双功能或双价抗体片段类似物的制作方法

专利名称：双功能或双价抗体片段类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的双特异性的或双价的抗体片段类似物，产生该抗体片段类似物的方法以及该抗体片段类似物的各种用途。
背景技术：
及现有技术1.抗体结构抗体分子一般为“Y”形分子，其基本单位由四条多肽所组成，即两条相同的重链和两条相同的轻链，它们通过二硫键共价连系到一起。这些链中的每一条折叠成不连续的结构域。两条重链和轻链的C-末端区域序列保守并称之为恒定区，也叫C-区。N-末端区域也叫V-区，其序列是可变的且负责抗体的特异性。抗体主要通过它们V-区中六个短的互补-决定区特异地识别和结合抗原(见

图1)。在该说明书中所用的缩略语意义如下。C-区 恒定区V-区 可变区VL轻链可变区VH重链可变区Fv既含有VH又含有VL的双链抗体片段scFv 单链Fv(VH和VL在遗传上直接相连系或通过肽接头相连系)CDR 互补决定区ELISA 酶联免疫吸附分析PCR 聚合酶链式反应IPIG 异丙基-β-硫代半乳糖苷PBS 磷酸缓冲盐溶液PBST 含0.15％吐温的磷酸缓冲盐溶液TMB 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺众所周知以木瓜蛋白酶对抗体进行蛋白水解产生三个片段。含有通过完全铰链区相连的两条重链CH2和CH3区的片段(见图1)很容易结晶且因此称为Fc片段。其它两个片段相同且称为Fab片段，因为它们含有抗原-结合位点。以胃蛋白酶消化后两Fab仍通过铰链区相连，仅形成两个片段Fc′和Fab2。
Fv仍含有完整结合位点(见图1)和全部抗原结合活性的抗体最小单位。它仅由重链和轻链的V-区所组成，因此形成小的异二聚体可变片段或Fv。Fv的分子量约25kD，仅为母体完整抗体(在IgG的情况)的六分之一。以前Fv仅能在选出的少数几个实例的蛋白水解才可得到(Givol，1991)。Fv的生产现在可常规地用通过克隆和表达仅编码感兴趣抗体V-区的DNA的遗传工程方法完成。已证明更小的片段，如单个V-区(结构域抗体或dABs，Ward等，1989)，甚至单个CDR(Williams等，1989；Taub等，1989)保留有母体抗体的结合特性。然而，在常规的基础上这是不可以得到的大多数天然产生抗体既需要VH又需要VL以维持完整的免疫反应性。例如，在VHD1.3的情况(Ward等，1989)，尽管它仍能以与母体抗体相近的亲和力结合鸡卵溶菌酶(HEL)，但已观察到其特异性的丧失，因为它不再能够区分火鸡溶菌酶与HEL，而后者却能(Berry与Davies，1992)。虽然鼠dABs可更为常规地从脾文库中获得(Ward等，1989)，但由于许多与其生产和物理行为有关的问题表达极低，亲和力超低，在水中的稳定性和可溶性低，且非特异性结合常常很高，故该方法不能稳定维持。根据文献，对这些非必需特征的可能解释是时常埋藏于VH-VL界面中的疏水残基的暴露。暴露的疏水部分被认为是有助于细胞内和/或培养基中蛋白的聚合，导致低表达和/或低溶解性(Anthory等，1992；Ward等，1989)。疏水部分也可解释Berry和Devies，1992年所描述的高非特异性结合。这些问题显然限制了这些分子的有用性。
大多数骆驼科的(Camelid)抗体似乎是该规则的例外，因为它们仅需要一个V-区，即VH便可特异而有效地结合抗原(Hamers-Castermans等，1993)。此外，初步的实验数据表明它们不会产生鼠dABs的不足，因为这些骆驼科的(Camelid)抗体或其片段是可溶的且已表明在酵母和曲霉属霉菌中表达良好。这些观察结果会对抗体依赖性产品的生产和开发具有重要影响，见专利申请WO94/2559l(UNILEVER等，最初优先权日期93年4月29日)。2.抗体片段的产生已开发出好几种微生物表达系统用于产生活性抗体片段，例如，在各种宿主，如大肠杆菌(Better等，1988，Skerra和Plückthun，1988，Carter等，1992)，酵母(Horwitz等，1988)，以及丝状真菌Trichodermareesei(Hyyssnen等，1993)中Fab的产生已被描述。在这些可选系统中重组蛋白产量可能会相对较高(在高细胞密度发酵中，分泌到大肠杆菌壁膜间隙的Fab为1-2g/L，见Carter等，1992)，或以更低的水平，如，在酵母发酵物中约0.1mg/l Fab(Horwitz等，1988)，以及在木霉(Trichoderma)发酵物中150mg/l的融合蛋白CBHI-Fab和1mg/l的Fab(Nyyssnen等，1993)并且这种产生与在哺乳动物细胞(杂交瘤，骨髓瘤，CHO)中的整个抗体的产生相比是非常便宜的。尽管在高细胞浓度发酵中后者可达到1g/l数量级的产量，但这是一种费时及昂贵的生产方法，产生的抗体价格约1000磅/克。进一步证实植物可用作整个抗体(Hiatt等，1989)和scFv(Owen等，1992；Firek等，1993)产生的宿主，籍此已有提及在烟草叶子中产量可达总可溶性蛋白含量的0.5％。
片段可被产生为Fab或Fv，但此外已证明VH与VL可在遗传上通过可弯曲的多肽接头以任意的顺序连系在一起，此连接产物称为scFv(Bird等，(1988)，Huston等，(1988)，且授权专利为EP-B-0281604(GENEX/ENZON LABS TNC；最初优先权日期1986年9月2日)。3.双价和双特异性的抗体及抗体片段抗体片段Fab，Fv和scFv不同于完整抗体，在于抗体片段仅具有单个抗原-结合位点。具有2个结合位点的重组片段可以好几种方法产生，例如，通过在Fv的VHC-末端(Cumber等，1992)，或scFv的VLC-末端(Pack和Pluskthun，1992)引入半胱氨酸残基的化学交联或通过Fab的铰链半胱氨酸残基(Carter等，1992)。Kostelny等(1992)和Pack与Plückthun(1992)描述了另一种产生双价抗体片段的方法并且是根据包括进去一条促进二聚化的C-末端肽。
当需要两种不同的特异性时，便可生产双特异性抗体片段。传统的产生双特异性完整抗体的方法是融合两个杂交瘤细胞系，其中每个都产生需要特异性的抗体。由于免疫球蛋白重链与轻链的随机组合，这些杂交的杂交瘤产生出多达10种不同重链与轻链组合的混合物，仅其中的一种为双特异性抗体(Mitstein与Cuello，1983)。因此，这些双特异性抗体不得不用繁琐的方法加以纯化，这又大大降低了所需产品的产量。可选的方法包括通过铰链中的半胱氨酸残基或上述的通过遗传导入的C-末端Cys的化学交联在体外连系两个抗原的特异性。这种体外装配的改进通过用Fab与促进二聚体形成的肽的重组融合得以完成(Kostelny等，1992)。然而，用这些方法的双特异性产物的产量远低于100％。
Holliger等(1993)描述了一种不包括体外化学装配步骤的更为有效的产生双价或双特异性抗体片段的方法。该方法采用了如下观察结果的优势即细菌分泌的scFv常既以单体又以二聚体存在。该观察结果表明不同链的VH和VL能够配对，因此形成二聚体和更大的复合物。二聚体抗体片段，也被Hollinger等命名为“二体”(“diabodies”)，实际上是在体内装配的小的双价抗体片段。通过连系2个不同抗体1和2的VH和VL以形成“交叉”(“cross-over”)链VH1VL2和VH2-VL1(见图2B)，已证明二聚化过程为两个抗原结合位点重新装配。已证明两个结合位点的亲和力与起始的scFv相同，或当去除共价连系VH和VL的多肽接头时亲和力甚至增加10倍，这样便产生2个蛋白，每个由VH直接且共价地与不与VH匹配的VL共价连接所组成(见图2C)。产生双特异性抗体片段的这种策略在几个专利申请中也有描述。专利申请WO94/09131(SCOTGEN有限公司；优先权日期92年10月15日)涉及双特异性的结合蛋白，其中的结合区来自或者存在于两条链或者在scFv中连系在一起的VH和VL区域，其中其它的融合抗体区域，如C-末端恒定区用于稳定二聚体结构。专利申请WO94/13804(剑桥抗体技术/医学研究委员会；最早优先权日期92年12月4日)涉及含有能相互联结的VH与VL的多肽，其中的V-区可用接头或不用接头而被连接。
Mallender与Voss，1994(在专利申请WO94/13806中也有描述；Dow化工公司；优先权日期92年12月11日)报导在大肠杆菌体内单链双特异性抗体片段的产生。双价蛋白的双特异性是依据以前生产的2个在遗传水平上通过可弯曲的多肽接头而连系在一起的具有独特特异性的单价scFv分子。已证明这样形成的VH1-接头-VL1-接头-VH2-接头-VL2片段(见图2A)含有抗原结合特异性1和2。(1＝抗-荧光素，2＝抗-单链DNA)。传统地，无论何时提及单-链抗体片段，意思是指在多肽接头存在或不存在的情况下由一条重链连系到一条(相应)轻链所组成的单个分子。当通过‘双价抗体’(‘diabody’)方法(Holliger等，(1993)和专利申请WO94/09131)或‘双scFv’方法(Mellender和Voss，1994和专利申请WO94/13806)制备双价或双特异性抗体片段时，又一次VH被连接到(相应的)VL上。
已知专利申请WO93/11161(ENZON INC；优先权日期91年11月25日)的权利要求32与33和此说明中22页的1～10行的相应段落也许分别意味着包括通可弯曲的多肽接头而融合在一起的两条VL的多肽以及包括通过可弯曲的多肽接头融合在一起的两条VH的多肽。然而，没有给出实施例来证实该方法，因此这实际上只是个假说性的可能性而不是实际产生的化合物。
至少由于三个原因技术人员将不会期望这种方法是可行的。首先，广泛认为免疫球蛋白重链(不包括上述的骆驼免疫球蛋白)具有很有限的可溶性且当与其轻链对应体分离时自发沉淀出水溶液。其次，几个小组证实(Ward等，1989，Berry与Davies，1992，与Anthony等，1992)在VL不存在时VH的表达由于不稳定产物的极低产量而受阻，且带有许多不必要的特性，如，非-特异性结合。第三在专利申请WO94/13804中的31页10～12行描述了在计算机模型实验中，在短的接头的限制下他(她)们不能构建出异二聚体VH-VH与VL-VL模型。
因此，无论建议是否会奏效，专利申请WO93/11161中给出的简单建议不是一个能引导技术人员以合理的成功预期进行试验该建议能否起作用的公开；因此，那个专利申请不应看作为本发明的相关现有技术。
发明概述本发明提供了双特异性或双价的抗体片段类似物，其包括含有两条多肽链的结合物，其中的一条包括2个连续的重链可变区(VH)且另一条包括2个连续的轻链可变区(VL)。
在本发明的一个方面，抗体片段类似物的一条链包括连接到第二个VH(VH-B)上的第一个VH(VH-A)且另外一条链包括连接到第二个VL(VL-B)上的第一个VL(VL-A)。在这方面的优选实施方案中一条链包括后续有第二个VH(VH-B)的第一个VH(VH-A)，即[VH-A*VH-B]，且另一条链包括后续有第二个[VL(VL-B)的第一个VL(VL-A)，即[VL-B*VL-A]。对于这方面的有些实施方案两个VH直接相互连接，但对于本发明该方面的其它实施方案两个VL直接相互连接。根据本发明这方面的另外实施方案，两个VH通过接头互相连接且两个VL也通过接头相互连接。这种接头通常包括至少一个氨基酸残基。
根据本发明这方面的特定实施方案，一条链包括后续有第二个VH(VH-B)的第一个VH(VH-A)，即[VH-A*VH-B]，且另外一条链包括后续有第二个VL(VL-B)的第一个VL(VL-A)，即[VL-A*VL-B]，且其中的两个VH通过接头彼此连接且两个VL也通过接头彼此连接，而每个接头包括至少10个氨基酸残基。
根据本发明的上述方面，其中A不同于B，由此提供了双特异性的抗体片段类似物。
根据本发明的另一方面，A与B特异性相同，得到的是双价抗体片段。
根据本发明的更进一步的方面，双特异性或双价抗体片段类似物可用于诊断技术或免疫分析，纯化方法中，治疗，或其它使用免疫球蛋白或其片段的方法中。这种用途在本领域众所周知。
本发明也提供产生本发明抗体片段的方法，其中的宿主通过吸收进宿主编码具有或不具有连接接头的两个VH的DNA和编码具有或不具有连接接头的两个VL的DNA而转化该宿主。优选地，两段DNA置于双顺反子(dicistronic)的排列。
两个连接的VH与两个连接的VL通过不同的宿主分别产生，然后由一个宿主产生的连接VH可连接到由另一宿主产生的连接VL上，这也是可能的。
宿主可选自原核细菌，其例子有格兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，及格兰氏阳性细菌，如枯草杆菌或乳酸菌；低等真核生物的例子有属于酵母属、克鲁维酵母属、木霉属的酵母，有如属于曲霉属及脉孢菌属的霉菌及高等真核生物，其例子为植物，如烟草以及动物细胞，其实例为骨髓瘤细胞和CHO细胞。通过遗传工程方法转化宿主以获得由该宿主产生的所需多肽的技术对本领域的技术人员已众所周知，因为从上面题为“发明背景及现有技术”中提及的文献来看这是显而易见的。
附图简述图1 简要描述典型抗体(免疫球蛋白)分子的结构。
图2 简要描述发表的已被证明产生双特异性抗体片段的重链和轻链V-区基因片段的排列。
图3 图示建议的根据本发明双头抗体片段V-区的排列，V-区以下面的顺序排列VHA-VHB+VLB-VLA。
图4 显示pUR.4124 EcoRI-HindIII插入子的核苷酸序列，其中含有编码VLLys-接头-VHLys(见序列2)的DNA(见序列1)。
图5 显示质粒Fv.3418 HindIII-EcoRI插入子的核苷酸序列(见序列3)，含有编码pelB异肽-VH3418(见序列4)的DNA与编码pelB异肽-VL3418(见序列5)的DNA。
图6 显示质粒Fv.4715-myc HindIII-EcoRI插入子的核苷酸序列(见序列6)，含有编码pelB异肽-VH4715(见序列7)的DNA与编码pelB异肽-VL4715-Myc标记的DNA(见序列8)。
图7 显示scFv.4715-myc HindIII-EcoRI插入子的核苷酸序列，含有编码pelB异肽-VH4715-接头-VL4715-Myc标记(见序列10)的DNA(见序列9)。
图8a/b显示pGOSA.E HindIII-EcoRI插入子的核苷酸序列(见序列11)，其含有编码pelB异肽-VH4715-接头-VL3418的DNA(见序列12)和编码pelB异肽-VL3418-接头-VH4715的DNA(见序列13)。
图9 总体描述了pGOSA.E中可用于替换V-区基因片段的寡核苷酸及其位置。图10 图解融合多肽GOSA.E(见序列12中氨基酸114-145和序列13中氨基酸102-128)，GOSA.V(见序列30及在序列13中氨基酸102-128)，GOSA.S(见序列12中的氨基酸114-145及序列31)及GOSA.T(见序列30及序列31)中VH-VH与VL-VL区接头的氨基酸序列。图11 显示链球菌属scFv.4715-myc结合的特异性。图12 显示通过GOSA.E定向结合到各种链球菌菌株表面的葡萄糖氧化酶的特异性。图13 显示通过GOSA.V定向结合到各种链球菌菌株表面的葡萄糖氧化酶的特异性。图14 显示通过GOSA.S定向结合到各种链球菌菌株表面的葡萄糖氧化酶的特异性。图15 显示通过GOSA.T定向结合到各种链球菌菌株表面的葡萄糖氧化酶的特异性。图16 显示ELISA的结果。从部分纯化的GOSA.E作为原料得到的凝胶过滤的各个级份用于测试葡萄糖氧化酶与血链球菌之间的双特异结合活性。图17 显示ELISA的结果。从部分纯化的GOSA.V作为原料得到的凝胶过滤的各个级份用于测试葡萄糖氧化酶与血链球菌之间的双特异结合活性。图18 显示ELISA的结果。从部分纯化的GOSA.S作为原料得到的凝胶过滤的各个级份用于测试葡萄糖氧化酶与血链球菌之间的双特异结合活性。图19 显示ELISA的结果。从部分纯化的GOSA.T作为原料得到的凝胶过滤的各个级份用于测试葡萄糖氧化酶与血链球菌之间的双特异结合活性。图20 图示PCR.I BstEII/SacI片段的来源。图21 图示PCR.II SfiI/EcoRI片段的来源。图22 图示PCR.III NheI/SacI片段的来源。图23 图示PCR.IV XhoI/EcoRI片段的来源。图24 图示PCR.V SalI/EcoRI片段的来源。图25 图示PCR.VI BfiI/NheI片段的来源。图26 图示PCR.VII BstEII/NheI片段的来源。图27 图示PCR.VIII XhoI/EcoRI片段的来源。图28 图示PCR.IX BstEII/NheI片段的来源。图29 图示PCR.X PstI/EcoRI片段的来源。图30 图示质粒pGOSA.A的构建。图31 图示质粒pGOSA.B的构建。图32 图示质粒pGOSA.C的构建。图33 图示质粒pGOSA.D的构建。图34 图示质粒pGOSA.E的构建。图35 图示质粒pGOSA.V的构建。图36 图示质粒pGOSA.S的构建。图37 图示质粒pGOSA.T的构建。图38a/b图示质粒pGOSA.G的构建。图39 图示质粒pGOSA.J的构建。图40 图示质粒pGOSA.Z的构建。图41 图示质粒pGOSA.AA的构建。图42 图示质粒pGOSA.AB的构建。图43 图示质粒pGOSA.L的构建。图44 图示质粒pGOSA.Y的构建。图45 图示质粒pGOSA.X的构建。图46 图示质粒pGOSA.AC的构建。图47 图示质粒pGOSA.AD的构建。表1 显示用于产生本说明书中所述构建体寡核苷酸的核苷酸序列。由这些引物编码的限制位点有下划线。表2 给出了所有在本说明书中描述的GOSA构建体的整体描述。
表2A描述了没有进一步测试的中间构建体。
表2B描述了双顺反子构建体。
表2C描述了单顺反子构建体。
发明详述在本说明书中描述了由两条链蛋白复合物所组成的抗体片段类似物的构建，其中的一条链由任意顺序的两条重链V-区所组成且另一条链由二种顺序的中任一顺序的两条相应的轻链V-区所组成。可变区直接或通过多肽接头相连接。随后对这种连接分子的模型构建表明，只要连接接头保持30～35足够长的跨度，该蛋白链便会折叠从而可完全得到两个结合位点。
而在专利申请WO93/11161中明确描述了对于上述的双特异性复合物则需要两条可弯曲的多肽接头用于复合物的自我装配，本发明在这里特别描述了仅含一个接头或根本不含接头的两个链蛋白复合物的构建。因此后者的抗体片段类似物由两条链蛋白复合物所组成，其中一条多肽链包括直接融合在一起的重链V-区且另一条多肽链包括融合在一起的相应轻链V-区，两种融合均无接头存在。但是其是每条链的两个可变区之间包括一个接头的两个链蛋白复合物也可以通过构建体pGOSA.E按下述用作根据本发明的抗体片段类似物。然而，优选仅含一条接头或根本无接头的两条链复合物。缩略语G-OSA用在本说明中是涉及葡萄糖氧化酶与血链球菌的组合。
在本说明书中提供了这些抗体片段类似物(“双头”)含有用于产生这些双特异性抗体片段Fv的两个抗原结合特异性的证据。通过举例说明，用来自表达针对这些抗原的抗体的杂交瘤的抗体片段，根据本发明的这种构建体可用于将葡萄糖定向至整个细菌。
现在通过参照一些具体的实施例对本发明加以描述，收入这些实施例仅用于说明的目的而不是要限制本发明的范围。
实施例一般性实验菌株、质粒及培养基所有克隆步骤在大肠杆菌JM 109(endA1，ercA1，gyrA96，thi，hsdR17(rk，mk+)，relA1，supE44，Δ(lac-proAB)，[F′，traD36，proAB，lacIqZΔM15]中完成。大肠杆菌培养于2×TY培养基中(每升水中16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl)，当补充以2％葡萄糖和/或100μg/ml氨苄青霉素时另加说明。转化产物铺板于SOBAG平板上(每升水中20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，0.5g NaCl另加10mM MgCl2，2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)。使用的表达载体为pUC19衍生物。用于PCR反应的寡核苷酸引物在应用生物系统381A DNA合成仪(Applied Biosystems 381A DNA Synthesiser)上以磷酰亚胺(phosphoramidite)方法合成。GOSA构建体的表达铺板于SOBAG平板上的新鲜转化JM 109菌落用于接种补充以100μg/ml氨苄青霉素，2％葡萄糖的2×TY培养基。培养物在37℃摇至D0600在0.5～1.0的范围。离心沉淀细胞且去除上清。沉淀的细胞重悬于含100μg/ml氨苄青霉素，1mM IPTG的2×TY培养基，且在25℃进一步生长18个小时。离心沉淀细胞且含有所分泌链的上清直接用于ELISA。沉淀细胞的周质蛋白通过重悬细胞沉淀于1/20最初培养体积的裂解缓冲液(20％蔗糖，200mM pH7.5的Tris-HCl，1mMEDTA，500μg/ml溶菌酶)加以提取。在25℃温育20分钟后加入等体积的水且继续温育20分钟。悬液以10,000g离心15分钟且含周质蛋白的上清直接用于ELISA。ELISA96孔ELISA平板(Greiner HC平板)在37℃以200μl/孔于pH＝9.5、0.05M碳酸钠缓冲液1/10的链球菌属细胞过夜培养物稀释液活化过夜。经PBST洗过一次后，抗原敏化(sensitised)平板用200μl/孔封闭缓冲液(2％BSA，0.15％PBS中的吐温)在37℃预封闭1小时。含50μl封闭缓冲液与50μl培养上清或含周质细胞提取物(纯净的或以PBS稀释的)的样品加至链球菌属敏化的平板且37℃温育2小时。以PBS-T洗四次后，向每孔加入含葡萄糖氧化酶(50μg/ml)的100μl的封闭缓冲液。经37℃温育1小时后，以PBS-T洗4次以去除未结合的葡萄糖氧化酶。通过向每孔中加100μl底物(70mM柠檬酸钠，320mM磷酸钠，27mg/ml葡萄糖，0.5μg/ml HRP，100μg/ml TMB)检测结合的葡萄糖氧化酶。1小时后通过加入35μl 2M HCl终止颜色反应且测量A450(比较图11/15)。GOSA抗体片段的亲和纯化GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S与GOSA.T通过亲和层析部分纯化。100ml每个这些构建体的周质提取物装入根据制造商的指南制备的葡萄糖-氧化酶琼脂糖柱(CNBr-Sepharose，发码西亚)。经PBS彻底洗以后结合的GOSA抗体片段以pH＝2.8的0.1M甘氨酸缓冲液洗脱。级份以Tris中和且经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的银染加以分析并且测试双头抗体的存在。
实施例1.pGOSA双头表达载体的构建在该实施例中描述了双链蛋白复合物的构建，其中的一条链由两个重链V-区组成且另外一条链由两个相应的轻链V-区所组成。可变区直接或通过多肽接头而连接。所用的表达载体为pUC19的衍生物，衍生质粒含有HindIII-EcoRI片段，在质粒scFv.4715-myc情况下含有编码一个融合到VHN-末端的pelB信号序列的DNA片段，VH通过连接可弯曲的肽接头，(Gly4Ser)3(存在于序列2中氨基酸109-123及序列10中氨基酸121-135)直接连接到抗体的相应VL上，这样便产生单链分子(见图7)。
在双链Fv及pGOSA表达载体中，既编码抗体VH又编码抗体VL的DNA片段的前面连接从在单个可诱导启动子控制下人工双顺反子操纵子中的核糖体结合位点和编码pelB信号序列的DNA序列(见图5，6和8)。这些构建体的表达由可诱导的lacZ启动子驱动。用于产生双特异性抗体片段的质粒pUR.4124，Fv.3418，Fv.4715-myc及scFv.4715-myc构建体中的HindIII-EcoRI插入子核苷酸序列分别列于图4-7。此外，带有质粒scFv.4715-myc的大肠杆菌培养物及带有质粒Fv.3418的大肠杆菌培养物根据布达佩斯条约保藏于伦敦(英国)的国家典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cuctures)中(中央公共卫生实验室)，保藏号分别为NCTC 12916与NCTC 12915。根据EPC 28(4)条件，或类似的规定，对于EPC非缔约国，在这里特此要求，当需要时，该保存样品将只授予专家。
pGOSA.E的构建(见图8pUC19 HindIII-EcoRI插入子)包括几个克隆步骤。在各区的适当限制性位点通过用列于下文表1的寡核苷酸的PCR介导的诱变而引入。仅具一个或没有接头序列的pGOSA.E衍生物pGOSA.V，pGOSA.S及pGOSA.T通过用以列于下表1的寡核苷酸的PCR定点诱变去除连系序列而衍生自pGOSA.E。
表1DBL.15’-CAC CAT CTC CAG AGA CAA TGG CAA G-3’(＝SEQ ID NO14)DBL.25’-GAG CGC GAG CTC GGC CGA ACC GGC C1GA TCC GCCACC GCC AGA GCC-3’ (＝SEQ ID NO15)DBL.35’-CAG GAT CCG GCC GGT TCG GCC1CAG GTC CAG CTGCAA CAG TCA GGA-3’ (＝SEQ ID NO16)DBL.45’-CTA CAT GAA TTC2 GCT AGC3 TTA TTA TGA GGA GACGGT GAC GGT GGT CCC TTG GC-3’ (＝SEQ ID NO17)DBL.55’-TAA TAA GCT AGC3 GGA GCT GCA TGC AAA TTC TATTTC-3’ (＝SEQ ID NO18)DBL.65’-ACC AAG CTC GAG4 ATC AAA CGG GG-3’ (＝SEQ ID NO19)DBL.75’-AAT GTC GAA TTC2 GTC GAC5 TCC GCC ACC GCC AGAGCC-3’ (＝SEQ ID NO20)DBL.85’-ATT GGA GTC GAC5 ATC GAA CTC ACT CAG TCT CCATTC TCC-3’ (＝SEQ ID NO21)DBL.95’-TGA AGT GAA TTC2 GCG GCC GC6T TAT TAC CGT TTGATT TCG AGC TTG GTC CC-3’ (＝SEQ ID NO22)DBL.10 5’-CGA ATT CGG TCA CC8G TCT CCT CAC AGG TCC AGTTGC AAC AG-3’ (＝SEQ ID NO23)DBL.11 5’-CGA ATT CTC GAG4 ATC AAA CGG GAC ATC GAA CTCACT CAG TCT CC-3’ (＝SEQ ID NO24)DBL.12 5’-CGA ATT CGG TCA CC8G TCT CCT CAC AGG TGC AGTTGC AGG AG-3’ (＝SEQ ID NO25)pCR.51 5’-AGG T(C/G)(A/C) A(C/A)C TGC AG7(C/G) AGT C(A/T)GG-3’(＝SEQ ID NO26)pCR.89 5’-TGA GGA GAC GGT GAC C8GT GGT CCC TTG GCC CC-3’(＝SEQ ID NO27)PCR.90 5’-GAC ATT GAG CTC9 ACC CAG TCT CCA-3′(＝SEQ ID NO28)PCR.116 5’-GTT AGA TCT CGA G4CT TGG TCC C-3′(＝SEQ ID NO29)1＝sfiI，2＝EcoRI，3＝NheI，4＝XhoI，5＝SalI，6＝NotI，7＝PstI，8＝BstEII，9＝SacI这三个构建体在新接头位点缺少一些限制位点。不带接头的VHA-VHB基因片段缺乏5′VHB SfiI位点。没有接头的VLB-VLA基因片段缺乏5′VLA SalI位点。列于表1的pGOSA构建体中的寡核苷酸位置显示于图9。设计pGOSA表达载体和表1中的寡核苷酸以使大多数特异性克隆进入pGOSA构建体。图10显示了由存在于pGOSA.E，pGOSA.V，pGOSA.S及pGOSA.T中DNA所编码的VHA-VHB与VLB-VLA片段之间接头处的氨基酸序列。pGOSA.E，pGOSA.V，pGOSA.S及pGOSA.T制备的更为详细的描述在实施例5中给出。
实施例2.GOSA双头的双功能结合活性在该实施例中我们提供了上述分子(“双头”)，即，双链蛋白复合物，含有用于产生这些多功能抗体片段类似物Fv的两个抗原结合特异性的证据。图12-15显示使用来自表达针对这些抗原的抗体的杂交瘤的抗体片段，GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S及GOSA.T可用于特异性地将葡萄糖氧化酶定向至几种血链球菌菌株。
比较GOSA构建体(见图12-15)结合特异性与scFv.4715-myc(见图11)的结合特异性表明抗血链球菌scFv.4715的精确特异性在GOSA“双头”中得以保存。
实施例3.GOSA双头的FPLC分析部分纯化的GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S与GOSA.T样品(通过聚丙烯酰胺凝胶电泳估计纯度为50～80％)在Pharmacia FPLCSuperose 12柱上加以分析。分析用0.3ml/分钟的PBS流速来进行。在280nm处监测洗脱液且收集0.3ml级份用ELISA分析。用ELISA检测，通常GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S及GOSA.T样品仅具有一个GOSA双头活性峰(见图16-19)。该峰在洗脱图谱中的位置表明GOSA双头分子量为40-50kD。用于该分子量相当于VH2+VL2双头二聚体的预期分子量，从而证实了GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S与GOSA.T主要作为二聚体分子而产生的结论。偶尔观察到表观分子量≈200kD的活性峰(见图16)。葡萄糖氧化酶活性在这些级份中的存在(数据未显示)表明这些级份含有GOSA双头，并混杂有以GOSA为样品从葡萄糖氧化酶琼脂糖亲和基质中洗脱的葡萄糖氧化酶。
实施例4.其它双头的生产前面实施例中描述的方法用于生产其它双头，它们似乎对正因为它们而抗体被开发的抗原具有活性。这些别的双头具有以下的特性抗-血链球菌/抗-β-HCG，抗-血链球菌/抗-尿素酶，抗-血链球菌/抗-鸡卵溶菌酶，抗-β-HCG/抗-鸡卵溶菌酶，抗-鸡卵溶菌酶/抗-葡萄糖氧化酶，抗-huIgG/抗-葡萄糖氧化酶，抗-尿素酶/抗-葡萄糖氧化酶，抗-乳酸-过氧化酶/抗-葡萄糖氧化酶，抗-α-HCG/抗-葡萄糖氧化酶，及anti-reactive-Red-6/抗-葡萄糖氧化酶。实施例5.中间构建体pGOSA.A，pGOSA.B，pGOSA.C及pGOSA.D的制备及其用于质粒pGOSA.E及其衍生物pGOSA.V，pGOSA.S和GOSA.T制备中的详细描述寡核苷酸与PCR用于双特异性‘pGOSA’构建体构建的寡聚核苷酸引物的主要结构列于上面的表1。用于DNA片段扩增的反应混合物为10mMTris-HCl，pH8.3，2.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％明胶(w/v)，0.1％Triton X-100，400mM每种dNTP，5.0单位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)，100ng模板DNA，及500ng的每种引物(对100μl的反应)。反应条件为94℃4分钟，然后以94℃1分钟，55℃1分钟，及72℃1分钟进行33轮循环。质粒DNA/载体/插入子制备及连接/转化用‘Qiagen P-100 Midi-DNA制备’系统制备质粒DNA。以特异的限制性核酸内切酶在合适的条件下(缓冲液与温度由供应商说明)消化10μg(用于载体制备)或20μg(用于插入子制备)而制备载体和插入子。以Klenow DNA聚合酶对DNA末端的修饰和以牛肠磷酸酶的脱磷酸化根据制备商的指南而完成。载体DNAs和插入子经琼脂糖凝胶电泳而分离并按Maniatis等所述以DEAE-膜NA 45纯化(Schleicher& Schuell)。连接在含30mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，300-400ng载体DNA，100-200ng插入DNA及1Weiss单位的T4 DNA连接酶的20μl体系中完成。在室温连接2～4小时后，用7.5μl连接反应液转化CaCl2感受态的大肠杆菌JM109(Maniatis)。转化混合物铺板于SOBAG平板且在37℃培养过夜。通过限制性分析鉴定正确的克隆且以自动双脱氧测序(应用生物系统)进行核实。PCR产物的限制性酶切扩增以后通过琼脂糖凝胶电泳检查每个反应中适当大小带的存在。一个或两个100μl每个PCR反应的PCR反应混合物，PCR.I-PCR.X(图20-29)，总共约含有2-4μg DNA产物经酚-氯仿抽提，氯仿抽提及乙醇沉淀。DNA沉淀以70％乙醇洗2次且允许干燥。下一步，在指定温度和体积的下面混合物中，在过量限制性酶存在下，将PCR产物酶切过夜(18小时)。PCR.I50mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl2，50mM NaCl，4mM亚精胺，0.4μg/ml BSA，4μl(＝40U)SacI，4μl(＝40U)BstEII，37℃，总体积为100μl。PCR.II10mM Tris-醋酸pH7.5，10mM MgAc2，50mM KAc(1דOne-Phor-All”缓冲液ex Pharmacia)，4μl(＝48U)SfiI，50℃矿物油存在下50μl总体积。经过夜酶切以后，PCR.II-SfiI通过加入16μl H2O，30μl 10דOne-Phor-All”缓冲液(Pharmacia)(100mM Tris-醋酸pH7.5，100mM MgAc2，500mM Kac)4μl(＝4U)EcoRI，用EcoRI进行酶切。PCR.III10mM Tris-醋酸pH7.5，10mM MgAc2，50mM KAc(1דOne-Phor-All”缓冲液{Pharmacia})，4μl(＝40U)NheI，4μl(＝40U)SalI，在37℃100μl的总体积中。PCR.IV20mM Tris-醋酸pH7.5，20mM MgAc2，100mM KAc(2דOne-Phor-All”缓冲液{Pharmacia})，4μl(＝40U)XhoI，4μl(＝40U)EcoRI，在37℃100μl的总体积中。PCR.V20mM Tris-醋酸pH7.5，20mM MgAc2，100mM KAc(2דOne-Phor-All”缓冲液{Pharmacia})，4μl(＝40U)SalI，4μl(＝40U)EcoRI，在37℃100μl的总体积中。PCR.VI10mM Tris-醋酸pH7.5，10mM MgAc2，50mM KAc(1דOne-Phor-All”缓冲液{Pharmacia})，4μl(＝48U)SfiI，在矿物油存在下50℃50μl的总体积中。经过夜酶切以后，通过加入41μlH2O，5μl 10דOne-Phor-All”缓冲液(Pharmacia)(100mMTris-醋酸pH7.5，100mM MgAc2，500mM KAc)和4μl(＝40U)NheI后以NheI酶切PCR-VI-SfiI。PCR.VII50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM MgCl2，50mM NaCl，4mM亚精胺，0.4μg/ml BSA，4μl(＝40U)NheI，4μl(＝40U)BstEII，在37℃100μl的总体积中。PCR.VIII20mM Tris-醋酸pH7.5，20mM MgAc2，100mM KAc(2דOne-Phor-All”缓冲液{Pharmacia})，4μl(＝40U)EcoRI，在37℃50μl的总体积中。经过夜消化后，通过加入46μl H2O和4μl(＝40U)XhoI而以XhoI酶切PCR.VIII-EcoRI(37℃过夜)。PCR.IX25mM Tris-醋酸，pH7.8，100mM KAc，10mM MgAc，1mM DTT(1דMulti-Core”缓冲液{Promega})，4μl亚精胺，0.4μg/ml BSA 4μl(＝40U)NheI，4μl(＝40U)BstEII，在37℃100μl的总体积中。PCR.X50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM MgCl2，50mM NaCl，4mM亚精胺，0.4μg/ml BSA，4μl(＝40U)PstI，4μl(＝40U)EcoRI，在37℃100μl的总体积中。酶切的PCR片段PCR.I-SacI/BstEII， PCR.II-SfiI/EcoRI，PCR.III-NheI/SacI， PCR.IV-XhoI/EcoRI，PCR.V-SalI/EcoRI， PCR.VI-SfiI/NheI，PCR.VII-BstEII/NheI，PCR.VIII-XhoI/EcoRI，PCR.IX-BstEII/NheI，与 PCR.X-PstI/EcoRI按Maniatis等描述以DEAE-膜NA 45(Schleicher & Schuell)在1.2％的琼脂糖凝胶中加以纯化。纯化的片段以100-150ng/μl的浓度溶于H2O中。pGOSA双头表达载体的构建pGOSA.E的构建(见图8)包括产生4个中间构建体pGOSA.A到pGOSA.D(见图30-34)的好几个克隆步骤。设计最终的表达载体pGOSA.E及上面表1中的寡核苷酸以使大多数特异性克隆进入最终的pGOSA.E构建体(图9)。上游VH区域可用以寡核苷酸PCR.51和PCR.89(见上表1)而获得的任意PstI-BstEII VH基因片段来替代。设计寡核苷酸DBL.3和DBL.4(见上表1)以在VH基因片段中引入SfiI和NheI限制性位点，从而允许这些VH基因片段克隆进入SfiI-NheI位点作为下游的VH区域。所有以寡核苷酸PCR.116和PCR.90(见上表1)而获得的VL基因片段可作为SacI-XhoI片段而被克隆进入VL.3418基因片段的位置。然而这里的困难是在VH.3418基因片段中存在内部的ScaI位点。设计寡核苷酸DBL.8和DBL.9(见上表1)以允许将VL基因片段作为SalI-NotI片段而克隆进入VL.4715基因片段的位置。仅具有一个或不具有接头序列的pGOSA.E的衍生物pGOSA.V，pGOSA.S及pGOSA.T在新的接头位点具有一些异常的限制性位点。不具接头的VHA-VHB构建体缺乏5′VHB SfiI位点。用寡核苷酸DBL.10或DBL.11及DBL.4(见上表1)将VHB片段作为BstEII/NheI片段而克隆进入这些构建体。不具接头的VLB-VLA构建体缺乏5′VLA SalI位点。用寡核苷酸DBL.11与DBL.9(见上表1)将VLA片段作为XhoI/EcoRI片段而克隆进入这些构建体。
在下面的描述中提到以下的接头，它们也存在于序列表中(Gly4Ser)3接头，存在于SEQ ID NO2的109-123氨基酸及SEQID NO10的121-135氨基酸，(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头(＝接头A)，存在于SEQ ID NO12的121-139氨基酸，及(Gly4Ser)3Gly4Val接头(＝接头V)，存在于SEQ ID NO13的108-122氨基酸。pGOSA.A该质粒既来自Fv.4715-myc构建体又来自scFv.4715-myc构建体。
在编码(Gly4Ser)3接头的DNA序列与编码scFv.4715-myc构建体VL(见图30)的基因片段之间导入了SfiI限制性位点。这通过用在编码(Gly4Ser)3接头DNA与VL.4715基因片段之间含有SfiI位点的PCR-IBstEII/SacI片段(图20)替换后者构建体的BstEII-SacI片段而完成。SfiI位点的引入也在(Gly4Ser)3接头和VL.4715之间引入了4个额外的氨基酸(AlaGlySerAla)，得到(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头(接头A)。设计用于产生PCR-I(DBL.1与DBL.2，见上表1)的寡核苷酸与VH.4715框架-3区域的序列相匹配并分别结合到编码(Gly4Ser)3接头的DNA与VL.4715基因片段的接头处。这样pGOSA.A可表示为pelB-VH4715-接头A-(SfiI)-VL4715-myc。pGOSA.B该质粒来自质粒Fv.3418(见图31)。去除具有终止密码子的包括编码VL框架-4DNA 3′-端的质粒Fv.3418的XhoI-EcoRI片段且以PCR-IV XhoI/EcoRI片段(图23)替代。设计用于产生PCR-IV(DBL.6和DBL.7，见上表1)的寡核苷酸从而准确地与VL与(Gly4Ser)3接头(DBL.6)接头处的序列相匹配，并且能够在pUR.4124(DBL.7)中结合到(Gly4Ser)3接头与VH的接头处。DBL.7去除了VH中的PstI位点无义突变且在(Gly4Ser)3接头与VH，接头处引入了SalI限制性位点，因而以Val残基替换了接头的最后一个Ser，得到(Gly4Ser)2-Gly4Val接头(接头V)。这样pGOSA.B可表示为pelB-VH3418+pelB-VL3418-接头V-(SalI-EcoRI)pGOSA.C该质粒含有由(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头将其连接到VH.3418上(见图32)的编码VH.4715的DNA，即pelB-VH4715-接头A-VH3418。该构建体通过以含有VH.3418基因(见图21)的PCR-II SfiI/EcoRI片段替换pGOSA.A中编码VL.4715的SfiI-EcoRI片段而获得。用于产生PCR-II(DBL.3与DBL.4，见上表1)的寡核苷酸分别杂交于编码VH.3418基因的框架-1和框架-4区域。设计DBL.3以去除PstI限制性位点(无义突变)并且在VH基因上游引入SfiI限制性位点。DBL.4破坏了框架-4区域的BstEII限制性位点且在终止密码子下游引入了NheI限制性位点。pGOSA.D该质粒含有包括VH.3418基因与编码VL.3418 DNA的双顺反子操纵子，后者由接头(Gly4Ser)2Gly4Val将其连接到VL.4715(见图33)，即pelB-VH3418+pelB-VL3418-接头V-VL4715。该构建体通过以SalI-EcoRI酶切质粒pGOSA.B并插入含VL4715基因的PCR-V SalI/EcoRI片段(图24)而获得。设计用于获得PCR-V(DBL.8与DBL9，见上表1)的寡核苷酸以分别与VL.4715基因的框架-1区域和框架-4区域的核苷酸序列相匹配。DBL.8去除了框架-1区域的SalI位点(无义突变)且在VL.4715基因的上游导入SalI限制性位点。DBL.9破坏了VL.4715基因框架-4区域的XhoI限制性位点(无义突变)并且在终止密码子下游导入NotI与EcoRI限制性位点。pGOSA.E该质粒含有双顺反子的操纵子，其中包括编码VH.4715的DNA通过(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头连接到VH.3418加上编码VL.3418的DNA通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头连接到VL.4715上(见图34)，即pelB-VH4715-接头A-VH3418+pelB-VL3418-接头V-VL4715。两个翻译单位通过核糖体结合位点及编码pelB导肽序列的DNA而相连接。该质粒通过三点连接而获得，即通过混和从pGOSA.D经去除编码PstI-SalI插入子的VH3418而得到的载体与含有连接到VH.3418上的VH.4715的PstI-NheI pGOSA.C插入子以及PCR-III NheI/SacI片段(见图22)。剩下的PstI-SalI pGOSA.D载体含有VH.3418框架-1区域的5′端直至PstI限制性位点以及从VL.3418 SacI限制性位点起始的VL.3418通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头连接到VL.4715上。PstI-NheIpGOSA.C插入子含有从VH.4715中框架-1区域里的PstI限制性位点起始的VH.4715通过(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头连接到VH.3418上。NheI-SacI PCR-III片段提供了核糖体结合位点及用于VL.3418-(Gly4Ser)2Gly4Val-VL.4715构建体的编码pelB导肽序列的DNA。设计用于产生PCR-III的寡核苷酸DBL.5及PCR.116(见上表1)从而和Fv.4715中VL.4715核糖体结合位点的上游序列相匹配且导入NheI限制性位点(DBL.5)，并且与VL.3418(PCR.116)的框架-4区域相匹配。pGOSA.V该质粒来自pGOSA.E(见图35)，将pGOSA.E中含编码接头A-VH.3418的DNA的BstEII/NheI片段切除且代替以含VH.3418基因(见图26)的PCR-VII BstEII/NheI片段。得到的质粒pGOSA.V含有VH.3418直接连接到VH.4715的框架-4区域，及VL.4715通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头连接到VL.3418的框架-4区域，即pelB-VH4715*VH3418+pelB-VL3418-接头V-VL4715。pGOSA.S该质粒来自pGOSA.E(见图36)，将pGOSA.E中的(Gly4Ser)2Gly4Val-VL4715 XhoI/EcoRI片段切除并且代替以含VL.4715(见图27)的PCR-VIII XhoI/EcoRI片段。得到的质粒pGOSA.S含有VH.4715通过(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头连接到VH.3418上及VL.3418直接连接到VL.4715框架-1区域的5′端，即pelB-VH.4715-接头A-VH.3418+pelB-VL.3418*VL.4715。pGOSA.T该质粒含有双顺反子操纵子，它由VH.3418直接连接到VH.4715框架-4区域及VL.3418直接到VL.4715(见图37)框架-1区域的5′端而组成。两个转录单位通过核糖体结合位点及pelB导肽序列而相连，即pelB-VH.4715*VH.3418+pelB-VL.3418*VL.4715。该构建体通过将含有直接连接到VL.4715框架-1区域的5′端的VL.3418的pGOSA.S中NheI/EcoRI片段插入到其中含通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头而连接到VL.4715的VL.3418的NheI/EcoRI片段被去除的pGOSA.V载体中而获得。实施例6.其它双顺反子构建体pGOSA.G，和pGOSA.J，pGOSA.Z，pGOSA.AA及pGOSA.AB制备的详细描述pGOSA.G该质粒是用于pGOSA.J合成的中间体。它来自pGOSA.E，将pGOSA.E中的VH4715 PstI/BstEII片段切除并且代替以VH3418 PstI/BstEII片段(从Fv.3418中切下的)。得到的质粒pGOSA.G(见图38)含有通过(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头而连接的2拷贝的VH.3418，及VL.4715通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头连接到VL.3418框架-4区域上，即pelB-VH.3418-接头A-VH.3418+pelB-VL.3418-接头V-VL.4715。pGOSA.J该质粒含有由(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头将其连接到VH.4715的VH.3418及由(Gly4Ser)2Gly4Val接头将其连接到VL.4715的VL.3418所组成的双顺反子操纵子。两个转录单位通过核糖体结合位点及pelB异肽序列(见图39)而相连，即pelB-VH.3418-接头A-VH.4715+pelB-VL.3418-接头V-VL.4715。
该构建体通过将含VH4715(图25)的PCR-VI Sfi/NheI片段插入到其中的SfiI/NheI VH3418片段被切除的pGOSA.G载体中而获得。pGOSA.Z该质粒来自其中的(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头-VH3418 BstEII/NheI片段被切除并代替以含VH.4715(图28)的PCR-IX BstEII/NheI片段的pGOSA.G。得到的质粒pGOSA.Z(见图40)含有直接连接到VH.4715框架-1区域的VH.3418，与通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头连接到VL.3418框架-4区域的VL.4715，即pelB-VH.3418*VH.4715+pelB-VL.3418-接头V-VL.4715。pGOSA.AA该质粒含有由直接连接到VH.4715框架-1区域的5′端的VH.3418及直接连接到VL.4715框架-1区域的5′端的VL.3418所组成的双顺反子操纵子。两个转录单位通过核糖体结合位点与pelB异肽序列而相连(见图41)。该构建体通过将含直接连接到VL.4715框架-1区域5′端的VL.3418的pGOSA.T NheI/EcoRI片段插入到其中的含由接头(Gly4Ser)2Gly4Val将其连接到VL.4715上的VL.3418的NheI/EcoRI片段被去除的载体pGOSA.Z中而获得，即pelB-VH.3418*VH.4715+pelB-VL.3418*VL.4715。pGOSA.AB该质粒来自通过三点连接反应的pGOSA.J(见图42)。去除含部分VH.3418和全部(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头-VH.4715及VL.3418-(Gly4Ser)2Gly4Val-VL.4715编码序列的SacI/EcoRI插入子并且代替以含VH.3418相同部分和全部(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头-VH.4715的SacI/SacI pGOSA片段及含有直接连接到VL.4715(见图37)框架-1区域的VL.3418的SacI/EcoRI pGOSA.T片段。得到的质粒含有通过(Gly4Ser)3AlaGlySerAla接头连接到VH.4715框架-1区域5′端的VH.3418及直接连接到VL.4715框架-1区域5′端的VL.3418，即pelB-VH.3418-接头A-VH.4715+pelB-VL.3418*VL.4715。实施例7.单顺反子构建体pGOSA.L与pGOSA.Y，及pGOSA.C，pGOSA.X，pGOSA.AC以及pGOSA.AD制备的详细描述pGOSA.L该质粒来自其中的含编码VH.4715-(Gly4Ser)3AlaGlySerAla-VH.3418的DNA的HindIII/NheI片段被去除的pGOSA.E(见图43)。载体的DNA末端以Klenow DNA聚合酶补平并且连接。得到的质粒pGOSA.L含有通过(Gly4Ser)2Gly4Val接头而连接到VL.4715框架-1区域的5′端的VL.3418，即pelB-VL.3418-接头V-VL.4715。pGOSA.Y该质粒来自pGOSA.T，其中含编码VH.4715-VH.3418 DNA的HindIII/NheI片段被去除(见图44)。载体的DNA末端用Klenow DNA聚合酶补平并且连接。得到的质粒pGOSA.Y含有直接连接到VL.4715框架-1区域5′端的VL.3418，即pelB-VL.3418*VL4715。pGOSA.C的制备已在上面的实施例5中给出；它可表示为pelB-VH.4715-接头A-VH.3418。pGOSA.X该质粒来自pGOSA.T，其中的含编码VL.3418-VL.4715的DNA的NheI/EcoRI片段被去除。载体的DNA末端用Klenow DNA聚合酶补平且连接。得到的质粒pGOSA.X(见图45)含有直接连接到VH.3418框架-1区域5′端的VH.4715，即pelB-VH.4715*VH.3418。pGOSA.AC该质粒来自pGOSA.Z，其中的含编码VL.3418-(Gly4Ser)2Gly4Val-VL.4715 DNA的NheI/EcoRI片段被去除(见图46)。载体DNA的末端用Klenow DNA聚合酶补平且连接。得到的质粒pGOSA.AC含有直接连接到VH.4715框架-1区域5′端的VH.3418，即pelB-VH.3418*VH.4715。pGOSA.AD该质粒通过将含编码VH.3418-(Gly4Ser)3AlaGlySerAla-VH.4715(见图29)DNA的PstI/EcoRI PCR.X片段插入到其中的PstI/EcoRIFv.4715-myc插入子被去除的Fv.4715-myc载体(见图47)而获得，即pelB-VH.3418-接头A-VH.4715。
这些单顺反子构建体可用两个不同的质粒而用于转化相同的宿主或转化两个不同的宿主，从而可与两个连续VL分开来产生两个连续的VH。得到结果的评价GOSA双头的双功能结合活性在该说明书中描述了双链蛋白复合物的构建，其中一条链由两条重链V-区所组成且另一条链由两条相应轻链V-区所组成。可变区或直接连接或通过多肽接头连接。在本发明书提供了这些类型分子(“双头”)含有用于产生这些多功能抗体片段Fv的两个抗原结合特异性的证据。图12显示用来自表达针对这些抗原的抗体的杂交瘤的抗体片段，GOSA.E可用于特异性地定向葡萄糖氧化酶到好几个血链球菌菌株上。图12进一步显示了抗-血链球菌scFv 4715的精确特异性在GOSA.E双头中得以保存。接头和V-区相对位置对双头活性的影响在证明“交叉双头”方法(VHA-VHB+VLB-VLA)产生有活性的双特异分子之后，便研究了这些构建体中V-区相对位置的重要性。构建两种可能的位置方向(GOSA.E＝VHA-接头A-VHB+VLB-接头V-VLA与GOSA.J＝VHB-接头A-VHA+VLB-接头V-VLA)并且测试双特异活性，尽管通过分子模型构建表明通过构型VHB-VHA+VLB-VLA(GOSA.J)中第二个(下游/C-末端)V-区而形成的结合位点在结合细胞表面大蛋白抗原时处于不利的位置。然而，令人惊奇的是，实验发现下游的结合位点实际上是可以利用的。虽然已发现重链和轻链的相对位置对观察到的反应性有影响，两个测试过的组合物均表现出双特异性活性，其中的“交叉”组合物(GOSA.E＝VHA-VHB+VLB-VLA)与证明是用于A＝抗-Strep和B＝抗-Gox的组合物VHB-VHA+VLB-VLA(GOSA.J)相比显示出更高水平的反应性。
分子模型构建VHB-VHA+VLB-VLA(＝GOSA.J)的构型进一步表明，仅仅当连接接头保持足够长(跨度30～35)时，蛋白链方可折叠从而两个结合位点可完全利用。
预测其中的接头长度不很关键的“交叉”构型VHA-VHB+VLB-VLA(GOSA.E)会得到一个两个结合位点面向相反方向的复合物而没有构型VHB-VHA+VLB-VLA(GOSA.J)中所表现出来的限制。
从VHA-VHB链中去除可弯曲的多肽接头仅会对“交叉”构型(GOSA.V＝VHA*VHB+VLB-VLA)双头结合血链球菌和葡萄糖氧化酶的能力产生极小的影响。然而，去除VHB-VHA+VLB-VLA构型(GOSA.Z＝VHB*VHA+VLB-VLA)分子中VHB-VLA链里可弯曲的多肽接头导致其结合血链球菌和葡萄糖氧化酶能力的剧烈下降。
与两条重链区之间没有可弯曲多肽接头的“交叉”构型(GOSA.V)双头相比，其中通过分子模型构建预测得到的分子是有活性的，为了使两个结合位点可充分利用，从VLB-VLA链中去除可弯曲的接头便不能模型构建。ELISA结果证实两条轻链区之间没有接头的VHB-VHA+VLB-VLA构型(GOSA.AB)中双头仅表现出极小的血链球菌和葡萄糖氧化酶结合活性。令人吃惊的是，删除“交叉”构型(GOSA.S)中双头里VLB-VLA链中的可弯曲接头对得到的分子的双特异活性仅具有较小的影响。与从两条轻链区之间没有可弯曲接头的双头中预期的分子模型构建结果一样，为了可完全得到两个结合位点，去除双头分子中两个可弯曲的多肽接头便不能作模型构建。根据用GOSA.AB构建体获得的ELISA结果，没有任意接头(GOSA.AA)的VHB-VHA+VLB-VLA构型(GOSA.AA)中的双头对任何血链球菌与葡萄糖氧化酶仅表现出极小的结合活性。令人吃惊的是，当与具有2个接头的“交叉”构型中的双头活性相比，没有任何接头的“交叉”构型(GOSA.T＝VHA*VHB+VLB*VLA)中的双头仍然表现出对血链球菌与葡萄糖氧化酶25～50％的双特异结合活性。
因此本工作的结论是作模型构建可给出一些提示，但计算机程序不可能预言什么是可能的和什么是不可能的。从作模型构建预测中还发现好几个偏差。用一句古谚语来解释理论是完美的但实验才是终极真理。GOSA双头的敏感性与通过仍可检测到的固定于固相板(solid phase)的最低浓度的血链球菌抗原检测结果一样，用ELISA形式证明GOSA.E双头的敏感性至少与IgG-葡萄糖氧化酶偶合物敏感性一致。GOSA双头作为二聚体而产生与ELISA测定结果一样，以部分亲和-纯化的GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S与GOSA.T样品的FPLC分析通常仅给出一个GOSA双头活性峰(图16-19)。该峰在洗脱图谱中的位置表明GOSA双头的分子量为40-50kD。由于该分子量相当于预期的VH2+VL2双头二聚体的分子量，得出GOSA.E，GOSA.V，GOSA.S与GOSA.T主要作为二聚体分子而产生的结论。偶尔观察到表观分子量≈200kD的活性峰(图16)。葡萄糖氧化酶活性在这些级份中的存在表明这些级份含有混以葡萄糖氧化酶的GOSA双头。GOSA双头的体外装配已证明都在一个细胞中的双功能活性二聚体GOSA分子可通过翻译一个双顺反子信使(GOSA.E，GOSA.S，GOSA.T，GOSA.V，GOSA.J，GOSA.AB，GOSA.AA与GOSA.Z)而产生。此外，当混合产分离GOSA亚单位培养物上清时便形成高水平的血链球菌与葡萄糖氧化酶双特异结合活性(见实施例7)。在这些混合实验中观察到的接头及单个VH-区相对位置对血链球菌和葡萄糖氧化酶双特异性结合活性的影响与双顺反子构建体类似。上述的构建体小结于下面的表2中。表2A描述了没有进一步测试的中间构建体。表2B描述了双顺反子构建体。表2C描述了单顺反子构建体。
(LiA)代表VH-VH接头(Gly4Ser)3AlaGlySerAla(＝接头A)(LiV)代表VL-VL接头(Gly4Ser)2Gly4Val(＝接头V)(*)表示两个重链区域或两个轻链区不通过连接接头而融合在一起。
表2表2AGOSA.A VH.4715-LiA-(SfiI)-VL.4715-mycGOSA.B VH.3418-LiV-VL.3418-(SalI/EcoRI)GOSA.D VH.3418+VL.3418-LiV-VL.4715GOSA.G VH.3418-LiA-VH.3418+VL.3418-LiV-VL.4715表2BGOSA.E VH.4715-LiA-VH.3418+VL.3418-LiV-VL.4715GOSA.S VH.4715-LiA-VH.3418+VL.3418*VL.4715GOSA.T VH.4715*VH.3418+VL.3418*VL.4715GOSA.V VH.4715*VH.3418+VL.3418-LiV-VL.4715GOSA.J VH.3418-LiA-VH.4715+VL.3418-LiV-VL.4715GOSA.ABVH.3418-LiA-VH.4715+VL.3418*VL.4715GOSA.AAVH.3418*VH.4715+VL.3418*VL.4715GOSA.Z VH.3418*VH.4715+VL.3418-LiV-VL.4715表2CGOSA.L VL.3418-LiV-VL.4715GOSA.Y VL.3418*VL.4715GOSA.ADVH.3418-LiA-VH.4715GOSA.ACVH.3418*VH.4715GOSA.C VH.4715-LiA-VH.3418GOSA.X VH.4715*VH.3418参考文献专利文献-EP-0281604；GENEX/ENZON单个多肽链结合分子；优先权日期86年9月2日。-WO93/11161；ENZON，INC；多价抗原-结合蛋白；优先权日期91年11月25日。-WO94/09131；SCOTGEN LIMITED；重组特异性结合蛋白；优先权日期92年10月15日。-WO94/13804(剑桥抗体技术/医学研究委员会；多价和多特异性结合蛋白，它们的生产和用途；最初优先权日期92年12月4日。-WO94/13806；DOW化工公司；多价单链抗体；优先权日期92年12月11日。-WO94/25591；UNILEVER N.V.，UNILEVER PLC，Hamers，R.，Hamers-Casterman，C.，& Muylaermans，S；源自骆驼科免疫球蛋白重链的抗体或其(活化的)片段的产生；最初优先权日期93年4月29日。非专利文献-Anthony，J.，Near，R.，Wong，S.L.，Iida，E.，Ernst，E.，Wittekind，M.，Haber，E.与Ng，S-C；分子免疫学。29(1992)1237-1247，在大肠杆菌中稳定的抗-地高辛Fv的生产。-Berry，M.J.和Davies，J.；层析杂志(J.Chromatography)597(1992)239-245；抗体片段在免疫吸附层析中的应用Fv片段，VH片段及paralog肽的比较。-Better，M.，Chang，C.P.，Robinson，R.R与Horwitz A.H.；科学240(1988)1041-1043；大肠杆菌活性嵌合抗体片段的分泌。-Bird，R.E.，Hardman，K.D.，Jacobson，J.W.，Johnson，S.，Kanfman，B.M.，Lee，S.M.，Lee，T.，Pope，S.H.，Riordan，G.S.和Whitlow，M.；科学242(1988)423-426；单链抗原-结合蛋白。-Carter，P.，Kelley，R.F.，Rodrigues，M.L.，Snedecor，B.，Covarrubias，M.，Velligan，M.D.，Wong，W.L.T.，rowland，A.M.，Kotts，C.E.，Carver，M.E.，Yang，M.，Bourell.J.H.，Shepard，H.M.和Henner，D.；生物/技术(BIO/TECHNOLOGY)10(1992)163-167；双价人工抗体片段在大肠杆菌中高水平的表达和生产。-Cumber，A.J.，Ward，E.S.，Winter，G.，Parnell，G.D.和Wawrzynczak.E.J.；免疫学杂志。149-(1992)120-126；重组鼠抗体FvCys片段与bisFvCys偶合物体外与体内一致的稳定性。-Firek，S.，Draper，J.，Owen.M.R.L.，Gandecha，A.，Cockburn，B.，与Whitelam，G.C.；植物分子生物学。23(1993)861-870；有功能的单链Fv蛋白在转基因烟草植物和细胞悬浮培养物中的分泌。-Givol，D.；分子免疫学。28(1991)1379；抗体最小的抗原结合片段-Fv片段。-Hamers-Casterman，C.，Atarhouch，T.，Muyldermans，S.，Robrnson，G.，Hamers，C.，Bajyana Songa，E.，Bendahman，N.与Hamers，R.；自然363(1993)446-448；缺少轻链的自然发生抗体。-Hiatt，A.，Cafferkey，R.与Bowdish，K.；自然342(1989)76-78；在转基因植物中抗体的生产。-Holliger，P.，Prospero，T.，与Wrnter，G.；美国国家科学院院报(PNAS)90(1993)6444-6448；“双价抗体”小的双价和双特异性抗体片段。-Horwitz，A.H.，Cheng，C.P.，Better，M.，Hellstrom，K.E.和Robinson，R.R.；美国科学院院报85(1988)8678-8682；酵母细胞功能性抗体与Fab片段的分泌。-Huston，J.S.，LeVinson，D.，Mudgett-Hunter，M.，Tai，M-S.，Novotny，J.，Margolies，M.N.，Ridge，R.J.，Bruccoleri，R.E.，Haber，E.，Crea，R.和Oppermann，H.，美国国家科学院院报。85(1988)5879-5883；抗体结合位点的蛋白质工程大肠杆菌中产生的抗-地高辛单链Fv类似物特异性活性的恢复。-Kostelny，S.A.，Cole，M.S.和Tso，J.Y.；免疫学杂志。148.(1992)1547-1553；通过亮氨酸拉链的使用而形成的双特异性抗体。-Mallender，W.D.，与Voss，Jr，E.W.；生物化学杂志。269(1994)199-206；双价双特异性单链抗体的构建，表达和活性。-Mitstein，C.和Cuello，A.C.；自然，305(1983)537-540；杂交瘤及其在免疫组化中的应用。-Nyyssnen，E.，Penttill，M.，Harkki，A.，Saloheimo，A.，Knowles，J.K.C.和Kernen，S.；生物/技术(BIO/TECHNOLOGYBIO/fech)。11(1993)591-595；抗体片段在丝状真菌Trichodermareesei中的有效生产。-Owen，M.，Gandecha，A.，Cockburn，B.和Whitelam G.，生物/技术10(1992)790-794；在转基因烟草中有功能的抗-植物色素单链Fv蛋白的合成。-Pack，P.和Plückthun，A.；生物化学31(1992)1579-1584；微小抗体(Miniantibodies)用双亲和性单环(Amphiphatic Helices)在大肠杆菌中产生具有高亲和性的有功能的可弯曲连接的二聚体Fv片段。-Skerra，A.和Plückthun，A.；科学，240(1988)1038-1041；大肠杆菌中有功能免疫球蛋白Fv片段的装配。-Taub，R.，Gould，R.J.，Ciccarone，T.M.，Hoxie，J.，Friedman，P.A.，Shattrl，S.J.，和Garsky，V.M.；生物化学杂志。264(1989)259-265；抗血小板纤维蛋白原受体的单克隆抗体含有类似于纤维蛋白原中受体识别区的序列。-Ward，E.S.，Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P.T.和Winter G.；自然341(1989)544-546；大肠杆菌分泌的所有单个免疫球蛋白可变区的结合活性。-Williams，W.V.，Moss，D.A.，Kieber-Emmons，T.，Cohen，J.A.，Myers，J.N.，Weiner，D.B.和Greene，M.I.；美国国家科学院院报。86(1989)5537-5541；根据抗体结构开发具有生物活性的肽。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名Unilever PLC(B)街道Unilever House，Blackfriars(C)城市伦敦(E)国家英国(F)邮政编码EC4P 4BQ(GB)(A)姓名Unilever N.V.
(B)街道Weena 455(C)城市鹿特丹(E)国家荷兰(F)邮编NL-3013AL(A)姓名Paul James DAVIS(B)街道The Hawthorns，Pavenham Road(C)城市Felmersham(bedfordshire)(E)国家英国(F)邮编MK43 7EX(GB)(A)姓名Cornelis Paul Erik van der LOGT(B)街道1 Bluebell Rise(Peverel Manor Estate)(C)城市Rushden(Northamptonshire)(E)国家英国(F)邮编NN10 OTU(GB)(A)姓名Martine Elisa VERHOEIJEN(B)街道1 Tintagel Close(Manor Farm Estate)(C)城市Rushden(Northamptonshire)(E)国家英国(F)邮编NN10 ONP(GB)
(A)姓名Steve Wilson(B)街道3 Aldenham Close(Goldington)(C)城市Bedford(E)国家英国(F)邮编MK41 OFQ(GB)(ii)发明题目双特异性或双价抗体片段类似物(iii)序列数31(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，#1.30版(EPO)(v)当前申请数据申请号EP95307332.7(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度737个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“具有合成接头的cDNA区域”(vii)直接来源(B)克隆pUR 4124 EcoRI-HindIII插入子(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置11..730(D)其它信息/产物＝“VLlys-GS-VHlys”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置11..334
(D)其它信息/产物＝“VLlys”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置335..379(D)其它信息/产物＝“(Gly4Ser)3接头”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置380..727(D)其它信息/产物＝“VHlys”(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATTCGGCC GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTT TCT GCG 49Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala1 5 10TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT97Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile15 20 25CAC AAT TAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG145His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln30 35 40 45CTC CTG GTC TAT TAT ACA ACA ACC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG193Leu Leu Val Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg50 55 60TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAT TCT CTC AAG ATC AAC AGC241Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser65 70 75CTG CAA CCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG AGT289Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser80 85 90ACT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG GGT337Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly95 100 105GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG CAG GTG385Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val110 115 120 125CAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCG CCC TCA CAG AGC CTG433Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu130 135 140TCC ATC ACA TGC ACC GTC TCA GGG TTC TCA TTA ACC GGC TAT GGT GTA481Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val145 150 155AAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGA ATG 529Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met160 165 170ATT TGG GGT GAT GGA AAC ACA GAC TAT AAT TCA GCT CTC AAA TCC AGA 577Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg175 180 185CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTA AAA ATG 625Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met190 195 200 205AAC AGT CTG CAC ACT GAT GAC ACA GCC AGG TAC TAC TGT GCC AGA GAG 673Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu210 215 220AGA GAT TAT AGG CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 721Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val225 230 235TCC TCA TGA TAAGCTT 737Ser Ser *240(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度240个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val35 40 45Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly100 105 110Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln115 120 125Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr130 135 140Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val145 150 155 160Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly165 170 175Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile180 185 190Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu195 200 205His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Tyr210 215 220Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser *225 230 235240(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度920个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“具有合成接头的cDNA区域”(vii)直接来源(B)克隆Fv.3418 HindIII-EcoRI插入子(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置36..443(D)其它信息/产物＝“pelB-VH3418”(ix)特征(A)名称/键Sig肽(B)位置36..101(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置102..440(D)其它信息/产物＝“VH3418”(ix)特征(A)名称/键CDS
(B)位置495..884(D)其它信息/产物＝“pelB-VL4318”(ix)特征(A)名称/键Sig肽(B)位置495..560(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置561..881(D)其它信息/产物＝“VL3418”(xi)序列描述SEQ ID NO3AAGCTTGCAA ATTCTATTTC AAGGAGACAG TCATA ATG AAA TAC CTA TTG CCTMet Lys Tyr Leu Leu Pro-22 -20ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCC 101Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala-15 -10 -5CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTA AAG CCT GGG GCT 149Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT AGC TAT 197Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30GTT ATG CAC TGG GTG AAA CAG AAG CCT GGG CAG GGC CTT GAG TGG ATT 245Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GAT GGT ACT AAG TAC AAT GAG AAG TTC 293Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60AAA GGC AAG GCC ACA CTG ACT TCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC 341Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACC TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT 389Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95TCA AGA CGC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC 437Ser Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser100 105 110TCA TAA TAAGAGCTAT GGGAGCTTGC ATGCAAATTC TATTTCAAGG AGACAGTCAT 493Ser *A ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC539Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu-22 -20 -15 -10GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCC GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA TCT 587Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser-5 1 5TCC ATG TAT GCA TCT CTA GGA GAG AGA ATC ACT ATC ACT TGC AAG GCG 635Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala10 15 20 25AGT CAG GAC ATT AAT ACC TAT TTA ACC TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGG 683Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly30 35 40AAA TCT CCC AAG ACC CTG ATC TAT CGT GCA AAC AGA TTG CTA GAT GGG 731Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly45 50 55GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG CAA GAT TAT TCT CTC 779Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu60 65 70ACC ATC AGC AGC CTG GAC TAT GAA GAT ATG GGA ATT TAT TAT TGT CTA 827Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu75 80 85CAA TAT GAT GAG TTG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAG ATC 875Gln Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile90 95 100 105AAA CGG TAA TAATGATCAA ACGGTATAAG GATCCAGCTC GAATTCLys Arg *(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度136个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu-5 1 5 10Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly15 20 25Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly30 35 40Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr45 50 55Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys60 65 70Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp75 80 85 90Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly95 100 105Thr Thr Val Thr Val Ser Ser *110(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度130个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser-5 1 5 10Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser15 20 25Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys30 35 40Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val45 50 55Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr60 65 70Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln75 80 85 90Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys95 100 105Arg *(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度999个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“具有合成接头的cDNA区”(vii)直接来源(B)克隆Fv.4715-myc HindIII-EcoRI插入子(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置40..468(D)其它信息/产物＝“pelB-VH 4715”(ix)特征(A)名称/键sig肽(B)位置40..105(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置106..465(D)其它信息/产物＝“VH 4715”(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置520..963(D)其它信息/产物＝“pelB-VL 4715-myc”(ix)特征(A)名称/键sig肽(B)位置520..585(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置586..927(D)其它信息/产物＝“VL 4715”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置928..960
(D)其它信息/产物＝“myc-tag”(xi)序列描述SEQ ID NO6AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG 54Met Lys Tyr Leu Leu-22 -20CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG102Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met-15 -10 -5GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GGA GAC TTA GTG AAG CCT GGA150Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 1015GGG TCC CTG ACA CTC TCC TGT GCA ACC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGT198Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser20 25 30TAT GCC TTT TCT TGG GTC CGC CAG ACC TCA GAC AAG AGT CTG GAG TGG246Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Ser Leu Glu Trp35 40 45GTC GCA ACC ATC AGT AGT ACT GAT ACT TAT ACC TAT TAT TCA GAC AAT294Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn50 55 60GTG AAG GGG CGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GGC AAG AAC ACC CTG342Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu65 70 75TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC390Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr80 85 90 95TGT GCA AGA CAT GGG TAC TAT GGT AAA GGC TAT TTT GAC TAC TGG GGC438Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA TAA TAAGAGCTAT GGGAGCTTGC 488Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser *115 120ATGCAAATTC TATTTCAAGG AGACAGTCAT A ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG 540Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr-22 -20GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCC GAC588Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp-15 -10 -5 1ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA TTC TCC CTG ACT GTG ACA GCA GGA GAG636Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu5 10 15AAG GTC ACT ATG AAT TGC AAG TCC GGT CAG AGT CTG TTA AAC AGT GTA684Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asn Ser Val20 25 30AAT CAG AGG AAC TAC TTG ACC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGG CAG CCT732Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45CCT AAA CTG TTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA GTC CCT780Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro50 55 60 65GAT CGC TTC ACA GCC AGT GGA TCT GGA ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC 828Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile70 75 80AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT GAT 876Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp85 90 95TAT ACT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAG ATC AAA 924Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110CGG GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAAGATCAAA973Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn *115 120 125CGGTAATAAG GATCCAGCTC GAATTC 999(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度143个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp-5 1 5 10Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly15 20 25Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp30 35 40Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr45 50 55Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn60 65 70Gly Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp75 80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser *110 115 120(2)信息SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度148个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser-5 1 5 10Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Gly15 20 25Gln Ser Leu Leu Asn Ser Val Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr30 35 40Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser45 50 55Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly60 65 70Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala75 80 85 90Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly95 100 105Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu110 115 120Asp Leu Asn *125(2)信息SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度924个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“具有合成接头的cDNA区”(vii)直接来源
(B)克隆scFv.4715-myc HindIII-EcoRI插入子(ix)特征(A)名称/键sig肽(B)位置40..105(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置106..465(D)其它信息/产物＝“VH 4715”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置466..510(D)其它信息/产物＝“(Gly4Ser)3-接头”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置511..852(D)其它信息/产物＝“VL 4715”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置853..885(D)其它信息/产物＝“myc-tag”(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置40..888(D)其它信息/产物＝“pelB-VH4715-(Gly4Ser)3-VL4715-myc”(xi)序列描述SEQ ID NO9AAGCTTGCAT GCAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG 54Met Lys Tyr Leu Leu-22 -20CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG 102Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met-15 -10 -5GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GGA GAC TTA GTG AAG CCT GGA 150Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15GGG TCC CTG ACA CTC TCC TGT GCA ACC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGT 198Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser20 25 30TAT GCC TTT TCT TGG GTC CGC CAG ACC TCA GAC AAG AGT CTG GAG TGG 246Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Ser Leu Glu Trp35 40 45GTC GCA ACC ATC AGT AGT ACT GAT ACT TAT ACC TAT TAT TCA GAC AAT 294Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn50 55 60GTG AAG GGG CGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GGC AAG AAC ACC CTG 342Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu65 70 75TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC 390Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr80 85 90 95TGT GCA AGA CAT GGG TAC TAT GGT AAA GGC TAT TTT GAC TAC TGG GGC 438Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA 486Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA 534Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro130 135 140TTC TCC CTG ACT GTG ACA GCA GGA GAG AAG GTC ACT ATG AAT TGC AAG 582Phe Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys145 150 155TCC GGT CAG AGT CTG TTA AAC AGT GTA AAT CAG AGG AAC TAC TTG ACC 630Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asn Ser Val Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr160 165 170 175TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGG CAG CCT CCT AAA CTG TTG ATC TAC TGG 678Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp180 185 190GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GCC AGT GGA 726Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly195 200 205TCT GGA ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC 774Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp210 215 220CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT GAT TAT ACT TAT CCG TTC ACG TTC 822Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe225 230 235GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG GAA CAA AAA CTC ATC TCA 870Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser240 245 250 255GAA GAG GAT CTG AAT TAA TAAGATCAAA CGGTAATAAG GATCCAGCTC GAATTC 924Glu Glu Asp Leu Asn * 46260(2)信息SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度283个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp-5 1 5 10Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly15 20 25Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp30 35 40Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr45 50 55Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn60 65 70Gly Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp75 80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly110 115 120Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu125 130 135Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val140 145 150Thr Met Asn Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asn Ser Val Asn Gln155 160 165 170Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys175 180 185Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg190 195 200Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser205 210 215Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr220 225 230Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Glu235 240 245 250Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn *255 260(2)信息SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度1706个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“具有合成接头的cDNA”(vii)直接来源(B)克隆pGOSA.E的HindIII-EcoRI插入子(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置40..864(D)其它信息/产物＝“pelB-VH4715-LiA-VH3418”(ix)特征(A)名称/键sig肽(B)位置40..105(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置106..465(D)其它信息/产物＝“VH4715”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置466..522(D)其它信息/产物＝“接头A(Gly4Ser)3AlaGlySerAla”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置523..861(D)其它信息/产物＝“VH3418”(ix)特征
(A)名称/键CDS(B)位置913..1689(D)其它信息/产物＝“pelB-VL3418-Liv-VL4715”(ix)特征(A)名称/键sig肽(B)位置913..978(D)其它信息/产物＝“果胶酶”(ix)特征(A)名称/键mat肽(B)位置979..1299(D)其它信息/产物＝“VL3418”(ix)特征(A)名称/键misc RNA(B)位置1300..1344(D)其它信息/产物＝“接头V(Gly4Ser)2GlyVal”(ix)特征(A)名称/键；mat肽(B)位置1345..1686(D)其它信息/产物＝“VL4715”(xi)序列描述SEQ ID NO11AAGCTTGCAT GGAAATTCTA TTTCAAGGAG ACAGTCATA ATG AAA TAC CTA TTG 54Met Lys Tyr Leu Leu-22 -20CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA GCG ATG 102Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met-15 -10 -5GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCA GGG GGA GAC TTA GTG AAG CCT GGA 150Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15GGG TCC CTG ACA CTC TCC TGT GCA ACC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGT 198Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser20 25 30TAT GCC TTT TCT TGG GTC CGC CAG ACC TCA GAC AAG AGT CTG GAG TGG 246Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Ser Leu Glu Trp35 40 45GTC GCA ACC ATC AGT AGT ACT GAT ACT TAT ACC TAT TAT TCA GAC AAT 294Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn50 55 60GTG AAG GGG CGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GGC AAG AAC ACC CTG 342Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Leu65 70 75TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC 390Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr80 85 90 95TGT GCA AGA CAT GGG TAC TAT GGT AAA GGC TAT TTT GAC TAC TGG GGC 438Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA 486Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GCC GGT TCG GCC CAG GTC CAG CTG 534Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gln Val Gln Leu130 135 140CAA CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTA AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATG 582Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met145 150 155TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC ACT AGC TAT GTT ATG CAC TGG 630Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp160 165 170 175GTG AAA CAG AAG CCT GGG CAG GGC CTT GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT 678Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr180 185 190CCT TAC AAT GAT GGT ACT AAG TAC AAT GAG AAG TTC AAA GGC AAG GCC 726Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala195 200 205ACA CTG ACT TCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGC 774Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser210 215 220AGC CTG ACC TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT TCA AGA CGC TTT 822Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Arg Phe225 230 235GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACC GTC ACC GTC TCC TCA TAA 864Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser *240 245 250TAAGCTAGCG GAGCTGCATG CAAATTCTAT TTCAAGGAGA CAGTCATA ATG AAA TAC921Met Lys Tyr-22 -20CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA 969Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro-15 -10 -5GCG ATG GCC GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA TCT TCC ATG TAT GCA1017Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala1 5 10TCT CTA GGA GAG AGA ATC ACT ATC ACT TGC AAG GCG AGT CAG GAC ATT1065Ser Leu Gly Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile15 20 25AAT ACC TAT TTA ACC TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGG AAA TCT CCC AAG1113Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys30 35 40 45ACC CTG ATC TAT CGT GCA AAC AGA TTG CTA GAT GGG GTC CCA TCA AGG1161Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg50 55 60TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG CAA GAT TAT TCT CTC ACC ATC AGC AGC1209Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser65 70 75CTG GAC TAT GAA GAT ATG GGA ATT TAT TAT TGT CTA CAA TAT GAT GAG1257Leu Asp Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu80 85 90TTG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG GGT GGA1305Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly95 100 105GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA GTC GAC ATC GAA1353Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Asp Ile Glu110 115 120 125CTC ACT CAG TCT CCA TTC TCC CTG ACT GTG ACA GCA GGA GAG AAG GTC1401Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val130 135 140ACT ATG AAT TGC AAG TCC GGT CAG AGT CTG TTA AAC AGT GTA AAT CAG1449Thr Met Asn Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asn Ser Val Asn Gln145 150 155AGG AAC TAC TTG ACC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGG CAG CCT CCT AAA1497Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys160 165 170CTG TTG ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA GTC CCT GAT CGC1545Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg175 180 185TTC ACA GCC AGT GGA TCT GGA ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT1593Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser190 195 200 205GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT GAT TAT ACT1641Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Thr210 215 220TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GAA ATC AAA CGG TAA1689Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg *225 230 235TAAGCGGCCG CGAATTC 1706(2)信息SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度275个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp-5 1 5 10Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly15 20 25Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp30 35 40Lys Ser Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Thr Asp Thr Tyr Thr45 50 55Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn60 65 70Gly Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp75 80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly110 115 120Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ser125 130 135Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly140 145 150Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser155 160 165 170Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp175 180 185Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys190 195 200Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala205 210 215Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr220 225 230Cys Ser Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val235 240 245 250Ser Ser *(2)信息SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度259个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser-5 1 5 10Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser15 20 25Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys30 35 40Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val45 50 55Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr60 65 70Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln75 80 85 90Tyr Asp Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys95 100 105Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val110 115 120Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly125 130 135Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu Asn Ser140 145 150Val Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln155 160 165 170Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val175 180 185Pro Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr190 195 200Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn205 210 215Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile220 225 230Lys Arg *235(2)信息SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.1(xi)序列描述SEQ ID NO14CACCATCTCC AGAGACAATG GCAAG 25(2)信息SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.2(xi)序列描述SEQ ID NO15GAGCGCGAGC TCGGCCGAAC CGGCCGATCC GCCACCGCCA GAGCC 45(2)信息SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.3(xi)序列描述SEQ ID NO16CAGGATCCGG CCGGTTCGGC CCAGGTCCAG CTGCAACAGT CAGGA 45(2)信息SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度53个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.4(xi)序列描述SEQ ID NO17CTACATGAAT TCGCTAGCTT ATTATGAGGA GACGGTGACG GTGGTCCCTT GGC 53(2)信息SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.5
(xi)序列描述SEQ ID NO18TAATAAGCTA GCGGAGCTGC ATGCAAATTC TATTTC 36(2)信息SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.6(xi)序列描述SEQ ID NO1923ACCAAGCTCG AGATCAAACG GGG(2)信息SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.7(xi)序列描述SEQ ID NO20AATGTCGAAT TCGTCGACTC CGCCACCGCC AGAGCC 36(2)信息SEQ ID NO21的信息(i)序列特征
(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.8(xi)序列描述SEQ ID NO21ATTGGAGTCG ACATCGAACT CACTCAGTCT CCATTCTCC39(2)信息SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度50个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.9(xi)序列描述SEQ ID NO22TGAAGTGAAT TCGCGGCCGC TTATTACCGT TTGATTTCGA GCTGGTCCC 50(2)信息SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸
(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.10(xi)序列描述SEQ ID NO23CGAATTCGGT CACCGTCTCC TCACAGGTCC AGTTGCAACA G 41(2)信息SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL. 11(xi)序列描述SEQ ID NO24CGAATTCTCG AGATCAAACG GGACATCGAA CTCACTCAGT CTCC 44(2)信息SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物DBL.12(xi)序列描述SEQ ID NO25CGAATTCGGT CACCGTCTCC TCACAGGTGC AGTTGCAGGA G 41(2)信息SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物PCR.51(xi)序列描述SEQ ID NO2622AGGTSMAMCT GCAGSAGTCW GG(2)信息SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物PCR.89(xi)序列描述SEQ ID NO27TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CC 32(2)信息SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物PCR.90(xi)序列描述SEQ ID NO2822GTTAGATCTC GAGCTTGGTC CC(2)信息SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)说明/desc＝“合成DNA”(vii)直接来源(B)克隆引物PCR.116(xi)序列描述SEQ ID NO29GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA24(2)信息SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO30Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln1 5 10(2)信息SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO31Lys Leu Glu Ile Lys Arg Asp Ile Glu Leu Thr Gln1 5 10
权利要求
1.包括含有两条多肽链结合复合物的双特异性或双价抗体片段类似物，其中的一条多肽链包括两个连续的重链可变区(VH)且另一条多肽链包括两个连续的轻链可变区(VL)，并且结合复合物含有两对可变区(VH-A∥VL-A和VH-B∥VL-B)。
2.根据权利要求1的抗体片段类似物，其中的一条多肽链包括连接到第二个VH上的第一个VH且另外一条多肽链包括连接到第二个VL上的第一个VL。
3.根据权利要求2的抗体片段类似物，其中两个VH没通过中间肽接头而彼此直接连接。
4.根据权利要求2的抗体片段类似物，其中两个VL没通过中间肽接头而彼此直接连接。
5.根据权利要求3或权利要求4的抗体片段类似物，其中一条多肽链包括直接连接到第二个VH上的第一个VH，且另一条多肽链包括直接连接到第二个VL上的第一个VL。
6.根据权利要求2的抗体片段类似物，其中的两个VH通过肽接头而彼此相连接且两个VL也通过肽接头而彼此相连接，每个肽接头包括至少一个氨基酸残基。
7.根据权利要求6的抗体片段类似物，其中的一条多肽链包括连接有第二个VH(VH-B)的第一个VH(VH-A)且另一条多肽链包括连接有第二个VL(VL-B)的第一个VL(VL-A)，并且其中的两个VH通过肽接头(LiH)而彼此相连接，即[VH-A*LiH*VH-B]，且两个VL也通过肽接头(LiL)而彼此相连接，即[VL-A*LiL*VL-B]，每个肽接头包括至少10个氨基酸残基。
8.根据权利要求2的抗体片段类似物，其中的一条多肽链包括通过或不通过连接肽接头(LiH)而连接有第二个VH(VH-B)的第一个VH(VH-A)，即[VH-A*(LiH)*VH-B]，并且另一条多肽链包括通过或不通过连接肽接头(LiL)而连接有第二个VL(VL-B)的第一个VL(VL-A)，即[VL-B*(LiL)*VL-A]。
9.根据权利要求1的抗体片段类似物，其中的两个可变区不同而导致双特异性的抗体片段类似物。
10.根据权利要求1的抗体片段类似物，其中的特异性A和B是相同的而导致双价抗体片段类似物。
11.根据权利要求1的抗体片段类似物在包括诊断技术的免疫分析、凝集分析、对适于治疗的组合物的纯化方法，或其它可用免疫球蛋白或其片段的方法中的用途。
12.用于产生根据权利要求1-10中任意一项的抗体片段类似物的方法，其中包括(1)通过掺入具有或没有连接肽接头的编码两个连续VH的DNA和具有或没有连接肽接头的编码两个连续VL的DNA进入宿主而转化宿主。(2)在已形成连接的VH与连接的VL的条件下培养该转化宿主，并且(3)在双头抗体片段类似物形成的条件下允许两个连接的VH与两个连接的VL彼此结合，以及(4)任选收集双头抗体片段类似物。
13.产生根据权利要求1-10中任意一项的抗体片段类似物的方法，其中包括(1)通过掺入具有或没有连接肽接头的编码两个连续VH的DNA进入第一个宿主而转化该第一个宿主，(2)通过掺入具有或没有连接肽接头的编码两个连续VL的DNA进入第二个宿主而转化该第二个宿主。(3)在连接的VH和连接的VL分别形成的条件下培养第一个和第二个转化的宿主。(4)任选单独收集两个连接的VH和两个连接的VL，和(5)在它们能形成双头抗体片段类似物的条件下结合连接的VH与连接的VL。
14.根据权利要求12或13的方法，其中的宿主选自格兰氏阴性细菌(如，大肠杆菌)和格兰氏阳性细菌(如，枯草杆菌或乳酸菌)的原核微生物有机体、包括酵母(如属于酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属(Hansenula))及霉菌(如，属于曲霉属、脉孢菌属或木霉属)的低等真核微生物有机体、及高等真核有机体(如，植物)或细胞培养物(如，杂交瘤)。
全文摘要
本发明涉及包括含有两条多肽链结合复合物的双特异性或双价抗体片段类似物,其中一条多肽链包括两个连续的重链可变区(V
文档编号C12P21/08GK1173878SQ96191802
公开日1998年2月18日 申请日期1996年8月14日 优先权日1995年10月16日
发明者P·J·戴维斯, C·P·E·范德洛格特, M·E·维赫尔詹, S·威尔逊 申请人:尤尼利弗公司