专利名称：白色念球菌感染的生物检测试剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域。
白色念珠菌是一种最常见的条件致病菌，其深层(系统)感染危及病人的生命，在使用抗真菌药物进行治疗的情况下，死亡率仍高达百分之七十以上.白色念珠菌感染近二十多年来一直处于临床真菌感染的第一位.研究报道表明，艾滋病、癌症、肝病晚期和大量应用抗菌素的患者均易感染白色念珠菌，是被称为免疫系统薄弱病人的一个共同致死原因之一。目前，临床上对白色念珠菌感染的诊断主要采用的是血培养，这种方法需要在无菌条件下接种、在恒温条件下培养，条件要求严格、操作过程复杂。同时还需要数天的时间，故不能及时作出诊断，而且检测率只在40％左右。
本发明的目的是确立一种生物检测试剂，用来快速、简便、准确地诊断白色念珠菌感染。
本发明所选用的试剂为含有白色念珠菌热休克蛋白90抗原表位的丝状噬菌体外壳蛋白。这种抗原表位的基因核苷酸序列为CTGAAA GTT ATC AGA AAA，丝状噬菌体外壳蛋白基因序列是已知的。本发明的试剂的制备包括以下步骤首先合成白色念珠菌热休克蛋白90抗原表位基因。可以用商业公司的DNA合成仪进行人工合成。该基因的序列基本特征为长度18bp类型核酸链数双链几何结构线性分子类型DNA序列描述CTG AAA GTT ATC AGA AAA第二步是构建重组载体。原始质粒为以公知的pfd8SHU，公开文件为[Gene，171(1996)49-51]，用SacII和StuI两种限制性内切酶处理原始质粒，然后，将上述基因插入到酶切后的质粒中，而获得重组载体pfd8c(其中c为抗原表位基因，即外源基因)。
第三步骤是外源基因导入宿主细胞，宿主细胞为带有F因子的大肠杆菌TG1菌株，利用CaCl2法将带有外源基因的重组载体导入宿主细胞中得转化体。
第四步骤是制备含有白色念珠菌热休克蛋白90抗原的丝状噬菌体外壳蛋白。培养转化细胞，向培养液中加入IPTG，经离心、沉淀即可获得该发明的检测试剂。
本发明的使用方法是首先将检测试剂点于硝酸纤维素滤膜上，干燥后用溶于脱脂奶粉的PBS缓冲液处理；然后，分别加入待测血清(一抗)和酶标动物抗人的免疫球蛋白(二抗)；最后根据二抗标记酶选择染色剂进行染色，有颜色反应的为阳性，无反应的为阴性。
使用本发明的积极效果是1)操作简单不需要特殊的仪器设备，操作简单易学；2)快速在几小时内即可完成；3)灵敏性高由于利用免疫学方法进行检测，灵敏性较高，实验证明检测率可达100％；4)生产成本低可利用生物的繁殖特性进行大量制备，使生产成本大大降低。利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行了的临床检测实验。结果表明实验组(临床上怀疑为白色念珠菌感染的患者)的血清均呈阳性反应；对照组(在三年内无细菌感染病史并未使用过抗菌素的健康体检人员)的血清均呈阴性反应。说明本发明制备的生物检测试剂可以应用于白色念珠菌感染的临床诊断。实验中，较低浓度的检测试剂(0.03μg/μl〕可以与稀释了100倍的病人血清起反应，说明这种检测试剂灵敏性较高。
本发明的实施例包括以下内容制备生物试剂1.外源基因的合成利用商业生物公司的DNA合成仪进行外源基因(CTG AAAGTT ATC AGA AAA)的合成。
2.重组载体的构建利用已公开质粒pfd8SHU[Gene，171(1996)49-51]为原始质粒，进行重组载体的构建。
1〕取pfd8SHU质粒5μg，加入1-2μl的SacII酶，然后加入缓冲液和无菌水至总体积200μl。37℃保温24小时。酶切后，用常规方法将抽提质粒DNA。抽提后，用乙酸胺和二倍体积的乙醇沉淀DNA，并溶于50μl TE液中。
2〕用第二种内切酶StuI处理质粒DNA，方法同上。
3〕双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，测定载体浓度。
4〕载体与人工合成的外源DNA片段按摩尔浓度1∶3混合。10μl混合液加入0.5μlT4DNA连接酶和1μl缓冲液。15-20℃条件下，培养过夜，获得重组载体(pfd8c)，pfd8c中的c代表抗原表位外源基因。
3.制备感受态细胞将TG1细胞培养于LB培养基上，37℃培养16-20小时。挑选单菌落接种于2mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。培养液转入100mlLB培养液，37℃培养5小时。5000rpm离心15分钟。用8ml预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，获感受态细胞。
4.重组载体导入宿主细胞取浓度约为200μg/mL的DNA溶液1.25μl；加入100μl的感受态细胞，置于碎冰中15min；加入800μlLB培养液，置于37℃恒温箱中培养1小时；10000rpm离心5分钟；弃上清，将剩余部分铺展于含氨苄青霉素的LB培养基表面，37℃恒温箱中培养过夜。
5.杂合丝状噬菌体外壳蛋白制备挑取少量冰冻的转化细胞在LB平板上划线培养，过夜；选单菌落接种于含氨苄青霉素的3mlLB培养液中，37℃培养过夜；将培养液转入100mlLB培养液继续培养，并向其中加入IPTG(终浓度为1mM/ml)，37℃培养30分钟；离心(10,000rpm)10分钟；沉淀用100ml培养液重新悬浮，37℃培养2-4小时；离心(8000rmp)20分钟，弃上清，用TE液悬浮沉淀；离心(5000rpm)20分钟，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化钠。碎冰中放置4-5小时，离心(8000rpm)10分钟；弃上清，用TE液悬浮沉淀，得杂合丝状噬菌体外壳蛋白。
6.杂合丝状噬菌体外壳蛋白的SDS-PAGE检测此步骤的目的为1〕检测外源基因是否正常表达；2)制备的蛋白是否纯净。
按常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行。首先将杂合丝状噬菌体外壳蛋白在沸水中变性3-5分钟后，上样于胶板槽内；120v电泳6-7小时后，硝酸银染色法对胶板进行染色。观察实验结果，如果电泳胶板上出现两条带，下方带为野生型丝状噬菌体外壳蛋白带，上方带则为融合有外源基因产物的杂合丝状噬菌体外壳蛋白带。表明a〕外源表位基因已成功整合，并在宿主细胞中正常表达；b〕由于硝酸银染色法非常灵敏，胶板又无杂带出现，说明制备的蛋白已比较纯净。
试剂用于临床检测利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)的免疫斑点法进行检测。抗原为杂合丝状噬菌体外壳蛋白；第一抗体为病人血清中含有的抗白色念珠菌的抗体；第二抗体为酶标记的动物抗人免疫球蛋白。1〕实验对象实验组临床上怀疑为白色念珠菌感染的患者；对照组在三年内无细菌感染病史并未使用过抗菌素的健康体检人员。2〕免疫斑点检测(1)将噬菌体抗原0.5-1微升(0.03--0.05μg/μl)溶液点于硝酸纤维素滤膜上，干燥5-10分钟，用溶于脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭处理30分钟.
(2)用含有0.05％Tween-20的PBS(冲洗液)将封闭后的膜冲洗3次，每次5-10分钟。
(3)加待测血清，进行一抗标记.干燥5分钟，封闭液处理30分钟。
(4)封闭后，用冲洗液冲洗3次，每次5-10分钟。
(5)加入经酶标记的动物抗人免疫球蛋白(二抗)，37℃处理30分钟。
(6)冲洗液洗膜3次，每次5-10分钟。
(7)根据二抗所标记酶，选择染色剂进行染色.出现颜色反应为阳性。
3)检测结果实验结果表明实验组的血清均呈阳性反应；对照组的血清均呈阴性反应。说明本发明制备的生物检测试剂可以应用于白色念珠菌感染的临床诊断。实验中，较低浓度(0.03μg/μl)的检测试剂可以检测出稀释了100倍的病人血清中的抗体，说明这种检测试剂灵敏性较高。
权利要求
1.一种白色念珠菌感染的生物检测试剂，其特征在于该试剂为含有白色念珠菌休克蛋白90抗原表位的丝状噬菌体外壳蛋白，这种抗原表位基因核苷酸序列为CTG AAA GTT ATC AGA AAA。
2.一种白色念珠菌感染的生物检测试剂的制造方法，其特征在于(1)合成白色念珠菌热休克蛋白90抗原基因，可用商业公司的DNA合成仪进行人工合成；(2)构建重组载体，该重组载体的原始质粒为已公知的pfd8SHU，公开文件为[Gene，171(1996)49-51]，用SacII和StuI两种限制性内切酶处理原始质粒，然后，将上述基因插入到酶切后的质粒，而获得重组载体pfd8c；(3)外源基因导入宿主细胞，利用CaCl2法将带有外源基因的重组载体导入大肠杆菌TG1宿主细胞中得转化体；(4)培养转化细胞，向培养液中加入IPTG，经离心、沉淀可获得含有白色念珠菌热休克蛋白90抗原表位的丝状噬菌体外壳蛋白。
全文摘要
本发明提供一种可用于白色念珠菌感染的生物检测试剂及其制备方法。试剂为含有白色念珠菌热休克蛋白90抗原表位的丝状噬菌体外壳蛋白,制备方法包括外源基因的设计和合成、重组载体的构建、感受态宿主细胞的制备、含有外源基因的重组载体导入宿主细胞和杂合噬菌体外壳蛋白的制备等。这种利用新型DNA重组技术,即丝状噬菌体展示技术,生产的生物检测试剂可以应用于临床诊断,并具有简便、快速、灵敏和生产成本低等优点。
文档编号C12N15/10GK1277358SQ9911301
公开日2000年12月20日 申请日期1999年6月11日 优先权日1999年6月11日
发明者王丽 申请人:王丽