控制苯丙醇生物合成通路的转录因子的制作方法

专利名称：控制苯丙醇生物合成通路的转录因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及控制苯丙醇(Phenylpropanoid)生物合成有关基因表达的技术。
随着近年来植物分子生物学的进展，已经能够采用有义基因或反义基因来繁育具有有用特性，例如能抵抗疾病和虫害或抵抗除草剂的植物。即，通过将表达所需特性有关的基因以有义方向或反义方向与允许在植物内表达的启动子连接成嵌合基因，然后将所得的嵌合基因作为载体引入植株，由此促进或抑制所需特性的表达。根据这样的技术，已经生产出了例如抗病虫害的植物(其中以有义方向引入了来自苏云金芽孢杆菌的杀虫剂BT毒素基因)(D.A.Fischloff等人，生物技术(Bio/Technohogy),232:738-743(1987))和极耐保存的西红柿(其中以反义方向引入了与茄类水果过熟有关的多聚半乳糖醛酸酶基因)(C.J.Smith等，自然(Nature)334,724-727(1988))。
使用这种技术时，在引入了有义基因的植株中(表达所需特性的基因以有义方向与启动子融合)，所需特性的表达受到促进；相反，在引入了反义基因的植株中(表达所需特性的基因以反义方向与启动子融合)，所需基因的表达受到抑制。引入反义基因抑制所需特性的表达是因为在植物细胞内，以此反义基因为模板合成的RNA，与来自表达所需特性有关的植物本身基因的mRNA互补地结合，从而抑制了后续蛋白质的合成。
但是，植物的许多基因形成一个多基因家族，而属于此家族的基因表现出高度的核酸序列同源性。即使用反义方法来控制该族内某一基因的表达，反义基因的RNA不可避免地与该家族中许多其它基因的mRNA随机结合而控制其表达，使得不可能只控制所需单个基因的表达，因此引起了各种特征的抑制模式。所以，结果有时迥异于人们的期望。
而且，苯丙醇的生物合成通路是复杂的分支反应系统，它只存在于植物中，而且它与细胞壁组份(例如木质素、suberrin)、花色素、抗菌物质等的生物合成有关。由生物合成通路得到的苯丙醇还可用作UV保护剂、杀虫剂等。如果能够准确的促进或抑制有关苯丙醇生物合成的基因表达，就能够控制该生物合成通路来产生木质素含量低或含大量有用物质的树木。但是，这时，由于上述基因间的同源性问题，难以用反义方法来控制该基因的表达。例如，有报道称，以反义方向引入在苯丙醇生物合成通路中起作用的了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因或过氧化物酶(PRX)基因的转化植物表现出多样不同的控制结果(例如生长抑制)(M.M.Campbell和R.R.Sederoff,Plant Physiol.,110:3-13(1996))，还有，以反义方向引入了咖啡酸O-甲基转移酶基因的烟草中的木质素含量变化不如预期的大(W.Ni等，Transgen.Res.,3:120-126(1994))。
考虑到上述问题，本发明目的之一是提供一种DNA和一种载体，它们能够准确的促进或抑制植物苯丙醇生物合成通路相关特定基因的表达。
为了克服上述问题，本发明的发明人进行了广泛的研究。结果，发明人注意到了如下事实，即在苯丙醇生物合成通路相关特定基因(例如cynnamyl alcohol脱氢酶(CAD)基因、查尔酸合成酶(CHS)基因、4-香豆酸CoA连接酶(4CL)基因、PAL基因和PRX基因)的5’上游非翻译区内存在着控制这些基因表达的序列，而且这些基因之间的这些序列之间具有非常高的同源性。所以本发明人分离到了通过结合这些序列来促进基因转录的因子(后文称为“转录因子”)，然后将编码该因子的DNA以有义基因或反义基因引入植物，从而可准确地促进或抑制上述基因的表达。这样，就完成了本发明。
具体地说，本发明的上述以及其它目的的实现是通过分离和纯化且具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA；分离和纯化且在严谨条件下与具有SEQ IDNO:1核苷酸序列的DNA杂交、并编码控制苯丙醇生物合成通路转录因子的DNA；包含上述DNA的重组载体；还包含与上述DNA操作性融合的启动子的重组载体；重组载体，其中上述DNA以有义或反义方向地与启动子操作性融合；引入了上述DNA的植物细胞；由所述植物细胞再生而成的植物；产生所述植物细胞包括将上述DNA引入植物细胞的方法；来产生所述植物即包括由所述植物细胞再生植物的方法；分离和纯化的上述DNA编码的蛋白质；以及分离和纯化且编码具有SEQ ID NO:2氨基酸序列蛋白质的DNA。


图1，图示了实施例1所用效应物的一部分，其中插入了Ntliml基因。
图2图示了实施例1所用报道基因的一部分，其中插入了含P-BOX序列的融合基因。
图3显示了各基因在烟草中的表达情况，所述烟草中以有义或反义方向引入了Ntliml基因。
以下将详细说明本发明。
“分离和纯化的”指，从天然产生这些生物分子的生物来源中纯化分离得到的核酸或蛋白质。
本发明使用的严谨条件是以6×SSC(0.9M NaCl,0.09M柠檬酸钠)作为缓冲液，温度为55℃。
苯丙醇生物合成通路广泛存在于多种植物中，所以，许多植物都具有与此相关的基因(例如CAD基因)，而且具有一个控制所述基因表达的转录因子。所以，本发明的DNA可以通过常规方法从包括草本植物或木本植物的多种植物中分离得到(J.Samorook等，Molecullar Cloning，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，纳入本文作参考)。本发明的DNA也可按照常规方法，例如磷酸三酯法(H.Hunkapiller等，Nature,310:105-111(1984)，纳入本文作参考)来化学合成。
以上制得的DNA与可在植物中表达的启动子(例如花椰菜花叶病病毒的35S启动子(CaMV35S启动子)、nopaline合成酶启动子、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基的启动子)的下游区以有义方向或反义方向融合(J.Samorook等，Molecullar Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，纳入本文作参考)。本发明的DNA与启动子以有义方向融合是为了促进所需基因(本发明意欲促进或抑制其表达的基因)的表达，而当它与启动子以反义方向融合时则是为了抑制该基因的表达。促进所需基因表达的另一种方法是，将本发明DNA以有义方向与一启动子融合，将所需基因与另一启动子融合，将它们插入同一载体或分别插入不同载体后一起引入植物细胞。
与启动子融合的DNA可以直接引入植物细胞，例如通过微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、融合法或高速冲击穿透法(I.Portykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205(1991)，纳入本文作为参考)。或者，为了将该DNA插入用于将基因引入植物的质粒后，通过能够感染植物的病毒或细菌将该DNA间接引入植物细胞(I.Portykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205(1991)，纳入本文作为参考)。病毒的例子包括花椰菜花叶病病毒、芽孢病毒(gemini virus)、烟草花叶病病毒和可可花叶病病毒。细菌的例子包括根瘤土壤杆菌(后文称为A.tumefaciens)和毛根土壤杆菌。采用A.tumefaciens通过土壤杆菌法将基因引入植物，可以使用诸如pBI101或pBI121(都由Clontech Laboratories,Inc.生产)质粒。
本发明中，所需基因的表达受到促进或抑制的植物可通过增殖或再生用上述方法引入了本发明DNA的植物细胞来得到。对于所述植物细胞的增殖或再生条件的合适选择取决于植物的种类等因素(例如，就烟草而言，参见R.B.Horsch等，Science,227:1229-1231(1985)，纳入本文作为参考)。
本发明DNA和插入了该DNA的载体可以促进或抑制CAD基因、CHS基因、4CL基因、PAL基因、FRX基因的表达。本发明的DNA和载体不仅可以控制上述基因的表达而且可以控制目前已知在其转录控制区具有上述共有序列的任何基因的表达。
对于可用本发明促进或抑制基因表达的植物没有特殊的限定。主要说来，具有苯丙醇生物合成通路的植物适合于本发明。例如，除了烟草植物，还包括例如草本植物(例如稻米、arabidopsis、矮牵牛花)和木本植物(例如白杨、桉树、金合欢树、雪松、松树)。
在各种种类的植物中，从苯丙醇生物合成通路相关基因中发现了一段如表1所示的共有序列(共有序列栏内的数字表示距离转录起始位点的距离(单位bp))。
表1
结合了上述基因内该共有序列的转录因子彼此几乎具有相同的结构，而且，编码这些转录因子的DNA被认为具有一段相互同源的核苷酸序列。所以，本发明的DNA可以特异性的促进或抑制具有该共有序列的CAD基因、CHS基因、4CL基因、PAL基因和PRX基因中任何一个的表达，而不管转录因子所作用的植物种类或基因种类。
当本发明DNA以有义方向引入植物时，在内源转录因子之外，还通过引入DNA的表达合成了能与植物中上述共有序列结合的转录因子。这对于引入基因的植物种类没有限定。结果表现出为转录因子的表达水平总量的提高，而且，这些转录因子与共有序列以更高的频率结合，使得启动子区内具有该序列的基因的表达得以促进。
另一方面，当本发明DNA以反义方向引入植物时，以该基因作为模板合成的RNA与植物原有的转录因子基因所产生的mRNA互补结合，从而抑制了内源转录因子的合成。结果，转录因子的表达水平的降低，使得难以引起共有序列的结合，所以，在启动子区内具有该序列的基因的表达受到抑制。
本发明还包括SEQ ID NO:1编码的分离且纯化的蛋白质，其氨基酸序列见SEQ ID NO:2。而且，本发明还包括编码具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。这种核苷酸序列的具体例子见SEQ ID NO:1。利用SEQ ID NO:1和众所周知的遗传密码子简并性，本领域熟练技术人员可以方便地推断出编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白质的所有核苷酸序列。遗传密码可参见Stryer,Biochemistry第三版W.H.Freeman and Company(1988)，纳入本文全部作为参考。
本发明使得特异性促进或抑制在5’非翻译区具有特定共有序列的基因的表达成为可能。
换言之，本发明使得控制有关植物苯丙醇生物合成通路的基因(例如CAD基因、4CL基因、PAL基因和PRX基因)成为可能。
上述的CAD等是与苯丙醇生物合成通路尤其是木质素生物合成通路相关的酶，所以，根据能够控制上述基因表达的本发明，就有可能生产出有望成为纸张或纸浆原材料的树木，例如生产木质素含量低的树木。
通过参考实施例，本发明将作更详细地叙述。但应理解这并不是对本发明的限制。
实施例1(1)烟草mRNA的分离与纯化在从种子发芽后，将烟草在暖房中培养约1个月，取10g叶子在液氮中粉碎，用Chomcznski等(本文引作参考)的方法抽提其总RNA。
所得的总RNA溶解在含0.2％二乙基碳酸氢盐的无菌水中，65℃保温5分钟，用等量的上样缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.6,0.1M NaCl,1mM EDTA,0.1％SDS)稀释2倍。将稀释液上样在已经预先活化的寡聚dT纤维素柱上。用5至10倍柱体积的上样缓冲液洗柱，然后用5倍柱体积的洗涤缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.6,0.5M NaCl,1mM EDTA,0.1％SDS)洗柱。如下洗脱，即用2至3倍柱体积的洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA,0.05％SDS)灌柱，得到10mg纯化的mRNA。(2)制备cDNA文库利用寡聚dT引物，按照本文参考引用的Gubler & Hoffman方法(Gubbler等，Gene,25:263-269(1983))，从(1)中获得的mRNA合成cDNA。将所得的cDNA插入噬菌体DNAλgt11的EcoRⅠ位点，用λ噬菌体的包被蛋白(购自Statagene的“GeigapaekⅡ包装提取物”)进行体外包装，由此获得一个重组的λ噬菌体。
另一方面，将大肠杆菌Y1090接种到10ml LBMM培养基(1％色氨酸，1％氯化钠0.5％酵母提取物，10mM硫酸镁和0.4％麦芽糖)中， 37℃摇动预培养12小时，预培后，离心分离收获细胞，重悬在预先冷却至4℃的10ml 10mM硫酸镁中，使得它们容易被λ噬菌体感染。将λ噬菌体与所得的大肠杆菌混合，然后将混合物37℃放置15分钟，进行感染。(3)转录因子的筛选重组λ噬菌体感染的大肠杆菌Y-1090在含有1.5％琼脂的LBMM培养基中37℃培养。约4小时后，在观察到一个空斑产生后，将预先在10mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)中浸泡然后空气干燥的尼龙滤膜(Hybond-N.由Amersham PharmaciaBiotech生产)覆盖在培养板上。37℃放置过夜后，从板上移取尼龙薄膜。将尼龙薄膜于4℃在含有5％脱脂奶的结合缓冲液(10mM Hepes,pH7.5,50mM NaCl,1mM EDTA)中浸泡1小时进行封闭，再浸泡结合缓冲液中，其中加入了用于结合印迹在尼龙薄膜滤膜上的转录因子的探针。探针与转录因子之间的结合反应在4℃进行2小时。
作为用于结合反应的探针，使用的是4CL基因或腰形豆的PAL基因或辣根的PRX基因5’上游非翻译区内存在的一段共有序列(P-BOX序列-CCACTTGAGTAC-)。即，合成一段具有P-BOX序列的双链寡核苷酸，用地高辛配基(DIG)标记后使用。
结合反应后，将尼龙薄膜在结合缓冲液中室温浸泡30分钟进行3次洗涤，然后通过化学发光检测法进行初次和二次筛选。结果，从1.0×106空斑中，测得一个阳性空斑，它产生了结合上述共有序列的蛋白质。顺便说一下，在该测试中，从合成双链寡核苷酸的标记到用化学发光法筛选主要是利用一市售试剂盒(Boehringer Mannheim GmbH生产)按照非放射性同位素DIG核酸检测法进行的。(4)测定编码结合共有序列的蛋白质的DNA的核苷酸序列根据常规方法从产生上述阳性空斑的噬菌体内提取DNA。所得噬菌体DNA的插入部分(在(2)中，即插入了来自烟草的cDNA的部分)用含有λgt11的克隆位点的引物经PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，确定存在大约1kbp的DNA片段。将1kbp DNA片段在其末端磷酰化，然后将其插入质粒pNoTA/T7(使用CLONING SYSTEM(5prime,3prime Inc.)的PRIMER PCR CLONERTM)。关于所得的重组质粒DNA，使用DNA测序仪(“373S型DNA测序仪”，Perkin ElmerCorporation生产)通过双脱氧法来测定编码所需蛋白的DNA的核苷酸序列。
该序列以SEQ ID NO:1表示，据推测含有约200个氨基酸。分子量约为25kDa。根据对该蛋白质的同源性研究(SWISS-PROT Rel.34被用作数据库)，该蛋白据推测由2个LIM结构域，1个锌指纹基序构成。如果是这样，该转录因子就是显示LIM结构域结合DNA的第一例。该蛋白被命名为“Ntliml”。(5)分离用于确认DNA结合活性的Ntliml为了确认如此筛选到的蛋白质，即Ntliml有DNA结合能力，用大肠杆菌生产了必需数量的该蛋白质。
将具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA片段(Ntliml基因)与Ntliml翻译起始密码子区或翻译终止密码子区融合，并用各含有限制性核酸内切酶BamHⅠ位点的两个引物进行PCR扩增。用限制性核酸内切酶BamHⅠ消化所得的DNA片段后，将其插入表达质粒pGEX-2TX(Pharmacia Biotech Ltd.生产)的BamHⅠ位点，研究其连接位置的核苷酸序列，由此可以确认插入DNA的方向和flame的准确性，当利用上述载体产生Ntliml时，在tac启动子调控下所获得的Ntliml是GST融合蛋白。
将如此制备的表达质载体引入大肠杆菌JM109感受态细胞(Toyobo Co.,Ltd.生产)，所得的大肠杆菌培养在含100mg/l抗生素氨苄青霉素的LB琼脂培养基(1％色氨酸、0.5％氯化钠和0.5％酵母提取物)中，因此可挑选出具有Ntliml基因的转化细胞。将所得的转化细胞接种在1ml LB培养基中，37℃、200rpm预培过夜。然后在30ml含氨苄青霉素的LB培养基(氨苄青霉素的浓度100mg/l)中37℃、200rpm振荡培养。当OD600达到约1.0时，在培养基中加入IPTG使得其最终浓度达到2mM，然后继续在37℃、100rpm振荡培养。5小时后离心分离回收细胞，细胞悬浮在PPS缓冲液(140mM NaCl,2.7mM KCl.10.1mM Na2HPO4.1.8mMKH2PO4.PH7.3)中，将该悬液离心分离回收细胞。
由此获得的细胞重悬在2ml PBS缓冲液中。将悬浮液经超声波处理来粉碎，离心(15,000g,15分钟)分离出上清液(可溶性组份)。对可溶性组份进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，以确认所需蛋白即Ntliml-GST融合蛋白的表达。然后对可溶组分进行以下操作。
首先，在这组分中加入50％谷胱甘肽琼脂糖4B浆液(Pharmacia Biotech Ltd.生产)10μl，然后搅拌。然后，混合物室温放置30分钟，让Ntliml-GST融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖4B上。离心回收吸附有所需蛋白质的谷胱甘肽琼脂糖4B，用PBS缓冲液洗涤3次，通过以下步骤，只有Ntliml从中被洗脱并分离。即如下进行Ntliml的洗脱和分离在回收并洗涤过的谷胱甘肽琼脂糖4B中，加入19μl PBS缓冲液和1μl凝血酶蛋白酶(1切割单位在PBS中，可在16小时内90％消化100μg GST融合蛋白的酶量)将其悬浮，让所得的悬浮液室温放置2小时，将反应混合物离心分离(500g,5分钟)出上清液，然后对上清液进行SDS-聚丙烯酰胺电泳。(6)确认Ntliml的DNA结合能力采用电迁移率转移试验来确认所分离的Ntliml的DNA结合能力。
将2μg纯化的Ntliml溶解在10μl结合缓冲液(10mM Hepes,pH7.5,50mMNaCl,lmM EDTA)中。在所得的溶液中，加入上述(3)中所用含有P-BOX区的DIG-标记的双链合成寡核苷酸10nmol,2μg鲑精DNA作为探针，和载体DNA，所得的混合物室温放置20分钟。
用含1×TAE(6.7mM Tris-HCl,pH7.9,1mM EDTA,3.3mM乙酸钠)的5％聚丙烯酰胺凝胶，在100V电压下，对此反应混合物进行电泳，直至游离探针走出凝胶前终止电泳。将电泳模式从凝胶印迹到一张尼龙滤膜上，进行类似于(3)的化学发光检测。结果，发现有一条带迁移到了不同于Ntliml原先所示的电泳带位置，由此证实存在DNA-蛋白质复合物。另一方面，当1μmol非标记探针(与用来检测迁移条带所用的探针完全相同，但是没有用DIG标记)加入上述反应混合物中时，然后在同样条件下进行电泳，迁移的条带消失。所以，确定了Ntliml蛋白与P-BOX的结合是特异性的。(7)Ntliml调节表达活性的研究为了使Ntliml基因在植物内表达，将含有Ntliml基因的DNA片段以有义链方向插入质粒pBI221(Clontech Laboratories,Inc.生产)的β葡糖醛酸酶基因所在位置，所得的质粒被用作效应物。图1显示插入了Ntliml基因的此效应物的一部分的图示。另一方面，将三份重复P-BOX序列在CaMV35s启动子的-90bp处与EcoRV位点连接，并将3份重复G-BOX序列(-CCACGTGG-))(和P-BOX序列相似，通常天然存在于CAD基因等的5’非翻译区)与P-BOX序列融合，使得G-BOX序列位于上游。将所得的融合基因插入pUC19，以该质粒作为报道质粒。在此例中，为了更简便地显示Ntliml基因的功能，其表达易被检测到的GUS基因被置于受Ntliml基因(而不是与苯丙醇生物合成相关的CAD等基因)作用的P-BOX序列的下游。此时，G-BOX序列被假定起着增强子的作用。图2显示插入了融合基因的报道基因的一部分的示意图。
顺便说一下，上述制备的两种重组质粒之一一旦引入大肠杆菌JM109的感受态细胞，即可通过培养大肠杆菌来扩增。最后，得到约1mg的各种质粒DNA。大肠杆菌的培养是在37℃,LB培养基上，以200rpm的振荡速度进行的。用常规方法从大肠杆菌中分离并纯化质粒DNA。
根据纳入本文用作参考的Okada等(K.Okada等，Plant Cell Physiol.,27:619(1986))的方法，从烟草培养细胞BY-2制备了原生质体。为了用电穿孔法将10μg报道质粒或报道质粒和效应物各10μg引入原生质体，用一台基因引入仪，Gene，对悬浮在1ml电穿孔缓冲液(5mM MES,30mM KCl,0.3M甘露醇，pH5.8)中的3×106个原生质体施加电脉冲(200V,250μF)。使用的是Bio-RadLaboratories生产的脉冲仪。该原生质体接受基因引入处理后，用0.4M甘露醇洗涤，并培养在原生质体培养基(Murashige和Skoog培养基(Nippon Shinyaku Co.,Ltd.)，即在混合盐中加入0.4M甘露醇制得)上25℃24小时，然后将其均质化，并离心分离出可溶组份。用纳入本文作参考用以的Jefferson等的方法(R.Jefferson等，EMBO J.,6:3901-3907(1997))测定GUS的活性。结果，在同时引入了报道质粒和效应物的原生质体中，检测到GUS基因的表达比只引入了报道质粒的原生质体高约3倍。这表明，由于来自效应物Ntliml基因的Ntliml蛋白质的作用，在报道质粒中，连接在P-BOX序列下游区的GUS基因的表达被大大加强。换言之，Ntliml是一种转录因子，它结合P-BOX序列并促进受该P-BOX序列驱动的基因的表达。在植物内以有义方向引入Ntliml基因，可促进受Ntliml调控的基因的表达。
实施例2(1)在烟草内引入有义或反义的Ntliml基因按有义或反义方向，将Ntliml基因引入pBI121质粒(Clontech Laboratories,Inc.)中，引入位置与实施例1的(7)制备效应物时的洗脱。用限制性核酸内切酶消化试验测定了所得重组质粒中插入Ntliml基因的方向后，用电穿孔法将该质粒引入根瘤土壤杆菌EHA105(在10％甘油中，电脉冲为2500V,25μF)中。将根瘤土壤杆菌培养在含100mg/l卡那霉素的LB培养基上，28℃培养2天，选择性地只获得了引入了重组质粒的那些杆菌。
将烟草(Nicotiana tabacum L cv.SR-1)用作引入Ntliml基因的植物。即，将一片无菌条件下培育的秧苗的叶子(约发芽后4周)切割成5mm的方形叶片，在引入了重组质粒的根瘤土壤杆菌的培养液中浸1至3分钟，令叶片的表皮向下以被根瘤土壤杆菌感染，从而将Ntliml基因引入叶片。用无菌纸巾之类擦去培养液后，将被感染的叶片放在愈伤组织诱导培养基(Murashige和Skoog基础培养基，3％蔗糖，0.25％gellan gum,1mg/l乙酸亚萘酯，0.1mg/l苄基腺嘌呤)上，在25℃持续光照下培养3天。然后将培养后的叶片转移到芽(shoot)形成培养基(Murashige和Skoog基础培养基，3％蔗糖，0.25％gellan gum,0.1mg/l乙酸亚萘酯，1mg/l苄基腺嘌呤，100mg/l卡那霉素，500mg/l羧苄西林)中，在相同温度、相同光照条件下继续培养，以分化出芽来，在芽形成培养基上培养4周后，切下分化出的芽，移植到Murashige和Skoog基础培养基(加入3％蔗糖，0.8％琼脂或0.25％gellan gum)中，含有100mg/l卡那霉素和500mg/l羧苄西林，在相同温度和条件下培养约4周以诱导出根。使用Metromix350(Scotts-Sierrea Horticulture Company生产)作为培养土壤，将生根后的植株种植在25℃的暖房中。(2)对Ntliml基因转化烟草的分析(2-1)PCR分析按照常规方法从(1)中培养的转化烟草叶中提取基因组DNA，进行PCR，用对应于Ntliml基因中核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。结果，从各个PCR样品中都测得了Ntliml基因的扩增，而且确认，用于分析的25个转化体都具有有义或反义的Ntliml基因(其中13个个体是有义转化体，12个是反义转化体子)。(2-1)Northern杂交分析从已经确认存在Ntliml基因(2-1)的转化烟草中挑选出两株有义转化体(Ntliml基因按有义方向引入)和两株反义转化体(Ntliml基因按反义方向引入)。从它们的茎中用酸胍苯酚氯仿法提取总RNA。作为对照，同时还从非转化烟草中提取了总RNA。
使用含终浓度为0.66M的甲醛的1.2％琼脂糖凝胶和1×MOPS缓冲液(20mM MOPS/pH7.0,5mM乙酸钠，0.5M EDTA)，取10微克提取的总RNA进行电泳2小时60V。之后，将电泳模式从凝胶上印迹到一张尼龙滤膜上，对所得的尼龙滤膜进行Northern杂交。
按照实施例1(3)所述，用非放射性同位素DIG核酸检测法进行Northern杂交，除了Ntliml基因之外使用了PAL基因(820bp)和4CL基因(610bp)作为探针，后两者是通过PCR扩增烟草基因组DNA获得的。图3显示了Northern杂交后上述尼龙滤膜的化学发光情况。
根据图3发现，与非转化的C(泳道5)相比，Ntliml基因的表达在有义转化体OP1和OP2(泳道1和2)中较强，而在反义转化体UP1和UP2(泳道3和4)中较弱。就有义转化体OP1和OP2而言，PAL基因和4CL基因中所见的表达都比在非转化体C中的强，这种倾向性在OP2中特别突出。另一方面，在反义转化体UP2中，PAL基因和4CL基因各自的表达都几乎被完全抑制。在反义转化体UP1中，PAL基因和4CL基因各自的表达受抑制的程度没有这么高，可能是因为该转化体中反义基因的诱导量(在PAL基因和4CL基因的表达几乎被完全抑制的UP2转化子中，可能有许多Ntliml的反义基因拷贝被引入了植物的基因组内)，或者反义基因在植物基因组中的位置作用有很大影响。
根据上述结果，显而易见的是，Ntliml基因，即本发明DNA，能够促进或抑制PAL基因或4CL基因的表达。此外，从本发明DNA合成的转录因子通过结合所述基因的P-BOX或结合与P-BOX类似的5’非翻译区共有序列而发挥功能，不仅对迄今上述PAL基因或4CL基因，而且对具有该共有序列的任一基因都能够表现出促进作用。
参照具体的实施例对本发明进行了详细的说明，然而对本领域熟练技术人员来说显而易见的是，所进行各自种改变和修饰都在本发明的宗旨和范围内。
本文将下面的优先权申请全部纳入作为参考1998年3月31日的日本专利申请NO.Hei 10-125171。
序列表SEQ ID NO:1序列长度988序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型mRNA的cDNA最初来源生物体烟草组织类型叶特征名称/代码CDS位置100..702鉴定方法E名称/代码结构域位置127..282鉴定方法S其它信息LIM结构域是一种锌指纹基序名称/代码结构域位置1427..582鉴定方法S其它信息LIM结构域是一种锌指纹基序序列GAATTCGCGG CCGTTCCAAA AACCAAGTGC TAACACAAAG AAAGGGAAAG AGCCACAAAG 60ACCATTTTTG TTTTCTGTAA AACTTGCTCG TATATAGCC ATG GCT TTT GCA GGA 114ACC ACA CAG AAA TGC ATG GCA TGT GAC AAG ACT GTC TAT CTG GTT GAC 162AAA TTA ACT GCA GAT AAC AGA ATC TAT CAC AAA GCT TGT TTC AGA TGC 210CAT CAC TGC AAG GGC ACT GTC AAG CTT GGC AAC TAC AAT TCC TTT GAG 258GGA GTT CTA TAC TGT AGA CCA CAC TTT GAT CAG CTC TTC AAA CAA ACT 306GGC AGT TTG GAT AAA AGC TTT GAA GGT ACA CCA AAA ATT GTG AAG CCA 354CAG AAA CCC ATT GAC AGT GAG AAA CCA CAG GTA GCC AAA GTG ACA AGC 402ATG TTT GGT GGA ACA AGA GAG AAA TGT TTT GGC TGC AAG AAA ACT GTC 450TAC CCA ACA GAA AAG GTA TCA GCC AAT GGC ACG CCA TAC CAT AAG AGC 498TGC TTC CAA TGC AGC CAC GGA GGC TGT GTA ATA AGC CCT TCC AAC TAT 546ACC GCA CAT GAG GGG CGC TTA TAT TGT AAA CAT CAC CAT ATT CAA CTT594ATC AAG GAG AAG GGC AAC TTA AGC AAG CTT GAG GGT GAC CAT GAA ATG642AAT TCC ACG ACA ACA ACA GAA GTT ACT GCA GAG TCA TAC ACA GCC GAC690CAA GTT GAT TGA TCCTTATCTT TACCGCGATC ATGTATTACG TATCTGCTGT742TAGTTGTAAG AATCGAAGGC GTTCAGCAGC TTCCATGAAT GCACTTGCCT TGCCCCAGCG 802TATGTTTTAC TCTAATCTAG CTTCAATTAA TTTGATGTTG AACTATATAT TGTCTAGCTT 862TTGTGTGTAG ATTTTTGACC TTTGTTTGCT TGTGCTTCAC TTGTATTATG TGAATGTTGA 922ATGAGATTGA ATATAACATG GTTTTGCTGT CCCAGTGCAT GCAAATCTTT GAGCGGCCGC 982GAATTC 988SEQ ID NO:2序列长度200序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型蛋白序列Met Ala Phe Ala Gly Thr Thr Gln Lys Cys Met Ala Cys Asp Lys Thr 161 5 10 15Val Tyr Leu Val Asp Lys Leu Thr Ala Asp Asn Arg Ile Tyr His Lys 3220 25 30Ala Cys Phe Arg Cys His His Cys Lys Gly Thr Val Lys Leu Gly ASh 4835 40 45Tyr Asn Ser Phe Glu Gly Val Leu Tyr Cys Arg Pro His Phe Asp Gln 6450 55 60Leu Phe Lys Gln Thr Gly Ser Leu Asp Lys Ser Phe Glu Gly Thr Pro 8065 70 75 80Lys Ile Val Lys Pro Gln Lys Pro Ile Asp Ser Glu Lys Pro Gln Val 9685 90 95Ala Lys Val Thr Ser Met Phe Gly Gly Thr Arg Glu Lys Cys Phe Gly 112100 105 110Cys Lys Lys Thr Val Tyr Pro Thr Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Thr 128115 120 125Pro Tyr His Lys Ser Cys Phe Gln Cys Ser His Gly Gly Cys Val Ile 144130 135 140Ser Pro Ser Asn Tyr Thr Ala His Glu Gly Arg Leu Tyr Cys Lys His 160145 150 155 160His His Ile Gln Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ash Leu Ser Lys Leu Glu 176165 170 175Gly Asp His Glu Met Asn Ser Thr Thr Thr Thr Glu Val Thr Ala Glu 192180 185 190Ser Tyr Thr Ala Asp Gln Val Asp 200195 200
权利要求
1．一种分离和纯化的DNA，它具有的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1.
2．根据权利要求1所述的DNA，具有核苷酸序列SEQ ID NO:1。
3．一种分离和纯化的DNA，它与核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的DNA在严谨条件下杂交，并且编码控制苯丙醇生物合成通路的转录因子。
4．根据权利要求3所述的DNA，其中的严谨条件包括在55℃，在6×SSC中杂交。
5．一种重组载体，它包含权利要求1至4中任一项所述的DNA。
6．根据权利要求5所述的重组载体，它还包含与所述DNA操作性融合的启动子。
7．根据权利要求6所述的重组载体，其中DNA按有义方向与启动子操作性连接。
8．根据权利要求6所述的重组载体，其中DNA按反义方向与启动子操作性连接。
9．一种植物细胞，其中引入了权利要求1至4中任一项所述的DNA。
10．一种植物，它由权利要求9所述的植物细胞再生而成。
11．一种分离和纯化的蛋白质，它由权利要求1至4中任一项所述的DNA编码。
12．一种分离和纯化的DNA，它编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白质。
全文摘要
一种分离且纯化的、核苷酸序列包含SEQIDNO:1的DNA;一种分离且纯化的DNA,与核苷酸序列包含SEQIDNO:1的DNA在严谨条件下杂交,且编码控制苯丙醇生物合成通路的转录因子;包含该DNA,按有义或反义方向与之操作性融合的启动子的重组载体;引入了该DNA的植物细胞;由该植物细胞再生的植物;分离且纯化的由该DNA编码的蛋白质;和分离且纯化的DNA,编码氨基酸序列为SEQIDNO:2的蛋白质。
文档编号C12N15/29GK1232086SQ9910490
公开日1999年10月20日 申请日期1999年3月31日 优先权日1998年3月31日
发明者河冈明义, 海老沼宏安 申请人:日本制纸株式会社