专利名称：气单胞菌属鉴定培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种菌种培养基及其制备方法，特别是一种气单胞菌属鉴定培养基及其制备方法。
气单胞菌广泛分布于河水、池水、污水及河道和近陆地海湾的泥沙中，甚至在植物的根、茎和土壤中也可检出，常存在于鱼、虾、贝、青蛙、蛇等冷血动物和两栖动物的体腔。气单胞菌是冷血动物、某些温血动物和人的重要致病菌。因此，快速、准确地对气单胞菌进行鉴定，对该菌所致临床感染的临床诊断及指导合理用药有重要意义。目前，我国虽已建立了较系统的检验方法，但尚无一种特异性强的菌属鉴定培养基，它直接影响了气单胞菌的检出率和延长了确认鉴定的时间。气单胞菌发现已90多年的历史，长期以来，对该菌的检验都采用肠杆菌科细菌的检验程序，因此，其阳性检出率偏低。国外为了提高对该菌的检出率，除用SS和麦康开琼脂进行初分离外，据据气单胞菌对青霉素等耐药的特性，研制出在初分离培养基中加青霉素，先锋霉素或新生霉素，制成选择性初分离培养基，以提高阳性检出率。多年来我国对气单胞菌的初分离也采用SS和麦康开琼脂，初筛鉴定用肠杆菌科细菌指定的TSI琼脂。由于多数气单胞菌分解蔗糖，少数种迟缓分解乳糖并分解葡萄糖产酸或产酸产气。因此，气单胞菌在此培养基上的反应与肠杆菌科中的大肠埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、变形菌属、沙雷氏菌属等相一致，往往将它作为非致病菌给与抛弃。1979年，国外研制出一种嗜水气单胞菌的初筛鉴定培养基(AH)，在此培养基上，气单胞菌中的嗜水气单胞菌呈现表层紫色，底层黄色反应，并结合吲哚、动力、硫化氢试验，可排除肠杆菌科中与气单胞菌生化反应关的菌属，使嗜水气单胞菌属的阳性检出率大大提高，但是这种检验方法，程序复杂、检验范围只是一个菌种，检验范围较小，检验成本较高。
本发明的目的是提供一种简单、特异并且可以实现快速、准确的对气单胞菌进行鉴定的气单胞菌属鉴定培养基。
本发明的另一个目的是提供一种简单、方便的配制气单胞菌属鉴定培养基的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明为一种气单胞菌属鉴定培养基，它的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的有效范围是L-鸟氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、琼脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035。
本发明的另一个发明目的是通过以下方法实现的按照组成成份取肝蛋白胨0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白胨0.85-0.95，色氨酸0.09-0.11、L-鸟氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10肌醇0.5-1.0、硫代硫酸钠0.035-0.045、柠檬酸铁铵0.04-0.06、琼脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸馏水1000ml，加热溶化，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分装到小试管，每管2ml，胶塞封口，121℃高压灭菌1.2分钟，4℃冰箱保存备用。
本发明所述的培养基是鉴于气单胞菌鸟氨酸阴性(除维罗那气单胞菌外)，发酵甘露醇(除舒氏气单胞菌外)，不发酵肌醇的生化特征而制备的。在反应原理上，加入肝胨、酵母浸膏，硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵以测定硫化氢的存在，加入蛋白胨、色氨酸以观察吲哚反应，加入适量的琼脂以观察细菌的运动性，加入溴甲酚紫指示剂以显示酸碱度，它的变色范围是PH值5.2-6.8，颜色由黄到紫。本培养基配方的关键是L-鸟氨酸、肌醇、甘露醇的剂量。鸟氨酸脱羧产碱，肌醇、甘露醇发酵产酸。当鸟氨酸阴性时，如果肌醇阴性、甘露醇阳性，由于甘露醇的量较少，发酵产酸就少，只有底层变黄(K/A)，如果肌醇阳性，由于肌醇的量是甘露醇的10倍，所以产酸较多，表层和底层均变黄(A/A)，当鸟氨酸阳性时，如果肌醇阴性，鸟氨酸脱羧产碱量要远远大于甘露醇发酵产酸量，因此无论甘露醇阳性与否，培养基的表层和底层均为紫色(K/K)，如果肌醇阳性，鸟氨酸脱羧产碱量与肌醇发酵产酸量相差不多，无论甘露醇是否阳性，其培养基的PH值在5.2-6.5之间，会显示一种黄色和紫色之间的过渡颜色(K/N或N/N)。另外，变形菌属的细菌在该培养基上会产生一种特殊的生化反应，生成代谢产物靛基质丙酮酸，使培养基的表层变成红色(R/K或R/A)。
根据标准菌株测试结果，气单胞菌在该培养基上出现表层为紫色、底层为黄色、动力阳性、硫化氢阴性、吲哚阳性的特异反应模式，其他肠杆菌科、弧菌科的相关菌，除少数菌外，均不产生这样的生化反应模式。为提高培养基的敏感程度，降低了蛋白胨用量，增加了色氨酸，使吲哚反应加快并容易观察。为了使颜色反应明显、稳定，调整了各主要成份的用量并增加了指示剂的含量。
应用本发明培养基，共检查嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、简氏气单胞菌264株，符合气单胞菌反应模式的262株，符合率为99.24％。另2株反应不符，经进一步检查为鸟氨酸阳性、肌醇阴性、甘露醇阳性的气单胞菌1株，鸟氨酸阴性、肌醇阴性、甘露醇阴性的气单胞菌1株，它们是否是维罗那气单胞菌和舒氏气单胞菌或少见的嗜水气单胞菌有待进一步鉴定。由标本经SS或麦康开初分离，可疑菌落直接接种本培养基，呈现气单胞菌反应模式的197株。
经鉴定为气单胞菌190株，符合率为96.54％，另7株复查为大肠艾希氏菌5株(2.54％)，成团肠杆菌2株(1.01％)。
在该培养基上，气单胞菌的反应为表层紫色，底层黄色，根据颜色反应可排除肠杆菌科中的克雷伯氏菌、耶尔森氏菌、变形菌、普罗威登斯菌、摩根氏菌、沙雷氏菌等6个菌属的细菌，结合动力、吲哚、硫化氢试验结果，可进一步排除志贺氏菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌等3个菌属的细菌。在艾希氏菌属中，多数大肠艾希氏菌与气单胞菌反应不一致。文献中报告，大肠艾希氏菌有35％的菌株为乌氨酸阴性。因此，使用该培养基作菌属鉴定，会遇到同气单胞菌反应模式相同的大肠艾希氏菌。在肠杆菌属的12个种中，除成团肠杆菌鸟氨酸阴性(87-99％)，在该培养基中出现与气单胞菌相同的反应外，其他几个种不会出现这种反应。我们鉴定的36株大肠艾希氏菌中有6株及所收集的4株成团肠杆菌与气单胞菌有一致的反应模式。为排除这两种菌、可挑取其表面培养基，做氧化酶试验，若为阴性，即为肠杆菌科细菌，阳性即为气单胞菌属细菌。
该培养基可鉴别邻单胞菌和弧菌属中的常见细菌。由于该培养基未含有氯化钠，除霍乱弧菌生长好，各项反应明显外，副溶血弧菌等3个种生长较差，生化反应较迟缓。其中河弧菌的反应与气单胞菌相类似，根据初分离用培养基的不同，结合耐盐试验，可做出初步鉴别。同时可以排除铜绿假单胞菌等非发酵革兰氏阴性杆菌，该类细菌在本培养基上的生化反应，因对甘露醇氧化完全(或不氧化)，酸性产物少，培养基的颜色变化不大，且动力仅在表层可以观察，与气单胞菌容易鉴别。
为保证该培养基的各项反应特异、敏感，结果判定规范，建立了该培养基的质控菌株嗜水气单胞菌，在培养基上为表层紫色，底层黄色，动力阳性，吲哚阳性，硫化氢阴性，肺炎克雷伯氏菌，在培养基表层、底层均为黄色，动力、吲哚、硫化氢阴性，弗氏柠檬酸杆菌，测定硫化氢反应为阳性。
总之，气单胞菌属鉴定培养基对气单胞菌具有独特的生化反应模式，对临床上常见的气单胞菌有特异的鉴定作用，对肠杆菌科、弧菌科临床上常见的菌有明显的鉴别作用，并可排除铜绿假单胞菌，仅与肠杆菌科的成团肠杆菌和部分大肠艾希氏菌有相似反应，与弧菌属的河弧菌有类同反应，这些菌可结合初分离用培养基、氧化酶和耐盐试验加以鉴别。因此，该培养基作为气单胞菌属的鉴定培养基是较理想的。同时，对肠杆菌科各菌属之间也有一定的初步鉴别作用。该培养基组成合理，特异性强，性能稳定，各项反应明显，使用方便，制作工艺简单。它的研制成功，对气单胞菌所致腹泻、食物中毒及多种感染的实验诊断、流行病调查和指导临床合理用药有实用价值，对气单胞菌的准确、快速鉴定和进一步提高阳性检出率提供了可靠的方法。该培养基系国内首创，全部采用国产试剂，成本低，可节约外汇，使用方便、操作简单，结果容易判定，推广应用有一定的社会效益，适用于我国医疗、卫生防疫、商检、兽检等部门的广泛应用。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1本发明为一种气单胞菌属鉴定培养基，它的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的有效范围是L-鸟氨酸4.0-5.0、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、琼脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035，肝蛋白胨0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白胨0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、硫代硫酸钠0.035-0.045、柠檬酸铁铵0.04-0.06。
所述的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的最佳数值为蛋白胨0.5％、酵母浸膏0.3％、蛋白胨0.9％、色氨酸0.1％、L-鸟氨酸0.5％、甘露醇0.1％O 肌醇1.0％、硫代硫酸钠0.04％、柠檬酸铁铵0.05％、琼脂3.2％，加蒸馏水96.27的水，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.030％。
一种气单胞菌属鉴定培养基的制备方法，按照组成成份取肝蛋白胨0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白胨0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、L-鸟氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10 肌醇0.5-1.0、硫代硫酸钠0.035-0.045、柠檬酸铁铵0.04-0.06、琼脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸馏水1000ml，加热溶化，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分装到小试管，每管2ml，胶塞封口，121℃高压灭菌1.2分钟，4℃冰箱保存备用。
接种将收集的气单胞菌和相关菌，用营养琼脂纯化培养后，挑取典型菌落，接种该培养基，37℃培养18-24h。气单胞菌在该培养基上表层为紫色(碱性)，底层为黄色(酸性)观察动力和硫化氢后，加Kovacs试剂，观察吲哚反应。临床标本用SS或麦康开分离，挑取可疑单个菌落，穿刺接种该培养基，培养和结果观察同上述。
数值鉴定按文献操作和判定结果。
培养基的特异性用气单胞菌属细菌和相关细菌的标准菌株接种于该培养基，气单胞菌在其表层为紫色(碱性)、底层为黄色(酸性)、动力阳性、吲哚阳性、硫化氢阴性的独特的生化反应模式，它与肠杆菌科、弧菌科中相关菌鉴别特征见表1。
表1气单胞菌及相关菌的标准菌株在本培养基上的反应特征菌种株数表层 底层 硫化氢 动力 吲哚喷水气单胞菌 7 KA- + +肺炎克雷伯氏菌2 AA- - -小肠结肠炎耶尔森氏菌 1 KN- - -弗氏柠檬酸杆菌a2 KA+ + -阴沟肠杆菌2 NN- + -大肠艾希氏菌 3 KK- + +粘质沙雷氏菌 2 NN- + -普通变形菌a1 RK+ + +摩氏摩根氏菌 1 RK- + +猪霍乱沙门氏菌a1 KK+ + -类志贺邻单胞菌3 KK- + +霍乱弧菌 2 KK- + +铜绿假单胞菌b1 KK- + -注K紫色，A黄色，R褐红色，N界于黄色和紫色之间，+阳性反应，-阴性反应，a硫化氢产生量大时，呈黑色，其反应易被掩盖，b近原培养基颜色，动力在表面层观察，(下同)。
培养基的稳定性各批培养基在使用前分别用嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏柠檬酸杆菌测定其对鸟氨酸、动力、硫化氢、吲哚、肌醇、甘露醇的反应。对4℃冰箱保存至1个月、2个月、3个月、6个月的定型培养基，用嗜水气单胞及其他几种质控株检验其各项生化反应特征。结果表明各批培养基生化性稳定，4℃保存6个月无异常反应出现。
临床菌株鉴定实验和考核嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、简氏气单胞菌共264株，符合气单胞菌反应模式的262株，符合率99.24％，另2株菌的表层和底层均产碱(K)，占0.76％。对这2株菌进一步鉴定结果表明，一株为鸟氨酸阳性，另一株为甘露醇阴性。为进一步了解该培养基对气单胞菌属的鉴定效果，我们直接由初分离于SS或麦康开琼脂上挑取的可疑菌落接种该培养基，符合气单胞菌反应模式的197株(管)，经数值鉴定190株为嗜水气单胞菌，符合率为96.45％，另7株(占3.55％)经数值法鉴定5株为大肠艾希氏菌，2株为成团肠杆菌。气单胞菌与临床上常见的肠杆菌科中的11个菌属、弧菌科的2个菌属及铜绿假单胞菌在该培养基上的反应结果见表2。表2 临床分离的气单胞菌及相关菌在本培养基上的反应结果菌名 株数(386) 表层 底层 硫化氢 动力 吲哚 注嗜水气单胞菌 261 KA(259) - ++(243) 2株底层为K温和气单胞菌 2 K A + --简氏气单胞菌 1 K A - -+肺炎克雷伯氏菌5 N A - --安鼻克雷伯氏菌1 A - - --小肠结肠炎耶尔森氏菌 2 K N - - 37℃培养，动力阴性大肠艾希氏菌 36 KK(30)- ++6株底层为A福氏志贺氏菌 13 K A - -- 紫色仅出现在表面宋内氏志贺氏菌3 K N - --普通变形菌2 R K + ++ 硫化氢量大时均变黑奇异变形菌3 R K + ++ 硫化氢量大时，均变黑彭氏变形菌1 R K + ++斯氏普罗威登斯菌 2 R K - ++摩氏摩根式菌 3 R K - ++粘质沙雷氏菌 1 N N - +-居泉沙雷氏菌 1 K N - +-深红沙雷氏菌 2 N N - +-鼠伤寒沙门氏菌2 K K + -- 硫化氢量大时，均变黑乙型副伤寒沙门氏菌1 K K - +- 硫化氢量大时，均变黑伤寒沙门氏菌 1 K A + +- 硫化氢量少肠炎沙门氏菌 1 K K + +-产气肠杆菌2 K N - +-成团肠杆菌4 K A - ++ (3)弗氏柠檬酸杆菌4 K A + +- 硫化氢量大时，均变黑霍乱弧菌 8 K K - ++副溶血弧菌6 K K - ++生长不良解藻酸弧菌1 K K - ++生长不良河弧菌3 K A - +-生长不良类志贺邻单胞菌8 K K - ++铜绿佩单胞菌 6 K K - ++注()内数字为符合该反应的株数实施例2本发明在能够保证质量的前提下，成本最低，最容易推广的配方蛋白胨0.45％、酵母浸膏0.25％、蛋白胨0.85％、色氨酸0.10％、L-鸟氨酸0.40％、甘露醇0.07％肌醇0.55％、硫代硫酸钠0.04％、柠檬酸铁铵0.045％、琼脂0.32％，加蒸馏水96.27的水，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.0030％用胰蛋白胨(0.9-1.1)可以替换蛋白胨(0.85-0.95)和色氨酸(0.09-0.11)，但是吲哚实验颜色较浅，且成本高。
可以用柠檬酸铁替换柠檬酸铁铵，但是硫化氢产量小，不够稳定。
本发明还可以采用另一种方法进行生产将上述原料混合后，烘干、研磨至粒度为200-300目，避光、避潮封装。
气单胞是弧菌科的一个属。该属含8个中，即嗜水气单胞、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、杀鲑气单胞菌(无动力，含4个亚种)、中间气单胞菌、舒氏气单胞菌、嗜泉气单胞菌和维罗那气单胞菌。近年，国外学者又报告了尺骨气单胞菌、简氏气单胞菌和异常嗜糖气单胞菌3个新种。其中以嗜水气单胞菌为优势菌，其次是温和气单胞菌，其它几个种少见。除维罗那气单胞菌为鸟氨酸阳性外，其他的种均鸟氨酸阴性，除舒氏气单胞菌外其他几个种均发酵甘露醇。
本发明经中国科学院微生物研究所做技术鉴定，辽宁省卫生防疫站等四个单位的考核应用，一致认为该培养基对气单胞菌属细菌有独特的生化反应模式，对肠杆菌科、弧菌科的相关菌属可做出属的鉴别，具有应用和推广价值。
权利要求
1.一种气单胞菌属鉴定培养基，其特征是它的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的有效范围是L-鸟氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、琼脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035。
2.根据权利要求1所述的一种气单胞菌属鉴定培养基，其特征是所述的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的有效成分还包括肝蛋白胨0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白胨0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、硫代硫酸钠0.035-0.045、柠檬酸铁铵0.04-0.06。
3.根据权利要求1所述的一种气单胞菌属鉴定培养基，其特征是所述的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的最佳有效值为肝蛋白胨0 5％、酵母浸膏0.3％、蛋白胨0.9％、色氨酸0.1％、L-鸟氨酸0.5％、甘露醇0.1％0 肌醇1.0％、硫代硫酸钠0.04％、柠檬酸铁铵0.05％、琼脂3.2％，加蒸馏水96.27的水，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.0030％。
4.一种气单胞菌属鉴定培养基的制备方去，其特征是按照组成成份取肝蛋白胨0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白胨0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、L-鸟氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10 肌醇0.5-1.0、硫代硫酸钠0.035-0.045、柠檬酸铁铵0.04-0.06、琼脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸馏水1000ml，加热溶化，调整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分装到小试管，每管2ml，胶塞封口，121℃高压灭菌1.2分钟，4℃冰箱保存备用。
全文摘要
本发明涉及一种气单胞菌属鉴定培养基及其置备方法，它的组成成份及其组成成份水溶液在百分比浓度下的有效范围是肝蛋白胨、酵母浸膏、蛋白胨、色氨酸、L－鸟氨酸、甘露醇、肌醇、硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵、琼脂，加蒸馏水，调整pH值6.7，加入溴甲酚紫。以上成份混合，加蒸馏水，加热溶化，调整pH值6.7，加入溴甲酚紫，分装到小试管，胶塞封口，高压灭菌，4℃冰箱保存备用。本发明经中国科学院微生物研究所做技术鉴定，辽宁省卫生防疫站等四个单位的考核应用，一致认为该培养基对气单胞菌属细菌有独特的生化反应模式，对肠杆菌科、弧菌科的相关菌属可做出属的鉴别，具有应用和推广价值。
文档编号C12N1/20GK1238383SQ9911300
公开日1999年12月15日 申请日期1999年6月9日 优先权日1999年6月9日
发明者刘彤, 刁映红, 张波, 张萍, 姜媛 申请人:哈尔滨市道外区卫生防疫站