专利名称：源于丁香假单胞菌的过敏反应诱导物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明的完成得到了美国政府的资助，国家科学基金授权号为MCB9631530。美国政府可拥有一定权利。
本申请要求美国临时专利申请流水号60/055,107的优先权。
本发明领域本发明涉及源于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的过敏反应诱导物及其用途。
本发明背景细菌病原体及其植物宿主之间的相互作用一般分成两种类型(1)相容型(病原体-宿主)，在宿主植物上导致细胞间细菌生长，症状发展，和疾病发展；和(2)不相容型(病原体-非宿主)，导致过敏反应，发生一种特殊类型的不相容的相互作用，而没有逐渐发病症状。在宿主植物的相容性相互作用期间，细菌群体急剧增加，并逐渐出现症状。在不相容性相互作用期间，细菌群体不增加，并且不发生逐渐发展的症状。
所述过敏反应(HR)是一种快速的、局部的坏死，这种坏死与植物针对很多病原体的主动防御有关(Kiraly，Z.，“由入侵者引起的防御过敏反应”，201-224页，参见植物病害最新论文，第5卷，J.G.Horsfall和E.B.Cowling著，学术出版社，纽约(1980)；Klement，Z.，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约(1982))。如果高浓度(≥107细胞/ml)的诸如丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)或解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的有限宿主范围的病原体浸入非宿主植物的叶片的话，很容易通过组织的崩解观察到由细菌引起的过敏反应(坏死仅发生在接种物的下部叶片的分离的植物细胞上)(Kiraly，Z.，“植物致病性假单胞菌的致病性快速检测”，自然199299-300；KLement等，“由植物致病性细菌在烟草叶片中诱导的过敏反应”，植物病理学54474-477，(1963)；Turner等，“与过敏反应有关的植物和细菌细胞之间的定量关系”，植物病理学64885-890(1974)；KLement，Z.，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约(1982))。在非宿主中引起过敏反应的能力似乎与在宿主中的致病性有关。正如Kiraly，Z.(“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy著，学术出版社，纽约)披露的，所述病原体还能在其与相容性宿主的相互作用中导致生理学上相似的(虽然是推迟的)坏死。另外，产生过敏反应或致病性的能力取决于同一类基因，被称为hrp(Lindgren，P.B.等，“控制豆类植物的致病性和在非宿主植物上的过敏反应的丁香假单胞菌菜豆致病变种的基因簇”，细菌学杂志168512-22(1986)；Willis，D.K.等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991))。因此，过敏反应可以提供植物防御的性质和细菌致病性基础的线索。
所述hrp基因分布于革兰氏阳性植物病原体中，其中，这些基因是成簇的，保守的，并且在某些情况下是可以相互交换的(Willis，D.K.等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991)；Bonas，U.“植物病原性细菌的hrp基因”，79-98页，参见微生物学和免疫学的现代主题植物和动物的细菌致病性-分子和细胞机制，J.L.Dangl著，Springer-Verlag，柏林(1994))。若干hrp基因编码的蛋白分泌途径的成分类似于由耶尔森氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌用于分泌动物发病所必需的蛋白的成分(Van Gijsegem等，“在植物和动物病原体细菌之间致病性决定子的进化保守性”1175-180(1993))。在解淀粉欧文氏菌，丁香假单胞菌和青枯假单胞菌(Pseudomonas solancearum)中，业已证实了hrp基因控制富含甘氨酸的过敏反应蛋白诱导物的产生和分泌(He，S.Y.等，丁香假单胞菌丁香致病变种HarpinPss通过Hrp途径分泌的蛋白，该蛋白能在植物中引起过敏反应，细胞731255-1266(1993)，Wei，Z.-H.等，“解淀粉欧文氏菌的HrpI在Harpin的分泌中起作用，并且是新的蛋白家族的一员”，细菌学杂志1757958-7967(1963)；Arlat，M.等，PopA1，“一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，该蛋白是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。
所述蛋白的第一种发现于解淀粉欧文氏菌Ea321中，这种细菌能导致蔷薇科植物的火疫，该蛋白被命名为harpin(Wei，Z.-M.等，“Harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物”，科学25785-88(1992))。在编码hrpA基因中进行的突变揭示了harpin是解淀粉欧文氏菌在非宿主烟草叶片中诱导过敏反应所必需的，并且能在高度易感的梨果上引起发病症状。青枯假单胞菌GMI1000PopA1蛋白具有类似的物理特性，而且也能在烟草的叶片中引起过敏反应，而烟草不是这种菌株的宿主(Arlat，M.等，“PopA1，一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，该蛋白是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。不过，青枯假单胞菌popA突变型仍然能在烟草中引起过敏反应，并在番茄中导致发病。因此，所述富甘氨酸过敏反应诱导物的作用在革兰氏阳性植物病原体之间可以有很大的变化。
业已分离、克隆其它植物致病性过敏反应诱导物，并测定了其序列。其中包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐致病性”，MPMI8(4)484-91(1995))；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA-能超量表达hrpNEcc并且能在烟草叶片中引起过敏反应样反应”，MPMI9(7)565-73(1966))；施氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，“Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，第8卷，国际分子植物-微生物相互作用大会，1996年7月14-19日，以及Ahmad等，Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，美国植物病理学协会年会，1996年7月27-31日)；丁香假单胞菌丁香变种(WO94/26782，该专利属于Cornell Research Foundation公司)。
本发明是为了鉴定、克隆、和测序源于植物病原体的过敏反应诱导蛋白或多肽所做努力的进一步进展。
本发明概述本发明涉及能在植物中引起过敏反应的分离的蛋白或多肽，以及编码所述过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子。
所述过敏反应诱导蛋白或多肽可用于赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制昆虫。其中包括以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上，处理条件为赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。
作为将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上以便赋予抗病性，改善植物生长，和/或控制植物上的昆虫的另一种方案，可以使用转基因植物或植物种子。当使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物，并在能有效产生抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫的条件下生长所述植物。另外，可以提供用编码过敏性反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物种子并将其播种到土壤中。在能有效产生抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫的条件下繁殖植物。
附图的简要说明
图1表示通过丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringaepv.tomato)DC300hrpW的反式表达抑制由荧光假单胞菌(P.fluorescens)(pHIR11)在烟草中引起的HR。在左侧示出了携带hrpW片段的载体pML123衍生物，其中的两个在标明的部位具有ΩSpr插入。在右侧示出了以5×108细胞/ml的浓度接种24小时之后携带所述结构的荧光假单胞菌对烟草叶片的作用。
图2A-C表示丁香假单胞菌番茄致病变种DC 3000 hrpW区，它保守了丁香假单胞菌丁番致病变种B728a上的相应片段和HrpW的结构特征。图2A表示靠近hrp基因簇的DC3000的物理图谱，用空心箭头表示推测的σ54启动子，并用实心箭头表示推测的HrpL-依赖型启动子，由它控制以前确定的转录单位(Lorang，J.M.等，分子植物微生物相互作用，849-57(1995)，该文献被收作本文参考文献)。hrpR和hrpS编码调控蛋白并位于hrp簇的右侧末端。位于所述图谱上方的方框中的数字表示DC3000DNA共线性排列的部位与B728aDNA序列的百分相同性。在图2B中，HrpW的示意图表示过敏反应诱导物样和果胶酸裂合酶(“Ple”)样结构域。PCR亚克隆制备的His6-标记的过敏反应诱导物结构域片段包括氨基酸1-186；His6-标记的Pel结构域具有氨基酸187-425。图2C表示位于HrpW中部的区域的序列，它含有6个富含甘氨酸重复(见方框)，将源于丁香假单胞菌番茄致病变种(“Pto”)和丁香假单胞菌丁香致病变种(“Pss”)的HrpZ上的类似重复排列在下面。在需要表明之处引入折线。
图3表示HrpW在高严格条件下与源于其它细菌植物病原体总DNA的杂交。分离源于所标明的病原体的DNA，用EcoRI消化，在0.5％的琼脂糖凝胶上分离，转移到Immobilon-N膜上，在62℃下与32P标记的hrpW亚克隆杂交。缩略语Pto，丁香假单胞菌番茄致病变种；Psy，丁香假单胞菌丁香致病变种；Pgy，丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)；Ppp，丁香假单胞菌疱疹致病变种(P.syringae pv.papulans)；Ppi，丁香假单胞菌豌豆致病变种(P.syringae pv.pisi)；Pph，丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.syringae pv.phaseolicola)；pta，丁香假单胞菌烟草致病变种(P.syringae pv.tabaci)；Pvf.绿黄假单胞菌(P.viridiflava)；Rso，Rallstonia solanacearum，Xam，野油菜黄单胞菌假辣根致病变种(Xanthomonas campestris pv.amoraciae)；Xvs，野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(X.campestris pv.vesicatoria)；Ea，解淀粉欧文氏菌；Eca，胡萝卜软腐欧文氏菌；Ech，菊欧文氏菌。
图4A-B表示含有HrpW及其过敏反应诱导物域和Pel域片段的制剂的SDS-PAGE和免疫印迹分析。在图4A中，通过Ni-NTA层析部分纯化His6-标记的完整长度HrpW和两个域片段，通过SDS-PAGE分离，并用考马斯蓝R250染色。箭头表示完整长度的HrpW，其产量很低。泳道1，Pel域片段；2，过敏反应诱导物域片段；3，HrpW。在图4B中，用抗-HrpW抗体和Western Light化学发光测定在免疫印迹上可以观察到相同的HrpW衍生物。泳道4，Pel域片段；5，过敏反应诱导物域片段；6，HrpW。
图5表示通过含有HrpW和N-末端片段的无细胞制剂诱导烟草叶片的活组织死亡，表示HR。将图4中分析过的蛋白制剂浸入烟草叶片，在某些场合下用1.0mM氯化镧。48小时后对叶片进行照相。照片A.，丁香假单胞菌丁香致病变种61HrpZ(0.12μg/ml)；B.，HrpW；C，HrpW的harpin域(0.22μg/ml)；D.，HrpZ+氯化镧；E.，HrpW+氯化镧；F.，HrpW的Pel域片段(0.40μg/ml)。
本发明详细说明本发明涉及一种分离的DNA分子，该分子具有下面的序列1所示的核苷酸序列TCCACTTCGC TGATTTTGAA ATTGGCAGAT TCATAGAAAC GTTCAGGTGT GGAAATCAGG60CTGAGTGCGC AGATTTCGTT GATAAGGGTG TGGTACTGGT CATTGTTGGT CATTTCAAGG 120CCTCTGAGTG CGGTGCGGAG CAATACCAGT CTTCCTGCTG GCGTGTGCAC ACTGAGTCGC 180AGGCATAGGC ATTTCAGTTC CTTGCGTTGG TTGGGCATAT AAAAAAAGGA ACTTTTAAAA 240ACAGTGCAAT GAGATGCCGG CAAAACGGGA ACCGGTCGCT GCGCTTTGCC ACTCACTTCG 300AGCAAGCTCA ACCCCAAACA TCCACATCCC TATCGAACGG ACAGCGATAC GGCCACTTGC 360TCTGGTAAAC CCTGGAGCTG GCGTCGGTCC AATTGCCCAC TTAGCGAGGT AACGCAGCAT 420GAGCATCGGC ATCACACCCC GGCCGCAACA GACCACCACG CCACTCGATT TTTCGGCGCT 480AAGCGGCAAG AGTCCTCAAC CAAACACGTT CGGCGAGCAG AACACTCAGC AAGCGATCGA 540CCCGAGTGCA CTGTTGTTCG GCAGCGACAC ACAGAAAGAC GTCAACTTCG GCACGCCCGA 600CAGCACCGTC CAGAATCCGC AGGACGCCAG CAAGCCCAAC GACAGCCAGT CCAACATCGC 660TAAATTGATC AGTGCATTGA TCATGTCGTT GCTGCAGATG CTCACCAACT CCAATAAAAA 720GCAGGACACC AATCAGGAAC AGCCTGATAG CCAGGCTCCT TTCCAGAACA ACGGCGGGCT 780CGGTACACCG TCGGCCGATA GCGGGGGCGG CGGTACACCG GATGCGACAG GTGGCGGCGG 840CGGTGATACG CCAAGCGCAA CAGGCGGTGG CGGCGGTGAT ACTCCGACCG CAACAGGCGG 900TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCACACCCAC TGCAACAGGT GGCGGCAGCG GTGGCACACC 960CACTGCAACA GGCGGTGGCG AGGGTGGCGT AACACCGCAA ATCACTCCGC AGTTGGCCAA 1020CCCTAACCGT ACCTCAGGTA CTGGCTCGGT GTCGGACACC GCAGGTTCTA CCGAGCAAGC 1080CGGCAAGATC AATGTGGTGA AAGACACCAT CAAGGTCGGC GCTGGCGAAG TCTTTGACGG 1140CCACGGCGCA ACCTTCACTG CCGACAAATC TATGGGTAAC GGAGACCAGG GCGAAAATCA 1200GAAGCCCATG TTCGAGCTGG CTGAAGGCGC TACGTTGAAG AATGTGAACC TGGGTGAGAA 1260CGAGGTCGAT GGCATCCACG TGAAAGCCAA AAACGCTCAG GAAGTCACCA TTGACAACGT 1320GCATGCCCAG AACGTCGGTG AAGACCTGAT TACGGTCAAA GGCGAGGGAG GCGCAGCGGT 1380CACTAATCTG AACATCAAGA ACAGCAGTGC CAAAGGTGCA GACGACAAGG TTGTCCAGCT1440CAACGCCAAC ACTCACTTGA AAATCGACAA CTTCAAGGCC GACGATTTCG GCACGATGGT1500TCGCACCAAC GGTGGCAAGC AGTTTGATGA CATGAGCATC GAGCTGAACG GCATCGAAGC1560TAACCACGGC AAGTTCGCCC TGGTGAAAAG CGACAGTGAC GATCTGAAGC TGGCAACGGG1620CAACATCGCC ATGACCGACG TCAAACACGC CTACGATAAA ACCCAGGCAT CGACCCAACA1680CACCGAGCTT TGAATCCAGA CAAGTAGCTT GAAAAAAGGG GGTGGACTC1729该DNA分子被称为dspE基因。本发明的分离的DNA分子编码具有下面的序列2所示氨基酸序列的诱导植物病原体过敏反应的诱导蛋白或多肽Met Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu1 5 10 15Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Gln Pro Asn Thr Phe Gly20 25 30Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala Ile Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly35 40 45Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val50 55 60Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn Ile65 70 75 80Ala Lys Leu Ile Ser Ala Leu Ile Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr85 90 95Asn Ser Asn Lys Lys Gln Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln100 105 110Ala Pro Phe Gln Asn Asn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr130 135 140Pro Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly145 150 155 160Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly165 170 175Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr180 185 190Pro Gln Ile Thr Pro Gln Leu Ala Asn Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr195 200 205Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile210 215 220Asn Val Val Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp225 230 235 240Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Set Met Gly Asn Gly Asp245 250 255Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu Gly Ala Thr260 265 270Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu Asn Glu Val Asp Gly Ile His Val275 280 285Lys Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr Ile Asp Asn Val His Ala Gln290 295 300Asn Val Gly Glu Asp Leu Ile Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala305 310 315 320Val Thr Asn Leu Asn Ile Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp325 330 335Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys Ile Asp Asn Phe340 345 350Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly Gly Lys Gln355 360 365Phe Asp Asp Met Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ile Glu Ala Asn His Gly370 375 380Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr385 390 395 400Gly Asn Ile Ala Met Thr Asp Val Lys His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln405 410 415Ala Ser Thr Gln His Thr Glu Leu420该蛋白或多肽大约为4.5kDa。
本发明包括上述过敏反应诱导多肽或蛋白的片段。
可以通过若干方法生产合适的片段。首先，通过常规分子遗传学操作，通过亚克隆基因片段生产编码本发明诱导蛋白的基因的亚克隆。然后在细菌细胞中在体外或体内表达所述亚克隆，以便产生较小的蛋白或肽，按照下面所披露的方法可以测出所述蛋白或肽的诱导物活性。
另外，可以通过用诸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白酶消化完整长度的诱导蛋白，生产诱导蛋白的片段。不同的蛋白酶根据诱导蛋白的氨基酸序列以类似方式裂解诱导蛋白的不同位点。由蛋白分解所产生的某些片段可能是抗性的活性诱导物。
在另一种方法中，根据对所述蛋白一级结构的了解，可以用PCR技术和被选择用于体现所述蛋白的特定部分的特殊类型的引物合成所述诱导蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆到合适的载体上，以便加强截短的肽或蛋白的表达。
还可将化学合成用于制备合适的片段。所述合成是用已知的氨基酸序列进行的，以便生产所述引物。另外，用高温和高压处理完整长度的诱导物也可以产生片段。然后可以通过常规方法分离这些片段(例如，亲和层析，SDS-PAGE)。
还可以修饰变体(或者以此作为替代方案)，例如，缺失或添加对所述多肽的特性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸。例如，可将一种多肽缀合到位于所述蛋白的N-末端的信号(或前导)序列上，它能在翻译同时或在翻译之后指导该蛋白的转移。还可将所述多肽缀合到接头或其它序列上，以便于合成、纯化、或鉴定所述多肽。
合适的DNA分子是能在严格条件下与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的分子。合适的严格条件的一个例子是在65℃下在含有下列成分的介质中进行杂交20小时1M NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM EDTA，0.1％十二烷基硫酸钠，0.2％Ficoll，0.2％聚丙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白，50μmg/ml大肠杆菌DNA。不过，任何能在所述严格条件下与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子必须不同于编码解淀粉欧文氏菌的(如由Wei，Z.-M.等所披露的，“Harpin”，“由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物”，科学25785-88(1992)，该文献被收作本文的参考文献)，菊欧文氏菌(如由Bauer等所披露的，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐致病性”，MPMI8(4)484-91(1995)，该文献被收作本文的参考文献)，胡萝卜软腐欧文氏菌(如由Cui等所披露的，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种菌株Ecc71的RmsA-突变体，能在烟草叶片中超量表达hrpNEcc并能诱导过敏反应样反应”，MPMI9(7)565-73(1996)，该文献被收作本文的参考文献)，施氏欧文氏菌(如由Ahmad等所披露的“Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，第8卷，国际分子植物-微生物相互作用大会(1996)，以及Ahmad等，Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，美国植物病理学协会年会(1996)，以上文献被收作本文的参考文献)，和丁香假单胞菌丁香致病变种过敏反应诱导蛋白或多肽的核酸(WO94/26782，该专利属于Cornell ResearchFoundation公司，该文献被收作本文的参考文献)。
本发明的蛋白或多肽优选通过常规技术以纯化形式生产(纯度优选为至少大约80％，更优选90％)。通常，本发明的蛋白或多肽被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中，或者生产本发明的蛋白或多肽，但不分泌到生长培养基中。在以上情况下，为了分离所述蛋白，繁殖携带重组质粒的宿主细胞(例如，大肠杆菌)，通过超声波、加热、压力差、或化学处理裂解，并对匀浆物进行离心，以便除去细菌碎片。然后对上清液进行顺序硫酸铵沉淀。在合适大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱上对含有本发明多肽或蛋白的级份进行凝胶过滤，以便分离所述蛋白。如果必要，可以通过HPLC对所述蛋白级份进行进一步纯化。
可以用常规重组DNA技术将编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子整合到细胞中。通常，该方法包括将所述DNA分子插入与该DNA分子异源的表达系统中(即，该系统正常情况下不存在该分子)。以正确的有义取向和正确的读框将所述异源DNA分子插入所述表达系统。该载体含有所插入的蛋白编码序列转录和翻译所必需的因子。
被收作本文参考文献的授予Cohen和Boyer的US4,237,224披露了用限制酶裂解和用DNA连接酶连接以重组质粒的形式生产表达系统。然后通过转化方法将所述重组质粒导入，并且在包括生长在组织培养物中的原核生物和真核细胞在内的单细胞培养物中复制。
还可将重组基因导入病毒如痘病毒。可以通过将质粒转染到感染了病毒的细胞中生产重组病毒。
合适的载体包括，但不限于以下病毒载体，如λ载体系统gt11，gtWES.tB，Charon4，和质粒载体，如pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC1084，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKC101，SV40，pBluescriptII SK+/-或KS+/-(参见来自Stratagene的“Stratagene克隆系统”目录(1993)，La Jolla，加利弗尼亚，该资料被收作本文的参考文献)，pQE，pIH821，pGEX，pET系列(参见F.W.Studier等，“用T7RNA聚合酶指导克隆基因的表达”，基因表达技术，185卷，(1990)，该文献被收作本文的参考文献)，及其任何衍生物。可以通过转化，特别是通过转导、接合、转移或电穿孔将重组分子导入细胞。用本领域标准的克隆方法将DNA序列克隆到载体中，所述方法如Sambrook等所述，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，该文献被收作本文的参考文献。
可将各种宿主载体系统用于表达所述蛋白编码序列。首先，所述载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括，但不限于以下系统用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化过的细菌；诸如含有酵母载体的酵母的微生物；用病毒(例如，疫苗病毒，腺病毒等)感染过的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如，杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；和用细菌感染过的植物细胞。所述载体的表达因子在其强度和专一性方面有所不同。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适转录和翻译因子中的任一种。
由不同的遗传信号和加工过程控制很多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(mRNA)翻译)。
DNA的转录取决于启动子的存在，启动子是指导RNA聚合酶结合并因此促进mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列不同于原核启动子的DNA序列。另外，真核启动子以及相伴的遗传信号在原核系统中不能被识别或者不能起作用，而且，原核启动子在真核细胞中也不能被识别并且不能起作用。
类似地，mRNA在原核生物中的翻译取决于不同于真核生物的正确原核信号在原核生物中的存在。有效翻译需要一个核糖体结合位点，该位点在mRNA上被称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列。该序列是位于起始密码子(通常为AUG)之前的短的mRNA核苷酸序列，所述起始密码子编码该蛋白的氨基末端甲硫氨酸。SD序列互补于16SrRNA(核糖体RNA)的3’末端，并有可能通过与rRNA形成双链体对核糖体进行正确定位而促进mRNA与核糖体的结合。为了了解增强基因的表达，参见Roberts和Lauer，酶学方法，68473(1979)，该文献被收作本文的参考文献。
启动子的“强度”(即促进转录的能力)有所不同。为了表达克隆的基因，需要使用强的启动子，以便获得高水平的转录，也因此获得该基因的高水平表达。根据所使用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任一种。例如，当在大肠杆菌、其噬菌体或质粒中克隆时，可将以下启动子用于指导相邻DNA片段的高水平转录如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌λ噬菌体的PR和PL启动子以及其它启动子，包括，但不限于lacUV5，ompF，bla，lpp等。另外，通过重组DNA或其它合成DNA技术生产的杂种trp-lacUV(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子可用于进行插入基因的转录。
可以选择细菌宿主细胞菌株和表达载体，使其能抑制所述启动子的作用，除非受到特别诱导。在某些操作中，为了有效转录插入的DNA，必须添加特殊的诱导物。例如，lac操纵子是通过添加乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导的。诸如trp、pro等的多种其它操纵子受到不同的控制。
为了在原核细胞中进行有效的基因转录和翻译也需要特定的起始信号。这些转录和翻译起始信号的“强度”也可以变化，所述强度是通过分别定量基因特异信使RNA和所合成的蛋白测定的。所述含有启动子的DNA表达载体，还可以含有各种“强度”的转录和/或翻译起始信号的组合。例如，在大肠杆菌中的有效翻译需要与起始密码子(“ATG”)的5’末端间隔大约7-9个碱基的SD序列，以便提供核糖体结合位点。因此，可以使用能被宿主细胞核糖体采用的任何SD-ATG组合。所述组合包括，但不限于源于大肠杆菌λ噬菌体的cro基因或N基因或源于大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。另外，可以使用与采用合成核苷酸有关的重组DNA或其它技术生产的任何SD-ATG组合。
一旦将编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的分离的DNA分子克隆到表达系统中，即可将其整合到宿主细胞中。所述整合可以通过上文提到的各种转化形式完成，这要取决于载体/宿主细胞系统。合适的宿主细胞包括，但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、和植物等。
本发明还涉及赋予植物抗病性、改善植物生长、和/或实现植物的昆虫控制的方法。所述方法包括以非感染形式将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子的全部或部分上，处理条件为所述多肽或蛋白接触所述植物或植物种子细胞的全部或部分。另外，还可将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物上，以便由该植物所收获的种子本身能够在植物上产生抗病性，改善植物生长，和/或实现植物的昆虫控制。
作为将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上以便在植物上产生抗病性，影响植物生产和/或控制所述植物或由所述种子长成的植物上的昆虫的另一种方案，可以使用转基因植物或植物种子。在使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白转化过的转基因植物，并在能够有效实现由所述DNA分子赋予植物抗病性，改善植物生长、和/或控制昆虫的条件下生长所述植物。另外，可以提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物种子，并种植在土壤中。然后在由所述DNA分子有效赋予植物抗病性，改善植物生长、和/或控制昆虫的条件下，由播种的种子繁殖植物。
本发明的将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上的实施方案可以用多种方法完成，包括1)施加分离的诱导多肽或蛋白；2)施加不会导致发病并且用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过的细菌；和3)施加能导致某些植物种(但不会导致其所施加的植物种)发病，并且天然含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的基因的细菌。
在本发明的一种实施方案中，可以从丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)中分离本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白，如在下面的实施例中所述。不过，本发明的分离的过敏反应诱导多肽或蛋白优选是通过重组方法生产并纯化的，如上文所述。
在本发明的其它实施方案中，可以通过施加含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的基因的细菌，将本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上。所述细菌必须能够分泌或输出所述多肽或蛋白，以便所述诱导物能够接触植物或植物种子细胞。在以上实施方案中，所述过敏反应诱导多肽或蛋白是在植物体内或在种子上由细菌生产的，或者是在将所述细菌导入植物或植物种子之前产生的。
在本发明的细菌施加方式的一种实施方案中，所述细菌不会导致发病，并且用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过(例如通过重组方式转化)。例如，可以用编码过敏反应诱导多肽或蛋白转化不能在植物上诱导过敏反应的大肠杆菌，然后将其施加到植物上。在本发明的该实施方案中还可以使用除大肠杆菌之外的细菌种。
在本发明细菌施加模式的细菌另一种实施方案中，所述细菌能够致病，并天然含有编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因。所述细菌的例子在上文中提及。不过，在该实施方案中，将所述细菌施加到不易感由该细菌引起的病害的植物或其种子上。例如，丁香假单胞菌番茄致病变种能在番茄上导致发病，但在豆类上不能导致发病。不过，所述细菌能在番茄上引起过敏反应。因此，根据本发明的该实施方案，可将丁香假单胞菌番茄致病变种施加到番茄植物或种子上，以便产生抗病性，改善生长，或控制昆虫，而不会在该物种上引起发病。
可将本发明的方法用于处理多种植物或其种子，以赋予抗病性，改善植物生长，和/或控制昆虫。合适的植物包括双子叶和单子叶植物。更具体地讲，有用的作物类植物可以包括苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣(endive)、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦(zucchini)、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓(raspberry)、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。合适的观赏植物的例子有拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
就将本发明的诱导蛋白或多肽用于产生抗病性的用途而言，可能不会产生对感染的绝对免疫性，但病害的严重程度得到减轻，症状发生被推迟。损伤数量、损伤大小、和真菌病原体的产孢程度都得到减弱。这种赋予抗病性的方法具有处理以前不能处理的病害的潜力，能够系统性处理病害，这些病害由于成本原因而不可能单独处理，并避免使用感染制剂或对环境有害的材料。
本发明赋予病原体抗性的方法可用于赋予包括病毒、细菌、和真菌在内的多种病原体抗性。通过本发明方法可以获得抗性，特别是对以下病毒的抗性烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明，可赋予植物抗性，特别是对以下细菌的抗性青枯假单胞菌、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv.tabaci)，和野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthomonas campestrispv.pelargonii)。使用本发明的方法可赋予植物抗性，特别是对以下真菌的抗性尖镰孢(Fusarium oxysporum)和Phytophthora infestans。
就将本发明的诱导蛋白或多肽改善植物生长的用途而言，可以获得各种形式的植物生长改善或促进作用。这一过程可以在从种子开始的植物生长早期进行或在植物生命的更晚时期进行。例如，根据本发明的植物生长包括更高的产量、提高的所产生种子的质量，提高的种子发芽率增加的植物大小、更大的生物量、更多和更大的果实、更早的果实着色、和更早的果实和植物成熟。结果，本发明可以为种植者提供明显的经济效益。例如，萌发早和成熟早使得作物能够在生长期短的地区种植，否则的话，这些植物不能在这些地区种植。种子萌发百分比的提高，可导致改善的作物植被和更有效的种子利用。较高的产量、较大的体积、和提高了的生物量使得能够从特定的土地面积上获取更大的收益。
本发明的另一方面涉及对植物进行任何形式的昆虫控制。例如，本发明的昆虫控制包括防止昆虫接触业已施加了所述过敏反应诱导物的植物，防止由于采食损害对植物造成的直接昆虫损害，导致昆虫离开所述植物，杀伤接近所述植物的昆虫，干扰昆虫幼虫在所述植物上采食，防止昆虫寄居在宿主植物上，防止寄居的昆虫释放植物毒素等。本发明还避免了由于昆虫感染而对植物造成的后续病害。
本发明能有效地抗多种昆虫。欧洲玉米钻蛀虫是玉米(马齿玉米和甜玉米)的主要害虫，这种害虫还能采食200种以上的植物，包括绿荚菜豆、黄荚菜豆、和利马菜豆和食用大豆、胡椒、马铃薯、和番茄，以及许多杂草物种。其它昆虫幼虫采食害虫能损害蔬菜类作物，这些害虫包括甜菜粘虫、甘蓝尺蠖、玉米穗虫、草地夜蛾、菜蛾、甘蓝根蛆、葱蛆、玉米种子蛆、泡菜野螟(甜瓜野螟)、胡椒蛆和番茄蛲虫。总体上讲，这一类昆虫类害虫代表了世界范围内的蔬菜生产的在经济上最重要的一类害虫。
当对包括叶、茎、根、繁殖体(例如，插穗)等在内的植物的全部或部分进行处理时，施加过敏反应诱导多肽或蛋白的本发明的方法可以通过多种方法完成。该方法可以(但不一定)包括将过敏反应诱导多肽或蛋白浸入植物。合适的施加方法包括高压或低压喷雾、注射、和在进行诱导物施加时对邻近的叶片进行摩擦。在根据本发明的施加实施方案处理植物种子时，可以通过低压或高压喷雾、包衣、浸泡、或注射施加过敏反应诱导蛋白或多肽。本领域技术人员可以设计出其它合适的施加方法，这些方法能够实现过敏反应诱导多肽或蛋白与植物或植物种子的细胞接触。一旦用本发明的过敏反应诱导物进行处理，即可将所述种子播种到天然或人工土壤中，并用常规方法栽培，以便形成植株。在由按照本发明处理的种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导蛋白或多肽处理所述植株，以便赋予植物抗病性，改善植物生长，和/或控制植物上的昆虫。
根据本发明，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白单独或与其它材料混合施加到植物或植物种子上。另外，可以在不同时间将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与其它材料施加到植物上。
根据本发明施加实施方案的适于处理植物或植物种子的组合物含有包含在一种载体里的过敏反应诱导多肽或蛋白。合适的载体包括水、水溶液、糊剂、或干粉。在该实施方案中，所述组合物含有高于500nM过敏反应诱导多肽或蛋白。
尽管不是必须，该组合物可以含有其它添加成分，包括肥料、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、及其混合物。合适的肥料包括硝酸铵。合适的杀昆虫剂的例子是马拉硫磷。有用的杀真菌剂包括克菌丹。
其它合适的添加剂包括缓冲剂、湿润剂、包衣剂和摩擦剂，这些材料可用于促进本发明方法的完成。另外，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与包括粘土和多糖在内的其它常规种子配制和处理材料一起施加到植物种子上。
在本发明的涉及使用转基因植物和转基因种子的另一种实施方案中，没有必要将过敏反应诱导多肽或蛋白局部施加到植物或种子上。相反，按照本领域众所周知的方法，生产用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物。
可以用微量移液管将上述载体直接显微注射到植物细胞中，以便通过机械方法转移重组DNA。Croosway，分子基因遗传学202179-85(1985)，该文献被收作本文参考文献。还可以用聚乙二醇将所述遗传材料转移到植物细胞中。Krens等，自然，29672-74(1982)，该文献被收作本文参考文献。
用能赋予对病原体的抗性的基因转化植物的另一种方法是对宿主细胞进行粒子轰击(又被称为生物轰击转化)。该方法可以用多种方法中的一种实现。首先包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中。该技术披露于授予Sanford等的US4,945,050，US5,036,006和US5,100,792中，以上专利被收作本文参考文献。一般，该方法包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中，以上过程是在能有效穿透所述细胞的外表面，并整合到其内部的条件下进行的。当使用惰性颗粒时，可以通过用含有内源DNA的载体涂敷所述颗粒，将所述载体导入所述细胞中。或者，可以用所述载体包围靶细胞，以便所述载体能够尾随颗粒带入所述细胞。还可将生物活性颗粒(例如含有所述载体和异源DNA的干燥细菌细胞推进到植物细胞中。
导入的另一种方法将原生质体与其它实体、小细胞、细胞、脂质体或其它可融合脂类表面体融合。Fraley等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，该文献被收作本文参考文献。
还可以通过电穿孔将所述DNA分子导入植物细胞。Fromm等，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，855824(1985)，该文献被收作本文参考文献。在该技术中，在存在含有所述表达弹夹的质粒的条件下对植物原生质体进行电穿孔。高电场强度的电脉冲可逆地穿透生物膜，以便导入所述质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂、并再生。
将所述DNA分子导入植物细胞的另一种方法是在用所述基因转化之前用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下，让转化的植物细胞生长形成芽或根，并进一步发育成植株。一般，该方法包括用细菌悬浮液接种植物组织，并在25-28℃下在含抗生素的再生培养基上培养所述组织48-72小时。
农杆菌属是革兰氏阴性根瘤菌科的一个代表性的属。其种决定冠瘿病(根癌农杆菌)和毛根病(发根农杆菌)的发生。冠瘿瘤和毛根中的植物细胞被诱导产生被称为冠瘿碱的氨基酸衍生物，该衍生物仅能由细菌分解代谢。决定冠瘿碱表达的细菌基因，是嵌合表达框的控制元件的常见来源。另外，测定冠瘿碱的存在可被用于鉴定转化的组织。
可以用根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒将异源遗传序列导入合适的植物细胞。通过农杆菌属将Ti或Ri质粒转入感染的植物细胞中，并稳定整合到植物基因组中。J.Schell，科学，2371176-83(1987)，该文献被收作本文参考文献。
在转化之后，必须对转化过的植物细胞进行再生。
由培养的原生质体进行的植物再生披露于以下文献中Evans等，植物细胞培养手册，第1卷(麦克米兰出版公司，纽约，1983)；和Vasil I.R.(著)，植物细胞培养和体细胞遗传学，学术出版社，Orlando，第1卷，1984，或第3卷(1986)，以上文献被收作本文参考文献。
众所周知，实际上所有植物都可以从培养的细胞或组织中再生，包括，但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆科植物的所有主要种。
再生方法因植物种而有所不同，但通常首先提供转化过的原生质体的悬浮液或含有转化的外殖体的培养皿。形成愈伤组织，并由愈伤组织诱导发芽，然后长根。另外，可以在愈伤组织中诱导胚胎形成。这种胚胎像天然胚胎一样萌发形成植株。所述培养基通常含有各种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。将谷氨酸和脯氨酸加入所述培养基也是有利的，特别是对于诸如玉米和苜蓿的种来说尤其如此。有效的再生取决于培养基、基因型、和培养物的历史。如果对以上三个可变参数加以控制，再生通常是可以再现的和可以重复的。
在所述表达框稳定整合到转基因植物中之后，可以通过有性杂交将其转移到其它植物中。可以使用多种杂交技术中的任一种，这要取决于被杂交的物种。
一旦产生这种类型的转基因植物，可以按照常规方法在有编码所述过敏反应诱导物的基因的条件下培养所述植物，导致抗病性，改善植物生长，和/或控制所述植物上的昆虫。另外，从所述转基因植物上回收转基因种子，然后可将所述种子种植到土壤中，并用常规方法栽培，以便产生转基因植物。在能有效赋予植物抗病性、改善植物生长、和/或昆虫的条件下由播种的转基因种子繁殖转基因植物。尽管不希望受理论的限制，所述抗病性、生长改善作用、和/或昆虫控制可能是RNA介导的或是由于诱导多肽或蛋白表达所致。
当转基因植物和植物种子被用于本发明时，与通过施加过敏反应诱导多肽或蛋白处理过的植物和种子所使用还可以用相同的材料进行额外的处理。所述其它材料包括过敏反应诱导物，可通过上述方法将其施加到转基因植物和植物种子上，这些方法包括高压或低压喷雾、注射、包衣、和浸泡。类似地，在从所述转基因植物种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导物处理所述植株，以赋予其抗病性、改善生长、和/或控制昆虫。所述植物还可以用常规植物处理剂(例如，杀昆虫剂、肥料等)处理。
实施例例1-细菌菌株，质粒和培养基。
按常规让大肠杆菌菌株在37℃下生长于LM(Hanahan，D.(1985)参见DNA克隆实践方法，Glover，D.M.著(IRL出版社，牛津)，109-135页，该文献被收作本文的参考文献)或Terrific培养基(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.，分子克隆，第2版(冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)，109-135页(1989)，该书被收作本文的参考文献)中。主要被用于质粒构建的大肠杆菌菌株是DH5α和DH5αF’IQ(生命技术，格兰德岛，NY)。对于标准DNA操作来说，使用购自Stratagene(La Jolla，CA)的pBluescriptII载体。在30℃下，让丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Preston，G.，分子植物微生物相互作用，8717-32(1995)，该文献被收作本文的参考文献)和荧光假单胞菌(Huang，H.C.细菌学杂志，1704748-56(1988)，该文献被收作本文的参考文献)生长在King’sB培养液(King，E.O.，实验室医学杂志22301-07(1954)，该文献被收作本文的参考文献)或hrp-脱阻抑果糖基本培养基(Huynh，T.V.，科学，2451374-77(1989)，该文献被收作本文的参考文献)上。按以下浓度(μg/ml)使用抗生素氨苄青霉素，100；庆大霉素，10；卡那霉素，50；利福平，100；壮观霉素，50；和四环素，20。
例2-DNA操作。
按照标准方法进行DNA操作和PCR反应(Sambtook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.，分子克隆，第2版(冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)(1989)；Innis，M.A.，Gelfand，D.H.Sninsky，J.J.&White，T.J.PCR方法(学术出版社，San Diego)(1990)，以上文献被收作本文的参考文献)。用于测序或PCR的寡核苷酸引物购自生命技术公司。PCR反应使用Pfu聚合酶(Stratagene)。所有DNA测序都是在康乃尔大学生物技术中心用自动DNA测序仪，model373A(应用生物系统，Foster市，CA)进行的。用遗传学计算机组7.3版(Devereaux，J.，基因，12387-95(1984)，该文献被收作本文的参考文献)和DNASTAR(Madison，WI)软件包进行DNA序列分析。业已将hrpW的DNA序列保存在GenBank，保藏号为AF005221。
例3-植物测定。
生长烟草(Nicotiana tabacum L.‘xanthi’)和番茄(Lycopersicum gsculentum Mill.“Moneymaker”)并按公开方法接种细菌(Gopalan，，植物细胞，81095-05(1996)，该文献被收作本文的参考文献)。为了进行毒性试验，将含有104细胞/ml的细菌悬浮液浸入烟草叶片，并在为期5天的时间内每天监测症状的发展和细菌增殖。
例4-分离位于丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000上的hrp簇旁侧的DNA。
用Sau3A部分消化源于丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的总DNA，连接粘粒载体pCPP47(Bauer，D.W.分子植物微生物相互作用，10369-79(1979)，该文献被收作本文的参考文献)的BamHI位点上，并用GigapackIIIGold包装提取物(Stratagene)包装到噬菌体颗粒内。将大约800个细菌菌落转移到菌落/噬斑筛选杂交膜(杜邦NEN研究制品，波士顿，MA)并在高严格条件下用32P标记的含有源于丁香假单胞菌丁香致病变种61的hrpR的PstI片段检测，由此得到一种杂交粘粒pCPP2357。将源于pCPP2357的6.5kbEcoRI片段亚克隆pML123(Labes，M.基因，8937-46(1990)，该文献被收作本文的参考文献)上，产生pCPP2373。通过用MfeI部分消化pCPP2373，并将一个携带源于pHP45Ω的ΩSpr片段的EcoRI片段插入hrpW或转录单位IV构建pCPP2374和pCPP2375(Prenkti，P.，基因，29303-13(1984)，该文献被收作本文的参考文献)。用相同方法由源于丁香假单胞菌丁香致病变种B728A的总DNA在pCPP47中制备粘粒文库。
例5-DNA凝胶印迹。
用EcoRI消化总DNA(2μg)，并通过电泳在0.5％的琼脂糖凝胶上分离。将DNA转移到Immobilon-N膜(Millipore公司，Bedford，MA)并在62℃下在HYB-9杂交溶液(GNTRA系统，Research TrianglePark，NC)中与1.3kb PCR扩增hrpW片段杂交8小时，所述片段是用Peime-ItII试剂盒(Stratagene)用32P标记过的。在1.0％SDS和1×SSC中将所述膜洗涤4次，然后在1.0％SDS和0.2×SSC中洗涤2次。让膜对OMAT X光胶片曝光4-12小时。
例6-制备HrpW及衍生物。
用分别含有BamHI和HindIII位点的引物5N-ATGAGGATCCAGCATCGGCATCACACCC-3N(被称为W1)(序列3)和5N-ATGAAAGCTTAAGCTCGGTGTGTTGGGT-3N(被称为W2)(序列4)由pCPP2368 PCR扩增HrpW完整编码序列。用W1引物和含有HindIII位点的引物5N-ATGAAAGCTTGCCACCGCCTGTTGCAGT-3N(序列5)由pCPP2368 PCR扩增编码HrpW的N-末端186个氨基酸的DNA。用含有BamHI位点的引物5N-ATGAGGATCCGAGGGTGGCGTAACACCG-3N(序列6)和W2引物由pCPP2368 PCR扩增编码HrpW的C-末端236个氨基酸的DNA。扩增产物相当于完整长度的HrpW，将HrpW的N-末端和C-末端直接克隆到pQ30(Qiagen)的BamHI和HindIII位点，分别得到pCPP2377，pCPP2378，和pCPP2379。用于用Ni-NTA自旋柱(Qiagen)分离His-标记过的蛋白的方法是公开方法(Alfano，J.R.，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)。将生长在补充了葡萄糖(0.2％)、酪蛋白氨基酸(0.02％)、和硫胺素(1μg/ml)的M9培养基(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.，分子克隆，第2版(冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)(1989)，该文献被收作本文参考文献)上的大肠杆菌ABLEK(Stratagene)用于获得His6-HrpW，因为其具有明显毒性。按现有方法(Alfano，J.R.，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)用以前获得的抗-HrpZ和抗-HrpW抗体(He.S.Y.，细胞，731255-66(1993)；Yuan，J.细菌学杂志，1786399-6402(1996)，以上文献被收作本文参考文献)和Western-Light化学发光检测系统(Tropix，Bedford，MA)和OMATX光胶片(Kodak，Rochester，NY)进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。例7-构建hrpZ和hrpW突变和丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的标记交换诱变。
为了构建丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000 hrpZ突变，从pCPP2334上缺失位于hrpZ内部的603bpClaI片段(pCPP2334是含有hrpA和hrpZ的LITMUS28(新英格兰生物实验室)衍生物，产生pCPP2336。用引物5N-CCATCGATGGTGGTGGCGATAGCTAGACTTGG-3N(序列7)和5N-CCATCGATGGTCTCGTGATGGCAGGTTG-3N(序列8)由pCPP2988PCR扩增缺少转录终止子的npt11衍生物(Alfano，J.R.，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)，并以正确取向克隆到pCPP2336的单一的ClaI位点。用来自所产生的结构pCPP2338的具有hrpZ突变的BglII/HindIII片段交换pCPP2340上的BglII/HindIII片段，产生pCPP2342。将源于pCPP2342的具有hrpZ突变的5.3kb EcoRI片段克隆到广宿主范围质粒pRK415上(Keen，N.T.等，基因，70191-97(1988)，该文献被收作本文参考文献)，产生pCPP2344。将具有被ΩSpr片段中断的hrpW的源于pCPP2375的8.5EcoRI片段亚克隆到pRK415上，产生pCPP2376。通过电穿孔使pCPP2376和pCPP2344进入丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000中。质粒的丢失和标记的保留是按现有方法进行的(Alfano，J.R.，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)。
例8-hrpW反式表达消除荧光假单胞菌(pHIR11)诱导HR的能力。
为了在丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000中hrpR旁侧的DNA上鉴定任何过敏反应诱导物样基因，分离含有存在于载体pCPP47上的该片段的粘粒pCPP2357。在pML123中构建两种潜在的过敏反应诱导物表型(i)在含有pCPP2274(ΔhrpZpHIR11衍生物)的荧光假单胞菌中促进烟草HR诱导活性的能力(Gopalan，S.等，81095-105(1996)，该文献被收作本文参考文献)，和(ii)干扰携带野生型pHIR11的荧光假单胞菌细胞HR诱导活性(Alfano，J.R.，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)。没有一个亚克隆具有第一种表型，但有一个pCPP2373具有第二种表型。pCPP2373含有源于pCPP2357的6.5kb EcoRI片段，它具有转录单位IV和V(Lorang，J.M.等，分子植物微生物相互作用，849-57(1995)，该文献被收作本文参考文献)，并消除了荧光假单胞菌(pHIR11)(图1)的HR诱导活性。为了确定哪一个转录单位控制所述表型，将ΩSpr片段插入转录单位IV和V的MfeI位点，分别构建pCPP2374和pCPP2375。将两种质粒转入荧光假单胞菌(pHIR11)细胞，然后将其浸入烟草叶片。仅有pCPP2375能阻止HR诱导(图1)，这表明转录单位V编码具有HrpZ的特征之一的蛋白。
例9-hrpW的DNA序列预言了一种蛋白，它具有过敏反应诱导物和Pel域。
测定转录单位V的完整DNA序列。发现了一个1,275bp ORF，被称为hrpW。该基因的前面是共有hrp启动子(Lorang，J.M.等，分子植物微生物相互作用，849-57(1995)，该文献被收作本文参考文献)，而其后面是不依赖于p的终止子(图2A)。预测的hrpW的N-末端序列与由Yuan和He鉴定的5种丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000Hrp分泌蛋白之一Exp-60吻合(Yuan，J.等，细菌学杂志，1786399-402(1996)，该文献被收作本文参考文献)。HrpW的旁侧是以不同方向转录的操纵子，并且似乎是单顺反子操纵子。与过敏反应诱导物相似，所述推测的42.9kDa hrpW蛋白是酸性的，富含甘氨酸，缺少半胱氨酸，并且缺乏芳族氨基酸。推测的hrpW蛋白序列揭示出至少两个不同的结构域(图2B)。一个过敏反应诱导物样结构域(氨基酸1-186)富含谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸。119-186片段含有6个不完整的富含甘氨酸的重复，具有很多酸性和极性残基，与丁香假单胞菌番茄致病变种和丁香假单胞菌丁香致病变种的HrpZ蛋白上的类似重复对仗(图2C)。推测位于该片段上的TPS/DAT基序具有β折叠结构，在该β折叠的一侧具有所有的苏氨酸和丝氨酸残基，并推测甘氨酸重复被回转，以上推测是由Garnier-Robson算法完成的(Plaster，T.N.，参见分子生物学方法，70卷，Swindell，S.R.著(Humana出版社，Totawa，NJ)，227-239页(1997)，该文献被收作本文参考文献)。交替的β折叠和回转可形成β-桶结构。用BLAST进行的数据检索(Altschul，S.S.等，分子生物学杂志，215403-10(1990)，该文献被收作本文参考文献)，发现没有蛋白具有与过敏反应诱导物结构域明显的相似性。
相反，HrpW的C-末端236个氨基酸类似于源于红球藻赤丛壳交配型IV(豌豆腐皮镰孢)的若干真菌Pels和源于胡萝卜软腐欧文氏菌的一种细菌Pel相似。例如，HrpW表现出与红球藻赤丛壳Pel-3具有32％的相同性(Zuo，W.等，Arch.Biochem.Biophys.，323352-60(1995)，该文献被收作本文参考文献)，与源于胡萝卜软腐欧文氏菌的Pel-3具有21.2％的相同性(Liu，Y.等，应用环境微生物学，602545-52，(1994)，该文献被收作本文参考文献)。这一类型的Pels的氨基酸序列不同于大部分已知Pels，并且对该类型蛋白的活性位点或四级结构所知甚少(Henrissat，B.等，植物生理学，107963-66(1995)，该文献被收作本文参考文献)。
例10-hrpW似乎广泛分布于植物病原体细菌中，并且存在于两种丁香假单胞菌致病变种之间保守的片段上。
通过DNA凝胶印迹和DNA序列分析检验hrpW的分布和hrpW片段的保守性。通过PCR扩增hrpW ORF，并用作高严格性凝胶印迹杂交的探针与EcoRI消化过的源于典型致坏死革兰氏阴性植物病原体的DNA杂交(图3)。所述hrpW至少能与试验过的每一种丁香假单胞菌致病变种的一条特有带杂交大豆致病变种、疱疹致病变种、豌豆致病变种、菜豆致病变种、烟草致病变种、和丁香致病变种菌株B728A和61(弱)。还观察到了与绿黄假单胞菌，Ralstonia solanacearum(弱)，和野油菜黄单胞菌致病变型假辣根致病变种和辣椒斑点致病变种的杂交。未观察到与源于欧文氏菌的DNA杂交。通过分离粘粒pCPP2347对存在于丁香假单胞菌丁香致病变种B728A上的该片段进行进一步检验，该片段具有与hrpR和hrpW杂交的DNA。限制性作图和部分DNA序列分析证实该片段在以上两种丁香假单胞菌的致病变型之间是高度保守的，而且，丁香假单胞菌丁香致病变种B728A hrpW也具有Pel结构域(图2A)。例11-HrpW及其过敏反应诱导物域能在烟草叶片中诱导HR-样坏死，但HrpW和Pel域缺少可检测的Pel活性。
在pQE30中构建hrpW的PCR亚克隆，以便生产HrpW的衍生物和两种具有N-末端His6-标记的结构域片段。通过Ni-NTA层析对所述融合蛋白进行部分纯化，并通过SDS-PAGE和用抗丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000Hrp分泌蛋白的抗体免疫吸印进行分析(图4)。抗-HrpW抗体能结合完整长度的HrpW和两个片段，但与过敏反应诱导物结构域片段的结合明显较弱。产生HrpW的转化体在所述质粒的保持方面十分不稳定。因此，HrpW的含量很低，Ni-NTA层析得到一种仅仅部分富集了HrpW的制剂。不过，所述HrpW制剂能在烟草叶片中诱导过敏反应(“HR”)-样坏死，这种坏死明显不同于由丁香假单胞菌丁香致病变种61HrpZ所引起的坏死，这种坏死症状仅仅在大约12小时之后出现(图5)。所述诱导物活性是热稳定的，并且对蛋白酶敏感，而载体对照制剂不产生反应。所述部分纯化的过敏反应诱导物结构域片段还能诱导一种稍微推迟的坏死，而且，该反应类似于由HrpZ引起的反应，能够被1.0mM氯化镧(一种钙通道抑制剂)抑制(图5)。因此，由HrpW harpin结构域引起的坏死是一种活性植物反应。相反，获自大肠杆菌JA-221(pPEL748)的纯化菊欧文氏菌PelE(Ken，N.T.等，细菌学杂志，168595-606(1986)，该文献被收作本文参考文献)能诱导黑色、浸软坏死，这种坏死不能被1.0mM氯化镧，50μM矾酸钠，或100μM环己酰亚胺抑制。这一结果与预期结果一致，即果胶酶的杀伤作用是通过弱化细胞壁，分解膨胀的原生质体，而不是诱导细胞死亡程序而实现。另外，Pel结构域片段在浸泡过的烟草组织中不能引起可见的反应。通过使用灵敏的A230测定使用4，5-不饱和果胶产品检验了所有3种蛋白的Pel活性(Collmer，A.，酶学方法161329-35(1988)，该文献被收作本文参考文献)。尽管尝试用聚半乳糖醛酸和31％的甲基酯化衍生物作底物，用氯化钙和氯化锰作辅助因子，并试验了若干pH水平，但都没有检测到活性。例12-丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000HrpzHrpW突变型诱导HR的能力明显减弱。
将标记交换诱变用于构建丁香假单胞菌番茄致病变种突变型CUCPB5094(ΔhrpZnptII)，CUCPB5095(hrpWΩSpr(mabd/cycOB5985*ΔhrpZnptII hrpWΩSpr)。ΔhrpZnptII突变在功能上是无极性的，并且所有突变型结构用DNA凝胶印迹和免疫印迹证实。用两种结构水平，用丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000和3种突变型衍生物浸入烟草叶片，并在48小时之后检查发生坏死的浸入组织的百分比(表1)表1-丁香假单胞菌番茄致病变种DC30000hrpZ和hrpW突变型在烟草叶片中诱导过敏反应的频率降低
a在接种48小时之后，与总数量相比接种组表现出50％以上的崩溃。
仅有hrpZ hrpW突变型在诱导强的HR方面的频率明显降低。为了确定该突变型在毒力方面是否也降低，在为期5天的时间内监测接种了所述突变型和野生型DC3000的番茄叶片的症状产生和细菌增殖。未发现二者之间的差别。为了证实丁香假单胞菌中的预期的第二种过敏反应诱导物，筛选丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000hrp基因片段DNA上的具有过敏反应诱导物样表型的基因。HrpW具有预期的、但似是而非的表型，即当以反式形式表达时能干扰HR诱导，并证实与以前鉴定的转录单位V相同，并且编码以前鉴定的Hrp分泌蛋白EXP-60(Lorang，J.M.等，分子植物微生物相互作用，849-57(1995)；Yuang，J.等，细菌学杂志1786399-402(1996)，以上文献被收作本文参考文献)。HrpW的若干特性及其产物与未解决的问题相关，这些问题涉及过敏反应诱导物的功能，寄生启动“Avr”蛋白通过植物细胞壁转移到植物细胞内部的机制，毒力基因座在植物病原性细菌中的保守性和组构。
HrpW具有过敏反应诱导物的若干一般特性，包括氨基酸组成，热稳定性，出人意料地在SDS-PAGE中的低迁移率，以及完整长度或截短的蛋白诱导HR的能力(Allfano，J.R.等，植物细胞，81683-98(1996)；He.S.Y.等，细胞731255-66(1993)；Wei，Z.M.等，科学25785-8(1992)；Allfano，J.R.等，分子微生物学，19715-28(1996)，以上文献被收作本文参考文献)。HrpW也具有6个富甘氨酸重复，类似于存在于HrpZ上的重复序列，并且是HrpZ的富含重复片段结构的再现(Allfano，J.R.等，分子微生物学，19715-28(1996)，该文献被收作本文参考文献)。在过敏反应诱导物中一般缺乏半胱氨酸残基的特性在HrpW上表现尤其突出，因为与同源真菌和细菌Pels的比较发现，在所述蛋白中所有6个保守的半胱氨酸残基在HrpW中都被取代了。以上所有特性提供了这样一种可能性，即诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)FlgM蛋白的过敏反应诱导物在缺乏其底物或靶的条件下可能处于非折叠状态(Daughdrill，G.W.等，自然结构生物学，4285-91(1997)，该文献被收作本文参考文献)。这一点似乎对FlgM很重要，因为通过鞭毛对球蛋白运动进行空间限制。对于过敏反应诱导物来说，未折叠的状态对于穿透植物细胞壁基质可能比通过Hrp途径转运更重要，因为若干被认为通过所述途径向植物细胞内转运的Avr蛋白较大，并且富含半胱氨酸。
分离的丁香假单胞菌HrpZ和HrpW蛋白在浸入烟草叶片之后诱导HR的能力，有可能不能直接反映其生物学功能，因为Avr蛋白似乎对于诱导细菌HR来说是必要的并且是足够的(一旦输入植物细胞质之后)(Allfano，J.R.等，植物细胞，81683-98(1996)，该文献被收作本文参考文献)。因此，很多植物对过敏反应诱导物的过敏性可能是所述蛋白局部修饰植物细胞壁结构以便支持寄生启动“Avr”蛋白输送的主要活性的副产品。若干品系的证据表明，丁香假单胞菌过敏反应诱导物可能是这样一种Hrp分泌系统的细胞外成分(i)hrpZ定位于hrp分泌操纵子上，它在丁香假单胞菌致病变型之间是保守的(Preston，G.等，分子植物微生物相互作用，8717-32(1995)，该文献被收作本文参考文献)，而hrpW(与典型的avr基因相反)似乎是保守的，并且连接于hrp簇上；(ii)而Avr蛋白似乎仅在接触宿主之后分泌到细菌细胞质外面(类似于耶尔森氏菌Yop效应子蛋白的接触决定型III分泌(Cornelis，G.R.等，分子微生物学，43861-67)1977，该文献被收作本文参考文献)，当Hrp系统被转录激活时，分泌HrpZ和HrpW，表明它们可能是转运装置的成分；(iii)发现hrpZ或hrpW的反式表达能抑制野生型细菌的HR诱导活性，这与作为化学计量灵敏蛋白组件的成分的过敏反应诱导物一致；(iv)HrpZ与植物细胞壁而不是细胞膜相关，并且，所述蛋白不能在没有细胞壁的原生质体上引起反应(Hoyos，M.E.等，分子植物微生物相互作用，9608-16(1996)，该文献被收作本文参考文献)；(v)Pel结构域在HrpW中的存在明显暗示了与细胞壁的果胶部分的相互作用，该部分是控制细胞壁基质孔度的成分(Baron-Epel，O.等，植物，175389-95(1988)，该文献被收作本文参考文献)。大型Avr蛋白，如AvrBs3(125kDa)(Van den Ackerveken等，细胞，871307-16(1996)，该文献被收作本文参考文献)被输送到植物细胞质中的日益增加的证据表明，Hrp系统可以打开一个通过植物细胞壁的通道。
HrpW蛋白不具有可检测的Pel活性。在体外没有可检测活性的Pel同系物也存在于若干植物的花粉和花柱组织中，而该蛋白上的催化残基的保守性，表明其具有隐蔽性酶促功能(Henlissat，B.等，植物生理学，107963-76(1995)，该文献被收作本文参考文献)。在HrpW上缺乏可检测的Pel活性并不令人吃惊，因为丁香假单胞菌的生体营养性寄生和典型Pels在植物组织上的损伤作用。不过，丁香假单胞菌和解淀粉欧文氏菌HrpW蛋白的Pel结构域的保守性表明，这些蛋白确实具有Pel相关的功能。相反，在所述诱导物活性结构域上的极端变化与所述蛋白的诱导物活性的酶促基础相矛盾。
转录单位V突变不能减弱丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的HR或毒力表型(Lorang，J.M.等，分子植物微生物相互作用，849-57(1995)，该文献被收作本文参考文献)，而hrpZhrpW突变型仅在其HR表型方面显著减弱(不过毒力测定有可能缺乏微弱的降低)。对以上发现的一种解释是丁香假单胞菌能产生类似于菊欧文氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌的多种Pel异构酶的额外过敏反应诱导物样蛋白(Barras，F.等，植物病理学年度综述，32201-34(1994)，该文献被收作本文参考文献)。可能是由于宿主-寄生物共同进化或细胞壁结构的复杂性，丰度(或微妙的特化)可能是与植物细胞壁广泛相互作用的毒力系统的特征。
与若干其它植物病原性细菌，特别是绿黄假单胞菌和野油菜黄单胞菌中的hrpW杂交的序列的存在，由于若干原因而变得重要。由于hrpW不能与源于解淀粉欧文氏菌或胡萝卜软腐欧文氏菌的DNA杂交，而这两种细菌已知能分别产生相似的过敏反应诱导物和Pel，与绿黄假单胞菌和野油菜黄单胞菌的杂交表明，以上细菌能产生与HrpW高度相似的蛋白。反过来，这一结果又暗示绿黄假单胞菌具有Hrp系统，而野油菜黄单胞菌能产生过敏反应诱导物。尽管业已对野油菜黄单胞菌的Hrp系统进行过深入鉴定(Bonas，U.参见“微生物学和免疫学当代主题”，192卷，植物和动物的细菌致病性-分子和细胞机制，Dangl，J.L.著(Springer-Verlag，柏林)，79-98页(1994)，该文献被收作本文参考文献)，尚未发现在培养物中通过Hrp系统分泌的过敏反应诱导物或任何其它蛋白。可以将hrpW用作探针，由野油菜黄单胞菌克隆编码所述蛋白的基因。
所述致病性孤岛概念提示，hrp基因簇位于富含毒力相关基因的较大区域上(Groisman，E.A.等，细胞87791-94(1996)；Allfano，J.R.等，植物细胞，81683-98(1996)，以上文献被收作本文参考文献)。预计所述毒力片段的某些部分具有效应物编码基因，该基因可以“切换”，以便寄生物与宿主的快速共进化。位于hrp簇的与hrpR相反一端的hrmAlavrPphE基因座提供了这样一种例子。另外，更保守的片段会具有与必须寄生功能相关的基因，如将效应物(例如，“Var”)蛋白输送到宿主细胞内部的功能。对丁香假单胞菌番茄致病变种和丁香致病变种的比较表明，hrpW位于这样一个区域上。整体上讲，以上观察表明HrpW在细菌植物致病性方面广泛起着重要作用。尽管过敏反应诱导物Avr蛋白必须通过III型途径，但其在结构特征方面，其在培养物中分泌的能力方面，以及其对宿主范围确定和其它毒力作用的影响方面明显不同。具有Pel结构域的丁香假单胞菌过敏反应诱导物的发现提供了其在作用位点方面不同的进一步证据，很多Var蛋白作用于植物细胞内部，而过敏反应诱导物作用于细胞外部。
尽管业已出于说明目的而对本发明进行了详细说明，但应当理解的是，以上细节仅仅是用于说明目的的，本领域技术人员可以在不脱离由以下权利要求书限定的本发明构思和范围的前提下作出各种变化。
序列表(1)一般资料(i)申请人Cornell Research Foundation，Inc.(ii)发明名称源于丁香假单胞菌的过敏反应诱导物及其用途(iii)序列数8(iv)相关地址(A)收件人尼克松，哈格雷佛，迪旺司&多伊尔LLP(B)街道邮政信箱1051，克林顿广场(C)城市洛切斯特(D)州纽约(E)国家美国(F)邮编14603(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(vii)在先申请数据(A)申请号US60/055,108(B)申请日1996年8月6日(viii)律师/代理人资料(A)姓名戈德曼，米切尔L.
(B)注册号30，727(C)资料/档案号19603/1582(ix)通信资料(A)电话(716)263-1304(B)传真(716)263-1600(2)序列1资料
(i)序列特征(A)长度1729个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列1TCCACTTCGC TGATTTTGAA ATTGGCAGAT TCATAGAAAC GTTCAGGTGT GGAAATCAGG 60CTGAGTGCGC AGATTTCGTT GATAAGGGTG TGGTACTGGT CATTGTTGGT CATTTCAAGG120CCTCTGAGTG CGGTGCGGAG CAATACCAGT CTTCCTGCTG GCGTGTGCAC ACTGAGTCGC180AGGCATAGGC ATTTCAGTTC CTTGCGTTGG TTGGGCATAT AAAAAAAGGA ACTTTTAAAA240ACAGTGCAAT GAGATGCCGG CAAAACGGGA ACCGGTCGCT GCGCTTTGCC ACTCACTTCG300AGCAAGCTCA ACCCCAAACA TCCACATCCC TATCGAACGG ACAGCGATAC GGCCACTTGC360TCTGGTAAAC CCTGGAGCTG GCGTCGGTCC AATTGCCCAC TTAGCGAGGT AACGCAGCAT420GAGCATCGGC ATCACACCCC GGCCGCAACA GACCACCACG CCACTCGATT TTTCGGCGCT480AAGCGGCAAG AGTCCTCAAC CAAACACGTT CGGCGAGCAG AACACTCAGC AAGCGATCGA540CCCGAGTGCA CTGTTGTTCG GCAGCGACAC ACAGAAAGAC GTCAACTTCG GCACGCCCGA600CAGCACCGTC CAGAATCCGC AGGACGCCAG CAAGCCCAAC GACAGCCAGT CCAACATCGC660TAAATTGATC AGTGCATTGA TCATGTCGTT GCTGCAGATG CTCACCAACT CCAATAAAAA720GCAGGACACC AATCAGGAAC AGCCTGATAG CCAGGCTCCT TTCCAGAACA ACGGCGGGCT780CGGTACACCG TCGGCCGATA GCGGGGGCGG CGGTACACCG GATGCGACAG GTGGCGGCGG840CGGTGATACG CCAAGCGCAA CAGGCGGTGG CGGCGGTGAT ACTCCGACCG CAACAGGCGG900TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCACACCCAC TGCAACAGGT GGCGGCAGCG GTGGCACACC960CACTGCAACA GGCGGTGGCG AGGGTGGCGT AACACCGCAA ATCACTCCGC AGTTGGCCAA 1020CCCTAACCGT ACCTCAGGTA CTGGCTCGGT GTCGGACACC GCAGGTTCTA CCGAGCAAGC 1080CGGCAAGATC AATGTGGTGA AAGACACCAT CAAGGTCGGC GCTGGCGAAG TCTTTGACGG 1140CCACGGCGCA ACCTTCACTG CCGACAAATC TATGGGTAAC GGAGACCAGG GCGAAAATCA 1200GAAGCCCATG TTCGAGCTGG CTGAAGGCGC TACGTTGAAG AATGTGAACC TGGGTGAGAA 1260CGAGGTCGAT GGCATCCACG TGAAAGCCAA AAACGCTCAG GAAGTCACCA TTGACAACGT 1320GCATGCCCAG AACGTCGGTG AAGACCTGAT TACGGTCAAA GGCGAGGGAG GCGCAGCGGT 1380CACTAATCTG AACATCAAGA ACAGCAGTGC CAAAGGTGCA GACGACAAGG TTGTCCAGCT 1440CAACGCCAAC ACTCACTTGA AAATCGACAA CTTCAAGGCC GACGATTTCG GCACGATGGT 1500TCGCACCAAC GGTGGCAAGC AGTTTGATGA CATGAGCATC GAGCTGAACG GCATCGAAGC 1560TAACCACGGC AAGTTCGCCC TGGTGAAAAG CGACAGTGAC GATCTGAAGC TGGCAACGGG 1620CAACATCGCC ATGACCGACG TCAAACACGC CTACGATAAA ACCCAGGCAT CGACCCAACA 1680CACCGAGCTT TGAATCCAGA CAAGTAGCTT GAAAAAAGGG GGTGGACTC 1729(2)序列2资料(i)序列特征(A)长度424个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线形(ii)分子类型蛋白(xi)序列描述序列2Met Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu1 5 10 15Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Gln Pro Asn Thr Phe Gly20 25 30Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala Ile Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly35 40 45Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val50 55 60Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn Ile65 70 75 80Ala Lys Leu Ile Ser Ala Leu Ile Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr85 90 95Asn Ser Asn Lys Lys Gln Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln100 105 110Ala Pro Phe Gln Asn Asn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr130 135 140Pro Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly145 150 155 160Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly165 170 175Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr180 185 190Pro Gln Ile Thr Pro Gln Leu Ala Ash Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr195 200 205Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile210 215 220Asn Val Val Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp225 230 235 240Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Met Gly Asn Gly Asp245 250 255Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu Gly Ala Thr260 265 270Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu Asn Glu Val Asp Gly Ile His Val275 280 285Lys Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr Ile Asp Asn Val His Ala Gln290 295 300Asn Val Gly Glu Asp Leu Ile Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala305 310 315 320Val Thr Asn Leu Asn Ile Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp325 330 335Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys Ile Asp Asn Phe340 345 350Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly Gly Lys Gln355 360 365Phe Asp Asp Met Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ile Glu Ala Asn His Gly370 375 380Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr385 390 395 400Gly Asn Ile Ala Met Thr Asp Val Lys His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln405 410 415Ala Ser Thr Gln His Thr Glu Leu420(2)序列3资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列3ATGAGGATCC AGCATCGGCA TCACACCC 28(2)序列4资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列4ATGAAAGCTT AAGCTCGGTG TGTTGGGT 28(2)序列5资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列5ATGAAAGCTT GCCACCGCCT GTTGCAGT 28(2)序列6资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列6ATGAGGATCC GAGGGTGGCG TAACACCG 28(2)序列7资料(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列7CCATCGATGG TGGTGGCGAT AGCTAGACTT GG 32(2)序列8资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单(D)拓扑结构线形(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述序列8CCATCGATGG TCTCGTGATG GCAGGTTG 28
权利要求
1.一种编码过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子，其中，所述分离的DNA分子选自下列一组(a)包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子，(b)编码包括序列2所示氨基酸的蛋白的DNA分子，(c)能在严格条件下与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子，和(d)互补于DNA分子(a)、(b)、和(c)的DNA分子。
2.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子。
3.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是编码包括序列2所示氨基酸的蛋白的DNA分子。
4.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是能在严格条件下与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的DNA分子。
5.如权利要求1的分离的DNA分子，其中，所述DNA分子是互补于DNA分子(a)、(b)、和(c)的DNA分子。
6.一种用权利要求1的DNA分子转化过的表达载体。
7.如权利要求6表达载体，其中，所述DNA分子处于合适的有义取向和正确的读框。
8.一种用权利要求1的DNA分子转化过的宿主细胞。
9.如权利要求8的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自下列一组植物细胞或细菌细胞。
10.如权利要求8的宿主细胞，其中，所述DNA分子是用表达载体转化过的。
11.一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物。
12.如权利要求11的转基因植物，其中，所述植物选自下列一组苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘著、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
13.如权利要求11的转基因植物，其中，所述植物选自下列一组拟南芥、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
14.一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物种子。
15.如权利要求14的转基因植物种子，其中，所述植物种子选自下列一组苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗
16.如权利要求14的转基因植物种子，其中，所述植物种子选自下列一组拟南芥、非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
17.一种分离的过敏反应诱导蛋白或多肽，选自下列一组包含序列2所示氨基酸的蛋白或多肽和由能与包括序列1的核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码的氨基酸。
18.如权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中，所述蛋白或多肽具有包括序列2的氨基酸。
19.如权利要求17的分离的蛋白或多肽，其中，所述蛋白或多肽是由能与包括序列1所示核苷酸序列的DNA分子杂交的核酸编码。
20.一种赋予植物抗病性的方法，包括在能有效赋予抗病性的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
21.如权利要求20的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
22.如权利要求20的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
23.一种改善植物生长的方法，包括在能有效改善植物生长的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
24.如权利要求23的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
25.如权利要求23的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
26.一种赋予植物抗病性的方法，包括在能有效控制昆虫的条件下以非感染形式将权利要求17的蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
27.如权利要求26的方法，其中，在所述施加过程中处理植物。
28.如权利要求26的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植物。
29.一种赋予植物抗病性的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效赋予抗病性的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
30.如权利要求29的方法，其中，提供了一种转基因植物。
31.如权利要求29的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
32.一种改善植物生长的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效改善植物生长的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
33.如权利要求32的方法，其中，提供了一种转基因植物。
34.如权利要求32的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
35.一种对植物进行昆虫控制的方法，包括提供一种用权利要求1的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子，和在能有效控制昆虫的条件下生长转基因植物或由所述转基因植物种子产生的转基因植物。
36.如权利要求35的方法，其中，提供了一种转基因植物。
37.如权利要求35的方法，其中，提供了一种转基因植物种子。
38.一种组合物，包括一种如权利要求17的蛋白或多肽，和一种载体。
39.如权利要求38的组合物，还包括选自下列一组的添加剂肥料、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、及其混合物。
全文摘要
本发明涉及能在植物中引起过敏反应的分离的蛋白或多肽,以及编码所述过敏反应诱导蛋白或多肽的分离的DNA分子。所述分离的蛋白或多肽以及分离的DNA分子可用于赋予植物抗病性,改善植物生长,和/或控制植物上的昆虫。这一目的可以通过以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上而实现,处理条件为能够有效赋予抗病性,改善植物生长,和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。另外,可以提供用编码过敏反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物或植物种子,并且生长所述转基因植物或由所述转基因植物种子产生的植物,生长条件为能有效赋予抗病性,改善植物生长,和/或控制植物或由所述植物种子长成的植物上的昆虫。
文档编号C12N5/10GK1274259SQ98809922
公开日2000年11月22日 申请日期1998年7月24日 优先权日1997年8月6日
发明者A·科尔默, A·查科夫斯基, J·R·阿法诺 申请人:康乃尔研究基金会有限公司