专利名称：用于高温氧化的嗜热甲胺氮营养菌的制作方法
技术领域：
本申请涉及合成甲烷单加氧酶的嗜热细菌(甲胺氮营养菌)有机体的共生体。该共生体在甲烷存在时形成并在高于50℃的温度下起作用。该有机体的共生体可用于降解有机污染物并用于化学物质，尤其是立体专一性异构体的合成。
背景技术：
称为甲胺氮营养菌的厌氧微生物群体已用来降解有机污染物。该有机体群体合成单加氧酶，能氧化甲烷，并且在此酶合成后无甲烷时，该酶将随机氧化其它化合物，如卤化的碳氢化合物，烃类，醇类等。
由使用甲胺氮营养菌的共代谢降解的多个优势污染物之一是三氯乙烯(TCE)，三氯乙烯是在金属加工，干洗和镀膜工业中广泛使用的有机溶剂。由于泄漏，溢出和排出，常常在地下土壤环境中发现TCE。TCE也是在危险废物处最常见的污染物之一。TCE和其他氯化碳氢化合物是地下水中常见的污染物。大多数治理土壤和含水层的污染的尝试涉及使用泵或真空装置以将污染物运到表面处理。这些方法的结果是有限地去除污染物。现有技术的实际应用非常昂贵而且一般没有操作的终点。当实际应用现有技术的治理方法时，涉及水电导率，土块，解吸附作用和残余物饱和或污染物贮存的限制存在真正的问题。
由Casagrande发展的电动方法已用于使土壤脱水。这个方法也用于从土壤和含水层去除污染物。这个方法利用直流电(直流电场)引发水的移动并使离子溶解作为转运污染物的方法。这种方法仅仅在污染物适当溶于水时有效(例如苯，甲苯，二甲苯，酚和氯化溶剂)。而且，电动方法的结果是污染物的转运，而不是降解。因此在土壤中的电动应用仅仅提供对土壤和水污染问题不完全的解决方法。H。运用电动方法使用装有颗粒状活性碳(GAC)的盒子移动并俘获对-硝基苯酚(PNP)。然而，涉及除去和处理污染的盒子的问题仍未解决。
发明概述本发明是培养基中嗜热甲胺氮营养菌有机体的共生体，包括在50℃到80℃温度下该共生体的繁殖，上述共生体主要包括卵圆形或杆状有机体。此共生体可以注入到土壤或水中以降解污染物，尤其碳氢化合物和取代的碳氢化合物。发明详述本发明提供嗜热甲胺氨营养菌的共生体，此共生体用于降解污染物，尤其是土壤和地下水中发现的污染物。共生体将在超过50℃的温度下生长并使污染物代谢。本发明的共生体可以与电动方法一起使用以减轻环境污染，尤其地下水和土壤的污染。使用水力传送方法如电动力学将污染物收集到含共生体的处理区域(remediation zone,RZ)。共生体已在美国典型培养物保藏中心(在Rockville,Maryland,U.S.A)保存，并得到ATCC号55945。
本发明的共生体也可以在现有技术的工业发酵过程中使用。这些过程包括将含纤维素的物质捣成浆状并再利用以生产中间产物和终产物，如醇类，其改进是工序可以在更高的温度下进行。这也包括从烃类生产醇类及形成环氧化物和有用中间产物。本发明的共生体也可用于降解醇类，如甲醇。材料和方法嗜热甲胺氮营养菌共生体的形成嗜热甲胺氮营养菌共生体从在黄石国家公园收集的土壤和水样品中得到。从中得到共生体的样品最初来自艺术家绘画作品汇集区(ArtistPaint Port area)和方解石泉(the Calcite Springs)。方解石泉是公园中仅有的两个天然油泉之一，并与温泉相连。取样区域的温度在46℃到78℃的范围内变动。样品通过邮件隔夜运到实验室。
5g样品放入60ml血清小瓶中，并在其中加入20ml改进的硝酸矿物盐(MNMS)培养基[Bowman和Sayler，生物降解51-11(1994)]。改进的MNMS培养基在1升去离子水中含有2mM NaNO3,2mM磷酸缓冲液pH(6.8),50μM FeCl3·6H2O,50μM MgSO4·7H2O,10μg/LD型生物素和0.5μg/L维生素B12。小瓶用TEFLONTM线型连续瓶塞密封。排空小瓶内气体，加入含3％甲烷的气体，在50℃,60℃,70℃或80℃培养箱中静置培养。(温度的选择以采集时原始样品的温度为基础。)在培养期间，在空气/培养基接触面形成菌膜。培养后，收获菌膜。收获的菌膜结合在一起以提供单一的共生体。
负染后，用透射电镜(TEM)拍摄共生体。共生体培养物在55℃生长，150rpm混合。旋转离心后，将在离心管中得到的细胞放置于喷碳铜网上，然后用2％磷钨酸染色。然后观察细胞并用Jeol 1200 EXⅡTEM以20，000×到50,000×的放大倍数拍摄。大部分细胞看起来很小并呈卵圆形或杆状。在很多细胞中可看到内膜圆盘。这样的结构是Ⅱ型甲胺氮营养菌的典型结构。
甲胺氮营养菌一般是生长缓慢的有机体。这些嗜热甲胺氮营养菌生长非常缓慢。正如所测试的，需双倍时间，在最适条件下在20到30天之间变动。在60°-70℃观察到的生长比50°或80℃更好(以前描述甲胺氮营养营仅在最高45℃的温度下生长。)因此，共生体表现了在真正嗜热温度下生长的独特能力。然而，在70℃和80℃下，萘酚的产率(暗示了TCE降解)低得多。也发现，正如以下在实施例中描述的，加入新鲜培养基恢复旧培养物的可溶甲烷单加氧酶活性(sMMO)。这个发现暗示培养基的缺乏和抑制产物随着时间产生。
实施例进行一些研究以确定共生体对于TCE降解和可溶甲烷单加氧酶活性(sMMO)的最适生长温度。共生体在装有300ml改进MNMS培养基的1升带侧壁的培养瓶中生长。培养瓶密封并排空气体。每天向培养物供应合3％甲烷的气体。培养物在50℃,60℃,70℃和80℃的几种不同温度水浴中静置培养。定期地进行培养物取样。样品在培养箱中冷却到24℃之后，培养物的生长情况用600nm分光光度法测定。为测定TCE降解率，根据在Bowman和Saylar[生物降解5:1-11(1994)]中描述的一般方法测定萘酚的产率，除了试验是在与其生长相同的温度水浴中静置进行。嗜热甲胺氮营养菌共生体降解TCE在嗜热温度下TCE的降解使用培养物进行，培养物在来自NewBrunswick Scientific公司，New Brunswich,New Jersey的培养箱/摇床上生长。培养物于55℃和150rpms生长。用压缩气排除培养物的气体之后，将5ml培养物加入到15个60ml血清小瓶中。作为对照，将5ml无菌MNMS加入60ml血清小瓶中。每个小瓶加入TCE溶液以使血清小瓶中TCE终浓度到大约0.5μg/l。将小瓶倒置，并放回培养箱/摇床。培养5天后，测定并比较TCE浓度。MNMS和L培养基的摇瓶培养物的耐热生长和萘酚的产生培养物按如上所述准备，除了一部分样品含L培养基，L培养基包含2g/l NaNO3,0.2g/ml MgSO4·7H2O,0.001g/l FeSO4·7H2O,0.21g/lMa2PO4,0.09g/l NaH2PO4,0.04g/l KCl,0.015g/l CaCl2和1ml贮备液，在每0.1升贮备液中包含0.5mg CuSO4·5H2O,1mg H3BO3,1mgMnSO4·7H2O,7mg ZnSO4·7H2O和1mg MoO3。培养物于55℃,150rpm在培养箱/摇床中摇瓶生长。生长情况和1-萘酚的产生如上所述测定。产生萘酚的测试在55℃同样摇床上进行。
作为测试结果，发现对于TCE降解(从sMMO活性数据表明)的最适温度看来在50℃和60℃之间。既然使用静置生长培养物得到了嗜热共生体的结果，那么积极混合的含共生体的培养物也在55℃生长并同样得到测定。比较在L和MNMS培养液中生长的嗜热甲胺氮营养菌共生体培养物的生长情况和sMMO活性。发现嗜热共生体在MNMS中比在L培养基中生长得更好。如果比较快速混合和静置生长下的生长率，静置生长的生长率看来是混合的几乎两倍。因为甲烷和氧气在水环境中溶解度低，快速混合可能增加这些气体在培养基中的保留时间。
在两种培养基中生长的细胞也表现了非常不同的sMMO活性。当细胞在L培养液中生长时，没有活性。L培养液中含有铜，缺少活性可能是由于培养液中的铜的抑制活性(典型的Ⅱ型甲胺氮营养菌已知是铜敏感的。)无甲烷加入时萘酚的产率在停止加入甲烷后，测定上面使用的培养物的可溶甲烷单加氧酶活性(sMMO)的稳定性。将培养物排空气体，培养瓶密封并放回到培养箱/摇床中，但不加入甲烷。每天根据以上所述测定sMMO活性。观察到sMMO活性增加两天，随后如果不加甲烷则下降。因此，如果在治理区域使用此共生体，两天后通过加入甲烷置换或复原是有益的。复原可以通过在合适间隔时间向RZ注入甲烷进行。(当在发酵过程中使用共生体，如果甲烷不是此过程的产物，应考虑加入甲烷。然而，因为一些工业发酵过程导致甲烷产生，所以不需要加入甲烷。)当其生体细胞固定在ISOLITETM时共生体的sMMO活性sMMO活性率的研究使用固定在ISOLITETM上的共生体细胞完成，ISOLITETM是用于固定细胞和土壤通气的硅藻土产品(78％SiO2,12％Al2O3和5％Fe2O3)。这是一种不吸附TCE的惰性材料。ISOLITETM预先在去离子水中洗涤去除脏物，然后在120℃烤箱中烘干48小时。300ml MNMS培养液中的20天的共生体样品加入到培养瓶中150g ISOLITETM上。培养瓶放置到培养箱/摇床(20rpm,55℃)上两周以使细胞结合到ISOLITETM上。然后从ISOLITETM上去除水相。然后1g接种材料在测量从萘产生萘酚的试验中使用。
当使用接种的ISOLITETM时，在sMMO测试中，发现固定的共生体细胞以10μm/小时/g ISOLITMTM的速率从萘产生萘酚。上述表明这些固定细胞可以用于在土壤中降解TCE。ISOLITETM不吸附TCE并且不俘获TCE。因此，如果在RZ中使用ISOLITETM，可以简单地通过改变受到治理的物质中放置的电极极性将TCE送回并通过RZ直到生物降解。
在存在TCE时，使用培养物的早期生长状态检测使用嗜热共生体的TCE降解。此培养物在55℃,150rpm摇瓶生长。实验对照仅装有MNMS培养基并加入TCE。在55℃温育5天后，TCE浓度的测量结果表明在有嗜热甲胺氮营养菌的小瓶中TCE显著降解。对照平均有0.47μg/lTCE，处理的小瓶平均为0.03μg/l。结果是，TCE浓度出现94％的减少。使用方差检定的一元分析结果表明，嗜热菌降解与对照的明显差异在0.05α水平。
本发明的共生体也可以在生物过滤器中使用以降解工业废物，包括液体和挥发性废物。
如此处说明的，共生体产生单加氧酶。而且，通过现有技术的方法，可能从共生体得到其他细胞酶，包括蛋白水解酶，DNA聚合酶，脂肪酶，纤维素酶，等。
权利要求
1．甲胺氮营养菌的共生体，此共生体在50℃到80℃表现最适生长，而且在甲烷存在的情况下生长后降解三氯乙烯和萘。
2．权利要求1的共生体，在经过发酵的组合物中。
3．权利要求1的共生体，在治理区域(Remediation Zone)内。
4．权利要求1的共生体，在生物过滤器中。
5．权利要求1的共生体，在含甲烷的培养基中。
6．降解污染物的方法包括以下步骤1)制备权利要求1的组合物，2)将权利要求1的组合物加入到含环境污染物的混合物中，3)将在步骤2中得到的混合物在至少50℃的温度下生长以降解污染物。
7．权利要求6的方法，其中包含污染物的混合物在治理区域内。
8．权利要求7的方法，其中将甲烷加入治理区域以促进生长。
9．权利要求1的共生体，其中最适生长在50℃和60℃之间得到。
10．在生长培养基中包含权利要求1的共生体的物质组合物。
11．权利要求10的组合物，其中生长培养基含有甲烷。
12．权利要求11的组合物，其中存在于培养基中的甲烷浓度是大约3％。
13．通过将要氧化的化合物暴露于权利要求1的共生体进行高温(高于50℃)氧化的方法。
14．权利要求13的方法，其中氧化的化合物是烃类，醇类或卤化物。
15．通过培养权利要求1的共生体生产酶的方法。
16．权利要求15的方法，其中生产的酶至少是蛋白水解酶，DNA聚合酶，脂肪酶，纤维素酶之中的一种。
17．权利要求15的方法，其中生产的酶是单加氧酶。
全文摘要
本发明是培养基中嗜热甲胺氮营养菌有机体的共生体,包括在50℃到80℃的温度下该共生体的繁殖,上述共生体主要包括卵圆形或杆状有机体。此共生体可以注入到土壤或水中以降解污染物,尤其碳氢化合物和取代的碳氢化合物。
文档编号C12N9/00GK1219920SQ97194899
公开日1999年6月16日 申请日期1997年4月25日 优先权日1996年4月26日
发明者S·J·威斯帕, W·J·戴维斯－霍夫尔 申请人:美国环境保护署