将外源dna导入植物的方法

专利名称：将外源dna导入植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种将外源DNA导入植物的方法，具体他说，本发明涉及一种通过子房切面渗入法向有性繁殖的被子植物导入外源DNA的方法。
已建立的植物转化方法可分为农秆菌介导转化法及外源基因直接转化法。由于前者在单子叶植物中难以应用，近十年来发展了多种不依赖于农杆菌的直接转化法。这些方法是将纯化的重组质粒DNA导入植物细胞，以期获得转基因植物。在这种方法中，最早是用聚乙二醇(PEG)介导转化植物原生质体。由于原生质体再生困难，又继续发展了一系列对组织和细胞的转化技术，最广泛采用的是基因枪法(particle gun)，又称微弹轰击法(microprojectile bombardment)，是一种将载有外源DNA的金属粒子经驱动后通过真空小室进入靶组织的一种转化技术。这种技术已得到广泛应用，已在30多个属的植物中获得转基因植物。此外，还有电击法(electroporation)和微束激光穿刺法(laser microbeampuncture)，即借助于高压放电及激光微束的脉冲使细胞膜形成可逆的微孔，并使外源DNA进入细胞。此外还有显微注射法(microinjection)，借助于显微注射器向细胞注入DNA，使细胞得到转化。这些方法都有成功的实例，但都需要建立较昂贵的设备。近几年来新发展的方法有碳化硅(silicon carbide fiber)介导法，是用微米级的纤维丝经涡旋振荡对细胞穿刺，从而导入外源DNA。又如电泳法(electrophoresis)，是在一定电场强度下，由从负极向正极的DNA泳动动力将DNA导入受体组织中。这些方法简单易行，价格低廉，但都依赖于组织培养再生技术。
我国学者周光宇等1978年首先提出用作物总DNA通过花粉管通道对作物进行DNA片断的转化，并首先用放射自显影的方法在棉花胚珠的花粉管通道和胚囊中看到带有同位素标记的DNA，证明转化时注入的DNA进入了胚囊。随后国内许多育种单位开展了通过花粉管通道将DNA导入植物的研究。
利用花粉管通道向植物导入外源DNA(包括天然DNA大分子，天然DNA片段和经人工改造构建的重组DNA)，现有的方法一般分为注射法和滴加法。注射法是在授粉后一定时间，即在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将外源DNA用注射器注入具有花粉管通道的组织上或组织内部，使DNA进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。滴加法也是在花粉萌发后花粉管穿过雌蕊组织到达胚囊这一时间段内，将花柱切断，将外源DNA滴加在切面上，或者不切断花柱，将外源DNA直接滴加在柱头上，使DNA沿花粉管通道涌入胚囊，进入合子并整合到基因组中，然后通过自然结实获得转化种子。
马骏等(1994，“棉花异科属外源DNA导入山陆地棉的方法及引起性状变异的研究”，麦棉分子育种研究，四川科学技术出版社，52-71页)公开了用注射法和滴加法将外源天然DNA导入棉花的方法。受体材料是棉株上扣线自交受精的隔日幼铃。操作方法是，在去除花冠、雄蕊、柱头和花柱后，用微量进样器从幼铃顶端向下插入胎座，将外源DNA注入(注射法)。或者，直接在花柱的切口处滴加外源DNA(滴加法)。其中注射法的结实率为29.3-32.7％(相对对照结实率91-100％)，滴加法的结实率为31-33％(相对结实率接近100％)。该文献没有报道关于变异植株后代的遗传稳定性，转化株系分子鉴定和转化频率的结果。其他文献也公开了类似的方法和结果，例如，龚蓁蓁群等，中国科学B辑，1988，(6)611-614页；翁坚等，1984，生物化学与生物物理学报，16(3)325-327页；于元杰等，1991，山东农业大学学报，22(4)335-340页；黄骏麒等，1993，农业分子育种研究进展，中国农业科技出版社，114-118页；许勇等，1991，园艺学报，18(1)49-54页。
谢道昕等(1991，“苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株”，中国科学B辑，4(4)367-373页)公开了一种将重组DNA导入棉花的方法。将BT基因重组在质粒上，采用如前文献所述的微量注射法将质粒DNA导入棉花。该方法采用了含有完整基因的重组DNA，获得了具有分子验证结果的转化植株，得到了明确的转化率。该方法的结实率为20.8％，经Southern杂交验证，在质粒导入的230株D1代植株中，有2株的基因组中整合了BT基因，转化率0.88％。
曾君祉等(1993，“用花粉管途径获得小麦转基因植株”，中国科学B辑，23(3)256-262页)公开了一种用重组DNA滴加法转化小麦的方法。该方法采用含有GUS、Luc报告基因的质粒DNA，选择正在开放的小花，用刀片切去羽状柱头，并立即滴加质粒DNA，然后自然结实得到种子。经分子检测和基因表达产物验证，转化率为4.9％。该转化率高于已报道的其它植物中的转化率。这是由于不同植物对外源基因的接受程度不同，而小麦接受外源基因的能力较强。其他文献也公开了类似的方法，例如，Eyal，Z.，等1993年9月16日公开的Wo9318168；Luo，Z.和Ray，W.，1993，PlantMolecular Biology Reporter，6(3)165-173；富威力等，1993，周光宇主编，农业分子育种研究进展，中国农业科技出版社，35-38页。
通过花粉管通道转化植物的方法具有操作简单，对仪器设备要求低的优点，适宜于所有有性繁殖的被子植物。因为有性繁殖的被子植物，其胚珠是由子房包被的，花粉管通过花柱进入子房包被的胚囊中。而且这种转化方法能够直接得到转化种子，不需要组织培养再生过程，适用的植物种类(品种)广泛。但目前不论是采用滴加或是注射操作方法，均存在转化结果的可重复性(稳定性)差，转化率(通过分子检测或目的性状测定证实的转化率)低的缺点。这是由于现有的滴加法均是在柱头或花柱切面上滴加外源DNA，DNA需要通过花粉管通道到达胚囊的距离长，而且柱头上及花柱横切面上可以容纳的DNA溶液体积小。再者，在授粉后一定时间内，花柱与子房之间会形成离层，阻碍外源DNA穿过花粉管通道，使其通过速度减慢，到达胚囊的DNA减少。对于现有的注射导入法来说，存在的问题有注射压力使组织内部损伤；注射针会将外界有害微生物带入组织内部引起污染，造成烂铃烂果；单点注射使外源DNA过于集中在组织的某一部位，造成对这部分组织的毒害等，使注射法容易产生落铃落果现象。上述这些原因限制了现有方法的应用，成功的事例较少。
本发明的目的是提供一种改进的将外源DNA通过子房切面渗入法导入有性繁殖的被子植物的操作方法。该方法具有较高的转化水平和导入后的结实率，并具有较高的稳定性(可重复性)。
一般认为，在对植物花器进行操作时，不能切除子房壁，否则会影响结实甚至导致转化失败。而本发明人发现，切除子房壁的顶部部分，只要不露出子房腔，能提高转化效率，而对植物结实影响很小。
本发明提供了一种将外源DNA导入有性繁殖的被子植物的方法，其特征在于，在植物花授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，切除上部子房壁，以不露子房腔为限，使该切面与待转化的DNA溶液接触，然后使植物自然结实。
在实施本发明的方法时，切除上部子房壁和使切面与待转化DNA溶液的操作最好是在15-25℃条件下进行的。
在实施本发明的方法时，所述的切面与待转化DNA溶液的接触最好是在采取防漏措施的同时将该DNA溶液滴加在切面上的。
在本发明的方法中，所述的植物可以是油菜(子房较小的植物，所获得的切面的直径小于2毫米)，切除上部子房壁的操作是在授粉后15-24小时进行的，所述防漏措施是用细针在切面上刺出一凹陷，然后将DNA溶液滴加在凹陷中。
在本发明的方法中，所述的植物也可以是黄瓜(子房较大的植物，所获得的切面的直径大于2毫米)，切除上部子房壁的操作是在授粉后5-24小时之间进行的，所述防漏措施是在所述的切口处加装管套，该管套两端开放，其直径和形状与切面相适应，其一端插入子房壁或用粘性材料粘附其上。
在本发明的方法中，所用的外源DNA溶液最好为溶解于TE缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度范围最好为50-700μg/ml。
本发明所提供的方法，其特征是在植物子房顶部切出大切面，使DNA分子通过花粉管萌发的途径到达胚囊，也可以通过花粉管腔进入合子并整合到基因组中，通过自然结实直接得到转化种子。
在实施本发明的方法时，最好选用健壮的植株。对于进行切除上部子房壁和使该切面与待转化的DNA溶液接触操作时的环境温度，最好是在15-25℃。温度过高，花柱、子房组织中DNA酶的活性强，对外源DNA的破坏作用强，这样难以得到有效转化；温度过低，花粉管生长受阻，授精延迟，也不易得到有效转化。所以超出该温度范围都容易造成转化率下降。
在本发明的方法中，切除上部子房壁的操作是在植物花授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内进行的。这一时期一般情况下为开花后5-32小时，随不同的植物与不同的环境条件而异。多数情况下以开花后5-26小时为宜。该时期也可以是人工授粉后0.5-24小时。
上述时期是指在正常的土壤温度、湿度和气候条件下。如遇降雨或灌溉造成土壤潮湿，可以在24-48小时以后再选择花朵进行导入操作，从而避免授粉不佳或切口处产生过多的伤流液影响导入效果。
所述的切除上部子房壁是指切除子房上壁顶端至子房腔上边缘(不切破子房腔)的组织，形成面积大于花柱横切面的切口。
所述的切口可以是平面，凹面、凸面或其它不规则曲面。切割工具最好为锋利的刀具或激光刀等锐利工具，以保证花粉管腔等组织在切断后保持其原来固有的形状。
子房上部做出切面以后，即可将待转化的DNA溶液滴加到该切面上。由于在这一操作过程中容易受到自然因素或人为因素如风力、露水、伤流、人为触碰等，造成所供DNA溶液受到蒸发、稀释、遗漏等不确定性因素的影响，最好在滴加转化的DNA溶液时采取防渗漏措施。
对于子房较小的植物，如油菜，可以在所述的子房壁切口处用机械的方法，如用一细针，制造出一个凹陷，其大小与切面相适应，深度1-5mm，将外源DNA滴入这一凹陷中实现渗入。
对于子房较大的植物，如黄瓜，可以在所述的切口处加装管套，形成可以盛载较多DNA溶液的容器结构，从而增加DNA溶液的供给。所述管套的横截面可以是园形、方形、椭圆形等各种形状。该横截面的大小与子房壁切面相适应，过小则不能充分发挥子房壁切面导入的优势，过大则不易稳定放置于子房上方，而且对DNA溶液的需要增加。该管套的横截面积可以是切口平面面积的0.8-1.5倍，以两者面积相等时为最佳。该管套的高度不限，以便于稳定放置在切口处为宜。
通常情况下，对于黄瓜来说，该管套的内径为2-10mm，高度为1-10mm。
所述管套可以在下边缘附着密封材料，以保证其被加装在子房壁切口上方时能够形成边缘与底部密闭的空间，防止外源的DNA溶液从缝隙遗漏出来。密封材料应是具有粘性的，不与DNA吸附或发生反应的无毒物质，如医用凡士林等。
所述管套可以在其上方附加密封盖或密封材料，以防止外界污染物侵入切面，并减少DNA溶液中水的蒸发，保证导入操作的一致性和效果的稳定性。
滴加到切面上的外源DNA的浓度范围最好为50-700μg/ml。浓度低导入效果差，浓度过高产生毒害影响结实。其中100-500μg/ml最佳。在附加管套的条件下，如黄瓜，一次供给的DNA溶液体积可以是5-50μl，在未附加管套的条件下，如油菜，一次供给的溶液体积为2-20μl。
所述的DNA溶液供给方式可以是一次性供给，也可以分多次供给。一般为1-4次，以2-3次为宜，间隔时间5-40分钟。在最后一次供给并维持足够时间后，可以补充一次不含外源DNA的溶液，以达到抑制DNA酶活性、保护已渗入的DNA分子的效果。该溶液可以是配制外源DNA溶剂，也可以是其它对DNA结构具有保护作用的物质，如TE缓冲液、SSC缓冲液等。
所述的外源DNA可以是各种生物的天然总DNA，天然总DNA片段，也可以是含有报告基因、含有目的基因的重组DNA(质粒)，或基因片段。这些DNA应配制成溶液供导入操作。所用溶剂可以是水，SSC，CaCl2或TE等溶液配制。考虑到抑制DNA酶对外源DNA的破坏作用，最好采用TE溶液。
本发明采用的子房顶部切面渗入DNA的方法，切口面积大，缩短了外源DNA通过植物组织进入胚囊的距离，增加了施用的DNA溶液体积，也避免了离层组织对DNA渗入的障碍，从而使DNA渗入通畅，到达胚囊的DNA较多，接受DNA的胚囊数较多，转化率高，结实率高，不确定因素较少，可重复性好。
如采用本发明的方法转化黄瓜，经Southern杂交验证的转化率为1.3％，结实率为42％。而且应用本方法已获得了带有目的基因的转化植株。
采用本发明的方法转化油菜，经Southern杂交验证的转化率为2％，结实率为72％。而作为对比，采用常规的花粉管通道法却没有得到转化植株。
附图简要说明

图1为显示本发明方法与现有技术方法的示意图。其中附图标记为1、柱头；2、花柱；3、子房；4、子房壁；5、子房腔；6、胚珠；7、胎座；8、常规方法中花柱切口位置；9、本发明方法中子房壁切口上限；10、本发明方法中子房壁切口下限。
图2为显示本发明的防漏管套的示意图。其中的附图标记为11、子房壁切口；12、管套；13、外源DNA溶液。
实施例下文将通过实施例对本发明做进一步说明。实施例用子房切面滴加外源DNA获得甘兰型油菜(Brassica napus L.)转基因植株供试的材料为甘兰型油菜，品种为低芥酸低硫苷(双低)的H165品种。
所用菌株为Ecoli DH5a，菌株中携带有含几丁酶基因及β-1，3葡聚糖酶基因的植物表达载体pBLGC质粒，几丁酶(Chitinase)基因被两个花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子所驱动，NPTII(KmT)标记基因和NOS终止子。
菌株在LB培养基(Km 50μg/ml)37℃，250rpm培养过夜，质粒提取和纯化参考Maniatis等的方法。纯化后溶于TE(pH8.0)缓冲液中，将浓度调整到500μg/ml。外源基因导入一、受体的选择选择健壮的植株30株为转化受体，选择主技上的花朵，摘除6朵最先开放的花。把无限花序顶部的小花蕾也摘除，对较大的花蕾，只摘除花蕾而留下小花柄，最后留下的是当天开放的花和次日开放的花。每花序10朵，共300朵。
二、授粉在北京的气候条件下油菜在上午8-10时开花，下午也有少量花朵开放，将当日开放的花进行授粉，授粉时不必去雄，用同品种不同株的花粉进行姐妹交。处理和空白对照均在同一时间进行姐妹交。
三、切除子房壁在授粉15-20小时后，即在授粉后次日清晨，用锐利的刀片切除子房顶部，以不露子房腔为限。共处理200朵花。
四、采用防漏措施滴加DNA溶液选100朵花，采用针灸用细针刺子房切面的中心后，立即滴2-3μl DNA溶液，连续滴加两次，间隔时间约10分钟。作为空白对照另选100朵花，操作方法同前，但滴加的溶液为不含DNA的TE(pH 8.0)缓冲液。
五、作为现有方法对照，选择100朵花切除柱头，在切面上滴加2-3μl DNA溶液。
标记导入操作过的花朵，处理后挂牌写明品种名称、处理日期及花朵数，次日的花连续做，两天做的花分别标记。
处理的花朵成熟较早，要及时收获。
收获的种子用卡那霉素筛选将T0代种子播种，待苗达5片真叶时选一片嫩叶，用微量进样器将5μl卡那霉素溶液滴到叶片的一侧。在另一侧用针刺一洞，以示此叶做过处理。在正常日照条件下3-5天后观察，处理过的叶片如变为白色或浅紫色即为阴性植株(不抗卡那霉素)。先后采用1μg/ml和5μg/ml卡那霉素溶液进行两次筛选，均呈阳性的为抗性植株。
抗性植株的接种试验苗长至40-50公分时，进行菌核病的接种试验。将菌核灭菌后接种到PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)中，在25℃培养3-5天。待菌丝长满后即可对抗卡那霉素植株进行感染。
PCR检测对油菜具卡那霉素抗性苗的基因组总DNA的PCR扩增检测所用引物为I几丁酶3’5’-GGGATGACAGTGTCACTGAG-3’和35S启动子5’5’-CTGACGTAAGGGATGACGC-3’；II也使用葡聚糖酶基因两个末端序列3’5’-GCGGATCCGACCATGGCTGCTATCACACTCC-3’和5’5’-CGGTCGACCTCACATCTCACTTACCAGA-3’，用以检测几丁酶基因及β-1，3葡聚糖酶基因是否导入抗性植株中。取1μl油菜DNA为模板，以pBLGC质粒作为阳性对照，未转化的油菜DNA作为阴性对照。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
经PCR检测的部分阳性转化植株再进行Southern杂交。
所得的T0代种子收获时进行考种。导入外源基因处理共做100朵花，现有方法和空白对照也分别取100朵花，均用人工姊妹交法授粉，所得结果见表1-1。表1-1用子房切面滴加外源DNA后的结实状况
核病接种试验，其中有68株感染菌核病较轻或不感病，取其中22株提取总DNA进行PCR扩增检测，有10株扩增出1.3kb DNA片段；其大小与pBLGC为模板进行扩增的片段相同。表明几丁酶基因已整合到油菜的基因组中，按PCR测定结果推算转基因植株占处理植株的频率为5.1％。在此基础上进行了Southern杂交检测。取PCR阳性株共5株进行Southern杂交，结果有两株为阳性株，按其比例推算确认转化率为处理总株数的2％，同时这些植株显示出抗菌核病能力。从以上检测结果可知，用子房切面滴加外源DNA可以得到转基因植株。将T0代经Southern检测已确认的转基因植株收获其种子，得到T1代。这些种子种植后仍保持其抗病的特性，如得到139株苗进行接种试验，有43％的植株显示对菌核病抗性。采用现有方法转化的种子播种后，得到1375个植株，将其进行卡那霉素筛选，选出3株受卡那霉素伤害轻或不见伤害的植株，提取总DNA进行PCR扩增检测，没有阳性结果。实施例2用子房切面防漏滴加法将外源DNA导入黄瓜供体植物为津研7号，种子为天津农科院推广品种。
在大肠杆菌DH5a其中含有质粒pB602，其中携带有Bacillusthuringiensis(BT)基因的植物表达，该基因被CaMV35S启动子所趋动，以Nptll(KmT)为标记基因，并包含NOS终止子。
开始外源基因导入的操作时温度为18℃，结束时为25℃，即在18-25℃之间进行的。土壤条件为在灌水两天以后。处理过程如下一、选择健壮的植株为转化受体，共选择50株。选择自主枝上第一和第二朵雌花。除入选花朵外，其余雌花均摘除，仅留下叶片。
二、在套袋条件下用异株雄花的花粉使入选的雌花授粉。外源DNA导入是在授粉后15-20小时之间进行的。
三、将子房顶部造成较大的切面。用锐利的刀片将子房顶部切成直径约3mm左右的大切面，切面以不露子房腔为准。
四、将切割的子房加防漏措施。将子房垂直固定，采用内经3-4mm聚丙烯饮料吸管，切成高2-3mm的切段，然后将切段基部边缘蘸少量医用凡士林。将其固定在子房顶部切口处，与切面边缘吻合。
五、滴加外源DNA时，以300μg/ml浓度的质粒DNA(5-6μl左右)滴在大切面上。半小时后再滴一次，总共约10-12μl，然后再滴5μl TE缓冲液。
处理后立即挂牌写明品种名称、处理日期、基因名称及处理方法。然后，使其在自然条件下发育、结实。按常规进行栽培管理并按时防治病虫害，按时收获种子。
将T0代种子播种于田间，待长到现开花期时，选一片嫩叶，用微量进样器将5μl卡那霉素溶液滴加到叶片一侧，另一侧用针刺一洞以示此叶做过处理。在正常日照条件下3-5天后观察选择抗卡那霉素的阳性植株。先后采用1μg/ml和5μg/ml卡那霉素溶液进行两次筛选，均呈阳性的为抗性植株。
PCR检测对卡那霉素筛选出的阳性植株的基因组总DNA扩增检测时所用的引物为5’-ACADTACGGATTGGGTAGCG-3’。质粒Pb602作为阳性对照，未转化株DNA为阴性对照。再将PCR阳性株进行Southern杂交。
分子生物学检测用完全的Southern杂交方法(Complete Southernanalysis)，以分析外源基因在植物基因组中的结构。
T0代共播种210粒种子，得到152株苗，经两次卡那霉素筛选，其中有10株显示对卡那霉素具有抗性。将抗性株进行Southern杂交，有2株显示出阳性。可以确认转化频率为1.3％。
权利要求
1.一种将外源DNA导入有性繁殖的被子植物的方法，其特征在于，在植物花授粉并萌发出花粉管后，从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内，切除上部子房壁，以不露子房腔为限，使该切面与待转化的DNA溶液接触，然后使植物自然结实。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的切面与待转化DNA溶液的接触是在采取防渗漏措施的同时将该DNA溶液滴加在切面上的。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，切除上部子房壁和使切面与待转化DNA溶液的操作是在15-25℃条件下进行的。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所得到的切面的直径小于2毫米，所述防漏措施是用细针在切面上刺出一凹陷，然后将DNA溶液滴加在凹陷中。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的植物是油菜，切除上部子房壁的操作是在授粉后15-24小时进行的。
6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所得到的切面的直径大于2毫米，所述防渗漏措施是在所述的切口处加装管套，该管套两端开放，其直径和形状与切面相适应，其一端插入子房壁切面或用粘性材料粘附其上。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物是黄瓜，切除上部子房壁的操作是在授粉后15-24小时之间进行的。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所用的外源DNA溶液为溶解于TE缓冲液中的DNA溶液，DNA的浓度为50-700μg/ml。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的DNA的浓度为100-500μg/ml。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，外源DNA溶液在切面上被施用1至4次，间隔时间为5至40分钟。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源DNA溶液为含有一种或多种目的基因的质粒的重组DNA溶液。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的切除上部子房壁和使切面与待转化DNA溶液的接触是在降雨或灌溉至少24小时之后进行的。
全文摘要
本发明提供了一种将外源DNA导入有性繁殖的被子植物的方法。为解决现有技术的转化效率低,转化效果不稳定,重复性差的缺点,本发明在植物花授粉并萌发出花粉管后,从花粉管到达胚囊开始到合子第一次分裂为止的时间段内,切除上部子房壁,以不露子房腔为限,使该切面与待转化的DNA溶液接触,然后使植物自然结实。本发明的方法可应用于生产转基因植物。
文档编号C12N15/64GK1269420SQ9910541
公开日2000年10月11日 申请日期1999年4月6日 优先权日1999年4月6日
发明者陈正华, 张丽华, 刘桂珍, 张铁汉, 王兰岚, 邓向东 申请人:中国科学院遗传研究所