专利名称：植物细胞鉴定体系的制作方法
即使在现代生物技术出现以前，对具有独特并有商业价值特性的植物的不同品系的研究已经成为农业科学的一个重要分支。许多这样的植物或其细胞或者通过专利权或者作为商业秘密而成为专有的。因此，植物的拥有者对追寻和鉴定他们的专有植物的分布有兴趣，其中的一些植物可能已经落入了专利侵权者或者盗用商业秘密的个人的手中。
遗传鉴定生物体、比如植物的本方法包括检测限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP分析依赖于一种植物的内源基因组序列与另一种植物的内源基因组序列比较时的不同以及相似性。
本发明涉及一种通过向植物基因组中引入预定的DNA序列来登记植物或植物细胞的新方法。通过标准的方法、比如Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)，可以容易地检测或追溯到这些DNA序列。
因此，本发明的特征在于一种通过向植物基因组中引入100个碱基对或者小于100个碱基对的DNA序列来遗传标记植物的鉴定方法，所述DNA序列在基因组中是特有的。DNA序列可以有80个碱基对或者更少(例如60或40个碱基对或者更少)，或者至少有10个碱基对(例如至少有30，50或70个碱基对)，但其上限不超过100个碱基对。DNA序列可以包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少2个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列。另一方面，DNA序列可以包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中第一序列与第二序列是相同的。同向重复序列是指沿着双链DNA分子的一条链、全部以同样的取向的单序列的拷贝序列。相同序列是指以相同的5’至3’取向的相同的序列。
本发明还包括一种通过把DNA序列引入植物基因组中来遗传标记植物的鉴定方法，所述DNA序列在基因组中是特有的并且沿着该DNA序列呈直线排列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少2个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中第一序列、第二序列和鉴定序列不含改变转录或者编码功能蛋白的序列。DNA序列可以选择性地包括选择性标记基因。
此外，本发明的特征在于一种通过将DNA序列引入植物基因组中来遗传标记植物的鉴定方法，所述DNA序列在基因组中是特有的并且不含改变转录或者编码功能蛋白的序列。所述DNA序列可以包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少2个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列。另一方面，所述DNA序列可以包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中第一序列和第二序列是相同的。
在本发明中进一步包括一种通过将DNA序列引入植物基因组中来遗传标记植物的鉴定方法，所述DNA序列在基因组中是特有的并且沿着该DNA序列呈直线排列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或者更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中第一序列、第二序列和鉴定序列不含改变转录或者编码功能蛋白的序列，而第一序列和第二序列是相同的。所述DNA序列可以选择性地包括选择性标记基因。
通过本领域中已知的任何标准方法、包括通过根瘤农杆菌或者粒子轰击，可以将本发明的方法中使用的DNA序列引入植物基因组中。
在本发明的方法中可以选择性使用的选择性标记基因为其活性促进了含有被引入的DNA序列的植物细胞的选择的任意基因。
功能蛋白为一种多肽，除了它的结构特征之外，它还具有已知的生物化学活性(例如分子量，pKa，等电点等等)。因此，在凝胶上呈现出20kDa、甚至更小的分子量的多肽不是功能蛋白。
本发明的方法提供了一种通过把特有的外源DNA序列引入植物基因组中来鉴定植物的新的方法。在一些实施方案中，所述DNA序列不含有影响植物基因表达或者编码功能蛋白的序列。这样的DNA序列具有多个优点。例如，外源DNA序列不会以任何方式影响植物的生物学性质，从而这就减轻了政府和社会的担心，因为他们担心具有不同于野生型植物的生物学活性的重组植物对人类或者环境有害。因此，可以预计为人类消耗或者在土地上培育所认可的植物可以是进行了遗传标记的、并且没有规章限制的障碍。
从下面的附图以及详细的描述，显而易见本发明的其它特征或优点。
图1为表示在本发明的方法中使用的几个DNA序列鉴定植物的地理起源的示意图。10个碱基对的同向重复序列表示植物的地理起源，例如来自美洲(AAAAAAAAAA；SEQ ID NO1)、来自非洲(CCCCCCCCCC；SEQ ID NO2)、来自亚洲(GGGGGGGGGG；SEQ ID NO3)、来自欧洲(TTTTTTTTTT；SEQ ID NO4)或者来自太平洋岛屿(ACACACACAC；SEQ ID NO5)。介于同向重复序列之间的每个箱表示关于植物的性质和起源的其它的序列信息。
图2为表示排除了引物序列(AAAAAAAAAAAAACCCCAAAGTAAACCCCAAAGTAAACCCCAAAGTAAAAAAAAAA；SEQ ID NO6)的特异的100个碱基对的DNA序列的示意图，它用于标记起源于美洲的植物。
本发明基于一种通过将人工DNA序列引入植物细胞基因组中来遗传标记植物或者植物细胞的新方法。
预计短序列(100个碱基对或者更少的碱基对)的用途也在本发明的范围内。可以把短序列划分为4个部分，以便具体地说明植物的拥有者(例如公司)、地理起源(例如欧洲)、国家起源(例如德国)以及其它的植物特征(例如马铃薯)。
不再进一步进行详细的描述，人们相信在以上公开的内容以及下面的描述的基础上，本领域的技术人员将在最大可能的范围内利用本发明。下面的描述仅仅构成对本领域的技术人员如何实践本发明的说明，并且不以任何方式限制公开内容的其余部分。在本公开内容中引用的任何出版物在此插入本文、仅供参考。100个碱基对的登记序列可以使用标准的寡核苷酸合成技术来合成100个碱基对或者更少个碱基对的一短段DNA及其补体。可以修饰该片段，以便含有用于克隆进入质粒载体的侧翼序列。在图1中说明了在本发明的方法中有用的一种DNA序列。
参照图1，显示出一组DNA序列，其中的每一个都标记着来自世界的具体地区的植物。从5’向3’移动，所述的100个碱基对的DNA序列包括(1)有22个碱基对的引物序列A，(2)代表植物的地理起源的有10个碱基对的序列(SEQ ID NOs1-5)，(3)如下所述的有36个碱基对的鉴定序列，(4)有10个碱基对的序列的同向重复序列，以及(5)有22个碱基对的引物序列B。鉴定序列为具有12个核苷酸的序列的三个同向重复序列，具有12个核苷酸的序列按照直线排列是由具体地说明植物的起源国家的3个核苷酸、具体地说明公司拥有者的4个核苷酸以及具体地说明植物性质的5个核苷酸组成的。使这一“3+4+5”ID序列重复三次，并且在重复序列之间没有间插序列。
一般说来，鉴定序列含有明确地具体说明所标记的植物的信息。在上面的实例中，鉴定序列包括标记植物的起源国家、植物的拥有者以及植物品种的性质的序列。
为了把这些序列引入质粒载体(例如根瘤农杆菌双重载体、比如除去了卡那霉素选择性标记基因的标准的pBI101载体)，可以通过化学的方法或者酶法将ID序列引入载体中。通过标准的克隆技术(Sambrook等编辑，《分子克隆实验室手册第二版》，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，1989)，可以把完整的100个碱基对的序列引入载体的合适区域。
可以使用含有将要被引入植物基因组的序列的pBI101通过电穿孔或冷冻/融化来转化常用的根瘤农杆菌菌株LBA4404。然后，用转化的细菌感染靶植物细胞。在克隆和培养植物细胞之后，通过从克隆中分离出基因组DNA并使用引物A和引物B进行PCR来证实含有100个碱基对的序列的单个克隆(一般至少有10个克隆)。若有的话，可以选择性地测定PCR产物的序列。然后使得到证实的克隆分化为成熟的植物。
通过从第一枝条、幼苗或其它组织中分离出基因组DNA并使用引物A和B进行PCR，可以进行被整合的鉴定序列的第二次验证。还可以再次测定PCR产物的序列。此时，还应当证实植物的表型和倍性。
在下面的文献中可以发现以上所讨论的关于质粒和细菌菌株的其它详细情况Kado，《基因工程》201-24，1998；McCormac等人，《分子生物技术》9155-159，1998；Guerrero等人，《植物分子生物学》21929-935，1993；以及在这些文献中引用的参考文献。选择性标记的内含物为了促进含有登记序列的植物细胞克隆的分离，如图2所示，可以把上述100个碱基对的登记序列克隆到野生型pBI101载体中。然后，通过金粒子轰击(例如参见Wakita等人，《基因遗传系统》73219-226，1998；Sawasaki等人，《基因》21827-35，1998；以及在这些文献中引用的参考文献)把质粒引入植物细胞中。简而言之，在250μl的Eppendorf管中将37μl的40mg/ml金贮存液(直径为1.6μm；Biorad)依次与25μl的水和2μg的质粒DNA混合。在每次加入之前和之后都要旋转试管。沿试管侧壁以单独的液滴形式加入20μl 100nM的游离碱性亚精胺和50μl2.5M的CaCl2，以避免两种溶液中的任一种与DNA/金溶液过早的混合。然后通过旋转混合试管10秒钟以使DNA附着在金颗粒上，该金颗粒被沉淀。离心试管5秒钟，并除去上清液。加入100μl 100％的乙醇，并把试管放置在冰上。然后使用体积为5μl的超声处理过的金/DNA混合物来进行每次的轰击。
然后在含有足够的卡那霉素的培养基中培育受过轰击的细胞，以便选择含有所述100个碱基对的序列的植物细胞。每组或每片卡那霉素一抗性组织(通常至少为10个克隆)被认为是独立的转化事件。然后使转化的组织分化成为成熟的植物。如上所述进行登记序列是否存在的验证。登记号体系从任何登记过的植物中，可以对整合的登记序列进行PCR扩增并且测序。可以用得到的序列来给植物指派登记号。例如，如下把“3+4+5”ID序列转换成一个数字。对每个碱基来说，A＝1，C＝2，G＝3，而T＝4。然后把12个碱基对的同向重复序列AAACCCTAAAGT(SEQ ID NO7；参见附图2)转换为111222411134这样的一串数字。注意序列CCCT和对应的数字2224代表着植物的拥有者(参见上文)。把由12个碱基对的序列得到的数字加在一起，便得到了总数23。因此在该体系下，所述植物将含有经遗传嵌入的登记号2224.23。
当嵌入的登记序列不含影响植物转录的序列或者编码功能蛋白的序列时，所述登记序列对除拥有者以外的每个人都是隐藏着的，其中拥有者已经保守了引物A序列、引物B序列或者两者的秘密。情况正是如此，因为从生物学和生物化学的角度来看，这些被标记的植物与原始的未标记的植物没有什么不同。
应当理解的是，当结合本发明的详细描述已经描述了本发明的时候，前面的描述是用来说明、并不是限制本发明的范围，而本发明的范围是由所附的权利要求的范围限定的。其它的方面、优点和改进也在本发明的范围之内。
例如，可以与本发明的方法一起使用其它的加密(encryption)层，以便保护嵌入的遗传标记的透明度。
权利要求
1.一种遗传标记植物的鉴定方法，该方法包括向植物基因组中引入由100个碱基对或者更少的碱基对组成的DNA序列，所述DNA序列在所述基因组中是特有的。
2.权利要求1的方法，其中所述DNA序列由80个碱基对或者更少的碱基对组成。
3.权利要求2的方法，其中所述DNA序列由60个碱基对或者更少的碱基对组成。
4.权利要求3的方法，其中所述DNA序列由40个碱基对或者更少的碱基对组成。
5.权利要求1的方法，其中所述的DNA序列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少两个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列。
6.权利要求1的方法，其中所述的DNA序列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中所述的第一序列与第二序列是相同的。
7.权利要求1的方法，其中通过根瘤农杆菌把所述DNA序列引入植物基因组中。
8.权利要求1的方法，其中所述DNA序列由至少10个碱基对组成。
9.权利要求8的方法，其中所述DNA序列由至少30个碱基对组成。
10.权利要求9的方法，其中所述DNA序列由至少50个碱基对组成。
11.权利要求1的方法，其中所述DNA序列由至少70个碱基对组成。
12.一种遗传标记植物的鉴定方法，该方法包括把DNA序列引入植物基因组中，所述DNA序列在所述基因组中是特有的并且沿着该DNA序列呈直线排列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少两个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中所述第一序列、第二序列和鉴定序列不含改变转录或者编码功能蛋白的序列。
13.权利要求11的方法，其中所述DNA序列进一步包括选择性标记基因。
14.权利要求11的方法，其中所述DNA序列是由根瘤农杆菌引入的。
15.一种遗传标记植物的鉴定方法，该方法包括将DNA序列引入植物基因组中，所述DNA序列在所述基因组中是特有的并且不含改变转录或者编码功能蛋白的序列。
16.权利要求15的方法，其中所述DNA序列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的鉴定序列的至少两个同向重复序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列。
17.权利要求15的方法，其中所述DNA序列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中所述的第一序列与第二序列是相同的。
18.权利要求15的方法，其中所述DNA序列是由根瘤农杆菌引入的。
19.一种遗传标记植物的鉴定方法，该方法包括把DNA序列引入植物基因组中，所述DNA序列在所述基因组中是特有的并且沿着所述DNA序列呈直线排列包括(1)有10个碱基对的第一序列；(2)有6个或更多个碱基对的间插序列；以及(3)有10个碱基对的第二序列，其中所述的第一序列、第二序列和间插序列不含改变转录或者编码功能蛋白的序列，并且其中所述的第一序列与第二序列是相同的。
20.权利要求19的方法，其中所述DNA序列进一步包括选择性标记基因。
全文摘要
本发明涉及一种遗传标记植物的鉴定方法,该方法包括向植物基因组中引入具有特殊信息内容的DNA序列。在一些实施方案中,所述DNA序列少于100个碱基对并且在植物基因组中是特有的。在其它的实施方案中,所述DNA序列不含有影响植物细胞转录或者编码功能蛋白的序列。
文档编号C12Q1/00GK1271775SQ9910600
公开日2000年11月1日 申请日期1999年4月23日 优先权日1999年4月23日
发明者高建元 申请人:新发国际生物科技股份有限公司, 高建元