植物生长和发育的遗传调控的制作方法

专利名称：植物生长和发育的遗传调控的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生长和/或发育的遗传调控和与之有关的基因的克隆和表达。更详细地讲，本发明涉及普通小麦(Triticum Aestivum)Rht基因和来自其它物种的同源物的克隆和表达，以及这些基因在植物中的用途。
对影响包括开花等的植物生长和发育的遗传机制的了解，提供给人们改变靶植物特性的方法。对生长和/或发育特征的操作会使之有利的物种包括所有的农作物，重要的例子有禾谷类，在较温和气候带大概最具农艺重要性的水稻和玉米，以及在更温和气候带的小麦、大麦、燕麦和黑麦。产籽的重要农作物是油菜(oil seed rape)和canola、玉米、向日葵、大豆和高粱。许多收获其根部的作物当然每年从种子开始生长，且任何种类种子的生产非常依赖于植物开花、传粉和结籽的能力。在园艺上，控制包括开花等生长和发育的时间很重要。可控制其开花的园艺植物包括莴苣、菊苣和包括甘蓝、硬茎花椰菜及花椰菜的蔬菜类芸苔属(brassicas)以及康乃馨和天竺葵。一方面矮生植物和另一方面在大小上较高植物，还包括树、种植园作物和草，可能在各个园艺活农业方面是有利和/或被人们所期望。
近数十年来，由于将半矮生的Rht部分同源等位基因(homeoallele)引入育种程序，小麦谷粒的产量大幅度增加。这些增幅使得小麦产出能够与增长的世界人口的需求相持平。以前，我们描述了拟南芥属(Arabidopsis)gai等位基因的克隆(John Innes Centre InnovationsLimited于1997年2月12日提交并于1998年8月14日公开为WO97/29123的国际专利申请PCT/GB97/00390，其全文通过引用加入到本发明中)，象小麦(单子叶植物)中的Rht突变等位基因一样，拟南芥gai等位基因赋予拟南芥属(双子叶植物)半显性的矮生表型和对植物生长激素赤霉素(GA)反应性降低。gai编码突变蛋白(gai)，该突变蛋白缺乏在野生型(GAI)蛋白的N-端附近的17个氨基酸残基区段。该区段的序列在水稻cDNA序列(EST)中高度保守。在此我们表明，该cDNA作图至已知含有Rht基因座重叠禾谷类基因组图谱的短部分上，并我们用该cDNA分离出小麦的Rht基因。象拟南芥属和小麦属的基因组一样广泛趋异的基因组应该携有保守序列，该保守序列一旦突变，则影响GA的反应性，这揭示了在整个植物界中该序列在GA信号传递中保守的作用。进而，Rht的克隆使得可以将其转移至许多不同的作物物种中，目的就是达到象之前在小麦上获得的产量的大幅提高。
将半矮生Rht部分同源等位基因(最初称为Norin10基因，来源于日本变种Norin10)导入优良的普通小麦育种系中，是对所谓的“绿色革命”最重要的贡献之一(Gale等，1985，小麦中的矮生基因，发表于植物育种进展，G.E.Russel(编辑)Butterworths，London第1-35页)。含有这些部分同源等位基因的小麦的产量总是高于缺乏这些基因的小麦，这种小麦现在占有世界小麦作物的80％左右。这种增产的生物学基础似乎为两点。首先，Rht等位基因所赋予的半矮生表型引起对倒伏(植物被风/雨打倒，使产量减少)的抗性增强。其次，这些等位基因引起光同化作用的重分配，使其更多地导向谷粒，而较少导向茎部(Gale等，1985)。在农民采用含有Rht的小麦期间，英国的小麦产量增产20％以上，这个事实表明这些特征对小麦产量有重要影响。
rht突变体矮生的原因是它们含有在遗传上显性的突变rht等位基因，该等位基因损害它们对赤霉素的反应(GA，一种内源性的植物生长调节剂)(Gale等，1976，Heredity 37283-289)。因此rht突变体的胚芽鞘不象那些野生型小麦植株的一样，对GA的应用不反应。另外，rht突变体积累生物活性GA的水平比在野生型对照中发现的要高(Lenton等，1987，小麦的赤霉素不敏感性和缺失-发育的结果，发表于植物发育中的激素作用-评论性评价。GV Hoad，JR Lenton，MB Jackson和RK Atkin(编辑)Butterworths，London第145-160页)。这些特征(遗传显性、退化的GA反应，以及高的内源性GA水平)为其它物种中的突变(玉米中的D8/D9，拟南芥中的gai)赋予的表型所共有的，这表明这些突变等位基因限定了这些不同物种中的定向进化同源基因；观察到在玉米和小麦的基因组中D8/D9和Rht是同线基因座，这进一步支持以上观点。
本发明一方面提供核酸分子，该核酸分子含有编码具Rht功能的多肽的核苷酸序列。术语“Rht功能”表明影响象小麦属的Rht基因一样的植物表型的能力。“Rht功能”在植物中通常观察为植物生长的压制、抑制、阻抑或减少，GA拮抗所述压制、抑制、抑压或减少。Rht表达往往赋予植物被GA所拮抗的矮生表型。
可以利用植物中来自编码具Rht功能的多肽的核苷酸序列的超量表达，赋予植物以经GA处理后可矫正的矮生表型。
本发明一方面还提供包含的核苷酸序列编码多肽的核酸分子，该多肽一旦表达，可赋予rht突变表型。与野生型相比较，rht突变植物是矮生的，这种矮生对GA不敏感。
在本文中，“Rht”(字母大写)用于指野生型功能，而“rht”(非大写)用于指突变型功能。
许多植物的生长过程和发育过程由已知为赤霉素(GA)的四环双萜类生长因子家族的特殊成员调控(Hooley，Plant Mol.Biol.26，1529-1555(1994))。赤霉素或GA是指具有如图5所示的基本碳环结构并有生物活性双萜类分子，即具有生物活性的赤霉素。
生物活性可定义为细胞伸长的刺激、叶片衰老、或禾谷类糊粉α-淀粉酶反应诱发中的一种或多种。在本领域有许多可利用的标准检测，其中任何一种或多种检测的阳性结果将受试赤霉素信号转化转化为生物活性(Hoad等，Phytochemistry 20，703-713(1981)；Serebryakov等，Phytochemistry 23，1847-1854(1984)；Smith等，Phytochemistry 33，17-20(1993))。
本领域现有的检测方法包括莴苣下胚轴分析、黄瓜下胚轴分析和燕麦第一片叶片分析，所有这些分析均根据应用的赤霉素引发各个组织伸长的能力测定生物活性。先前的检测是将测试合物用于缺乏赤霉素的植物上。这种优选的检测包括处理矮生的GA缺乏拟南芥属以决定生长、测定结间伸长的矮生豌豆分析、测定叶鞘伸长的Tan-ginbozu矮生水稻分析、以及也是测定叶鞘伸长的d5-玉米分析。延长生物检测测定各个器官中一般细胞伸长的效果，并未局限于特殊的细胞类型。
其它可利用的检测包括酸模属(Rumex)叶片衰老分析和禾谷类糊粉α-淀粉酶分析。谷粒胚乳周围的糊粉细胞萌发时分泌α-淀粉酶，可消化淀粉产生糖，用于植物生长。GA控制该酶的产生。给予生物活性GA的分离出的糊粉细胞，分泌α-淀粉酶，然后可以通过例如测定淀粉的降解而测出其活性。
对于高生物活性(显示为GA1、GA3、GA4和GA7)重要的结构特征是B环C-6上的羧基；C-19、C-10内酯；和C-3处的β-羟化作用。C-2处的β-羟化引起失活(显示为GA8、GA29、GA34和GA51)。rht突变体对GA处理无反应，例如用GA1、GA3或GA4处理。
用GA处理，优选以水溶液喷洒，例如可能每周或更频繁地用水溶液中10-4M的GA3或GA4喷洒；可以通过将小滴置于植株上而不是喷洒。也可以将GA溶解于诸如乙醇或丙酮的有机溶剂中施用，因为与水相比它们更易溶解于所述有机溶剂中，但由于这些溶剂倾向于破坏植物，所以并不主张这样做。如果采用有机溶剂，适合的配方包括将24ηl溶解于80％乙醇中的0.6、4.0或300mM GA3或GA4。诸如拟南芥属的植物可生长在含有GA的培养基上，例如用琼脂固化和含有补充GA的组培培养基(GM)。
按照本发明的核酸可以具有小麦属野生型Rht基因的序列，或者可以是所提供的序列的突变体、衍生物、变异体或等位基因。优选的突变体、衍生物、变异体或等位基因为这样的基因其编码的蛋白保留由野生型基因编码的蛋白的功能特性，特别是被GA拮抗的植物生长抑制能力，或赋予植物一种或多种对植物的GA处理有反应的其它特性的能力。其它优选的突变体、衍生物、变异体或等位基因编码的蛋白赋予rht突变表型，也就是说减缓植物生长，这种减缓对GA敏感，即不为承受GA处理的克服。所述核酸中一个或多个核苷酸的一个或多个添加、插入、缺失或置换，可以使序列改变，产生突变体、衍生物或变异体，导致所编码的多肽中一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或置换。当然，包括未造成所编码的氨基酸序列差异的核酸改变。
优选的Rht基因的核苷酸序列为编码图3b所示的RHT氨基酸序列的核苷酸序列，特别是编码图3a所示的Rht编码序列。优选的rht突变体缺少部分或全部图3b中下划线的17个氨基酸的序列和/或紧接其后的序列DVAQKLEQLE。
更优选的核苷酸序列编码示于本发明任何其它图中的氨基酸序列，特别是编码图中的编码序列。在本发明所有方面的其它实施方案中，运用编码图6b、7b、8b、9b、11b、11d或12b中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。这种编码序列可以如图6a、7a、8a、9a、11a、11c或12a中所示。
本发明还提供核酸构成物或载体，该构成物或载体含有具任何一种所提供的序列的核酸，优选可以表达可以从中由所述核酸序列编码多肽的构成物或载体。该构成物或载体优先适合于转化进植物细胞中。本发明还包括用这种构成物或载体转化的宿主细胞，特别是植物细胞。因此，提供了含有按照本发明核酸的宿主细胞，诸如植物细胞。可将该核酸引入该细胞的染色体中。每个单倍体基因组可以有一个以上的异源核苷酸序列。例如如下面将讨论的，这使得该基因产物的表达较之内源水平有所提高。
含有按照本发明核酸的构成物或载体不必包括启动子或其它调控序列，特别是如果要用该载体将所述核酸引入细胞中以将该基因重组入基因组时。但是，一方面本发明提供的核酸构成物含有与调控序列相连接以控制表达的Rht编码序列或rht编码序列(这包括来自非小麦属的同源物)，所述调控序列不同于那些与所述编码序列自然融合的调控序列，并优选为另一基因的调节序列或衍生于另一个基因。
按照本发明的核酸分子和载体可以是这样的分离物，它是从其自然环境分离而来，为大致纯或均质形式，或者是无或基本无目的物种或起源物种的、，编码能影响生长和/或发育(可能包括开花)的多肽的序列以外的核酸或基因，如普通小麦非Rht编码序列的核酸。术语“核酸分离物”包括全部或部分合成的核酸。
核酸自然可以是适合的双链或单链的，为cDNA或基因组DNA、RNA，可以是全部合成或部分合成的。当然，其中按照本发明的核酸包括RNA，对所示的序列的参考应该解释为包括U取代T的RNA相当物。
本发明还包括已公开的任何核酸序列的表达产物，以及在合适的条件和适当的宿主细胞中，通过编码核酸的表达而制备表达产物的方法。那些在本技术领域的专业人完全能够为重组基因表达产物的表达和回收而构建载体并设计方案。可以选择或构建合适的载体，该载体含有调控序列，包括适合的启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适合的序列。更具体的内容可参见如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》第二版，1989，冷泉港实验室出版社。转化步骤依采用的宿主而定，但均为常规方法。许多操作核酸的已知技术和方法，如制备核酸构成物、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达、蛋白质分析等，在John Wiley andSons(1992)的《分子生物学方案》第二版(Ausubel等编辑)一书中有详细叙述。先前在植物中使用较多并获得成功的具体方法和载体在Bevan，Nucl.Acids Res.(1984)12，8711-8721)和Guerineau和Mullineau，(1993)的植物转化和表达载体(Plant Molecular BiologyLabfax(Croy RRD ed)Oxford，BIOS Scientific Publishers，第121-148页)中有描述。Sambrook等和Ausubel等的公开内容以及所有其它本文提及的资料，通过引用加入到本发明中。
作为与聚组氨酸标签的融合体表达，使得可采用QIAGEN Inc.(美国)和DIAGEN GmbH(德国)的Ni-NTA树脂完成Rht或rht的纯化。参见Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8972-8976(1991)和EP-A-0253303和EP-A-0282042。Ni-NTA树脂对该蛋白的N-端或C-端接近的连续组氨酸具体高亲和性，所以可以用于从植物、植物部分或提取物或表达该蛋白的酵母或细菌(如大肠杆菌)的生物中纯化具组氨酸标记的Rht蛋白或rht蛋白。
纯化的Rht蛋白(如以重组方式由编码它们的核酸表达而产生)可用于以本领域的标准技术产生抗体。如以下进一步讨论的，可以利用抗体和含有抗体的抗原结合片段的多肽，从其它物种中鉴别同源物源物。
制备抗体的方法包括用该蛋白或其片段免疫一种哺乳动物(如灵长类、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊或猴子)。运用本领域已知的各种技术中的任何一种，都可以从接受免疫的动物中获得抗体，优选利用抗体和目的抗原的结合筛选抗体。例如，可采用蛋白质印迹技术或免疫沉淀法(Armitage等，1992，Nature 35780-82)。抗体可以是多抗或单抗。
作为免疫哺乳动物的替代办法或补充，具有适合的结合专一性的抗体可从用重组法产生的已表达免疫球蛋白可变域的文库获得，如采用λ噬菌体或在其表面呈现功能性免疫球蛋白结合域的丝状噬菌体；例如参见WO92/01047。
针对Rht或rht多肽而产生的抗体，可以用于鉴别和/或分离同源同源物多肽，继而分离编码的基因。因此，本发明提供鉴别或分离具Rht功能或能够赋予rht突变表型的多肽的方法，包括用含有抗体(例如整个抗体或其片段)的抗原结合域的多肽筛选侯选多肽，所述抗体能够与普通小麦Rht多肽或rht多肽结合，或优选对如具有图3b中的氨基酸序列的这种多肽具有结合特异性。
筛选的候选多肽，例如可以是用来自目的植物的核酸产生的表达文库的产物，或者是来自自然资源的纯化过程的产物。
可以分离发现与抗体相结合的多肽，然后进行氨基酸测序。可运用任何适合的技术对所述多肽进行全部或部分测序(例如可对所述多肽的一个片段测序)。例如如下文将讨论的，通过设计一个或多个寡核苷酸(如寡核苷酸的简并库)用作与侯选核酸杂交过程中的探针或引物，可以利用氨基酸序列信息，获得编码该多肽的核酸。
本发明再一方面提供从小麦属以外的植物物种中鉴别和克隆Rht同源物的方法，该方法采用源自图2或图3a或本文其它图中所示的核酸序列。可将源自这些序列的序列自身用于鉴别和克隆其它序列。可将本发明提供的核苷酸序列信息或其任何一部分用于数据库检索中，寻找同源序列、可用于检测Rht功能的表达产物。或者，用本专业领域技术人员众所周知的技术筛选核酸文库，然后检测从中鉴别出的同源序列。
例如，本发明还提供鉴别和/或分离Rht或rht同源物基因的方法，包括用编码具Rht功能的多肽或其片段或突变体、衍生物或等位基因的核酸作为探针，筛选出侯选(或“靶“)核酸。该侯选核酸(例如可以是cDNA或基因组DNA)可来源于任何可能含有或预期含有编码这种同源物的核酸的细胞或有机体。
在本发明这方面的一个优选实施例中，当作探针用于筛选侯选核酸的核酸编码示于图3b的氨基酸序列，为与编码序列互补的序列，或为任何这些序列的片段，最优选包含示于图3a中的核苷酸序列。
或者，如所讨论的，可利用对下述多肽测序而获得的氨基酸序列信息设计探针，所述多肽已鉴定为能够被能结合Rht或rht多肽(诸如具有图3b中所示的Rht氨基酸序列的多肽)的抗体的抗原结合域所结合。
用探针探测的优选条件是足够严格，使得产生简单的杂交图型，即仅有少数鉴别为阳性的杂交可以进一步进行调查。逐渐增强杂交严格性直至仅有少数阳性克隆留下，这是在本专业领域众所周知。
作为用探针探测的替代方法，虽然仍然采用核酸杂交，但设计用于从Rht基因扩增DNA序列的寡核苷酸，可以常规程序用于PCR或其它涉及核酸扩增的方法中。例如参见“PCR方案，方法和应用指南，”Innis等编著，1990，Academic Press，纽约。
适合用于探针或PCR引物设计的优选氨基酸序列是在Rht基因之间保守(完全、基本上或部分保守)的序列。
以氨基酸序列信息为基础，可以设计寡核苷酸探针或引物，可以考虑遗传密码的简并性，以及若方便，考虑为侯选核酸来源的有机体的密码子选择。特别是，可以利用显然来自如图3和/或图4以及

图10中的保守序列的信息设计引物和探针。
在尚未获得全长编码核酸分子时，可以利用代表全部分子的一部分的较小分子获得全长克隆。例如可从部分的cDNA克隆制备插入片段，并用于筛选cDNA文库。可将已分离的全长克隆亚克隆进诸如表达载体的载体或适于转化进植物中的载体中。可以利用重叠克隆提供全长序列。
本发明还扩展至可利用来源于图2或图3a中的核苷酸序列获得的编码Rht或同源物的核酸同源物；和可利用一个或多个(如一对)包括表1中所示序列的引物而获得的这种核酸。
在本发明范围内，还包括编码氨基酸序列的核酸分子，其中的氨基酸序列是小麦属的Rht编码的多肽的同源物。同源物可以来源于小麦属以外的物种同源物。
同源性可以体现在核苷酸序列水平和/或氨基酸序列水平。优先地，该核酸序列和/或氨基酸序列与图3a中的核苷酸序列所编码的序列享有同源性，该同源性优选至少50％，或60％，或70％，或80％或85％，更优选至少90％，92％，95％或97％。编码这种多肽的核酸最好可以与小麦属的Rht基因共享在植物中表达时赋予特殊表型的能力，优选表型为GA反应型表型(即用GA处理时，该植物特性有所变化)，例如抑制植物生长的能力，其中的抑制作用被GA所拮抗。如所注意到的，植物中的Rht表达可能影响该植物的一个或多个其它特性。一个可能与小麦属Rht基因分享的优选特性是互补诸如小麦属的植物中Rht无效突变表型的能力，这种表型对多效唑的矮生效应有抗性。大麦的细长突变作图至大麦基因组中相当于小麦基因组中Rht的位置。这种突变植物具有强烈的多效唑抗性。本发明人相信，该细长大麦的突变体是小麦Rht的定向进化同源基因的无效突变等位基因，使得用所述小麦基因能够互补该大麦突变体。互补大麦中细长突变的能力可能是本发明实施例的一个特性。
按照本发明多肽(由按照本发明的核酸实施方案编码)的一些优选例子包括图3b中下划线的17个氨基酸的序列或具有与所述17个氨基酸的序列中各自相应的残基具有相似性或同一性的至少约10个残基的连续序列，所述连续序列更优选具有11、12、13、14、15、16或17个这种残基；和/或DVAQKLEQLE序列，或有至少大约5个残基与DVAQKLEQLE的各自相应的残基(就位置而言)相似或一致氨基酸连续序列，所述该链需序列更优选具有6、7、8或9个这种残基。其它实施方案包括27个氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMADVAQKLEQLE或氨基酸残基中至少有约15个残基与该序列内各自相应的残基(就位置而言)相似或一致的连续序列，所述连续序列更优选具有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个这种残基。
正如人们所理解的，氨基酸水平的同源性通常依据氨基酸的相似性和同一性。相似性允许“保守性变异”，即诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一种疏水残基被另一种疏水残基置换；或一种极性残基被另一种极性残基置换，例如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸，或谷氨酸酰胺置换天冬酰胺。相似性可由以下程序定义和测定Altschul等(1990)的TBLASTN程序(J.Mol.Biol.215403-10)，该程序规范使用于本技术领域；或更优选GAP(Wisconsin软件包，第8版，1994年9月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，USA)，该程序使用Needleman和Wunsch算法对序列进行序列对比。GAP合适的参数包括缺省参数间隙产生补偿(gap creation penalty)＝12，而间隙扩大补偿(gap extension penalty)＝4，或间隙产生补偿为3.00，而间隙扩大补偿为0.1。可以在图3b的全长Rht序列内具有同源性；或更优选在10个氨基酸的连续序列内与DVAQKLEQLE相比具有同源性；和/或与图3b中下划线的17个氨基酸相比，在17个氨基酸的连续序列内具有同源性；和/或与DELLAALGYKVRASDMADVAQKLEQLE相比，在27个氨基酸的连续序列内具有同源性；或与优选包括下划线的17个氨基酸和/或DVAQKLEQLE的图3b的氨基酸序列相比，在更长的序列，如大约30、40、50或更多氨基酸内具有同源性。
在核酸水平，在图3a序列的全长序列内，或与该序列内编码序列DVAQKLEQLE的30个核苷酸的编码序列相比具有同源性；和/或与图3a序列中编码图3b中下划线的17个氨基酸序列的51个核苷酸的编码序列相比具有同源性；或与更长序列相比，如与大约60、70、80、90、100、120、150或更多核苷酸，并优先包括编码图3b中下划线的17个氨基酸序列的图3中的51个核苷酸的较长序列相比具有同源性。
如所注意到的，相似性可由Altschul等(1990)的TBLASTN程序(J.Mol.Biol.215403-10)定义和测定，该程序规范使用于本技术领域；或者用标准程序BestFit定义和测定，该程序为Wisconsin软件包，第8版，1994年9月(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA，Wisconsin 53711)的一部分。BestFit在两种序列之间进行相似性最佳区段的最佳序列对比。最佳序列对比是利用Smith和Waterman的局部同源性运算法则(Adv.Appl.Math.(1981)2482-489)，通过插入间隙使匹配数目最大化而发现的。其它运算法则包括GAP，它运用Needleman和Wunsch的运算法则对两个完全序列进行序列对比，使匹配数目最大化，并使间隙数目最小化。对于任何运算法则，通常也利用缺省参数，这对GAP来说是间隙产生补偿＝12和间隙扩大补偿＝4。运算法则FASTA(该运算法则运用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA852444-2448的方法)是再一替代方法。
本发明无论使用术语“同源性”或术语“同源的”，并不意味着相比较的序列之间有任何必需的进化关系，例如与诸如“同源重组”的术语的标准应用一致，“同源重组”仅仅要求两种核苷酸序列足够相似，以在适合条件下重组。下面是可以由按照本发明的核酸编码的按照本发明的多肽进行进一步的探讨。
本发明扩展至在严格条件下，与本发明公开的任何一个或多个特定序列相杂交的核酸。
杂交情况可以由以核酸为探针进行探测和在适合的严格条件(按照已知技术)下鉴别阳性杂交而确定。对于用探针探测，优选条件为足够严格以获得简单杂交图型，即仅少数杂交被鉴别为阳性，能够作进一步调查。本专业领域技术人员众所周知，可以逐渐增强杂交的严格性直至仅有少数阳性克隆留下。
可以利用那些本技术领域的任何操作方法来测定探针与靶核酸(如DNA)的结合。例如，探针可以是经过放射性、荧光或酶标记的。其它未采用探针标记法的方法包括检测限制性片段长度多态性、用PCR扩增、RNAase切割和等位基因特异性寡核苷酸标记。
可采用标准的DNA印迹技术进行探针探测。例如，可以从细胞中提取DNA，用不同的限制性酶消化。然后在变性和转至硝酸纤维素滤膜上之前，在琼脂糖凝胶上用电泳法分离限制性片段。标记的探针可能与滤膜上的DNA片段杂交，然后测定结合。可以用诸如反转录酶-PCR的技术，从细胞的RNA制备物制备用作探针的DNA。
初步试验可以这样进行在低严格条件下，各种探针与用限制性酶消化的DNA进行DNA印迹杂交。对于用探针探测，优选条件是足够严格，从而只有简单的杂交图型，即少数杂交被鉴别为阳性，能够作进一步调查。本专业领域技术人员众所周知，可以逐渐增强杂交的严格性直至仅有少数阳性克隆留下。当获得大量杂交片段而背景杂交低时，表明杂交条件适合。运用这些条件，就可探求核酸文库，如代表已表达序列的cDNA文库。那些本领域的专业人员完全能够利用选择性杂交所需严格性的适合条件，同时考虑诸如寡核苷酸长度和碱基组成、温度等类似的因素。
例如，筛选首先在以下条件下进行温度约37℃或更高，甲酰胺的浓度小于约50％，以及中度至低度的盐(如标准的柠檬酸盐水(‘SSC’)＝0.15M氯化钠；0.15M柠檬酸钠；pH7)浓度。
或者，温度大约50℃或更高，以及高盐(如‘SSPE’＝0.180mM氯化钠；9mM磷酸氢二钠；9mM磷酸二氢钠；1mM EDTA钠盐；pH7.4)。进行筛选的优选条件为温度约37℃，甲酰胺浓度约20％，以及约5 x SSC的盐浓度；或温度约50℃，约2x SSPE的盐浓度。这些条件将使得与该探针序列有大致同源性(相似性、同一性)的序列能够被鉴别，而对稳定杂交的鉴别不需要有完全的同源性。
适合的探测条件包括对于序列大约80-90％相一致的情况，于42℃在0.25M磷酸氢二钠，pH7.2，6.5％SDS，10％硫酸葡聚糖中杂交过夜，最后于55℃在0.1 x SSC，0.1％SDS中洗涤。对于序列大约90％以上相一致的情况，探测条件包括于65℃在0.25M磷酸氢二钠，pH7.2，6.5％ SDS，10％硫酸葡聚糖中杂交过夜，最后于60℃在0.1 x SSC，0.1％SDS中洗涤。
用于从其它中区别Rht基因和来自其它物种的同源物的条件可包括以下程序第一DNA分子和第二DNA分子在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后印迹到滤膜上(Sambrook等，1989)。于65℃，在预杂交液[6×SSC，5×Denhart’s溶液，20mM Tris-HCl， 0.1％ SDS，2mM EDTA，20μg/ml鲑鱼精DNA]中孵育5小时，期间持续振摇。然后，将该溶液更换为30ml含有放射性标记的第二DNA的相同溶液(按标准技术制备；参见Sambrook等，1989)，并于65℃孵育过夜，期间持续振摇。第二天早晨漂洗滤膜(用3×SSC-0.1％ SDS溶液漂洗一次)；然后洗涤一次于65℃，用3×SSC-0.1％ SDS溶液冲洗25分钟；第二次在相同温度用0.1×SSC-0.1％ SDS洗涤相同时间。然后用标准技术(参见Sambrook等，1989)记录过滤膜上的放射性图型。
若需要，提高洗涤温度，和/或降低甚至全部去掉洗涤溶液中的SSC，就可以增强严格性。
(SSC为150mM NaCl，15mM柠檬酸钠。50×Denhart’s溶液为1％(w/v)菲可，1％聚乙烯吡咯烷酮，1％(w/v)牛血清白蛋白。)本发明还提供rht突变体的同源物。这些可能是突变体，其野生型包括图3b中下划线的17个氨基酸或17个氨基酸的连续序列，在所述连续序列中至少有大约10个(更优选11、12、13、14、15、16或17个)氨基酸与图3中下划线的17个氨基酸序列的相应残基相似或一致，而突变体却非如此。与此相类似，这种突变体可能是其野生型包括DVAQKLEQLE序列或10个氨基酸的连续序列，在所述连续序列中有至少大约5个(更优选6、7、8、或9个)氨基酸与DVAQKLEQLE序列中相应的残基相似或一致，而突变体却非如此。编码这种突变多肽的核酸可能在植物中表达时，赋予植物这样的表型用GA处理植物时不敏感或无反应，这是用GA处理植物时不能克服或不能回复为野生型表型(虽然当提供或去除GA时植物中可能有一些反应)的一种突变型表型。
本发明再一方面提供其核酸序列编码一种多肽的核酸分离物，所述多肽所包括的氨基酸序列是图3b中普通小麦Rht氨基酸序列的突变体、等位基因、衍生物或变种的序列，或者是其它物种或其突变体、等位基因、衍生物或变异体序列同源物，所述多肽或为另一物种的同源物或其突变体、等位基因、衍生物、变异体同源物，其中所述突变体、等位基因、衍生物或变异体或同源物不同于图3b中所示的氨基酸序列，不同之处在于发生了一个或多个氨基酸的插入、缺失、增加和/或置换，所述核酸分离物的获得途径是通过用测试核酸转化具有Rht无效突变表型的植物，获得转基因植物，其中所述表型对多效唑的矮生效应有抗性；引起或使得测试核酸在转基因植物中进行表达；筛选转基因植物中显示互补Rht无效突变表型的转基因植物，以鉴别能够互补Rht无效突变的测试核酸；从如此鉴别为能够互补Rht无效突变体的核酸中，缺失以下核苷酸序列编码图3b中下划线的17个氨基酸序列或连续的17个氨基酸序列的核苷酸序列，其中在所述连续的17个氨基酸序列中至少有10个残基与图3b中下划线的17个氨基酸序列相应位置的各个氨基酸相似或一致，更优选具有11、12、13、14、15、16或17个这样的残基；和/或编码DVAQKLEQLE序列或10个氨基酸的连续序列的核苷酸序列，在所述连续序列中有至少大约5个(更优选6、7、8或9个)氨基酸与DVAQKLEQLE序列中相应的残基相似或一致。
含有本发明核酸的细胞代表本发明的再一方面，尤其是植物细胞，或细菌细胞。
该细胞可以包含编码该蛋白的核酸，方法为如用本技术领域任何适合的技术进行转化将所述核酸导入该细胞或该细胞祖先。
按照本发明还提供其基因组中引入已公开的核酸的植物细胞。
在采用完全自然存在的序列时，该植物细胞可以是该序列的自然宿主以外的植物的细胞。
本发明还提供含有这种植物细胞的植物。
同时按照本发明还提供其基因组中引入本发明提供的核苷酸序列的植物细胞，其中所述核苷酸序列在用于表达控制的调控序列有效控制下。本发明再一方面提供产生这种植物细胞的方法，包括将含有该核苷酸序列的载体导入植物细胞中，并引起或使得该载体和该植物细胞基因组之间重组，从而将该核苷酸序列引入该基因组中。
按照本发明的植物可以是在一种或多种特性方面不是纯育的植物。可排除植物变种，特别是根据植物育种者权益能够注册的植物变种。需注意的是，一种植物不能由于其基因组中稳定包含有引入该植物细胞或其祖先中的转基因而被简单认为是“植物变种”。
除植物之外，本发明提供这种植物的任何克隆、种子、自交或杂交子代及后代，以及任何这些的任何部分，如插条、种子。本发明提供任何的植物繁殖体，即可以用于以有性或无性方式生殖或繁殖的任何部分，包括插条、种子及诸如此类。本发明也包括经有性或无性方式繁殖的子代植物，这种植物的克隆或后代，或所述植物、子代、克隆或后代的任何部分或繁殖体。
本发明还提供影响植物所述特性的方法，包括在植物细胞内表达异源的Rht基因或rht基因序列(或如所讨论的，其突变体、等位基因、衍生物或同源物)。术语“异源的”表明运用遗传工程，即可能包括转化的人类干涉，将所述基因/核苷酸序列已引入到所述植物的细胞中，或其祖先中。该基因可以在基因组外的载体上或最好稳定地引入到基因组中。该异源基因可以置换内源的相当的基因，即通常在生长和/或发育的控制中发挥相同或相似功能的基因，或者该插入的序列对于内源基因可以是额外的。引入异源基因的好处在于能够将该基因的表达置于所选启动子的控制下，以便能够影响基因的表达，并因此根据选择影响该植物的生长和/或发育。另外，可将该野生型基因的突变体和衍生物用于置换该内源基因。对于宿主细胞，所插入的基因可以是外来的或外源的，如是另一种植物物种的基因。
运用本发明可以改变的主要特性是生长。
根据作为生长阻抑物的Rht基因的模型，可利用该基因的不足表达至少在只具有赋予Rht功能的内源基因的植物中(并非如有将补偿的内源同源物的同源物拟南芥属)促进生长。这可能涉及运用反义调节或有义调节。较高的植物可以通过在目的植物中剔除Rht或相关的同源基因而获得。可产生这种植物，它对诸如多效唑的抑制GA生物合成的化合物有抗性，例如允许利用GA生物合成抑制剂保持杂草矮生，但任作物植物长高。
正如根据该Rht阻抑模型所预言的，Rht基因的超量表达可以产生矮生植物，该矮生植物用GA处理可得以纠正。
由于rht突变基因在表型上是显性的，因此可利用它们产生GA-不敏感的矮生植物。例如将其应用于任何可转化的作物植物、树或果树物种上。这可以提供象Rht小麦一样的增高产量/减少倒伏。在水稻中，这可以提供GA-不敏感的抗恶菌病水稻，该病在日本和其它地方是一大难题。矮生观赏植物对于园艺学和插瓶花市场有价值。序列操作可以提供不同严重程度的矮生、GA-不敏感表型，使该严重程度能够迎合每种作物植物的需要或操作者的希望。rht突变序列的超量表达可能是最有用的。
第二种可改变的特性是植物的发育，如开花。在一些植物中，还有在特定的环境条件下，花的诱导需要GA信号。例如，在短日照条件下生长的GA缺陷型突变拟南芥属植物除非用GA进行处理，否则不能够开花，而这些植物在长日照条件下生长可以正常开花。拟南芥属的gai突变植物在短日照条件下显示延迟开花，而严重的突变体可能根本不开花。因此，例如通过Rht基因或rht基因的表达或超量表达，可产生这样的植物保持营养期直至给予GA处理来诱导开花。这在园艺学中或对于菠菜、莴苣和其它希望抑制抽苔的作物有用。
可以将按照本发明的核酸置于外部可诱导的基因启动子的控制之下，以使Rht或rht的编码序列处于使用者的控制之下。
当术语“诱导型”用于一个启动子时，完全可以为本技术领域人员所理解。基本上，在诱导型启动子控制之下的表达是“打开开关”的或对所施加的刺激物反应而增加表达。刺激物的性质随启动子的变化而不同。在缺乏适合的刺激物时，一些诱导型启动子几乎不引起表达或仅有无法检测得到的表达水平(或无表达)。其它诱导型启动子在缺乏适合的刺激物时引起可测到的组成型表达。缺乏适合的刺激物时，无论表达水平如何，当存在正确的刺激物时，任何来自诱导型启动子的表达将增加。优选的情形是在应用相关的刺激物时，表达水平增强，其增加量有效地使表型特性改变。因此，可以使用在缺乏适合的刺激物时产生基础表达水平的诱导型(或“开关型”)启动子，而所述基础水平太低而不能够产生所希望的表型(甚至事实上可能为零)。一经应用刺激物，表达增强(或开关打开)至产生所希望表型的水平。
适合的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)基因启动子，该启动子实质上在所有植物组织中均高水平表达(Benfey等，1990a和1990b)；玉米谷胱苷肽-S-转移酶同功型II(GST-II-27)基因启动子，该启动子在施加外源的安全剂时被激活(WO93/01294，ICI Ltd)；花椰菜meri 5启动子，该启动子在植物体的营养性顶端分生组织以及诸如内层韧皮部、花原基、根和茎的分枝点的数个很好定位的位置表达(Medford，1992；Medford等，1991)；以及拟南芥LEAFY启动子，该启动子在花发育的非常早的时期表达(Weigel等，1992)。
已经表明，GST-II-27基因启动子由特定的化学化合物所诱导，该化合物可以施用于正在生长的植物。该启动子在单子叶植物和双子叶植物中均有功能。所以可将其用于各种经遗传修饰的植物中控制基因表达，这些植物包括大田作物，如canola、向日葵、烟草、糖甜菜、棉花；禾谷类作物，如小麦、大麦、水稻、玉米、高粱；水果，如番茄、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉和瓜类；还有蔬菜类，如胡萝卜、莴苣、甘蓝和洋葱。GST-II-27启动子还适合用于各种组织，包括根、叶片、茎和生殖组织。
因此，本发明在再一方面提供基因构成物，所述基因构成物含有连接至本发明提供的核苷酸序列的诱导型启动子，这种核苷酸序列例如有来自小麦属的Rht基因、另一种物种的同源物或其任何突变体、衍生物或等位基因同源物。这使得能够控制该基因的表达。本发明还提供用所述基因构成物转化的植物和方法，所述方法包括将这种构成物引入植物细胞中，和/或通过施加适合的刺激物即有效的外源诱导剂，在植物细胞中诱导构成物的表达。该启动子可以是GST-II-27基因启动子或任何其它诱导型植物启动子。
在将选择的基因构成物引入细胞中时，必需考虑到本技术领域技术人员熟知的一些问题。应将即将插入的核酸装配在含有驱动转录的有效调节元件的构成物之内。必须存在将该构成物传送到该细胞中的方法。一旦该构成物在细胞膜之内，将发生或不发生向内源染色体物质中的整合。最后，涉及植物，靶细胞的类型必须使得细胞可以被再生为整个植株。
可以利用选择性遗传标记，包括赋予诸如抗抗生素的选择性表型的嵌合基因，所述抗生素例如有卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、氯磺隆、氨甲蝶呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮和草甘膦。
本发明的一个方面为按照本发明的核酸在产生转基因植物中的用途。
本发明另一方面提供一种方法，该方法包括将该核酸引入到植物细胞中，并引起或允许该核酸进入该细胞的基因组中。
任何适合的植物转化方法都可以用来产生含有按照本发明核酸的植物细胞。转化之后，从已转化的植物细胞和组织中再生植株。
将该核酸引入植物细胞中之后，可任选地接着再生成植株，可以如利用一个或多个诸如抗生素抗性(参看上文)的标记基因，筛选成功转化的细胞和/或植物，既该构成物已经进入了它们的基因组中。
可用已知用于植物基因操作的标准技术产生用含有该序列的DNA区片转化的植物。运用任何适当的技术可将DNA转化进植物细胞中，这些技术例如有利用其天然的基因转移能力的农杆菌所携带的卸甲(disarmed)Ti-质粒(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12(22)8711-87215 1984)；粒子轰击或微弹轰击(US5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)；微注射(WO 92/09696，WO 94/00583，EP331083，EP175966，Green等，(1987)Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press)；电穿孔(EP290395，WO 8706614 Gelvin Debeyser-参见附录)；其它形式的DNA直接摄入(DE 4005152，WO 9012096，US4684611)；脂质体介导的DNA摄入(如Freeman等，Plant Cell Physiol.291353(1984))；或涡旋混合法(如Kindle，PNAS U.S.A.871228(1990d)。在Oard，1991，Biotech.Adv.91-11中有关于用物理方法转化植物细胞的综述。
本技术领域的技术人员广泛应用农杆菌转化法转化双子叶物种。最近，在几乎所有与经济相关的单子叶植物中产生稳定、能育的转基因植物方面，已取得了实质性进展(Toriyama等，(1988)Bio/Technology 6，1072-1074；Zhang等，(1988)Plant Cell Rep.7，379-384；Zhang等，(1988)Theor Appl Genet 76，835-840；Shimamoto等，(1989)Nature 338，274-276；Datta等，(1990)Bio/Technology 8，736-740；Christou等，(1991)Bio/Technology 9，957-962；Peng等，(1991)International Rice Research Institute，Manila，Philippines 563-574；Cao等，(1992)Plant Cell Rep.11，585-591；Li等，(1993)Plant Cell Rep.12，250-255；Rathore等，(1993)Plant Molecular Biology 21，871-884；Fromm等，(1990)Bio/Technology 8，833-839；Gordon-Kamm等，(1990)Plant Cell 2，603-618；D’Halluin等，(1992)Plant Cell 4，1495-1505；Walters等，(1992)Plant Molecular Biology 18，189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology 11，194-200；Vasil，I.K.(1994)Plant Molecular Biology 25，925-937；Weeks等，(1993)Plant Physiology 102，1077-1084；Somers等，(1992)Bio/Technology 10，1589-1594；WO92/14828)。特别是，农杆菌介导的转化也越来越成为单子叶植物中的高效转化方法(Hiei等，(1994)The Plant Journal 6，271-282)。
在禾谷类的水稻、玉米、小麦、燕麦和大麦中已经获得能育的转基因植物(综述参见Shimamoto，K.(1994)Current Opinion inBiotechnology 5，158-162；Vasil等，(1992)Bio/Technology 10，667-674；Vain等，(1995)Biotechnology Advances 13(4)653-671；Vasil，1996，Nature Biotechnology 14第702页)。
当农杆菌转化法低效或无效时，首选微弹轰击、电穿孔和DNA直接摄入。或者，采用不同方法的组合来提高转化法的效率，例如用农杆菌包被的微粒轰击(EP-A-486234)或微弹轰击诱导创伤，然后与农杆菌协同培养(EP-A-486233)。
Moloney等(1989)在Plant Cell Reports 8238-242中描述了甘蓝型油菜(Brassica napus)的转化。
转化之后，如本专业领域的标准所述，植物可以从诸如单个细胞、愈伤组织或叶圆盘再生。几乎任何植物都能够从该植物的细胞、组织和器官完全再生。可利用的方法综述于Vasil等的Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plant，第I、II和III卷，Laboratory Proceduresand Their Applications，Academic Press，1984；以及Weissbach和weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989。
转化技术的具体选择将取决于其转化特定植物物种的效率，以及实践本发明的人员运用所选的特定方法学的经验和爱好。很显然，对熟练的技术人员来说，将核酸导入植物细胞中的转化系统的具体选择，不是本发明的实质所在，或是对本发明的限制，植物再生技术的选择也是如此。
在本发明中，以有义方向引入该核苷酸序列可获得超量表达。因此，本发明提供影响植物特性的方法，该方法包括引起或使得在植物细胞内由按照本发明的核酸表达该核酸。
运用反义技术或“有义调节”，可获得该基因产物多肽的不足表达。现已建立起利用反义基因或部分基因序列负调节基因表达。将DNA置于启动子的控制之下，这样该DNA“反义”链的转录就产生与正常的从靶基因的“有义”链转录的mRNA互补的RNA。对于双链DNA，将编码序列或其片段以“反方向”置于启动子的控制之下而达到这一点。这样就认为互补的反义RNA序列与mRNA结合，形成双链体，抑制内源mRNA从靶基因翻译成蛋白质。现在仍无法确定这是否是作用的真正模式。但是，事实表明，该技术发挥了作用。例如参见Rothstein等，1987；Smith等，(1988)Nature 334，724-726；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4，1575-1588；English等，(1996)The Plant Cell 8，179-188。反义技术还综述于Bourque，(1995)，Plant Science 105，125-149，以及Flavell，(1994)PANAS USA 91，3490-3496。
不必利用反方向相应于编码序列的完整序列。例如，可利用足够长度的片段。对于本领域技术人员，筛选各种大小和来自编码序列不同部分的片段使反义抑制最佳化是常规技术。包括起始的甲硫氨酸ATG密码子和或许起始密码子上游的一个或多个核苷酸可能是有益的。进一步的可能性是靶定基因的一个调节序列，例如一种或多种希望获得对其抗性的病原体的一个或多个基因的特征性序列。适合的片段可以具有至少约14-23个核苷酸，例如约15、16或17个，或更多，至少大约25个，至少大约30个，至少大约40个，至少大约50个或更多。其它片段至少可为300个核苷酸，至少大约400个核苷酸，至少大约500个核苷酸，至少大约600个核苷酸，至少大约700个核苷酸或更多。这种有义方向的片段可用于共抑制(参见下文)。
虽然可能是首选，但序列完全互补并非必需。反义构成物中的一个或多个核苷酸可以与靶基因不同。优选情况是对于各自的反义和有义RNA分子杂交而言有足够的同源性，特别是在存在于植物细胞中的条件下。
因此，本发明还提供影响植物特性的方法，该方法包括引起或使得在该植物细胞内从按照本发明的核酸进行反义转录。
当靶基因的额外拷贝以有义方式插入时，其方向与靶基因相同，产生一定范围的表型，包括发生超量表达的个体以及发生由靶基因不足表达蛋白质的某些个体。当插入的基因只是内源基因的一部分时，转基因群体中不足表达的个体数增加。对于发生有义调节，特别是发生负调节的机制尚不能完全了解。但是，该技术在科技和专利文献中有较多报道，且常规用于基因控制。例如参见van der Krol等，(1990)The Plant Cell 2，291-299；Napoli等，(1990)The Plant Cell 2，279-289；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4，1575-1588和US-A-5,231,020。
因此，本发明也提供影响植物特性的方法，该方法包括引起或使得在该植物细胞内由按照本发明核酸进行表达。可以利用这点影响生长。
现在将以附图为参考，通过实施例描述本发明的各个方面和实施方案。其它方面和实施方案对于本技术领域技术人员是显而易见的。在此所提及的所有文献均通过引用加入到本发明中。
下列图示包括图1N-端预测的GAI氨基酸序列(Gai)和水稻EST D39460(0830)的序列对比，其中同源区以黑体表示。
图2C15、14a1和5a1的DNA序列。
图2a显示共有DNA序列cDNA C15-1(经单程测序而获得)。
图2b显示由14a1进行的原始DNA测序的数据(单程)。
图2c显示由5a1进行的原始DNA测序的数据(单程)。
图3Rht序列。
图3a显示得自图2中数据的小麦Rht基因的复合DNA序列，包括编码序列。
图3b显示由图2中的编码序列编码的完整的预测Rht蛋白序列(rht)和拟南芥属的完整的预测GAI蛋白序列(Gai)的序列对比。以黑体突出序列同一性的区域。
图4D39460序列。
图4a显示水稻cDNA D39460的DNA序列(单程)。该cDNA是不完整的部分克隆，缺失其来源于的mRNA的3’端。
图4b显示全部的预测Rht蛋白序列(小麦-由图2中的编码序列编码)与GAI序列(Gai)以及由图4a中的DNA序列(水稻)预测的水稻蛋白序列的序列对比。以黑体突出序列同一性的区域；一些保守的置换以阴影表示。
图5赤霉素的基本碳-环结构。
图6水稻的EST序列。
图6a显示本发明人测定的水稻EST D39460的核苷酸序列。
图6b显示图6a中的水稻EST序列编码的预测氨基酸序列。
图7小麦C15-1 cDNA。
图7a显示小麦C15-1 cDNA的核苷酸序列。
图7b显示图7a中的小麦C15-1 cDNA的预测氨基酸序列。
图8小麦5a1基因组克隆。
图8a显示5a1小麦基因组克隆的核苷酸序列。
图8b显示图8a中5a1小麦基因组克隆的预测氨基酸序列。
图9玉米1a1基因组克隆。
图9a显示1a1玉米基因组克隆(即D8)的核苷酸序列。
图9b显示图9a中玉米1a1基因组克隆的氨基酸序列。
图10玉米D8多肽与小麦Rht多肽及由本发明人人测定的所述水稻EST序列和拟南芥Gai多肽的氨基酸序列的PRETTYBOX序列对比。
图11玉米D8等位基因的序列。
图11a显示玉米D8-1等位基因的部分核苷酸序列。
图11b显示玉米D8-1等位基因的部分氨基酸序列。
图11c显示玉米D8-2023等位基因的部分核苷酸序列。
图11d显示玉米D8-2023等位基因的部分氨基酸序列。
图12小麦rht-10等位基因。
图12a显示小麦rht-10等位基因的部分核苷酸序列。
图12b显示小麦rht-10等位基因的部分氨基酸序列。
以前，我们克隆了拟南芥属的GAI基因(PCT/GB97/00390-WO97/29123，公开于1997年8月14日)。对野生型(GAI)和突变型(gai)等位基因的DNA序列的比较表明，gai编码突变的预测蛋白产物(gai)，该产物从该蛋白的近N-端处缺少17个氨基酸的区段。用GAI序列筛选该DNA序列数据库，发现存在一个水稻EST(D39460)，该水稻EST含有一个与gai蛋白中从GAI缺失的区段的序列密切相关的序列区。在两种序列中，对从DELLA区到EQLE区的预测氨基酸序列的比较相一致。两处差异(V/A；E/D)是保守的置换，其中一个氨基酸残基被另一个具有类似化学特性的氨基酸残基置换。另外，同一性区延伸至gai蛋白中缺失区边界之外。gai中的缺失并不影响序列DVAQKLEQLE，序列DVAQKLEQLE在GAI序列和D39460序列之间仍然完好地保存(图1)。
在低严格性杂交试验中，利用D39460的一个约700bp的SalI-Notl亚片段从小麦cDNA文库和基因组文库(由中国春小麦变种的DNA制备)和玉米基因组文库(由B73N系制备)中分离杂交克隆。分离了数个小麦克隆，包括C15-1和C15-10(cDNA)，以及5a1和14a1(基因组克隆)。已将克隆C15-1用于基因作图试验。缺体-四体分析表明，克隆C15-1与来自小麦染色体4A、4B和4D的基因组DNA片段杂交。这与克隆C15-1含有Rht序列相一致，因为Rht基因座作图于第4组染色体上。另外，用为Rht-Dlb(以前是Rht2)等位基因而分离的群体进行的重组分析鉴定了一个杂交片段，该片段显示与所述突变等位基因的完美地共分离。这就将cDNA C15-1中编码该mRNA序列的基因的基因组位置置于第4组染色体的2cM区段之内(已知其包含Rht)，还提供该cDNA克隆和基因组克隆确实含有Rht基因的有力证据。此处公开的玉米D8 DNA序列来自从1a1亚克隆的相邻的1.8kb和3.0kb Sall片段(克隆进BluescriptTMSK+中)。此处公开的小麦Rht序列来自从克隆5a1的5.7kb DraI亚片段(克隆进BluescriptTMSK+中)。
图2a给出了cDNA C15-1的完整(单程)DNA序列。我们还获得C15-10的DNA序列，该序列与C15-1的序列一致，因此未显示。图2b和图2c显示得自克隆14a1和克隆5a1各个测序的原始数据。可以将图2中所示序列进行重叠，产生复合的DNA序列，如图3a所示。该序列显示与拟南芥属GAI的序列有强的同源性，正如对所述小麦序列(Rht)与GAI(GAI)的预测翻译产物的氨基酸序列进行比较所揭示的一样，如图3b所示。特别是，推定的Rht的预测氨基酸序列揭示出一个与GAI接近一致的区，而gai中没有该区(图4)。图4显示，水稻EST中延伸至gai缺失区之外的同源性在Rht(DVAQKLEQLE)中也保守，因此表明除在gai缺失中发现的之外，该区参与GA信号传导。在SCR中未发现该区，SCR是在序列上与GAI相关但不参与GA信号传导的另一种蛋白。以上测序试验中所用的引物示于表1中。
如下所示，通过分析从各种突变等位基因来源的基因序列，获得了这些序列确实是小麦Rht基因座和玉米D8基因座的进一步确认。
本发明人获得并测序了数据库中鉴定为水稻EST D39460的克隆，以及来自分别示于图6a和图6b中的核苷酸序列和预测氨基酸序列。
过去对拟南芥属GAI基因的工作显示，GAI蛋白由两部分组成，N-端一半未显示与任何已知功能的蛋白有同源性，C-端一半显示与拟南芥属SCR侯选转录因子(Peng等，(1997)Genes and Development113194-3205；PCT/GB97/00390)有广泛同源性。如上所述，该蛋白N-端一半的部分缺失引起gai突变等位基因特性性的GA反应降低(Peng等，1997；PCT/GB97/00390)。所以本发明人预计，如果D8和Rht分别是拟南芥GAI的玉米和小麦的功能型同源物(定向进化同源物)，则D8和Rht显性突变等位基因应该也含有影响它们编码的蛋白的N-端部分的突变。
先前的报道描述许多D8和Rht处的显性突变等位基因，特别是D8-1、D8-2023和Rht-Dlc(以前是Rht10)(Bruer等，(1996)Euphytica8969-75；Harberd和Freeling(1989)Genetics 121827-838；Winkler和Freeling(1994)Planta 193341-348)。因此本发明人从这些突变体中克隆了侯选的D8/Rht基因，并以DNA测序检查了编码该蛋白N-端一半的该基因的部分。
用PCR法，从含有D8-1、D8-2023和Rht-Dlc的植物基因组DNA中，扩增编码D8/Rht蛋白N-端一半一部分的侯选D8或Rht基因的片段，采用以下引物用于扩增对于D8-1，引物为ZM-15和ZM-24；对于D8-2303，引物为ZM-9和ZM-11；对于Rht-Dlc，用嵌套式PCR法进行，先用Rht-15和Rht-26，后用Rht-16和Rha-2。PCR反应采用Perkin Elmer的GeneAmp XL PCR试剂盒，运用下列条件反应于94℃温育1分钟，接着是94℃ 15秒-x℃15秒-69℃5分钟(其中x是指开始于64℃和结束于52℃的每个循环降低1℃)的13个循环，然后是94℃ 15秒-53℃ 15秒-65℃ 15分钟的25个循环，然后70℃ 10分钟。之后将这些片段克隆进pGEMR-T Easy载体中(Promega，参见技术手册)并测定它们的DNA序列。
突变发现于各个以上突变体的侯选D8基因和Rht基因中。D8-1突变是去除氨基酸VAQK(55-59)和加进一个G的读框内缺失(参见图11a和图11b中的序列)。该缺失与上述保守的DVAQKLEQLE同源区段相重叠。D8-2023是另一种读框内缺失，从D8蛋白的N-端去除了氨基酸LATDTVHYNPSD(87-98)(参见图11c和图11d)。该缺失不与gai或D8-1中的缺失重叠，但却覆盖另一个在GAI、D8和Rht之间高度保守的区(参见图10)。最后，Rht-Dlc包含另一个小的读框内缺失，该缺失去除了它所编码的突变Rht蛋白的N-端区的氨基酸LNAPPPPLPPAPQ(109-121)(参见图12a和图12b)(LN-P在GAI、D8和Rht之间保守，参见图10)。
因此，所有上述突变等位基因均是显性的，并赋予与GA反应降低有关的矮态。所有三种这些等位基因均包含去除它们所编码蛋白的N-端一半的一部分的缺失突变。这些观察表明，已克隆出玉米和小麦的D8基因和Rht基因。表1-Rht测序中所用的引物名称 序列方向15-L TTTGCGCCAATTATTGGCCAGAGATAGATAGAGAG 正向16-L GTGGCGGCATGGGTTCGTCCGAGGACAAGATGATG 正向23-L CATGGAGGCGGTGGAGAACTGGGAACGAAGAAGGG 反向26-L CCCGGCCAGGCGCCATGCCGAGGTGGCAATCAGGG 反向3-L GGTATCTGCTTCACCAGCGCCTCCGCGGCGGAGAG 反向9-L ATCGGCCGCAGCGCGTAGATGCTGCTGGAGGAGTC 反向RHA-1 CTGGTGAAGCAGATACCCTTGC 正向RHA-2 CTGGTTGGCGGTGAAGTGCG反向RHA-3 GCAAGGGTATCTGCTTCACCAGC 反向RHA-5 CGCACTTCACCGCCAACCAG正向RHA-6 TTGTGATTTGCCTCCTGTTTCC 正向RHA-7 CCGTGCGCCCCCGTGCGGCCCAG 正向RHA-8 AGGCTGCCTGACGCTGGGGTTGC 正向RHT-9 GATCGGCCGCAGCGCGTAGATGC 反向RHT-10GATCCCGCACGGAGTCGGCGGACAG 反向RHT-12TCCGACAGCATGCTCTCGACCCAAG 反向RHT-13TTCCGTCCGTCTGGCGTGAAGAGG正向RHT-14AAATCCCGAACCCGCCCCCAGAAC正向RHT-15GCGCCAATTATTGGCCAGAGATAG正向RHT-16GGCATGGGTTCGTCCGAGGACAAG正向RHT-18TTGTCCTCGGACGAACCCATGCCG反向RHT-19GATCCAAATCCCGAACCCGCCC 正向RHT-20GTAGATGCTGCTGGAGGAGTCG 反向RHT-21GTCGTCCATCCACCTCTTCACG 反向RHT-22GCCAGAGATAGATAGAGAGGCG 正向RHT-23TAGGGCTTAGGAGTTTTACGGG 反向RHT-24CGGAGTCGGCGGACAGGTCGGC 反向RHT-25CGGAGAGGTTCTCCTGCTGCACGGC 反向RHT-26TGTGCAACCCCAGCGTCAGGCAG 反向RHT-27GCGGCCTCGTCGCCGCCACGCTC 正向RHT-28TGGCGGCGACGAGGCCGCGGTAC 反向RHT-29AAGAATAAGGAAGAGATGGAGATGGTTG反向RHT-30TCTGCAACGTGGTGGCCTGCGAG 正向RHT-31CCCCTCGCAGGCCACCACGTTGC 反向RHT-32TTGGGTCGAGAGCATGCTGTCGGAG 正向表2-D-8克隆测序中所用的引物名称 序列 方向ZM-8 GGCGATGACACGGATGACG正向ZM-9 CTTGCGCATGGCACCGCCCTGCGACGAAG 反向ZM-10CCAGCTAATAATGGCTTGCGCGCCTCG反向ZM-11TATCCCAGAACCGAAACCGAG 正向ZM-12CGGCGTCTTGGTACTCGCGCTTCATG 反向ZM-13TGGGCTCCCGCGCCGAGTCCGTGGAC 反向ZM-14CTCCAAGCCTCTTGCGCTGACCGAGATCGAG正向ZM-15TCCACAGGCTCACCAGTCACCAACATCAATC正向ZM-16ACGGTACTGGAAGTCCACGCGGATGGTGTG 反向ZM-17CGCACACCATCCGCGTGGACTTCCAGTAC 正向ZM-18CTCGGCCGGCAGATCTGCAACGTGGTG正向ZM-19TTGTGACGGTGGACGATGTGGACGCGAGCCTTG 反向ZM-20GGACGCTGCGACAAACCGTCCATCGATCCAAC 正向ZM-21TCCGAAATCATGAAGCGCGAGTACCAAGAC 正向ZM-22TCGGGTACAAGGTGCGTTCGTCGGATATG 正向ZM-23ATGAAGCGCGAGTACCAAGAC 正向ZM-24GTGTGCCTTGATGCGGTCCAGAAG 反向ZM-25AACCACCCCTCCCTGATCACGGAG 反向ZM-27CACTAGGAGCTCCGTGGTCGAAGCTG 正向ZM-28GCTGCGCAAGAAGCCGGTGCAGCTC 反向ZM-29AGTACACTTCCGACATGACTTG 反向
权利要求
1.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包括氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA，当在普通小麦植株中表达时，所述多肽提供对植物生长的抑制，这种抑制被赤霉素所拮抗。
2.根据权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括可从普通小麦获得的Rht多肽的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的分离的多核苷酸，包括可获自普通小麦、编码Rht多肽的核酸的核苷酸序列，该核苷酸序列包括GACGAGCTGCTGGCGGCGCTCGGGTACAAGGTGCGCGCCTCCGACATGGCG。
4.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含图8a中所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4的分离的多核苷酸，具有图8a所示的编码核苷酸序列。
6.编码多肽的分离的多核苷酸，当在植物中表达时，所述多肽提供对植物生长的抑制，这种抑制被赤霉素所拮抗，其中该多肽具有的氨基酸序列显示与普通小麦的Rht多肽的氨基酸序列至少有80％同源性，该Rht多肽由可获自普通小麦的核酸编码，包括以下核苷酸序列GACGAGCTGCTGGCGGCGCTCGGGTACAAGGTGCGCGCCTCCGACATGGCG。
7.根据权利要求6的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA。
8.根据权利要求6的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括17个氨基酸的连续序列，该连续序列中至少有10个残基显示与氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA中相应位置的残基有氨基酸相似性或同一性。
9.根据权利要求8的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括17个氨基酸的连续序列，该连续序列中的16个残基显示与氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA中相应位置的残基有氨基酸同一性。
10.根据权利要求9的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括图9b中所示的玉米D8多肽的氨基酸序列。
11.根据权利要求10的分离的多核苷酸，具有图9a中所示的编码核苷酸序列。
12.根据权利要求9的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括示于图6b中的氨基酸序列。
13.根据权利要求12的分离的多核苷酸，具有图6a中所示的编码核苷酸序列。
14.编码多肽的分离的多核苷酸，当在植物中表达时，所述多肽赋予植物一种表型，这种表型为赤霉素非反应型矮态，或当在rht无效突变表型的植物中表达时互补该rht无效突变表型，这种rht无效突变表型对多效唑的矮生效应有抗性，其中该多肽所具有的氨基酸序列显示与普通小麦Rht多肽的氨基酸序列有至少80％的相似性，普通小麦的Rht多肽由可获自普通小麦的核酸编码，该核酸包括以下核苷酸序列GACGAGCTGCTGGCGGCGCTCGGGTACAAGGTGCGCGCCTCCGACATGGCG。
15.根据权利要求14的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括可获自普通小麦的Rht多肽的氨基酸序列，且缺失一个或多个氨基酸。
16.根据权利要求15的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA缺失。
17.根据权利要求15的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列LNAPPPPLPPAPQ缺失。
18.根据权利要求14的分离的多核苷酸，其中所述多肽包括图9b中所示的玉米D8多肽的氨基酸序列，且缺失一个或多个氨基酸。
19.根据权利要求18的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列DELLAALGYKVRSSDMA缺失。
20.根据权利要求19的分离的多核苷酸，具有图9a中所示的编码核苷酸序列，其中编码氨基酸序列DELLAALGYKVRSSDMA的核苷酸缺失。
21.根据权利要求18的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列VAQK缺失。
22.根据权利要求18的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列LATDTVHYNPSD缺失。
23.根据权利要求14的分离的多核苷酸，其中该多肽包括示于图6b中的氨基酸序列，且缺失一个或多个氨基酸。
24.根据权利要求23的分离的多核苷酸，其中氨基酸序列DELLAALGYKVRSSDMA缺失。
25.根据权利要求24的分离的多核苷酸，具有图6a中所示的编码核苷酸序列，其中编码氨基酸序列DELLAALGYKVRSSDMA的核苷酸缺失。
26.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽含有图8b中所示的氨基酸序列，且氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA缺失。
27.根据权利要求26的分离的多核苷酸，具有图8a中所示的编码核苷酸序列，其中编码氨基酸序列DELLAALGYKVRASDMA的核苷酸缺失。
28.分离的多核苷酸，其中根据权利要求1至27中任一项的多核苷酸与调节序列操作性连接以利于表达。
29.根据权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述调节序列包括诱导型启动子。
30.分离的多核苷酸，其核苷酸序列与下述序列互补根据权利要求1-27中任一项的核酸编码序列或与其相互的序列的至少50个相邻核苷酸的序列；所述多核苷酸适用于反义调节或有义调节(“共抑制”)所述编码序列的表达并处于转录调节序列控制之下。
31.根据权利要求30的多核苷酸，其中所述调节序列包括诱导型启动子。
32.适于植物细胞转化并包括根据前面任一权利要求中的多核苷酸的核酸载体，
33.含有根据前面任一权利要求的异源多核苷酸或核酸载体的宿主细胞。
34.根据权利要求33的宿主细胞，该细胞是微生物细胞。
35.根据权利要求33的宿主细胞，该细胞是植物细胞。
36.根据权利要求35的植物细胞，该细胞的染色体中具有异源的所述多核苷酸。
37.根据权利要求36的植物细胞，该细胞的每个单倍体基因组中具有一个以上的所述多核苷酸。
38.根据权利要求35至37中任一项的植物细胞，该细胞包含在植物、植物部分或植物繁殖体、或植物提取物或衍生物中。
39.产生根据权利要求35至37中任一项的细胞的方法，该方法包括将所述多核苷酸或核酸载体以转化途径引入到该细胞中。
40.根据权利要求39的方法，该方法包括将该多核苷酸与该细胞基因组核酸重组，从而使得所述多核苷酸稳定整合在其中。
41.根据权利要求39或权利要求40的方法，该方法包括从一个或多个转化细胞再生植株。
42.含有权利要求35至37中任一项的植物细胞的植物。
43.含有权利要求35至37中任一项的植物细胞的植物的一部分或繁殖体。
44.产生植物的方法，该方法包括将根据权利要求1至32中任一项的多核苷酸或核酸载体引入植物细胞中，并从所述植物细胞再生植株。
45.根据权利要求44的方法，该方法包括有性或无性地繁殖或培育由所述植物细胞再生的植株的子代或后代。
46.影响植物特性的方法，该方法包括引起或使得在植物细胞中从根据权利要求1至31中任一项的异源多核苷酸进行表达。
47.根据权利要求1至32中任一项的多核苷酸在产生转基因植物中的用途。
48.鉴别或获得根据权利要求6的多核苷酸的方法，该方法包括用与根据权利要求1至13中任一项的多核苷酸特异性杂交的核酸分子筛选候选核酸。
49.根据权利要求48的方法，其中寡核苷酸引物被用于PCR中。
50.根据权利要求49的方法，其中所述引物从表1和表2中所示的引物中挑选。
51.分离的多肽，该多肽由根据权利要求1至27中任一项的多核苷酸编码。
52.抗体，该抗体包括对根据权利要求51的多肽有特异结合亲和性的抗原结合位点。
53.包括根据权利要求52的抗体的抗原结合位点的多肽。
54.鉴别或获得根据权利要求51的多肽的方法，该方法包括用根据权利要求52或权利要求53的抗体或多肽筛选侯选多肽。
全文摘要
本发明描述小麦Rht基因和来自包括水稻和玉米(D8基因)的其它物种的同源物,它们可用于对植物的生长和/或发育特性的修饰。描述转基因植物及产生这种转基因植物的方法和途径。
文档编号C12Q1/68GK1274386SQ98809929
公开日2000年11月22日 申请日期1998年8月7日 优先权日1997年8月13日
发明者N·P·哈伯德, D·E·里查兹, J·彭 申请人:植物生物科学有限公司