将2μl的DNA溶液13和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得的目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DCR2。将溶液H20μl中的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约500bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液14)。将2μl的DNA溶液14和3μl的DNA溶液12混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出OCIFcDNA中具有导入了目标突变的质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DCR3。将溶液I20μl中的DNA片段用限制酶XhoI和SphI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约900bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液15)。然后，用限制酶XhoI和SphI(宝酒造株式会社产品)酶切2μg的pSK+OCIF，通过制备性电泳将约3.6kb的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液16)。将2μl的DNA溶液15和3μl的DNA溶液16混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DCR4。将溶液J20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和NdeI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约400bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液17)。将2μl的DNA溶液17和3μl的DNA溶液8混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DDD1。将溶液K20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和NdeI(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约400bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液18)。将2μl的DNA溶液18和3μl的DNA溶液8混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-DDD2。(2)突变体表达载体的构建用限制酶BamHI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切所得的目标质粒DNA(pSK-OCIF-DCR1，pSK-OCIF-DCR2，pSK-OCIF-DCR3，pSK-OCIF-DCR4，pSK-OCIF-DDD1，pSK-OCIF-DDD2)，将含OCIFcDNA全长的约1.4-1.5kb的DNA片段(也含目标突变)分离、纯化，溶解在灭菌蒸馏水20μl中。分别命名为DCR1DNA溶液、DCR2DNA溶液、DCR3DNA溶液、DCR4DNA溶液、DDD1DNA溶液和DDD2DNA溶液。分别将实施例22-ii)记载的pCEP4DNA溶液1μl与DCR1DNA溶液、DCR2DNA溶液、DCR3DNA溶液、DCR4DNA溶液、DDD1DNA溶液和DDD2DNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA连接缓冲液，进行连接反应。反应结束后，用7μl反应液转化大肠杆菌DH5α。从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有在pCEP4的BamHI-XhoI部位上各插入了1.4-1.5kb片段的结构的质粒DNA的菌株共6种。将具有目标结构的质粒分别命名为pCEP4-OCIF-DCR1、pCEP4-OCIF-DCR2、pCEP4-OCIF-DCR3、pCEP4-OCIF-DCR4、pCEP4-OCIF-DDD1和pCEP4-OCIF-DDD2。iii)缺失C末端结构域的突变体的制备(1)缺失C末端结构域的突变的导入制备分别缺失了序列No.4所记载的氨基酸中379位Cys和380位Leu、331位Ser至380位Leu、252位Asp至380位Leu、177位Asp至380位Leu、123位Arg至380位Leu、86位Cys至380位Leu的各突变体。将缺失了379位Cys和380位Leu的突变体命名为OCIF-CL，将缺失了331位Ser至380位Leu的突变体命名为OCIF-CC，将缺失了252位Asp至380位Leu的突变体命名为OCIF-CDD2，将缺失了177位Asp至380位Leu的突变体命名为OCIF-CDD1，缺失了123位Arg至380位Leu的突变体命名为OCIF-CCR4，将缺失了86位Cys至380位Leu的突变体命名为OCIF-CCR3。制备突变体OCIF-CL用的突变的导入按实施例22-ii)中记载的二步PCR法进行。突变导入反应中使用的引物见表12，其碱基序列见序列表中的序列No.23、40、55和56。用乙醇使由PCR得到的DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在40μl的灭菌蒸馏水中(溶液L)。将溶液L20μl中的DNA片段用限制酶BstPI和EcoRV(宝酒造株式会社产品)酶切。通过制备性电泳将约100bp的DNA片段分离、纯化，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中(DNA溶液19)。然后，将2μl的DNA溶液9和3μl的实施例22-ii)中记载的DNA溶液10混合，再加入DNA连接试剂盒ver.2I液5μl，进行连接反应。用反应后的连接溶液5μl使大肠杆菌DH5α转化。通过DNA结构解析，从所得的耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA命名为pSK-OCIF-CL。使用一步PCR法进行制备突变体OCIF-CC、突变体OCIF-CDD2、突变体OCIF-CDDl、突变体OCIF-CCR4、突变体OCIF-CCR3用的突变导入。反应条件如下。导入缺失C末端结构域的突变用的PCR反应液10XExTaq缓冲液(宝酒造株式会社产品)10μl2.5mMdNTP溶液8μl实施例11记载的质粒载体(8ng/ml)2μl灭菌蒸馏水73.5μl20μM引物OCIFXhoF5μl100μM导入突变用的引物1μlExTaq(宝酒造株式会社产品)0.5μl表12突变体名引物1引物2引物3引物4OCIF-CLIF6CLRIF14CLF导入各突变时，仅改变引物的种类，其他反应组成保持一致。在各反应中导入突变用的引物见表13，其序列由序列表中的序列No.57-61所示。将PCR反应液置入微量离心管中，混合后，在下述条件下进行PCR反应。在97℃处理3分钟后，将95℃30秒、50℃30秒、70℃3分钟的3步反应重复25次，然后在70℃保温5分钟。取反应液的一部分进行琼脂糖电泳，确认合成了目标长度的DNA片段。用Amiconmicrocon(Amicon公司产品)除去引物，并用乙醇将DNA沉淀，在真空中干燥，然后溶解在40μl的灭菌蒸馏水中。用限制酶XhoI和BamHI酶切各含突变DNA片段的溶液20μl中的DNA片段。酶切结束后，用乙醇将DNA沉淀，在真空中干燥，溶解在20μl的灭菌蒸馏水中。将各溶液分别命名为CCDNA溶液、CDD2DNA溶液、CDD1DNA溶液、CCR4DNA溶液、CCR3DNA溶液。表13突变体名导入突变用的引物OCIF-CCCCROCIF-CDD2CDD2ROCIF-CDD1CDD1ROCIF-CCR4CCR4ROCIF-CCR3CCR3R(2)突变体表达载体的构建用限制酶BamHI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切pSK-OCIF-CL，将含OCIFcDNA的约1.5kb的DNA片段(也含目标突变)分离、纯化，溶解在灭菌蒸馏水20μl中(CLDNA溶液)。分别将实施例22-ii)记载的pCEP4DNA溶液1μl与CLDNA溶液、CCDNA溶液、CDD2DNA溶液、CDD1DNA溶液、CCR4DNA溶液和CCR3DNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA连接试剂盒Ver.2I液，进行连接反应。反应结束后，用7μl反应液转化大肠杆菌DH5α。从所得耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有下述质粒DNA的菌株共6种在所述质粒DNA的结构中，pCEP4的BamHI-XhoI部位上插入了具有目标突变的OCIFcDNA片段。将具有目标结构的质粒分别命名为pCEP4-OCIF-CL、pCEP4-OCIF-CC、pCEP4-OCIF-CDD2、pCEP4-OCIF-CDD1、pCEP4-OCIF-CCR4和pCEP4-OCIF-CCR3。iv)缺失C末端的突变体的制备(1)缺失C末端的突变的导入分别制备序列No.4所记载的氨基酸中缺失了371位Gln至380位Leu但加入了Leu-Val二残基的突变体(OCIF-CBst)、缺失了298位Cys至380位Leu但加入了Ser-Leu-Asp残基的突变体(OCIF-CSph)、缺失了167位Asn至380位Leu的突变体(OCIF-CBsp)、缺失了62位Cys至380位Leu但加入了Leu-Val二残基的突变体(OCIF-CPst)。用限制酶BstPI、SphI、PstI(宝酒造株式会社产品)和BspEI(NewEnglandBiolabs公司产品)各酶切2μg的pSK+OCIF，通过酚处理、乙醇沉淀来纯化DNA，然后将其溶解在10μl的灭菌蒸馏水中。各取2μl溶液，用DNA平整试剂盒(宝酒造株式会社产品)将各DNA末端平整(最终容量5μl)。往该反应液中加入含琥珀密码子的XbaI接头(5’-CTAGTCTAGACTAG-3’)1μg(1μl)和6μl的DNA连接试剂盒Ver.2I液，进行连接反应。用反应后的连接溶液6μl转化大肠杆菌DH5α。通过DNA结构解析，从所得耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有目标质粒DNA的菌株。DNA结构是通过用限制酶酶切所得的片段的长度的测定和碱基序列的测定来解析的。将所得目标质粒DNA分别命名为pSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp、pSK-OCIF-CPst。(2)突变体表达载体的构建用限制酶BamHI和XhoI(宝酒造株式会社产品)酶切所得到的质粒DNA(pSK-OCIF-CBst、pSK-OCIF-CSph、pSK-OCIF-CBsp、pSK-OCIF-CPst)，将含OCIFcDNA全长的约1.5kb的DNA片段(也含目标突变)分离、纯化，溶解在灭菌蒸馏水20μl中(分别命名为CBstDNA溶液、CSphDNA溶液、CBspDNA溶液、CPstDNA溶液)。分别将实施例22-ii)记载的pCEP4DNA溶液1μl与CBstDNA溶液、CSphDNA溶液、CBspDNA溶液、CPstDNA溶液各6μl混合，往各混合液中加入7μl的DNA连接试剂盒Ver.2I液，进行连接反应。反应结束后，用7μl反应液转化大肠杆菌DH5α。从所得耐氨苄青霉素转化细胞中筛选出具有下述质粒DNA的菌株共5种在所述质粒DNA的结构中，pCEP4的BamHI-XhoI部位间插入了具有目标突变的OCIFcDNA片段。将具有目标结构的质粒分别命名为pCEP4-OCIF-CBst、pCEP4-OCIF-CSph、pCEP4-OCIF-CBsp、pCEP4-OCIF-CPst。v)突变体表达载体的制备使具有突变体表达载体的大肠杆菌(共21种)增殖，用QIAGEN柱(QIAGEN公司产品)纯化各突变体表达载体。将各表达载体用乙醇沉淀后，溶解在灭菌蒸馏水中，用于下述操作。vi)突变体cDNA的瞬时表达及其活性测定使用在实施例22-v)中纯化的各种OCIF突变体表达质粒，按实施例13的方法表达OCIF突变体。下面仅将变更之处进行表述。使用24孔平板进行DNA导入。使用含10％胎牛血清的IMDM培养基，将2×105个293/EBNA细胞接种于各孔中。DNA导入时使用的突变体表达载体和lipofectAMINE试剂(脂质转染胺试剂)的量分别为1μg和4μl。用OPTI-MEM培养基(GibcoBRL公司产品)稀释，使最终容量为0.5ml。往细胞中加入突变体表达载体和lipofectAMINE试剂的混合液，在37℃的CO2培养箱中培养24小时后，除去混合液，加入0.5ml的Ex-cell301培养基(JSR公司产品)，再在37℃的CO2培养箱中培养48小时。回收培养基，将其作为突变体活性测定用的试样。将所得各突变体的碱基序列和由该序列推断出的氨基酸序列分别显示在序列表的序列No.83-103和62-82。OCIF活性测定按实施例13的方法进行。此外，用实施例24中记载的EIA法对OCIF的抗原量进行了定量。在表14中，用与未改变的OCIF比较的比活性表示。表14突变体名称活性未改变的OCIF++OCIF-C19S+OCIF-C20S±OCIF-C21S±OCIF-C22S+OCIF-C23S++OCIF-DCR1±OCIF-DCR2±OCIF-DCR3±OCIF-DCR4±OCIF-DDD1+OCIF-DDD2±OCIF-CL++OCIF-CC++OCIF-CDD2++OCIF-CDD1+OCIF-CCR4±OCIF-CCR3±OCIF-CBst++OCIF-CSph++OCIF-CBsp±OCIF-CPst±(表中，++表示比活性超过未改变的OCIF活性的50％，+表示10-50％，±表示不满10％或生物活性未能正确测定)vii)Western印迹分析将活性测定用的样品10μl供给Westem印迹分析。在10μl样品中加入SDS-PAGE用样品缓冲液(0.5MTris-HCl、20％甘油、4％SDS、20μg/ml溴酚蓝(pH6.8)10μl，于100℃煮沸3分钟，于非还原条件下进行10％SDS聚丙烯酰胺电泳。电泳结束后用半干印迹装置(BIO-RAD公司制)，在PVDF膜(ProBlott，PerkinElmer公司制)上进行蛋白质印迹。将此膜进行印迹后，与实施例24所述的EIA用辣根过氧化物酶标记的抗OCIF抗体一起于37℃保温2小时。经洗涤后，用ECL系统(Amersham公司制)检出结合于抗OCIF抗体的蛋白质。OCIF被检出约120千道尔顿(kD)和60kD的区带。对于OCIF-C23S、OCIF-CL、OCIF-CC，仅检出60kD的区带。而OCIF-CDD2和OCIF-CDD1分别检出40-50kD和30-40kD的区带为主要区带。以上结果表明，OCIF具有序列表中序列4的氨基酸序列，其中第379位Cys残基会形成二聚物，即便是单体也保持活性，及从第177位Asp至第380位Leu的残基缺失也保持活性。实施例23人OCIF基因组DNA的分离i)人基因组DNA文库的筛选从STRATAGENE公司购入用人胎盘染色体DNA和λFIXII载体制成的基因组文库，以OCIFcDNA为探针进行筛选。筛选基本上按基因组文库所附的方案进行，噬菌体、大肠杆菌、DNA的一般处理方法按“分子克隆化实验室手册”进行。检测购入的基因组DNA文库的效价后，使1×106pfu的噬菌体感染大肠杆菌XL1-BlueMRA，与每一平板9ml的顶层琼脂糖一起铺展在20块平板(9×13cm)上。将平板于37℃培养一夜后，将Hybond-N尼龙膜(Amersham公司制)放在琼脂平板上，使噬菌体转移。将转移有噬菌体的尼龙膜放在1.5MNaCl/0.5MNaOH溶液湿润的滤纸上一分钟，然后分别用1MTris-HCl(pH7.5)和1.5MNaCl/0.5MTris-HCl(pH7.5)处理1分钟并中和，最后移到以2×SSC湿润的滤纸上。然后，在此尼龙膜上用STRATA接头(STRATAGENE公司制)进行1200微焦耳的UV照射，将噬菌体DNA固定在膜上，然后，将尼龙膜浸在快速杂交缓冲液(Amersham公司制)中进行预杂交。1小时的预杂交之后，加入32P标记的OCIFcDNA，于65℃杂交一夜。此cDNA探针是将具有实施例11所得的含1.6kb的OCIFcDNA的质粒pBKOCIF用限制酶BamHI和XhoI切断、将OCIFcDNA用琼脂糖凝胶电泳分离后，将此OCIFcDNA用MegaprimeDNA标记系统(Amersham公司制)以32P进行标记而制成。按标记系统中所附的方案进行标记。在杂交中，使用每1ml杂交缓冲液约5×105cpm的探针。在杂交后，将尼龙膜在室温下用2×SSC洗涤5分钟，然后于65℃以0.5×SSC/0.1％SDS洗4次，每次20分钟。第4次洗涤后，将尼龙膜干燥，用富士胶片社制的X线片、超级HR-H和增感屏幕，于-80℃进行放射自显影。在放射自显影图上检出6个信号，从与各个信号对应的琼脂板上的位置切取顶层琼脂糖，在加入了1％氯仿的0.5mlSM缓冲液中分别浸渍、放置一夜，提取噬菌体。将各噬菌体提取液用SM缓冲液稀释1000倍，从其中取出1μl和20μl，再感染上述大肠杆菌，与顶层琼脂糖一起按上述方法铺展在琼脂平板上。使噬菌体转移至尼龙膜上之后，用上述方法进行预杂交、杂交、洗涤、干燥、放射自显影。对当初放射自显影检出的6个信号全部进行该噬菌体的纯化操作，将琼脂板上的全部噬菌斑与cDNA探针反复进行杂交。切下纯化的噬菌斑，浸入含1％氯仿的SM缓冲液0.5ml，保存于4℃。将这样得到的6种纯化噬菌体分别取名为λOIF3、λOIF8、λOIF9、λOIF11、λOIF12和λOIF17。ii)用限制酶消化和Southern印迹杂交进行人OCIF基因组DNA克隆的分析按分子克隆化实验室手册(MolecularCloningALaboratoryManual)中所写的方法，用平板裂解法将经纯化的6种噬菌体的DNA进行精制。将这些DNA用限制酶消化，所得的片段用琼脂糖电泳进行分离。再将在琼脂糖凝胶上分离出的片段用常规方法转移到尼龙膜上，然后以OCIFcDNA为探针，进行Southern印迹杂交。这些结果表明经纯化的6种噬菌体是各不相同的克隆。在用限制酶消化得出的DNA片段中，对与OCIFcDNA杂交的片段在质粒载体上亚克隆以后按如下方法进行碱基序列的分析。iii)从基因组DNA克隆经限制酶消化所得的DNA片段在质粒载体上的亚克隆化和碱基序列的确定将λOIF8DNA用限制酶EcoRI及NotI消化，生成的片段用0.7％琼脂糖凝胶进行分离。用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)按所附的指南从凝胶中提取5.8kb的EcoRI/NotI片段。用预先经EcoRI和NotI酶切的pBluescriptIISK+载体(STRATAGENE公司制)和Ready-To-GoT4连接酶(Pharmacia公司制)按所附的指南将此片段进行连接。将所得的重组质粒引入感受态DH5α大肠杆菌(Pharmacia公司制)后，铺展在含有50μg/ml氨苄西林的琼脂板上，选择有质粒的大肠杆菌。将如上制成的含有5.8kbEcoRI/NotI片段的重组质粒命名为pBSG8-5.8。然后，将pBSG8-5.8用限制酶HindIII消化，将生成的0.9kb的DNA片段用琼脂糖凝胶分离，按上述方法提取后，插入用HindIII预先酶切的pBluescriptIISK-(STRATAGENE公司制)中，按上述方法进行克隆化。将这种具有0.9kb的HindIII片段的重组质粒命名为pBS8H0.9。另外，将λOIF11的DNA用EcoRI消化后生成的6kb、3.6kb和2.6kb的片段分别分离出来，然后按上述同样的方法插入pBluescriptIISK+载体中，按上述方法进行克隆化。将这样制成的含6kb、3.6kb和2.6kb的EcoRI片段的重组质粒分别命名为pBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6。再将用限制酶HindIII消化pBSG11-6所生成的2.2kb、1.1kb和1.05kb三种片段经琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别插入pBluescriptIISK-的HindIII部位，进行克隆化。这些具有2.2kb、1.1kb和1.05kb的HindIII片段的重组质粒分别命名为pBS6H2.2、pBS6H1.1和pBS6H1.05。在基因组DNA的碱基序列分析时，使用ABI双脱氧链终止循环测序快速反应试剂盒(ABIDyedeoxyTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit，PERKINELMER公司制)和373DNA测序系统(AppliedBiosystems公司制)。按分子克隆化实验室手册上所写的方法制备pBSG8-5.8、pBS8H0.9、pBSG11-6、pBSG11-3.6、pBSG11-2.6、pBS6H2.2、pBS6H1.1、pBS6H1.05，用作碱基序列测定用的模板。人OCIF基因组DNA的碱基序列见序列表序列104和105。介于外显子1和外显子2之间的碱基序列未必全部确定，而确定有约17kb核苷酸介于序列表中序列104和序列105所示的碱基序列之间。实施例24用EIA法进行OCIF的定量i)家兔抗OCIF抗体的制备将rOCIF200μg/ml与福氏完全佐剂(DIFCO公司制)等量混合制成乳剂，给雄性日本白色家兔(体重2.5-3.0kg，购自北山LABES会社)3只皮下免疫，每次各1ml。以1周为间隔共进行6次免疫，在末次免疫后第10天采全血。按如下方法从分离出的血清中精制抗体。即在以PBS二倍稀释的抗血清中加入硫酸铵使终浓度为40w/v％，于4℃放置1小时后，以8000×g离心分离20分钟，得到沉淀。将沉淀溶于少量PBS中，对PBS于4℃进行透析后，上蛋白G-琼脂糖柱(Pharmacia公司制)。用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱免疫球蛋白G，立即用1.5MTris盐酸缓冲液(pH8.7)调节成中性pH。将洗脱的蛋白质部分对PBS透析后，测定280nm处的吸光度以确定其浓度(E1％13.5)。用马来酰亚胺活化的过氧化物酶试剂盒(Pierce公司制)制成以辣根过氧化物酶标记的抗OCIF抗体。即在1ml精制抗体中加入80μgN-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯，于室温下反应30分钟。加入5mg羟胺进行脱乙酰基后，将经修饰的抗体用聚丙烯酰胺脱盐柱进行分离。将蛋白质部分与1mg马来酰亚胺活化的过氧化物酶混合，室温下反应1小时，得到酶标记抗体。ii)用夹层EIA法进行OCIF定量在96孔微量滴定板(MaxiSorpImmunoplate，Nunc公司制)的各孔中加入100μl家兔抗OCIF抗体(2μg/ml，50mM碳酸缓冲液(pH9.6))，于4℃放置一夜，使抗体固相化。在每一孔中加入用PBS配制的25％BlockAce(雪印乳业株式会社制)各300μl，于37℃放置1小时进行封闭后，加入试样(100μl/孔)，于室温下反应2小时。用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤3次后，加入10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记抗OCIF抗体各100μl，室温下保温2小时。用PBST洗涤3次后，加入100μl酶底物溶液(TMB，ScyTek公司制)，使其在室温下发色后停止反应。用微板读数仪(ImmunoReader，NuncNJ2000，日本ィンタ-メッド株式会社制)测定450nm处的吸光度，从以精制的重组OCIF为标准品得出的标准曲线对试样的OCIF浓度进行定量。OCIF的标准曲线见图13。实施例25抗OCIF单克隆抗体i)产生人OCIF抗体的杂交瘤的制备培养人成纤维细胞IMR-90，按实施例11所述方法从培养液中提纯OCIF。提纯的OCIF用PBS溶解成10μg/100μl的浓度，将此溶液每隔2周给BALB/c小鼠腹腔注射进行免疫共3次。第一次和第二次免疫给予等量福氏完全佐剂混合物。在最后一次免疫的第3天摘出脾脏，分离B淋巴细胞，按通常所用的聚乙二醇方法与小鼠骨髓瘤细胞P3×63-AG8.653进行细胞融合。然后为选择融合细胞而在HAT培养基上进行培养，选择杂交瘤细胞。为了确定所选择的细胞是否产生OCIF特异性抗体，将溶解于0.1M碳酸氢钠溶液的OCIF溶液(10μg/ml)100μl加到96孔微量滴定板(Nunc公司制)上用制成的固相ELISA进行杂交瘤培养液中的OCIF特异性抗体的测定。发现有抗体产生的杂交瘤用有限稀释法重复进行3-5次克隆化，每次用ELISA法检测抗体的产生量。从所得的抗体产生株中选择抗体产生量高的克隆。ii)单克隆抗体的产生将实施例25-i)中所得的抗体产生株按1×106个细胞/鼠分别移植到预先接种了Pristane(Aldrich公司制)的BALB/c系小鼠的腹腔中。移植2周后，采集蓄积的腹水，得到含本发明单克隆抗体的腹水。通过使用AffigelA蛋白琼脂糖凝胶(BioRad公司制)的亲和层析法从该腹水中得到精制抗体。即将腹水用等量结合缓冲液(BioRad公司制)稀释，上A蛋白柱后，用同一缓冲液充分洗涤。用洗脱缓冲液(BioRad公司制)进行IgG洗脱。所得的洗脱液对水透析后进行冷冻干燥。所得的精制抗体用SDS-PAGE进行纯度测定，确认为在分子量约150,000的位置上的均一区带。iii)对OCIF具有高亲和性的单克隆抗体的选择将实施例25-ii)中所得的抗体溶于PBS，用Lowry法进行蛋白定量。然后将各抗体按同一蛋白浓度溶于PBS，将此溶液用连续稀释法进行稀释，用实施例25-ii)所述固相ELISA选择与OCIF反应的单克隆抗体，直至高稀释阶段。其结果，得到A1G5、E3H8和D2F4三种抗体。iv)抗体亚类的鉴定用免疫球蛋白类型及亚类分析试剂盒(Amersham公司制)鉴定实施例25-iii)中所选择的本发明抗体的类型和亚类。鉴定按试剂盒中所指示的方案进行。结果见表15。E3H8、A1G5和D2F4分别为IgG1、IgG2a和IgG2b。表15抗体名称IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgAIgMKA1G5-+----+E3H8+-----+D2F4--+---+</table></tables>V)OCIF的ELISA测定法将实施例25-iv)中所得的A1G5、E3H8和D2F4三种单克隆抗体分别用作固相抗体和标记抗体。通过各种组合构建成夹层ELISA。用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒(Pierce公司制)进行抗体的标记。将各抗体用0.1M碳酸氢钠溶解成浓度为10μg/ml，分别注入96孔免疫板(Nunc公司制)，每孔100μl，室温放置一夜。然后，各板用1/2浓度的Blockace(雪印乳业株式会社制)进行封闭，用含0.1％吐温20的PBS(洗涤缓冲液)洗涤3次。将各浓度的OCIF用第一次反应缓冲液(含1/2.5浓度的Blockace和0.1％吐温20的0.2MTris-盐酸缓冲液，pH7.4)配制各浓度的OCIF。将所配制的各浓度的OCIF溶液100μl分别加入各孔中，37℃放置3小时，再用洗涤缓冲液洗涤3次。标记抗体的稀释使用第二次反应缓冲液(含1/4浓度的Blockace和0.1％吐温20的0.1MTris-盐酸缓冲液，pH7.4)。用第二次反应缓冲液将各标记抗体稀释400倍，在各孔中分别加入100μl。将各板于37℃放置2小时，接着洗涤3次，然后在各孔中加入100μl底物溶液(含0.4mg/ml盐酸邻苯二胺、0.006％过氧化氢的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，pH4.5)。于37℃暗室中放置15分钟后，在各孔中加入6N硫酸50μl停止酶反应，用免疫读数仪(NJ2000，日本ィンタ-メッド社制)测定492nm的吸光度。将三种抗体分别作固相抗体或标记抗体进行组合，任何一种组合均得到良好的测定结果，并确认三种抗体分别识别OCIF的不同表位。以A1G5为固相抗体，E3H8为标记抗体，典型的标准曲线见图14。vi)人血清中OCIF的测定用实施例25-(v)图14的ELISA系统测定5名健康常人血清中的OCIF。即与实施例25-(v)同样地将A1G5在免疫板上固相化，在各孔中加入第一次反应缓冲液50μl，接着加入各人血清50μl，于37℃放置3小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后，在各孔中加入以第二次反应缓冲液稀释400倍的E3H8标记抗体100μl，于37℃放置2小时。用洗涤缓冲液将板洗涤3次后，在各孔中加入上述底物溶液100μl，于37℃反应15分钟。在各孔中分别加入6N硫酸50μl使酶反应停止，用免疫读数仪测定492nm的吸光度。对含已知量的OCIF的第一次反应缓冲液也进行同样的操作，作成如图14所示的OCIF标准曲线，从血清试样的吸光度求出血清中的OCIF量。结果见表16。表16血清试样OCIF量(ng/ml)15.022.031.043.051.5实施例26对骨质疏松症的治疗效果确定了OCIF对神经切除引起的不动性骨萎缩模型的治疗效果。采用Fischer系雄性大鼠，在6周龄(体重约120g)时，切除左上肢神经丛，引起左上肢不能运动，制成骨萎缩模型。OCIF以含0.01％吐温80的PBS(-)配制，从次日起以5μg/kg和50μg/kg的用量按12小时间隔、一天两次，连日静脉注射2周。正常组施行假手术，对照组同样地投与含0.01％吐温80的PBS(-)。给药结束后，摘出左上肢测定骨强度。结果见图15。结果，观察到对照组比正常组骨强度降低，而OCIF50μg/kg给药组可见情况改善。产业上利用的可能性本发明提供具有破骨细胞形成抑制活性的新型蛋白质及其高效制备方法。本发明的蛋白质具有破骨细胞形成抑制活性，作为骨质疏松症等各种骨量减少性疾病的治疗剂或免疫学诊断用的抗原等可加以利用。关于保藏的微生物的说明保藏机构的名称和地址名称日本通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所地址日本茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)保藏日1995年6月21日(原保藏日)(从1995年6月21日保藏的微工研菌寄第P-14998号移存，移存日1995年10月25日)保藏号FERMBP-5267序列表(2)序列号1(i)序列特性(A)长度6(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类肽(蛋白质的内部氨基酸序列)(xi)序列1XaaTyrHisPheProLys15(2)序列号2(i)序列特性(A)长度14(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类肽(蛋白质的内部氨基酸序列)(xi)序列2XaaGlnHisSerXaaGlnGluGlnThrPheGlnLeuXaaLys1510(2)序列号3(i)序列特性(A)长度12(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类肽(蛋白质的内部氨基酸序列)(xi)序列3XaaIleArgPheLeuHisSerPheThrMetTyrLys1510(2)序列号4(i)序列特性(A)长度380(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类蛋白质(OCIF无信号)(xi)序列4GluThrPheProProLysTyrLeuHisTyrAspGluGluThrSer151015HisGlnLeuLeuCysAspLysCysProProGlyThrTyrLeuLys202530GlnHisCysThrAlaLysTrpLysThrValCysAlaProCysPro354045AspHisTyrTyrThrAspSerTrpHisThrSerAspGluCysLeu505560TyrCysSerProValCysLysGluLeuGlnTyrValLysGlnGlu657075CysAsnArgThrHisAsnArgValCysGluCysLysGluGlyArg808590TyrLeuGluIleGluPheCysLeuLysHisArgSerCysProPro95100105GlyPheGlyValValGlnAlaGlyThrProGluArgAsnThrVal110115120CysLysArgCysProAspGlyPhePheSerAsnGluThrSerSer125130135LysAlaProCysArgLysHisThrAsnCysSerValPheGlyLeu140145150LeuLeuThrGlnLysGlyAsnAlaThrHisAspAsnIleCysSer155160165GlyAsnSerGluSerThrGlnLysCysGlyIleAspValThrLeu170175180CysGluGluAlaPhePheArgPheAlaValProThrLysPheThr185190195ProAsnTrpLeuSerValLeuValAspAsnLeuProGlyThrLys200205210ValAsnAlaGluSerValGluArgIleLysArgGlnHisSerSer215220225GlnGluGlnThrPheGlnLeuLeuLysLeuTrpLysHisGlnAsn230235240LysAspGlnAspIleValLysLysIleIleGlnAspIleAspLeu245250255CysGluAsnSerValGlnArgHisIleGlyHisAlaAsnLeuThr260265270PheGluGlnLeuArgSerLeuMetGluSerLeuProGlyLysLys275280285ValGlyAlaGluAspIleGluLysThrIleLysAlaCysLysPro290295300SerAspGlnIleLeuLysLeuLeuSerLeuTrpArgIleLysAsn305310315GlyAspGlnAspThrLeuLysGlyLeuMetHisAlaLeuLysHis320325330SerLysThrTyrHisPheProLysThrValThrGlnSerLeuLys335340345LysThrIleArgPheLeuHisSerPheThrMetTyrLysLeuTyr350355360GlnLysLeuPheLeuGluMetIleGlyAsnGlnValGlnSerVal365370375LysIleSerCysLeu380(2)序列号5(i)序列特性(A)长度401(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类蛋白质(OCIF；含信号)(xi)序列5MetAsnAsnLeuLeuCysCysAlaLeuValPheLeuAspIleSer-20-15-10IleLysTrpThrThrGlnGluThrPheProProLysTyrLeuHis-5-115TyrAspGluGluThrSerHisGlnLeuLeuCysAspLysCysPro101520ProGlyThrTyrLeuLysGlnHisCysThrAlaLysTrpLysThr253035ValCysAlaProCysProAspHisTyrTyrThrAspSerTrpHis404550ThrSerAspGluCysLeuTyrCysSerProValCysLysGluLeu556065GlnTyrValLysGlnGluCysAsnArgThrHisAsnArgValCys707580GluCysLysGluGlyArgTyrLeuGluIleGluPheCysLeuLys859095HisArgSerCysProProGlyPheGlyValValGlnAlaGlyThr100105110ProGluArgAsnThrValCysLysArgCysProAspGlyPhePhe115120125SerAsnGluThrSerSerLysAlaProCysArgLysHisThrAsn130135140CysSerValPheGlyLeuLeuLeuThrGlnLysGlyAsnAlaThr145150155HisAspAsnIleCysSerGlyAsnSerGluSerThrGlnLysCys160165170GlyIleAspValThrLeuCysGluGluAlaPhePheArgPheAla175180185ValProThrLysPheThrProAsnTrpLeuSerValLeuValAsp190195200AsnLeuProGlyThrLysValAsnAlaGluSerValGluArgIle205210215LysArgGlnHisSerSerGlnGluGlnThrPheGlnLeuLeuLys220225230LeuTrpLysHisGlnAsnLysAspGlnAspIleValLysLysIle235240245IleGlnAspIleAspLeuCysGluAsnSerValGlnArgHisIle250255260GlyHisAlaAsnLeuThrPheGluGlnLeuArgSerLeuMetGlu265270275SerLeuProGlyLysLysValGlyAlaGluAspIleGluLysThr280285290IleLysAlaCysLysProSerAspGlnIleLeuLysLeuLeuSer295300305LeuTrpArgIleLysAsnGlyAspGlnAspThrLeuLysGlyLeu310315320MetHisAlaLeuLysHisSerLysThrTyrHisPheProLysThr325330335ValThrGlnSerLeuLysLysThrIleArgPheLeuHisSerPhe340345350ThrMetTyrLysLeuTyrGlnLysLeuPheLeuGluMetIleGly355360365AsnGlnValGlnSerValLysIleSerCysLeu370375380(2)序列号6(i)序列特性(A)长度1206(B)类型核酸(C)链的数目1(D)拓扑学直链状(ii)序列种类cDNA(OCIF)(xi)序列6ATGAACAACTTGCTGTGCTGCGCGCTCGTGTTTCTGGACATCTCCATTAAGTGGACCACC60CAGGAAACGTTTCCTCCAAAGTACCTTCATTATGACGAAGAAACCTCTCATCAGCTGTTG120TGTGACAAATGTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAACACTGTACAGCAAAGTGGAAGACC180GTGTGCGCCCCTTGCCCTGACCACTACTACACAGACAGCTGGCACACCAGTGACGAGTGT240CTATACTGCAGCCCCGTGTGCAAGGAGCTGCAGTACGTCAAGCAGGAGTGCAATCGCACC300CACAACCGCGTGTGCGAATGCAAGGAAGGGCGCTACCTTGAGATAGAGTTCTGCTTGAAA360CATAGGAGCTGCCCTCCTGGATTTGGAGTGGTGCAAGCTGGAACCCCAGAGCGAAATACA420GTTTGCAAAAGATGTCCAGATGGGTTCTTCTCAAATGAGACGTCATCTAAAGCACCCTGT480AGAAAACACACAAATTGCAGTGTCTTTGGTCTCCTGCTAACTCAGAAAGGAAATGCAACA540CACGACAACATATGTTCCGGAAACAGTGAATCAACTCAAAAATGTGGAATAGATGTTACC600CTGTGTGAGGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTGTTCCTACAAAGTTTACGCCTAACTGGCTT660AGTGTCTTGGTAGACAATTTGCCTGGCACCAAAGTAAACGCAGAGAGTGTAGAGAGGATA720AAACGGCAACACAGCTCACAAGAACAGACTTTCCAGCTGCTGAAGTTATGGAAACATCAA780AACAAAGACCAAGATATAGTCAAGAAGATCATCCAAGATATTGACCTCTGTGAAAACAGC840GTGCAGCGGCACATTGGACATGCTAACCTCACCTTCGAGCAGCTTCGTAGCTTGATGGAA900AGCTTACCGGGAAAGAAAGTGGGAGCAGAAGACATTGAAAAAACAATAAAGGCATGCAAA960CCCAGTGACCAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTGTGGCGAATAAAAAATGGCGACCAAGAC1020ACCTTGAAGGGCCTAATGCACGCACTAAAGCACTCAAAGACGTACCACTTTCCCAAAACT1080GTCACTCAGAGTCTAAAGAAGACCATCAGGTTCCTTCACAGCTTCACAATGTACAAATTG1140TATCAGAAGTTATTTTTAGAAATGATAGGTAACCAGGTCCAATCAGTAAAAATAAGCTGC1200TTATAA1206(2)序列号7(i)序列特性(A)长度15(B)类型氨基酸(D)拓扑学直链状(ii)序列种类肽(蛋白质的N末端氨基酸)(xi)序列7GluThrPheProProLysTyrLeuHisTyrAspGluGluThrSer151015(2)序列号8(i)序列特性(A)长度1185(B)类型核酸(C)链的数目1(D)拓扑学直链状(ii)序列种类cDNA(OCIF2)(xi)序列8ATGAACAACTTGCTGTGCTGCGCGCTCGTGTTTCTGGACATCTCCATTAAGTGGACCACC60CAGGAAACGTTTCCTCCAAAGTACCTTCATTATGACGAAGAAACCTCTCATCAGCTGTTG120TGTGACAAATGTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAACACTGTACAGCAAAGTGGAAGACC180GTGTGCGCCCCTTGCCCTGACCACTACTACACAGACAGCTGGCACACCAGTG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CCCTTTGTCATTTTTGCAG3389GTCAATGAATCATGTAGAAAGAGACAGGAGATGAAACTAGAACCAGTCCATTTTGCCCCT3449TTTTTTATTTTCTGGTTTTGGTAAAAGATACAATGAGGTAGGAGGTTGAGATTTATAAAT3509GAAGTTTAATAAGTTTCTGTAGCTTTGATTTTTCTCTTTCATATTTGTTATCTTGCATAA3569GCCAGAATTGGCCTGTAAAATCTACATATGGATATTGAAGTCTAAATCTGTTCAACTAGC3629TTACACTAGATGGAGATATTTTCATATTCAGATACACTGGAATGTATGATCTAGCCATGC3689GTAATATAGTCAAGTGTTTGAAGGTATTTATTTTTAATAGCGTCTTTAGTTGTGGACTGG3749TTCAAGTTTTTCTGCCAATGATTTCTTCAAATTTATCAAATATTTTTCCATCATGAAGTA3809AAATGCCCTTGCAGTCACCCTTCCTGAAGTTTGAACGACTCTGCTGTTTTAAACAGTTTA3869AGCAAATGGTATATCATCTTCCGTTTACTATGTAGCTTAACTGCAGGCTTACGCTTTTGA3929GTCAGCGGCCAACTTTATTGCCACCTTCAAAAGTTTATTATAATGTTGTAAATTTTTACT3989TCTCAAGGTTAGCATACTTAGGAGTTGCTTCACAATTAGGATTCAGGAAAGAAAGAACTT4049CAGTAGGAACTGATTGGAATTTAATGATGCAGCATTCAATGGGTACTAATTTCAAAGAAT4109GATATTACAGCAGACACACAGCAGTTATCTTGATTTTCTAGGAATAATTGTATGAAGAAT4169ATGGCTGACAACACGGCCTTACTGCCACTCAGCGGAGGCTGGACTAATGAACACCCTACC4229CTTCTTTCCTTTCCTCTCACATTTCATGAGCGTTTTGTAGGTAACGAGAAAATTGACTTG4289CATTTGCATTACAAGGAGGAGAAACTGGCAAAGGGGATGATGGTGGAAGTTTTGTTCTGT4349CTAATGAAGTGAAAAATGAAAATGCTAGAGTTTTGTGCAACATAATAGTAGCAGTAAAAA4409CCAAGTGAAAAGTCTTTCCAAAACTGTGTTAAGAGGGCATCTGCTGGGAAACGATTTGAG4469GAGAAGGTACTAAATTGCTTGGTATTTTCCGTAGGAACCCCAGAGCGAAATACA4523GlyThrProGluArgAsnThr115GTTTGCAAAAGATGTCCAGATGGGTTCTTCTCAAATGAGACGTCATCT4571ValCysLysArgCysProAspGlyPhePheSerAsnGluThrSerSer120125130135AAAGCACCCTGTAGAAAACACACAAATTGCAGTGTCTTTGGTCTCCTG4619LysAlaProCysArgLysHisThrAshCysSerValPheGlyLeuLeu140145150CTAACTCAGAAAGGAAATGCAACACACGACAACATATGTTCCGGAAAC4667LeuThrGlnLysGlyAsnAlaThrHisAspAshIleCysSerGlyAsn155160165AGTGAATCAACTCAAAAATGTGGAATAGGTAATTACATTCCAAAATAC4715SerGluSerThrGlnLysCysGlyIle170175GTCTTTGTACGATTTTGTAGTATCATCTCTCTCTCTGAGTTGAACACAAGGCCTCCAGCC4775ACATTCTTGGTCAAACTTACATTTTCCCTTTCTTGAATCTTAACCAGCTAAGGCTACTCT4835CGATGCATTACTGCTAAAGCTACCACTCAGAATCTCTCAAAAACTCATCTTCTCACAGAT4895AACACCTCAAAGCTTGATTTTCTCTCCTTTCACACTGAAATCAAATCTTGCCCATAGGCA4955AAGGGCAGTGTCAAGTTTGCCACTGAGATGAAATTAGGAGAGTCCAAACTGTAGAATTCA5015CGTTGTGTGTTATTACTTTCACGAATGTCTGTATTATTAACTAAAGTATATATTGGCAAC5075TAAGAAGCAAAGTGATATAAACATGATGACAAATTAGGCCAGGCATGGTGGCTTACTCCT5135ATAATCCCAACATTTTGGGGGGCCAAGGTAGGCAGATCACTTGAGGTCAGGATTTCAAGA5195CCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCTTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCA5255TGGTAGCAGGCACTTCTAGTACCAGCTACTCAGGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACC5315CAGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGTACCACTGCACTCCAGTCTGGGCAACAG5375AGCAAGATTTCATCACACACACACACACACACACACACACACACATTAGAAATGTGTACT5435TGGCTTTGTTACCTATGGTATTAGTGCATCTATTGCATGGAACTTCCAAGCTACTCTGGT5495TGTGTTAAGCTCTTCATTGGGTACAGGTCACTAGTATTAAGTTCAGGTTATTCGGATGCA5555TTCCACGGTAGTGATGACAATTCATCAGGCTAGTGTGTGTGTTCACCTTGTCACTCCCAC5615CACTAGACTAATCTCAGACCTTCACTCAAAGACACATTACACTAAAGATGATTTGCTTTT5675TTGTGTTTAATCAAGCAATGGTATAAACCAGCTTGACTCTCCCCAAACAGTTTTTCGTAC5735TACAAAGAAGTTTATGAAGCAGAGAAATGTGAATTGATATATATATGAGATTCTAACCCA5795GTTCCAGCATTGTTTCATTGTGTAATTGAAATCATAGACAAGCCATTTTAGCCTTTGCTT5855TCTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGAAGGAAGGGGTATTAAAAGGAGTGATCAAAT5915TTTAACATTCTCTTTAATTAATTCATTTTTAATTTTACTTTTTTTCATTTATTGTGCACT5975TACTATGTGGTACTGTGCTATAGAGGCTTTAACATTTATAAAAACACTGTGAAAGTTGCT6035TCAGATGAATATAGGTAGTAGAACGGCAGAACTAGTATTCAAAGCCAGGTCTGATGAATC6095CAAAAACAAACACCCATTACTCCCATTTTCTGGGACATACTTACTCTACCCAGATGCTCT6155GGGCTTTGTAATGCCTATGTAAATAACATAGTTTTATGTTTGGTTATTTTCCTATGTAAT6215GTCTACTTATATATCTGTATCTATCTCTTGCTTTGTTTCCAAAGGTAAACTATGTGTCTA6275AATGTGGGCAAAAAATAACACACTATTCCAAATTACTGTTCAAATTCCTTTAAGTCAGTG6335ATAATTATTTGTTTTGACATTAATCATGAAGTTCCCTGTGGGTACTAGGTAAACCTTTAA6395TAGAATGTTAATGTTTGTATTCATTATAAGAATTTTTGGCTGTTACTTATTTACAACAAT6455ATTTCACTCTAATTAGACATTTACTAAACTTTCTCTTGAAAACAATGCCCAAAAAAGAAC6515ATTAGAAGACACGTAAGCTCAGTTGGTCTCTGCCACTAAGACCAGCCAACAGAAGCTTGA6575TTTTATTCAAACTTTGCATTTTAGCATATTTTATCTTGGAAAATTCAATTGTGTTGGTTT6635TTTGTTTTTGTTTGTATTGAATAGACTCTCAGAAATCCAATTGTTGAGTAAATCTTCTGG6695GTTTTCTAACCTTTCTTTAGATGTTACCCTGTGTGAGGAGGCATTCTTCAGG6747AspValThrLeuCysGluGluAlaPhePheArg180185TTTGCTGTTCCTACAAAGTTTACGCCTAACTGGCTTAGTGTCTTGGTA6795PheAlaValProThrLysPheThrProAsnTrpLeuSerValLeuVal190195200GACAATTTGCCTGGCACCAAAGTAAACGCAGAGAGTGTAGAGAGGATA6843AspAsnLeuProGlyThrLysValAshAlaGluSerValGluArgIle205210215AAACGGCAACACAGCTCACAAGAACAGACTTTCCAGCTGCTGAAGTTA6891LysArgGlnHisSerSerGlnGluGlnThrPheGlnLeuLeuLysLeu220225230235TGGAAACATCAAAACAAAGACCAAGATATAGTCAAGAAGATCATCCAAG6940TrpLysHisGlnAsnLysAspGlnAspIleValLysLysIleIleGln240245250GTAATTACATTCCAAAATACGTCTTTGTACGATTTTGTAGTATCATCTCTCTCTCTGAGT7000TGAACACAAGGCCTCCAGCCACATTCTTGGTCAAACTTACATTTTCCCTTTCTTGAATCT7060TAACCAGCTAAGGCTACTCTCGATGCATTACTGCTAAAGCTACCACTCAGAATCTCTCAA7120AAACTCATCTTCTCACAGATAACACCTCAAAGCTTGATTTTCTCTCCTTTCACACTGAAA7180TCAAATCTTGCCCATAGGCAAAGGGCAGTGTCAAGTTTGCCACTGAGATGAAATTAGGAG7240AGTCCAAACTGTAGAATTCACGTTGTGTGTTATTACTTTCACGAATGTCTGTATTATTAA7300CTAAAGTATATATTGGCAACTAAGAAGCAAAGTGATATAAACATGATGACAAATTAGGCC7360AGGCATGGTGGCTTACTCCTATAATCCCAACATTTTGGGGGGCCAAGGTAGGCAGATCAC7420TTGAGGTCAGGATTTCAAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCTTGTCTCTACTAAAA7480ATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTAGCAGGCACTTCTAGTACCAGCTACTCAGGGCTGAG7540GCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGTACCACTG7600CACTCCAGTCTGGGCAACAGAGCAAGATTTCATCACACACACACACACACACACACACAC7660ACACATTAGAAATGTGTACTTGGCTTTGTTACCTATGGTATTAGTGCATCTATTGCATGG7720AACTTCCAAGCTACTCTGGTTGTGTTAAGCTCTTCATTGGGTACAGGTCACTAGTATTAA7780GTTCAGGTTATTCGGATGCATTCCACGGTAGTGATGACAATTCATCAGGCTAGTGTGTGT7840GTTCACCTTGTCACTCCCACCACTAGACTAATCTCAGACCTTCACTCAAAGACACATTAC7900ACTAAAGATGATTTGCTTTTTTGTGTTTAATCAAGCAATGGTATAAACCAGCTTGACTCT7960CCCCAAACAGTTTTTCGTACTACAAAGAAGTTTATGAAGCAGAGAAATGTGAATTGATAT8020ATATATGAGATTCTAACCCAGTTCCAGCATTGTTTCATTGTGTAATTGAAATCATAGACA8080AGCCATTTTAGCCTTTGCTTTCTTATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGAAGGAAGGGGT8140ATTAAAAGGAGTGATCAAATTTTAACATTCTCTTTAATTAATTCATTTTTAATTTTACTT8200TTTTTCATTTATTGTGCACTTACTATGTGGTACTGTGCTATAGAGGCTTTAACATTTATA8260AAAACACTGTGAAAGTTGCTTCAGATGAATATAGGTAGTAGAACGGCAGAACTAGTATTC8320AAAGCCAGGTCTGATGAATCCAAAAACAAACACCCATTACTCCCATTTTCTGGGACATAC8380TTACTCTACCCAGATGCTCTGGGCTTTGTAATGCCTATGTAAATAACATAGTTTTATGTT8440TGGTTATTTTCCTATGTAATGTCTACTTATATATCTGTATCTATCTCTTGCTTTGTTTCC8500AAAGGTAAACTATGTGTCTAAATGTGGGCAAAAAATAACACACTATTCCAAATTACTGTT8560CAAATTCCTTTAAGTCAGTGATAATTATTTGTTTTGACATTAATCATGAAGTTCCCTGTG8620GGTACTAGGTAAACCTTTAATAGAATGTTAATGTTTGTATTCATTATAAGAATTTTTGGC8680TGTTACTTATTTACAACAATATTTCACTCTAATTAGACATTTACTAAACTTTCTCTTGAA8740AACAATGCCCAAAAAAGAACATTAGAAGACACGTAAGCTCAGTTGGTCTCTGCCACTAAG8800ACCAGCCAACAGAAGCTTGATTTTATTCAAACTTTGCATTTTAGCATATTTTATCTTGGA8860AAATTCAATTGTGTTGGTTTTTTGTTTTTGTTTGTATTGAATAGACTCTCAGAAATCCAA8920TTGTTGAGTAAATCTTCTGGGTTTTCTAACCTTTCTTTAGATATTGACCTCTGT8974AspIleAspLeuCys255GAAAACAGCGTGCAGCGGCACATTGGACATGCTAACCTCACCTTCGAG9022GluAsnSerValGlnArgHisIleGlyHisAlaAsnLeuThrPheGlu260265270CAGCTTCGTAGCTTGATGGAAAGCTTACCGGGAAAGAAAGTGGGAGCA9070GlnLeuArgSerLeuMetGluSerLeuProGlyLysLysValGlyAla275280285GAAGACATTGAAAAAACAATAAAGGCATGCAAACCCAGTGACCAGATC9118GluAspIleGluLysThrIleLysAlaCysLysProSerAspGlnIle290295300CTGAAGCTGCTCAGTTTGTGGCGAATAAAAAATGGCGACCAAGACACC9166LeuLysLeuLeuSerLeuTrpArgIleLysAsnGlyAspGlnAspThr305310315320TTGAAGGGCCTAATGCACGCACTAAAGCACTCAAAGACGTACCACTTT9214LeuLysGlyLeuMetHisAlaLeuLysHisSerLysThrTyrHisPhe325330335CCCAAAACTGTCACTCAGAGTCTAAAGAAGACCATCAGGTTCCTTCAC9262ProLysThrValThrGlnSerLeuLysLysThrIleArgPheLeuHis340345350AGCTTCACAATGTACAAATTGTATCAGAAGTTATTTTTAGAAATGATA9310SerPheThrMetTyrLysLeuTyrGlnLysLeuPheLeuGluMetIle355360365GGTAACCAGGTCCAATCAGTAAAAATAAGCTGCTTATAACTGGAAA9356GlyAsnGlnValGlnSerValLysIleSerCysLeu370375380TGGCCATTGAGCTGTTTCCTCACAATTGGCGAGATCCCATGGATGAGTAAACTGTTTCTC9416AGGCACTTGAGGCTTTCAGTGATATCTTTCTCATTACCAGTGACTAATTTTGCCACAGGG9476TACTAAAAGAAACTATGATGTGGAGAAAGGACTAACATCTCCTCCAATAAACCCCAAATG9536GTTAATCCAACTGTCAGATCTGGATCGTTATCTACTGACTATATTTTCCCTTATTACTGC9596TTGCAGTAATTCAACTGGAAATTAAAAAAAAAAAACTAGACTCCACTGGGCCTTACTAAA9656TATGGGAATGTCTAACTTAAATAGCTTTGGGATTCCAGCTATGCTAGAGGCTTTTATTAG9716AAAGCCATATTTTTTTCTGTAAAAGTTACTAATATATCTGTAACACTATTACAGTATTGC9776TATTTATATTCATTCAGATATAAGATTTGGACATATTATCATCCTATAAAGAAACGGTAT9836GACTTAATTTTAGAAAGAAAATTATATTCTGTTTATTATGACAAATGAAAGAGAAAATAT9896ATATTTTTAATGGAAAGTTTGTAGCATTTTTCTAATAGGTACTGCCATATTTTTCTGTGT9956GGAGTATTTTTATAATTTTATCTGTATAAGCTGTAATATCATTTTATAGAAAATGCATTA10016TTTAGTCAATTGTTTAATGTTGGAAAACATATGAAATATAAATTATCTGAATATTAGATG10076CTCTGAGAAATTGAATGTACCTTATTTAAAAGATTTTATGGTTTTATAACTATATAAATG10136ACATTATTAAAGTTTTCAAATTATTTTTTATTGCTTTCTCTGTTGCTTTTATTT10190权利要求1.具有如下物理化学性质、并有抑制破骨细胞分化和/或成熟的活性的蛋白质(a)分子量(用SDS-PAGE测得)约60kD(还原条件下)、约60kD和约120kD(非还原条件下)；(b)亲和性对阳离子交换剂和肝素具有亲和性；(c)热稳定性于70℃热处理10分钟或56℃热处理30分钟，抑制破骨细胞分化成熟的活性降低，于90℃热处理10分钟则抑制破骨细胞分化成熟的活性丧失；(d)氨基酸序列具有序列表中序列1-3的氨基酸序列作为内部氨基酸序列。2.如权利要求1所述的蛋白质，其N末端序列表示为序列表中序列7的氨基酸。3.如权利要求1所述的蛋白质，为人成纤维细胞所产生的。4.权利要求1-3之一所述的蛋白质的制备方法，其特征在于将人成纤维细胞进行细胞培养，将培养液经离子交换柱、亲和层析柱和反相层析柱的吸附和洗脱而加以精制。5.权利要求4所述的蛋白质的制备方法，其中使用氧化铝陶瓷片作为载体进行细胞培养。6.以序列表中序列4的氨基酸序列所表示的蛋白质。7.编码序列表中序列4所示氨基酸序列的cDNA。8.序列表中序列6的碱基序列所表示的cDNA。9.与序列表中序列6的碱基序列所表示的cDNA在较温和条件下杂交的cDNA。10.编码序列表中序列4所示氨基酸序列的cDNA所表达的蛋白质。11.编码与序列表中序列4所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列的cDNA表达所得的、具有抑制破骨细胞分化和/或成熟活性的蛋白质。12.制备蛋白质的遗传工程方法，其特征在于采用编码序列表中序列4所示氨基酸序列的cDNA为基因，所述蛋白质具有如下物理化学性质、并有抑制破骨细胞分化和/或成熟的活性(a)分子量(用SDS-PAGE测得)约60kD(还原条件下)、约60kD和约120kD(非还原条件下)；(b)亲和性对阳离子交换剂和肝素具有亲和性；(c)热稳定性于70℃热处理10分钟或56℃热处理30分钟，抑制破骨细胞分化成熟的活性降低，于90℃热处理10分钟则抑制破骨细胞分化成熟的活性丧失；(d)氨基酸序列具有序列表中序列1-3的氨基酸序列作为内部氨基酸序列，该方法的特征是采用编码序列表中序列4所示氨基酸序列的cDNA作为基因。13.如权利要求10所述的蛋白质的遗传工程制备方法，其中采用哺乳动物细胞作为宿主细胞。14.如权利要求13所述的蛋白质的遗传工程制备方法，其中宿主细胞为293/EBNA细胞或CHO细胞。15.序列表中序列8的碱基序列所表示的cDNA。16.由序列表中序列8的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。17.编码序列表中序列9所示氨基酸序列的cDNA。18.序列表中序列10的碱基序列所表示的cDNA。19.由序列表中序列10的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。20.编码序列表中序列11所示氨基酸序列的cDNA。21.序列表中序列12的碱基序列所表示的cDNA。22.由序列表中序列12的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。23.编码序列表中序列13所示氨基酸序列的cDNA。24.序列表中序列14的碱基序列所表示的cDNA。25.由序列表中序列14的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。26.编码序列表中序列15所示氨基酸序列的cDNA。27.序列表中序列83的碱基序列所表示的cDNA。28.由序列表中序列83的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。29.编码序列表中序列62所示氨基酸序列的cDNA。30.序列表中序列84的碱基序列所表示的cDNA。31.由序列表中序列84的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。32.编码序列表中序列63所示氨基酸序列的cDNA。33.序列表中序列85的碱基序列所表示的cDNA。34.由序列表中序列85的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。35.编码序列表中序列64所示氨基酸序列的cDNA。36.序列表中序列86的碱基序列所表示的cDNA。37.由序列表中序列86的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。38.编码序列表中序列65所示氨基酸序列的cDNA。39.序列表中序列87的碱基序列所表示的cDNA。40.由序列表中序列87的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。41.编码序列表中序列66所示氨基酸序列的cDNA。42.序列表中序列88的碱基序列所表示的cDNA。43.由序列表中序列88的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。44.编码序列表中序列67所示氨基酸序列的cDNA。45.序列表中序列89的碱基序列所表示的cDNA。46.由序列表中序列89的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。47.编码序列表中序列68所示氨基酸序列的cDNA。48.序列表中序列90的碱基序列所表示的cDNA。49.由序列表中序列90的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。50.编码序列表中序列69所示氨基酸序列的cDNA。51.序列表中序列91的碱基序列所表示的cDNA。52.由序列表中序列91的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。53.编码序列表中序列70所示氨基酸序列的cDNA。54.序列表中序列92的碱基序列所表示的cDNA。55.由序列表中序列92的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。56.编码序列表中序列71所示氨基酸序列的cDNA。57.序列表中序列93的碱基序列所表示的cDNA。58.由序列表中序列93的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。59.编码序列表中序列72所示氨基酸序列的cDNA。60.序列表中序列94的碱基序列所表示的cDNA。61.由序列表中序列94的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。62.编码序列表中序列73所示氨基酸序列的cDNA。63.序列表中序列95的碱基序列所表示的cDNA。64.由序列表中序列95的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。65.编码序列表中序列74所示氨基酸序列的cDNA。66.序列表中序列96的碱基序列所表示的cDNA。67.由序列表中序列96的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。68.编码序列表中序列75所示氨基酸序列的cDNA。69.序列表中序列97的碱基序列所表示的cDNA。70.由序列表中序列97的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。71.编码序列表中序列76所示氨基酸序列的cDNA。72.序列表中序列98的碱基序列所表示的cDNA。73.由序列表中序列98的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。74.编码序列表中序列77所示氨基酸序列的cDNA。75.序列表中序列99的碱基序列所表示的cDNA。76.由序列表中序列99的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。77.编码序列表中序列78所示氨基酸序列的cDNA。78.序列表中序列100的碱基序列所表示的cDNA。79.由序列表中序列100的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。80.编码序列表中序列79所示氨基酸序列的cDNA。81.序列表中序列101的碱基序列所表示的cDNA。82.由序列表中序列101的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。83.编码序列表中序列80所示氨基酸序列的cDNA。84.序列表中序列102的碱基序列所表示的cDNA。85.由序列表中序列102的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。86.编码序列表中序列81所示氨基酸序列的cDNA。87.序列表中序列103的碱基序列所表示的cDNA。88.由序列表中序列103的碱基序列所表示的cDNA表达所得的蛋白质。89.编码序列表中序列82所示氨基酸序列的cDNA。90.编码序列表中序列4氨基酸序列的基因组cDNA。91.如权利要求90所述的基因组cDNA，它是以序列表中系列104和105表示的。92.对人破骨细胞形成抑制因子显示特异性亲和性的抗体。93.如权利要求92所述的抗体，该抗体为多克隆抗体。94.如权利要求92所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。95.如权利要求94所述的单克隆抗体，为分子量约150,000的IgG1、IgG2a或IgG2b亚型。96.人破骨细胞形成抑制因子的测定方法，其特征在于使用权利要求92-95所述的抗体。全文摘要具有抑制破骨细胞分化和/或成熟的活性的蛋白质及其制备方法。此蛋白质从人胎儿肺成纤维细胞产生,在还原条件下分子量约为60kD,在非还原条件下分子量约为120kD。此蛋白质可从该细胞的培养液中分离精制。还可用遗传工程的方法进行制备。本发明还包括遗传工程制备中的cDNA、或与该蛋白质有特异亲和性的抗体,使用该抗体的蛋白质测定方法。文档编号C12N5/08GK1175956SQ96192019公开日1998年3月11日申请日期1996年2月20日优先权日1995年2月20日发明者后藤雅昭,津田英资,望月伸一,矢野和树,小林文枝,岛伸行,保田尚孝,中川信明,森永伴法,上田正次,东尾侃二申请人:雪印乳业株式会社