利用阳离子表面活性剂稳定酶的制作方法

专利名称：利用阳离子表面活性剂稳定酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的稳定，特别是聚合酶在含有阳离子表面活性剂的水溶液中的稳定化。
许多稳定技术是已知的。这些技术包括将酶固定在固体底物上、对酶进行化学修饰、对酶进行基因工程处理以及加入稳定添加剂。表面活性剂是已显示能稳定酶的一组添加剂。表面活性剂是能稳定活性形式的酶和含有这些酶的液体环境之间的界面的表面活性化合物。
例如，已有种种显示表明非离子型洗涤剂能提高各种具有酶促活性的蛋白质(例如依赖于cAMP的蛋白激酶、酪氨酸羟化酶、氧化氮合酶、色氨酸羟化酶和一种甜薯β淀粉酶)的溶液稳定性。此外，非离子型洗涤剂诸如曲通X-100和吐温20已显示能稳定DNA聚合酶的活性(参见，例如《生物化学》14:789-95)。结合在此作为参考的欧洲专利申请776,970A1公开了非离子型洗涤剂(包括聚氧乙烯化脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)和乙氧基化烷基酚(NP-40))用于稳定Taq耐热DNA聚合酶活性的用途。
低浓度的阴离子型洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)已显示能稳定酶活性。但是，假如最佳浓度的SDS在溶液中过量的话，就有协同结合的可能性，SDS在蛋白质稳定化中的用途就会受到限制。然而，众所周知，许多阳离子型洗涤剂对蛋白质的结合能力远远小于强阴离子型洗涤剂如SDS(参见，例如Nozaki等，《生物化学杂志》249:4452-59)。另外，大多数蛋白质具有的阳离子结合位点要少于阴离子结合位点。
酶诸如DNA聚合酶的利用经常受到聚合酶在溶液中的稳定性的限制。因此，需要能提高溶液中酶稳定性的添加剂，特别是那些既能提高稳定性又能避免目前所用洗涤剂的各种缺点的添加剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，它包含具有酶促活性的蛋白质和阳离子表面活性剂的混合物。本发明不限于任何一种特定的酶。事实上，本发明试图涉及各种酶的稳定化。在一些优选的实施方案中，蛋白质是一种聚合酶(例如，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Taq聚合酶、Tne聚合酶、Tth聚合酶、T4 DNA聚合酶、RNA聚合酶Ⅱ、SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶，等等)。在其他实施方案中，酶优选是激酶、磷酸化酶或磷酸酶(例如小牛小肠磷酸酶)。
同样，本发明不限于一种特定的阳离子表面活性剂。事实上，本发明考虑了各种各样的阳离子表面活性剂。在一些实施方案中，阳离子表面活性剂具有约为10-17的亲水-亲油平衡(HLB)指数。在一些优选的实施方案中，阳离子表面活性剂具有约为11-16的HLB指数。在其他实施方案中，阳离子表面活性剂是一种聚乙氧基化胺。在一些特别优选的实施方案中，该聚乙氧基化胺具有以下结构 在一些实施方案中，z是约15-20的整数，首选为18。在其他实施方案中，x+y的平均值约为5-15，以使HLB指数为约11-16。在一些优选的实施方案中，x+y的平均值为5或15。在有些实施方案中，氮可以被亚磷、硫或砷基取代。在另一些实施方案中，阳离子表面活性剂以约0.0005-1.0％(体积)的浓度存在于溶液或混合物中。
在一些实施方案中，混合物或溶液包括缓冲试剂。本发明不限于一种特定的缓冲试剂。事实上，本发明考虑了各种各样的缓冲试剂。在一些实施方案中，缓冲试剂优选是MOPS、HEPES或Tris缓冲剂。在另一些实施方案中，缓冲剂在溶液中的浓度为约10mM-70mM。在一些实施方案中，pH为约7.0-9.2。
在另一些实施方案中，溶液或混合物包括一价盐和/或二价盐。本发明不限于任何一种特定的盐。事实上，本发明考虑了各种各样的盐，包括但不限于NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2。在有些实施方案中，二价阳离子以约0.1-10mM的浓度存在。在另一些实施方案中，一价阳离子以约1-100mM的浓度存在。
在另一些实施方案中，溶液或混合物包括螯合剂和/或还原剂。本发明不限于特定的螯合剂和还原剂。事实上，本发明试图涉及各种各样的螯合剂和还原剂。优选的螯合剂包括但不限于EDTA和EGTA。优选的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇和β-巯基乙醇。在有些实施方案中，螯合剂以约0.01-10mM的浓度存在。在另一些实施方案中，还原剂以约0.1-20mM的浓度存在。
在一些实施方案中，本发明提供了稳定具有酶促活性的蛋白质的方法。在有些实施方案中，提供了具有酶促活性的蛋白质(例如聚合酶、激酶、磷酸酶或磷酸化酶)和阳离子表面活性剂。在一些优选的实施方案中，阳离子表面活性剂的HLB指数为约10-17。在特别优选的实施方案中，阳离子表面活性剂是一种聚乙氧基化胺，如上所述。在另一些实施方案中，具有酶促活性的蛋白质和阳离子表面活性剂结合，以使与不存在阳离子表面活性剂时酶的活性相比，酶的活性被稳定了。定义为了有助于理解本发明，下面给出了一些术语的定义。
本文中所用的术语“酶”是指具有催化化学和生物反应作用的分子或分子聚集体。这类分子通常是蛋白质，但也可包括短肽、RNA、核酶、抗体以及其他分子。催化化学和生物反应的分子称之为“具有酶活性”或“具有催化活性”。
本文中所用的术语“稳定化”、“稳定”和“稳定的”当与酶活性有关时，指的是物质维持、增强酶活性的能力，或者反过来说是抑制酶活性下降或损失的能力，通常是针对时间来测量的(即，在稳定剂的存在下，酶活性能比不存在稳定剂时的酶活性保持更长一段时间)。“酶活性的稳定化”也指的是物质在次最优的温度和pH条件下维持酶活性的能力。再举一个例子，“稳定酶活性”指的是物质在次最优条件下，与不存在“稳定”化合物或物质时的活性相比，增强酶活性的能力。
术语“聚合酶”是指从核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸合成核酸链(例如RNA或DNA)的酶。
术语“聚合酶活性”是指酶从核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸合成核酸链(例如RNA或DNA)的能力。DNA聚合酶合成DNA，而RNA聚合酶合成RNA。
术语“表面活性剂”是指任何具有能积极地被水溶剂化的极性首基和不能被水很好地溶剂化的疏水尾部的分子。术语“阳离子表面活性剂”是指具有阳离子首基的表面活性剂。术语“阴离子表面活性剂”是指具有阴离子首基的表面活性剂。
术语“亲水-亲油平衡指数”和“HLB指数”指的是将表面活性剂分子的化学结构与它们的表面活性关联起来的指数。HLB指数可以利用如Meyers描述的各种经验式进行计算，(Meyers，《表面活性剂科学与技术》，VCH Publishers Inc.,纽约，pp.231-245)，该书结合在此作为参考。本文中所用的表面活性剂的HLB指数是在1996年的McCutcheon’s卷1乳化剂和洗涤剂北美版中赋予该表面活性剂的HLB指数，该书结合在此作为参考。商品表面活性剂的HLB指数范围从0至大约70或更高。在水中具有高溶解度并具有增溶性能的亲水性表面活性剂在该数值范围的高数值端，而作为水在油中的良好加溶剂的、在水中具有低溶解度的表面活性剂在该数值范围的低数值端。
术语“聚乙氧基化胺”是指任何包括疏水烷基侧链和一个或多个长链聚氧乙烯基的表面活性剂。
术语缓冲剂”或缓冲试剂”是指当加入溶液中时能防止pH变化的物质。
术语“还原剂”和“电子给体”是指将电子供予第二个物质以便减少第二个物质的一个或多个原子的氧化态的物质。
术语“一价盐”是指任何其中的金属(例如Na、K或Li)在溶液中具有净1+电荷(即，质子比电子多一个)的盐。
术语“二价盐”是指任何其中的金属(例如Mg、Ca或Sr)在溶液中具有净2+电荷的盐。
术语“螫合剂”或“螫合试剂”是指任何具有一个以上带有孤电子对的原子的物质，它们可有效地与金属离子键合。
术语“溶液”是指含水或非水混合物。
术语“缓冲溶液”是指含有缓冲试剂的溶液。
术语“反应缓冲液”是指酶促反应在其中进行的缓冲溶液。
术语“储存缓冲液”是指酶在其中储存的缓冲溶液。
“扩增”是一种特定的涉及模板特异性的核酸复制情形。它与非特异性模板复制(即，依赖于模板但并不依赖于一个特定模板的复制)形成对照。在这里，模板特异性与复制的保真度(即固有多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性要区别开来。模板特异性经常用“靶”特异性来描述。靶序列是在“对它们进行查找以将它们从其他核酸中挑选出来”这个意义上而言的“靶子”。扩增技术主要设计用于这种挑选。
在大多数扩增技术中，模板特异性是通过选择酶而实现的。扩增酶是在它们的使用条件下将仅加工核酸的多相混合物中的特定核酸序列的酶。例如，在Qβ复制酶的情况下，MDV-1 RNA是用于该复制酶的特定模板(Kacian等，《美国国家科学院院报》69:3038)。利用这种扩增酶，其他核酸将不被复制。类似地，在T7 RNA聚合酶的情况下，该扩增酶对其自己的启动子具有严格特异性(Chamberlin等，《自然》228:227)。在T4 DNA连接酶的情况下，在连接处寡核苷酸或多核苷酸底物和模板之间错配的地方，该酶将不会连接两个寡核苷酸或多核苷酸(Wu和Wallace，《基因组》4:560)。最后，Taq和Pfu聚合酶，由于它们具有在高温下发挥作用的能力，已发现它们对受到引物束缚并因此由其限定的序列显示出高度特异性；高温导致了支持引物与靶序列杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件(Erlich(编)，《PCR技术》，Stockton Press)。
本文中所用的术语“可扩增核酸”是指可用任何一种扩增方法进行扩增的核酸。自然，“可扩增核酸”通常将包括“样品模板”。
本文中所用的术语“样品模板”旨的是源于用于分析是否存在“靶”(如下定义)的样品的核酸。与此对照，所用的“背景模板”是指可以或不可以存在于样品中的除样品模板以外的核酸。背景模板常常是非故意的。它可能是样品遗留的结果，或者可能是由于存在想要从样品中精制去除的核酸污染物。例如，在测试样品中，可能有除了想要检测的那些以外的来自生物体的核酸作为背景存在。
本文中所用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论是在纯化限制酶切消化中天然产生的还是合成产生的，该寡核苷酸当置于诱导合成互补于一条核酸链的引物延伸产物的条件下(即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶的存在下和在适宜的温度和pH值下)时能作为合成的起始点。对于扩增时的最大效率来说，引物优选是单链的，但另一方面，它也可以是双链的。如果引物是双链的，则在用于制备延伸产物之前首先进行处理将其两条链分离开。该引物优选是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以便在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物的来源以及所使用的方法。
本文中所用的术语“探针”是指寡核苷酸(即，核苷酸的序列)，无论是在纯化限制酶切消化中天然产生的还是合成、重组或利用PCR扩增产生的，它能与所研究的另一个寡核苷酸杂交。探针可以是单链也可以是双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴别和分离。在优选的实施方案中，用于本发明的任何一种探针将用任何一种“报道分子”标记，以使其能在任何检测系统中被检测出来，包括但不限于酶(例如ELISA、以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。本发明并不打算限于任何一种特定的检测系统或标记。
本文中所用的术语“靶”当与聚合酶链式反应相关使用时，指的是受到用于聚合酶链式反应的引物束缚的核酸区域。因此，“靶”要进行查找以将它从其他核酸序列中挑选出来。“节段”定义为靶序列中的核酸区域。
本文中所用的术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)指的是K.B.Mullis的美国专利Nos.4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，这几篇专利各自结合在此作为参考，它们描述了不用克隆或纯化而增加基因组DNA混合物中靶序列节段浓度的方法。这个扩增靶序列的方法由以下步骤组成将大大过量的两个寡核苷酸引物引入含有所需靶序列的DNA混合物中，接着在DNA聚合酶的存在下进行精确的热循环程序。这两个引物与它们各自的双链靶序列的链是互补的。为了完成扩增，使混合物变性，然后引物在靶分子中退火成它们的互补序列。退火后，引物用聚合酶延伸，以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤可以重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”，可以有无数次“循环”)，以得到高浓度的所需靶序列的扩增节段。所需靶序列的扩增节段的长度利用引物彼此之间的相对位置来确定，因此，该长度是一个可控制的参数。由于该过程是重复进行，因此该方法称之为“聚合酶链式反应”(下文中称作“PCR”)。由于所需的靶序列的扩增节段成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，因此称它们是“PCR扩增的”。
利用PCR，有可能通过几种不同的方法(例如，与标记探针杂交；加入生物素化引物后进行亲和素-酶缀合物检测；将32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP加入到扩增节段中)将基因组DNA中的一个特定靶序列的单一拷贝扩增到可检测水平。除了基因组DNA外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列都可用合适的一组引物分子进行扩增。特别是，由PCR方法自己产生的扩增节段本身就是随后的PCR扩增的有效模板。
本文中所用的术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”是指在完成了两次或多次由变性、退火和延伸这些PCR步骤组成的循环后所得到的化合物的混合物。这些术语包括一个或多个靶序列的一个或多个节段扩增的情况。
本文中所用的术语“扩增试剂”是指除了引物、核酸模板以及扩增酶以外，在扩增时所需要的那些试剂(脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂等)。一般说来，扩增试剂和其他反应成分一起放置和包含在反应容器中(试管、微孔等)。本发明的总体描述本发明提供了用于稳定蛋白质的方法和组合物，特别是用阳离子表面活性剂稳定水溶液中的聚合酶。聚合酶在溶液中的活性，或是在储存缓冲液中或是在反应缓冲液中，都可通过加入非离子表面活性剂来稳定。本发明不打算限于特定的作用机理。事实上，在蛋白质稳定化中牵涉的各种机理的理解都不需要进行和使用本发明。但是，一个关于利用表面活性剂的蛋白质稳定化机理的理论是表面活性剂与蛋白质的结合起了交联作用，从而防止了蛋白质的解折叠或变性。在非离子表面活性剂的情况下，结合发生在蛋白质表面上的疏水部位。
对表面活性剂结合蛋白质和被一些离子表面活性剂变性的机理已进行了评论。(参见，例如Jones，载于《蛋白质的表面活性》，S.Magdassi(编)，Marcel Dekker公司，纽约，pp.237-284)。离子表面活性剂和蛋白质之间最初的相互作用是通过离子首基与蛋白质表面上的高能位点的结合介导的。首基与蛋白质表面上的带电部位的相互作用是静电作用。阴离子表面活性剂结合阳离子位点(例如赖氨酰、组氨酰和精氨酰残基)。阳离子表面活性剂结合阴离子位点(例如谷氨酰和天冬氨酰残基)。然后该表面活性剂的疏水尾部与蛋白质表面上的疏水区相互作用。
另外，已知许多离子型洗涤剂能与蛋白质协同结合。协同结合的特点是蛋白质的三级结构解折叠，使得能结合更多的表面活性剂分子。最初的解折叠据信是由于表面活性剂的疏水尾部插入到蛋白质的疏水内部而引起的。协同结合通常导致蛋白质完全变性，导致活性丧失。
表面活性剂对蛋白质的结合亲和力是通过首基的性质、疏水尾链的长度以及表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)介导的。对于阴离子型洗涤剂，已证明对于具有恒定疏水尾部长度的表面活性剂来说，当极性首基按照SO4--＞SO3--＞CO2-＞OH的顺序变化时，结合亲和力是逐渐减小的。链长也是一个因素。例如，当烷基链长为C12(即12个碳原子)时，烷基硫酸酯显示出伴有广泛解折叠的结合，而当链长小于C12时，发生的是没有广泛解折叠的结合。与此对照，对于烷基亚磺酸酯来说，C12链长不足以导致协同结合。
协同结合在增加的表面活性剂浓度下发生。无论如何，协同结合的发生取决于表面活性剂的CMC。表面活性剂的CMC是溶液中存在的游离表面活性剂分子聚集形成胶束时的浓度。对于表面活性剂与蛋白质的协同结合来说，最初的静电结合发生在表面活性剂的浓度远远低于表面活性剂的CMC时。许多强烈变性的表面活性剂具有相对高的CMC。对于具有低CMC的表面活性剂来说，表面活性剂将在相对低的表面活性剂浓度下优先形成胶束。因此，溶液中不能达到足以引起蛋白质变性的表面活性剂浓度。非离子型洗涤剂受到它们的CMC和它们可达到的游离浓度的限制，因此对于任何适当过量加入的表面活性剂来说，都不能发生协同结合和变性。
表面活性剂与蛋白质的结合通过构造结合等温线来进行研究。等温线是通过将表面活性剂分子/蛋白质分子的平均数作为游离表面活性剂浓度的对数的函数作图而得到的S形曲线。结合等温线有多个区域。第一个区域由相对显著上升的斜面组成，相当于表面活性剂与天然蛋白表面上的带电部位的特异性结合或与疏水区的特异性结合。当这些部位饱和时，产生一个平台样区域。对于与蛋白质协同结合的表面活性剂来说，明显可见一个急剧斜度的第三区域。该区域一般在游离表面活性剂接近表面活性剂的临界胶束浓度时产生。
从诱导结合的解折叠的数学模型预测，少量高亲和离子的结合可保护蛋白质不被其他试剂解折叠(参见，例如Steinhardt和Reynolds(编)，《多点平衡和蛋白质》，学院出版社，纽约，pp.234-350)。保护使不发生解折叠的基础是某些表面活性剂的带电首基与蛋白质表面上的带电残基之间的静电相互作用(Markus等，《生物化学杂志》239:3687)。随后疏水尾部与蛋白质上的疏水区的结合提供了非共价交联功能。
本发明提供了稳定酶活性的表面活性剂。在一些实施方案中，乙氧基化烷基胺阳离子表面活性剂Tomah E-18-5和Tomah E-18-15(Tomah Prod Inc,Milton,WI)与常用的非离子表面活性剂诸如吐温20、曲通X-100和NP-40相比，提供了相等或更优的对溶液中聚合酶的稳定作用。在一个测定中，从水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离的耐热DNA聚合酶(Taq聚合酶)、从嗜热栖热菌(Thermusthermophilius)分离的耐热DNA聚合酶(Tth聚合酶)和从黄栖热菌(Thermus flavus)分离的耐热DNA聚合酶(Tfl聚合酶)的表面活性剂稳定化利用催化聚合酶链式反应(PCR)的能力来测量。所得到的反应产物的量作为该反应中所用的酶的稳定性的量度。当较低浓度的Taq或Tth聚合酶与阳离子型洗涤剂联合使用时，观察到了优良的结果。在含有比在非离子表面活性剂对照反应中扩增靶所需要的聚合酶活性少了多达50％的聚合酶活性的反应中，靶DNA序列的扩增迅速而可再现地清晰可见。在另一项测定中，测得的Tth和Taq聚合酶在含有阳离子型洗涤剂的缓冲剂中的半衰期与它们在含有非离子表面活性剂的缓冲剂中观察到的半衰期相等或更长。
在本发明的其他实施方案中，阳离子表面活性剂也用于稳定其他酶，包括但不限于T4 DNA聚合酶、MMLV(Moloney鼠白血病病毒)逆转录酶和AMV(禽成髓细胞瘤病毒)逆转录酶。在用于证明这些酶的稳定化的实验中，含有DNA或RNA模板的聚合反应混合物使用标准稳定剂BSA(牛血清白蛋白)或阳离子表面活性剂来组配。通过在核酸中加入放射性dNTPs进行测定，T4聚合酶以及MMLV和AMV逆转录酶在含有阳离子表面活性剂的反应缓冲液中的活性与在含有BSA的反应缓冲液中的活性相比增强了。
本发明的阳离子表面活性剂因此可用于稳定耐热和不耐热聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tfl聚合酶、T4 DNA聚合酶、AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶。这些阳离子表面活性剂既可在反应缓冲液中也可在储存缓冲液中用作稳定剂。发明详述A．稳定酶活性的表面活性剂的鉴别使用几项测定(参见实施例1-12)来确定大约30种不同的阴离子、阳离子和两性表面活性剂的稳定或去稳定作用(总结于表1中)。这些实验证实，阳离子表面活性剂可以用于稳定酶活性。阳离子表面活性剂已发现了许多用途，包括用作杀真菌剂、用作杀虫剂和用作化妆品中的抗菌剂。阳离子表面活性剂可以分成两组1)含氮的；2)无氮的“鎓类”表面活性剂，包括磷鎓、硫鎓、氧化锍和砷鎓表面活性剂。含氮的表面活性剂制备容易且不昂贵，远远多于无氮的表面活性剂。含氮的表面活性剂可以分成两类，它们的含氮基团的性质不同。第一类包括烷基氮化合物，诸如含有能带来疏水性的长链烷基和一个或多个胺氢的简单铵盐。烷基氮化合物也可以是仲、叔或季铵化合物，其中所有胺氢已被有机取代基替代。对于仲、叔和季胺来说，取代的基可以是长链或短链烷基、烷芳基、芳基或乙氧基。第二类含氮表面活性剂包括杂环物质，诸如吡啶鎓、吗啉鎓和咪唑啉鎓衍生物。
表1在酶稳定化应用中测试的离子表面活性剂
因此，在有些实施方案中，本发明提供了稳定酶活性的阳离子表面活性剂。在优选的实施方案中，阳离子表面活性剂最好具有约为10-17的亲水-亲油平衡(HLB)指数，首选为约11-16。HLB指数是将表面活性剂分子的化学结构与它们的表面活性关联起来的指数。HLB指数可以利用各种经验式进行计算(参见，例如Meyers，《表面活性剂科学与技术》，VCH Publishers出版公司，纽约，pp.231-245)，该书结合在此作为参考)。商品表面活性剂的HLB指数范围从0至大约70或更高。亲水性表面活性剂因在水中具有高溶解度并具有增溶性能，因而位于该数值范围的高数值端，而作为水在油中的良好加溶剂的、在水中具有低溶解度的表面活性剂在该数值范围的低数值端。
在本发明的一些实施方案中，阳离子表面活性剂优选乙氧基化胺类。乙氧基化胺含有疏水烷基侧链和一个或多个长链聚氧乙烯组群。乙氧基化胺的水溶解性在很大程度上取决于烷氧基化的程度，并且不总是由盐的形成引起的。简单的聚氧乙烯化胺(POE胺)是从长链烷基胺通过乙氧基化制备的。大多数乙氧基化胺是水溶性的，是相对较弱的碱。乙氧基化胺主要用作乳化剂和发用调理剂。
阳离子表面活性剂优选选自在水溶液中具有下列通式结构的乙氧基化烷基胺 其中z是约15-20的整数，而其中x和y各自至少为1且x+y的平均值为约5-15，以使HLB指数为约10-17，优选为约11-16。氮原子可以被硫原子取代形成乙氧基化烷基硫化物，被亚磷原子取代形成乙氧基化烷基膦，或者被砷原子取代形成乙氧基化烷基砷(arsenine)。
最优选的是，阳离子表面活性剂选自在水溶液中具有下列结构的成员 其中x+y的平均值为5，和 其中x+y的平均值为15。
B．阳离子表面活性剂在储存和反应缓冲液中的运用上述阳离子表面活性剂可以用于稳定储存缓冲液和反应缓冲液中的酶。这些表面活性剂可以用于各种酶的稳定化，包括但不限于Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tfl聚合酶、MMLV逆转录酶、AMV逆转录酶和T4 DNA聚合酶。在有些实施方案中，酶可以是象本领域中已知的那样重组产生或从天然生物体纯化得到的。在另一些实施方案中，酶可以在没有表面活性剂的条件下利用柱层析法纯化，或者如果纯化是在除了本发明的阳离子表面活性剂以外的其他表面活性剂的存在下进行的话，这些表面活性剂可以利用层析法除去(参见，例如M.P.Deutscher(编)，《酶学方法-蛋白质纯化指南》，Academic Press Limited，伦敦)。
在本发明的一些实施方案中，用于耐热酶和其他酶的储存缓冲液包含浓度约为10-70mM的缓冲试剂(优选pH8.0的约50mM Tris-HCl)、浓度约为50-150mM的盐(优选约100mM KCl或NaCl)、与盐的摩尔比为约1∶500-1∶1500的螯合剂(优选约0.1mM EDTA)、浓度约为1-10mM的还原剂(优选约1mM DTT(二硫苏糖醇))、浓度为约50％(体积)的甘油、和浓度为约0.001％-1.0％(优选约0.1％)的本发明的阳离子表面活性剂。
在本发明的另一些实施方案中，用于耐热聚合酶和其他酶的反应缓冲液包含浓度约为5-15mM的缓冲试剂(优选在25℃下pH约为8.0-9.0的约10mM Tris-HCl)、浓度约为20-100mM的一价盐(优选约50mM NaCl或KCl)、浓度约为1.0-10.0mM的二价阳离子(优选MgCl2)、浓度各自为约0.05-1.0mM的dNTPs(优选各自为约0.2mM)、和浓度为约0.001％-1.0％体积(优选约0.1％)的本发明的阳离子表面活性剂。
在本发明的另一些实施方案中，用于不耐热DNA聚合酶如T4 DNA聚合酶的反应缓冲液包含浓度约为5-15mM的缓冲试剂(优选pH8.0的约10mM Tris-HCl)、浓度约为30-70mM的一价盐(优选约50mMNaCl)、浓度约为5-15mM的二价阳离子(优选约10mM MgCl2)、浓度为约5-5mM的还原剂(优选约1mM DTT)、和浓度为约0.001％-0.1％体积(优选约0.01％)的阳离子表面活性剂。
在本发明的另一些实施方案中，用于逆转录酶如MMLV逆转录酶的反应缓冲液包含浓度约为30-70mM的缓冲试剂(优选pH约为8.3的约50mM Tris-Cl)、浓度为约5-15mM的二价阳离子(优选约7mM MgCl2)、浓度约为20-60mM的一价盐(优选约40nM KCl)、浓度为约1-20mM的还原剂(优选约10mM DTT)、和浓度为约0.01％-1.0％体积(优选为约0.01％体积)的阳离子表面活性剂。
上述反应和储存缓冲液的各种成分存在有许多等价物，取代可以容易地进行。因此，这些优选缓冲液仅仅是为了充当酶和聚合酶可能在其中储存的缓冲液和用于进行聚合反应及其他酶反应的缓冲液的制备时的指南，而并不打算限制本发明。事实上，本发明不打算限于聚合酶的稳定化，因为本发明普遍适用于蛋白质的稳定化。
实验提供以下实施例是为了阐述和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，而不应理解为是对本发明范围的限制。
在下面的实验部分里，使用以下缩写℃(摄氏温度)；bp(碱基对；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl(微升)；μCi(微居里)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；ab(抗体)；HCl(盐酸)；MgCl2(氯化镁)；KCl(氯化钾)；NaCl(氯化钠)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mM NaCl,10mM磷酸钠缓冲剂，pH7.2])；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；EDTA(乙二胺四乙酸)；EGTA(乙二醇-双(B-氨基乙醚)N,N,N’,N’-四乙酸)；HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；Sigma(Sigma化学公司，St.Louis,MO)；MMLV(Moloney鼠白血病病毒)；AMV(禽成髓细胞瘤病毒)；RT(逆转录酶)；Taq(水生栖热菌)；Tfl(黄栖热菌)；Tth(嗜热栖热菌)。
实施例1Taq聚合酶在有或没有洗涤剂的条件下扩增DNA节段的能力这个实施例描述了基于PCR的用于测定洗涤剂(即表面活性剂)对聚合酶的稳定情况的测定法。其中规定的条件是聚合酶在没有洗涤剂的条件下不能产生可检测的扩增产物，但在存在稳定洗涤剂如吐温20的条件下能产生可检测的扩增产物。
组配以下反应混合物2mM dNTP混合物100μl2ng/μl pGEM luc 10μl引物A(1μg/μl)10μl引物B(1μg/μl)10μl10 X Taq缓冲剂100μl25mM MgCl2100μl纳纯水(Nanopure water)670μl总计 1000μl
从Promega公司，Madison WI购得pGEM luc(Part#E1541)和25mM MgCl2(Part#E1902)。10X Taq缓冲制剂是500mM KCl,100mMTris-Cl(在25℃下pH为9.0)。10X Taq缓冲剂是通过将KCl和Trizma溶于纳纯水中并用浓盐酸调节pH而制得的。纳纯水是通过用NANOPURE水系统高压灭菌处理去离子水而得到的。2mM dNTP混合物是通过用纳纯水将100mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP原料(分别为Promega U120、U122、U121和U123)混合生成含有2mM浓度的每种核苷酸的溶液而制得的。所用引物的NDA序列是TAATACGACTCACTATAGGGCGAAT(SEQ ID NO:1)和GAATCGTCGTATGCATGTAAAACTC(SEQ ID NO:2)。
将100微升的反应混合物加入一个0.2ml试管中，在另外5个试管中各加入50μl。使用上述配方，只是用10μl 10％(v/v)吐温20(Sigma,P-1379)代替670μl水中的10μl，从而组配出另一种反应混合物。这种反应混合物具有终浓度为0.1％v/v吐温20的洗涤剂。然后分配该第二种反应混合物，使一个试管中含有100μl反应混合物，另5个试管中各含有50μl混合物。
将1微升Taq聚合酶(10U/μl)(经过纯化但未在任何步骤中加入任何洗涤剂)加入到含有洗涤剂和不含洗涤剂的反应混合物中并混合各试管中的内容物。含有洗涤剂和不含洗涤剂的反应物如下进行系列稀释。取出50微升第一种混合物并将其加入到装在其余5个反应混合物试管之一中的50μl相同的反应混合物中。该试管进行混合并将50μl所得混合物转移到下一个装有50μl反应混合物的试管中。进行混合和转移，直到所有含有反应混合物的这5个试管都与含有酶的反应混合物混合。将各个试管置于热循环仪中并经历以下程序。
循环操作前的条件调节温度至94℃达1分钟，然后进入循环条件。
循环条件对于每个循环来说调节温度至94℃达15秒，然后降低温度至65℃达2分钟。重复温度循环操作25次。进入循环操作后的条件。
循环操作后的条件调节温度至68℃达4分钟，然后降低温度至4℃。
当各个试管经过了上列程序条件的循环操作后，向每个试管中加入5μl终止溶液。终止溶液是0.4％SDS,160mM EDTA,0.16％橙黄G和24％甘油。
反应产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析。将琼脂糖(3g)加入含有300ml 1X TBE缓冲剂的烧瓶中。该溶液通过微波加热煮沸并回荡该烧瓶中的内容物。然后加入30微升10mg/ml溴化乙锭溶液，将熔化的琼脂糖倒入BRL H4型水平凝胶电泳系统的带有一个梳状物的凝胶盒中并使之硬化。变硬后，将梳状物取出，将凝胶盒放置到先前已填充了1X TBE缓冲剂的电泳系统的泳床中。将每个扩增反应的25微升样品和pGEM标记样品一起加载到凝胶中的各个孔中。电泳使用HofferPS500X DC电源在100V下进行2小时，然后凝胶使用Ambis系统在紫外光下进行目测检验。
在含有来自具有最高量的Taq聚合酶和0.1％吐温20的扩增反应的样品的泳道中见到了强的1.5kb DNA带。在含有具有第二高水平的Taq聚合酶和0.1％吐温20的扩增反应的泳道中见到了较弱的1.5kb带，在含有最高水平的Taq聚合酶但没有加入洗涤剂的泳道中没有见到1.5kb带。
因此，这些条件可用于测试洗涤剂在扩增反应过程中稳定Taq聚合酶的能力。稳定酶的物质增加了在上述反应中产生的1.5kb DNA带(在没有洗涤剂的反应中产生的)的强度。特别优良的稳定物质鉴别为是能使在比使用0.1％吐温观察到的那些更低的酶浓度下产生1.5kbDNA带的那些。
实施例2表面活性剂的筛选在该实施例中，针对表面活性剂稳定酶的能力进行筛选。将以下化合物溶于纳纯水中，使终浓度为10％(w/v或v/v，取决于该物质是固体还是液体)溴化十四烷基三甲铵(Sigma T4762)、磺基丁二酸二辛酯(Sigma D-4422)、胆酸(Sigma C-1254 lot 56H0339)、牛磺胆酸(Sigma T-4009,lot 15H5001)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸内盐(Sigma C-3023,Lot 86H5022)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(Sigma C-3649,lot 35H5065)、氯化十六烷基吡啶鎓(Sigma C-9002,lot 77H1047)、吐温20(SigmaP-1379)和曲通X-100。
用这些表面活性剂溶液中的每一种制备10X缓冲液。对于每种表面活性剂来说的10X缓冲液组成为500mM KCl,100mM Tris-HCl pH9.0(在25℃下)，1％表面活性剂(通过将上述洗涤剂溶液在配制过程中以1∶10稀释到缓冲液中而制得)。如实施例1中所述，在这些实验中使用的Taq聚合酶经过纯化但没有接触任何洗涤剂。用每一种缓冲溶液如下配制Taq-表面活性剂溶液纳纯水 255μl10X表面活性剂缓冲液 32μl25mM MgCl232μlTaq聚合酶(10U/μl) 1μl总体积 320μl如上所示制备对照溶液，只是使用没有表面活性剂的32μl 10X缓冲液。溶液在95℃下温育，取出样品(10μl)并加入到新鲜试管中，在冰上保持0、5、10、30、60、90和120分钟。然后测定样品的Taq聚合酶活性。
Taq聚合酶活性通过测量酶样品能吸收的含氚脱氧核苷酸碱的量来确定。该测定如下所述进行。使用纳纯水将dATP、dCTP、dGTP和dTTP溶液(分别为Promega U120、U122、U121和U123)稀释至2mM终浓度(开始时为100mM)。从Amersham(TRK424,250μCi/250μl)获得含氚核苷酸3H-TTP。用于掺入的模板是小牛胸腺DNA(Sigma,D-1501)，其溶解在10mM Tris-HCl pH7.3,5mM MgCl2中，终浓度为2.5mg/ml。使用前，该DNA用1μl 1∶10稀释的RQ1 DNA酶(PromegaM610)(使用10mM Tris-HCl,5mM MgCl2稀释的)处理并在37℃下温育10分钟，然后在68℃下温育30分钟。这么做是为了“活化”用于掺入的DNA。制备含有500mM Tris-HCl(在25℃下为pH9.0)、500mMNaCl和100mM MgCl2的10X Taq测定缓冲液。
组配以下反应混合物10X Taq测定缓冲液 500μl纳纯水1700μldATP(2mM) 500μldCTP(2mM) 500μldGTP(2mM) 500μldTTP(2mM) 500μl活化小牛胸腺DNA 600μl3H-TTP(1μCi/μl) 100μl将时间点样品(10μl)加入到40μl反应混合物中，然后在74℃下温育10分钟。温育后，该溶液用500μl冰冷的10％TCA稀释。该TCA溶液通过一个GF/A滤器过滤。试管用1ml 5％TCA洗涤三次，然后将洗液过滤到相同的滤器上。该滤器再用5％TCA冲洗3次，然后用丙酮冲洗。滤器用热灯干燥10分钟，然后对放射性记数。在任何一个时间点存在的活性的百分数通过用样品在该时间点的净记数除以该酶溶液的0分钟样品的净记数再乘以100％来确定。将溶液的百分活性对时间作图。将各个点连接成一条光滑的曲线，酶在选定条件下的估计半衰期基于该曲线穿过50％活性时的点来估计。
然后确定在不同时间下剩余的活性百分数并作图，以估计酶在这些表面活性剂存在下的半衰期。结果显示，含有3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸内盐和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐的离子表面活性剂溶液的估计半衰期大约为5分钟。含有吐温20和曲通X-100的非离子表面活性剂溶液的半衰期大约为40分钟。没有表面活性剂的对照溶液的半衰期小于5分钟。所有其他的离子表面活性剂溶液的半衰期小于5分钟。
因此，这个测定可用于鉴别能对Taq聚合酶提供一定程度的稳定化的离子表面活性剂，如用3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸内盐和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐所见到的。此外，这个测定可用于鉴别能大大稳定Taq聚合酶的离子表面活性剂。这类表面活性剂在这些条件下将Taq聚合酶的半衰期提高到了大约与用吐温20观察到的结果相等或比其更大的值。
实施例3其他表面活性剂的筛选在这个实施例中，针对其他表面活性剂稳定蛋白质的能力进行筛选。制备以下物质的纳纯水溶液(10％w/v或v/v):N-十二烷基-n,n’-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐(Sigma D-4516,lot 95H5045)、Mega 10(Sigma D-6277,lot 37H5041)、N-十八烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐(Sigma O-8004,lot 44H5006)、SB 3-10、N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐(Sigma T-7763,lot 96H5001)、溴化二甲基二-十八烷基铵、曲通X-200(Sigma X200,lot 75H0989)、曲通W-30(Sigma Chem.Co.W-30,lot 18F0766)、曲通X-301(Sigma X301,lot 13H7706)、曲通770(Sigma 770,lot 18F0768)。
将实施例1中描述的主反应混合物的99微升等分试样加入到独立的0.2ml试管中，然后向每个试管中加入1μl 10％表面活性剂溶液和在没有洗涤剂的条件下纯化的2μl Taq聚合酶(10U/μl)。对照反应由含有1μl 10％吐温20(阳性对照)和不含表面活性剂(阴性对照)的试管组成。如上述实施例1中所述，使这些试管经受扩增条件并进行凝胶分析。
在添加了吐温20的反应中产生了强1.5kb DNA带，在没有加入表面活性剂的反应中产生了较弱但可见的带。其他所有反应都没有产生可见的1.5kb DNA片段，除了添加了N-癸基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐的反应以外。这个反应产生了一个强度介于在没有洗涤剂的反应(阴性对照)中观察到的和在添加了吐温20的反应中观察到的强度之间的中间带。
装配第二组反应，此时将95μl主反应混合物加入到带有5μl表面活性剂溶液和2μl Taq聚合酶(10U/μl)的试管中。同样装配吐温20和没有表面活性剂的对照反应。反应按照上面所描述的扩增条件进行，并利用凝胶电泳进行分析。
在添加了吐温20的反应中见到了强1.5kb DNA带，在没有加入表面活性剂的反应中未见到1.5kb DNA带。其他所有反应都没有产生可见的1.5kb DNA片段，即使是添加了N-癸基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐的反应。这些结果表明，作为Taq聚合酶的稳定剂，这些表面活性剂中没有一种能与吐温20等价。
实施例4其他表面活性剂的筛选在这个实施例中，针对其他表面活性剂稳定蛋白质的能力进行筛选。制备以下物质的纳纯水溶液(10％w/v或v/v):Miracare ZMHT、Miracare ZMCA、烷基氨基甜菜碱BB、烷基氨基甜菜碱ACS、烷基氨基甜菜碱CBR和烷基氨基甜菜碱CB(Rhone-Poulenc,North AmericanChemicals,Cranbury,NJ)。如实施例3中所述，表面活性剂溶液以0.1％浓度通过与吐温20和没有表面活性剂的对照反应进行对比测试，只是将酶浓度降低至10U Taq/100μl反应混合物。
在添加了吐温20的反应中见到了强1.5kb DNA带，在没有加入表面活性剂的反应中未见到1.5kb DNA带。其他所有反应都没有产生可见的1.5kb DNA片段。这些结果表明，作为Taq聚合酶的稳定剂，这些表面活性剂中没有一种能与吐温20等价。
实施例5来自Tomah的表面活性剂的初始评估在这个实施例中，检测乙氧基化胺稳定蛋白质的能力。制备以下物质的纳纯水溶液(10％w/v或v/v):Tomah E-14-2、Tomah E-14-5、Tomah E-18-15和Tomah E-18-5(Tomah Prod.Inc.,Milton,WI)。表面活性剂溶液以0.1％浓度进行测试，并如上述实施例3中所述，通过与吐温20对照反应进行对比来评估，只是将酶浓度降低至10UTaq/100μl反应混合物。
在添加了吐温20、Tomah E-18-15和Tomah E-18-S的反应中产生了强1.5kb DNA带。添加Tomah E-14-2和Tomah E-14-5的反应中没有产生可见的1.5kb DNA片段。这些结果表明，Tomah E-18-15和TomahE-18-5稳定了Taq聚合酶，而Tomah E-14-2和Tomah E-14-5没有。此外，Tomah E-18-15和Tomah E-18-5对酶的稳定看来约与吐温20一样有效。因此，对这些表面活性剂进行进一步的测试。
给出的所有Tomah洗涤剂都是乙氧基化胺类化合物，并且都是阳离子型洗涤剂。但是，如1996年的McCutcheon’s卷1乳化剂和洗涤剂北美版中报道，它们的HLB指数是不同的。表2中给出了这些物质和一些能稳定Taq聚合酶的非离子型洗涤剂的HLB值。这些结果提示，HLB指数在11-16范围内的阳离子型洗涤剂能有效地稳定Taq聚合酶。表2
实施例6对乙氧基化胺的进一步测试用Tomah E-18表面活性剂观察到的初步结果提示这些物质可能至少能象非离子型洗涤剂一样稳定Taq聚合酶。为了获得更多的关于这些物质如何起作用的精确概念，用较低浓度的酶和洗涤剂进行实验。
如上述实施例3中所述，装配含有0.1％、0.01％和0.001％吐温20、Tomah E-18-15和Tomah E-18-5的反应混合物。将没有洗涤剂的Taq聚合酶加入到这些混合物中形成含有10、5、2.5和1.25U Taq聚合酶/反应物的反应物。这些反应物如上述实施例1中所述在热循环仪中温育并对反应产物进行分析。
几乎所有的泳道都含有预期的1.5kb DNA片段。在大多数情况下，很难确定带有一种洗涤剂的泳道是否比带有其他洗涤剂的泳道具有更强的带。但是，当存在低浓度的酶和/或洗涤剂时，含有离子型洗涤剂的反应看来比含有非离子型洗涤剂的反应生成了更多的产物。
实施例7在离子型洗涤剂的存在下、在高温培养条件下，Taq聚合酶的增加的半衰期在这个实施例中，检测乙氧基化胺在高温下稳定耐热蛋白质的能力。如实施例2中所述制备含有0.005％Tomah E-18-15、Tomah E-18-5、吐温20、NP-40和曲通X-100的无洗涤剂的Taq聚合酶(2.5U/100μl溶液)溶液。将这些溶液在95℃下培养，如实施例2中所述在0、10、30、60和120分钟时取出样品并进行分析。用图表方式来估计酶在这些表面活性剂存在下的半衰期。含有Tomah E-18-5、曲通X-100和NP-40的溶液的Taq聚合酶半衰期都为约8分钟。含有吐温20的溶液具有50分钟的半衰期，而含有Tomah E-18-15的溶液具有70分钟的估计半衰期。这些结果表明，这两种阳离子表面活性剂在高温条件下稳定了Taq聚合酶，与常用于稳定酶的非离子表面活性剂一样好或者更好。
实施例8用离子型洗涤剂来提高Tth聚合酶的性能确定了Tomah E-18-5和Tomah E-18-15能提高Taq聚合酶的性能后，进行其他实验以确定这种效用是否能用其他酶加以证实。在这个实验中，检验耐热Tth聚合酶在阳离子和非离子表面活性剂存在下的稳定化情况。
装配下列溶液的10ml样品，一式三份2M Tris-HCl pH7.5 50μl3M Kcl 1ml1M DTT 10μl
0.5M EDTA,pH8.0 2ml牛血清白蛋白(10mg/ml)500μl甘油 5ml表面活性剂储备液 2ml纳纯水 加至10ml溶液A含有2ml曲通X-100的10％储备液；溶液B含有1ml吐温20的10％储备液和1ml NP40的10％储备液；溶液C含有2ml TomahE-18-15的10％储备液。将Tth聚合酶样品(Promega M210,lot8502201)以等体积与每一种溶液混合，生成三种含有2.5U/μl Tth聚合酶的酶洗涤剂溶液。如实施例1中所述使用各原料装配反应混合物，只是使用新的10X缓冲液。这种缓冲液是通过将1.67ml 3M KCl、0.5ml 2M Tris-HCl pH8.3(25℃)和7.83ml纳纯水混合而制成的。然后将4微升每种酶洗涤剂溶液加入到200μl反应混合物中并进行混合。然后取出100微升该溶液，将其与另外100μl反应混合物混合并取出第二个100μl混合物。再将该混合物加入到第二个100μl反应混合物中并进行混合。继续此过程，直到制备了含有反应混合物和5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.156单位的Tth聚合酶的6管试样。如实施例1中所述进行热循环。然后反应产物如实施例1中所述进行分析。
在从具有5、2.5和1.25单位酶的曲通X-100稳定化酶分离的泳道中存在清晰的1.5kb带。在用于分析具有5、2.5、1.25和0.625单位酶的吐温20和NP40稳定化酶的泳道中存在清晰的1.5kb带。在用于分析Tomah E-18-15稳定化酶反应的所有泳道中，除了0.156单位酶的反应以外，都存在清晰的1.5kb带。
这些结果表明，离子型洗涤剂Tomah E-18-15提高了Tth聚合酶的性能，并且提高的水平大于在该研究中用非离子型洗涤剂观察到的水平。特别令人感兴趣的一点是，这种酶既是逆转录酶又是NDA聚合酶，因此表明本发明的洗涤剂可用于稳定这两种类型的酶。
实施例9使用离子型洗涤剂提高T4 DNA聚合酶的性能既然Tomah E-18-15提高了两种不同的耐热DNA聚合酶(其中一种具有逆转录酶活性)的性能，于是测试其对不耐热DNA聚合酶(即T4 DNA聚合酶)活性的影响。
制备以下溶液纳纯水960μl10X缓冲液*200μl2mM dNTP混合物200μl活化DNA 200μl3H-TTP(1μCi/μl)40μl*本实施例中的10X缓冲液含有1ml 5M NaCl、0.5ml 2M Tris-HClpH8.0(25℃)、1ml 1M MgCl2、100μl 1M DTT，加入纳纯水将终体积调节至10ml。 2mM dNTP混合物按照实施例1中制备。
将T4 DNA聚合酶(Promega M421)用1X缓冲液稀释1∶100倍。如表3中所示在冰上装配反应物。表3
试管在37℃下温育15分钟，测量TCA可沉淀数量，以确定酶在这些表面活性剂浓度下的活性。数据列在表4中。这些结果显示，这种酶在0.001％和0.01％表面活性剂的存在下活性分别提高了大约79％和68％。
表4
为了证实这些发现，以及为了确定表面活性剂是否能提高这种酶在BSA存在下的活性，进行以下实验。如上所述装配两种反应混合物，只是对于其中一种混合物(即+BSA的混合物)来说，使用1.7ml 10mg/mlBSA来制备10X反应缓冲液，同时相应降低所用的纳纯水的量，以将组分溶液的体积调节至10ml。如表5中所示在冰上装配两组反应。表5
*T4 DNA聚合酶如上所述再次用1X缓冲液稀释1∶100倍。
**每组试管使用一种反应混合物，因此一组试管含有BSA，而另一组中没有。
试管在37℃下温育15分钟，测量TCA可沉淀数量，以确定酶在这些溶液中的活性。数据显示在表6中。这些结果显示1)离子型洗涤剂提高了这种不耐热聚合酶的活性；2)活性的提高与加入BSA观察到的结果类似，BSA是一种已知能帮助酶在稀释后仍保持其活性的物质；3)用表面活性剂观察到的活性的提高稍微大于用单独的BSA观察到的；4)酶在这两种物质存在下的活性稍微高于加入单独的BSA观察到的结果。表6
实施例10加入离子型洗涤剂后对MMLV逆转录酶性能的提高既然离子型洗涤剂Tomah E-18-15能提高具有逆转录酶活性的耐热酶(Tth聚合酶)的性能，于是检验这种表面活性剂对另一种逆转录酶MMLV-RT的作用。
如下制备10X MMLV-RT反应缓冲液2M Tris-HCl pH8.3(25℃)2.5ml1M MgCl20.7ml3M KCl 1.33ml1M DTT 1ml纳纯水 加至总体积为10ml
如下制备测定混合物成分 用量10X MMLV反应缓冲液500μl纳纯水3200μl100mM dTTP25μl聚rA/寡dT*1250μl3H-dTTP 25μl聚A/寡dT(Supertech,cat#111020A)是1mM聚A、0.1mM寡dT。MMLV-RT样品(Promega M170,lot#8157702)用测定缓冲液稀释1∶100倍。如表7中所示在冰上装配反应物。表7
这些反应物在37℃下温育10分钟，加入10μl 1mg/ml小牛胸腺DNA和0.5ml 10％TCA，将试管置于冰上10分钟。然后反应物使用GF/C滤器过滤，洗涤滤器并计数。数据显示在表8中。这些数据表明，当用离子型洗涤剂在上述所给条件下进行稳定时，这种逆转录酶的性能提高了。
表8MMLV-RT活性
实施例11加入离子型洗涤剂对AMV逆转录酶性能的提高既然离子型洗涤剂Tomah E-18-15提高了MMLV逆转录酶的性能(实施例10)，于是按照实施例10中详细描述的方法检测这种表面活性剂对另一种逆转录酶AMV-RT的作用。这些数据(参见表9)显示，当用离子洗涤剂在实施例10中详细描述的条件下进行测定时，AMV逆转录酶的性能提高了。
表9阳离子表面活性剂提高了AMV-RT活性
实施例12加入离子洗涤剂对Tfl DNA聚合酶性能的提高在Tomah E-18-15洗涤剂的存在下在PCR反应中测试无洗涤剂的Tfl聚合酶溶液。第一个反应含有0.1％洗涤剂和5单位Tfl聚合酶。将第一个反应进行一系列1∶2倍稀释，直到生成一个含有0.003％洗涤剂和0.15单位Tfl聚合酶的终反应，由此组成了一系列PCR反应。同样进行无洗涤剂的对照反应。所得PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，并用紫外光进行目测检验。
数据显示在表10中。在没有加入任何洗涤剂的情况下，Tfl聚合酶在经过25次循环后没有产生任何可见的PCR产物。在Tomah E-18-15的存在下，当在0.1％至0.0005％洗涤剂的存在下使用5单位至0.039单位的Tfl聚合酶时，可清楚地检测到PCR产物。
表10Tfl聚合酶性能的提高
在上面的说明书中提到的所有出版物和专利均结合在此作为参考。在不背离本发明精神和实质的条件下，对于本发明所描述的方法和组合物的各种修饰和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。尽管本发明已结合具体的优选实施方案进行了描述，但不言而喻，请求保护的本发明不应过度地限于这些具体实施方案。事实上，对于分子生物学、生物化学、蛋白质化学或相关领域中的那些技术人员来说显而易见的那些对于用于完成本发明的所述方式的各种修饰都将落在以下权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种组合物，它包含a)聚合酶；和b)阳离子表面活性剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述阳离子表面活性剂的HLB指数为约11-16。
3.权利要求1的组合物，其中所述阳离子表面活性剂是聚乙氧基化胺。
4.权利要求3的组合物，其中所述聚乙氧基化胺具有以下分子结构 其中z是约15-20的整数，x+y的平均值为约5-15。
5.权利要求3的组合物，其中所述聚乙氧基化胺的浓度为0.0005％至1.0％(体积)。
6.权利要求5的组合物，其中z是18,x+y的平均值是5。
7.权利要求5的组合物，其中z是18,x+y的平均值是15。
8.权利要求1的组合物，它还包含浓度为约10mM至70mM的缓冲剂。
9.权利要求1的组合物，它还包含选自NaCl和KCl的盐。
10.权利要求1的组合物，它还包含选自MgCl2和CaCl2的二价盐。
11.权利要求1的组合物，它还包含螯合剂。
12.权利要求1的组合物，它还包含还原剂。
13.一种组合物，它包含a)具有催化活性的蛋白质；b)聚乙氧基化胺；和c)缓冲剂。
14.权利要求13的组合物，其中所述聚乙氧基化胺的浓度为0.0005％至1.0％(体积)。
15.权利要求1的组合物，其中所述阳离子表面活性剂的HLB指数为约11-16。
16.权利要求13的组合物，其中所述聚乙氧基化胺具有以下分子结构 其中z是约15-20的整数，x+y的平均值为约5-15。
17.权利要求16的组合物，其中z是18,x+y的平均值是5。
18.权利要求5的组合物，其中z是18,x+y的平均值是15。
19.一种方法，它包括a)提供具有活性的聚合酶和阳离子表面活性剂；和b)将所述聚合酶和所述表面活性剂在使所述聚合酶的活性被稳定的条件下结合形成混合物。
20.权利要求19的方法，其中所述阳离子表面活性剂的HLB指数为约10-17。
21.权利要求19的方法，其中所述阳离子表面活性剂是聚乙氧基化胺。
22.权利要求21的方法，其中所述聚乙氧基化胺具有以下分子结构 其中z是约15-20的整数，x+y的平均值为约5-15。
23.权利要求22的方法，其中z是18,x+y的平均值是5。
24.权利要求22的方法，其中z是18,x+y的平均值是15。
全文摘要
本发明提供了用于稳定蛋白质的方法和组合物,特别是用阳离子表面活性剂稳定水溶液中的聚合酶。本发明还提供了能稳定溶液中的耐热和不耐热酶的阳离子表面活性剂,包括聚乙氧基化胺。这些表面活性剂稳定了各种酶的活性,包括耐热DNA聚合酶、不耐热DNA聚合酶以及逆转录酶。
文档编号C12N9/12GK1315996SQ99808861
公开日2001年10月3日 申请日期1999年6月23日 优先权日1998年6月24日
发明者J·W·舒尔茨, F·黄 申请人:普罗梅格公司