专利名称：拟南芥hmp－p激酶和tmp－pp酶及其在除草剂筛选中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选抑制如下酶活性的除草化合物的方法，所述酶为2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶单磷酸激酶(HMP-P激酶)或硫胺素单磷酸焦磷酸化酶(2-甲基-4-氨基-5-(羟甲基)嘧啶二磷酸4-甲基-5-(2-磷酸乙基)噻唑2-甲基-4-氨基嘧啶-5-次甲基转移酶)或TMP-PP酶，这两种酶在从头硫胺素生物合成中均有酶促活性。本发明涉及由此鉴定的除草化合物控制不期望的植被(vegetation)生长的用途。本发明还可应用于除草剂抗性植物、植物组织、植物种子及植物细胞的开发。
除草剂用来控制不期望的植被(如作物田间的杂草)的用途已经十分普遍。每年除草剂销售超过150亿美元。尽管应用这样广泛，杂草控制对农民而言仍旧为重要的和费钱的问题。
有效利用除草剂需要大量的管理工作。例如，应用的时间和方法以及杂草植物生长的阶段对于用除草剂取得良好的效果至关重要。由于多种杂草种类对除草剂有抗性，制备有效除草剂变得日益重要。现在可利用采取重组DNA技术的高通量筛选方法发现新除草剂。可重组生产对植物生长和发育十分重要的代谢酶类，并用做筛选新型酶活性抑制剂的除草剂靶标。通过这样的筛选发现的新抑制剂可被用作控制不期望的植被生长的除草剂。
遗憾地是，在土壤中显示较高效力、较宽的杂草谱剂且降解更快的除草剂也具有更大的作物植物毒性。一种解决此问题的方法是培育抗或耐受除草剂的作物。耐受除草剂的作物杂交品种或变种可允许使用除草剂杀死杂草而无损害作物的风险。耐受的形成使得可向作物应用除草剂，而此前由于作物对除草剂的敏感，该除草剂不能应用或限制使用(例如在紧急情况前才应用)。例如，美国专利4761373(Aderson等)涉及对多种咪唑啉酮或氨磺酰除草剂有抗性的植物。所述抗性通过改变的乙酰羟酸合酶(AHAS)赋予。美国专利4975374(Goodman等)涉及含有编码突变谷氨酰胺合成酶(GS)基因的植物细胞和植物，其可抵抗已知抑制GS的除草剂，如phosphinothricin和甲硫氨酸sulfoximine。美国专利5013659(Bedbrook等)涉及表达突变乙酰乳酸合酶的植物，该酶赋予植物抵抗磺酰尿除草剂类的抑制。美国专利5162602(Somers等)公开了耐受环己二酮除草剂类及芳氧基苯氧基丙酸除草剂类的植物。通过改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予耐受性。定义为明确起见，用于本说明书的一些术语定义如下可活化DNA序列在基因组尤其是植物基因组中调节基因表达的DNA序列。可活化DNA序列与基因组内源的靶基因互补。当可活化DNA序列导入并在细胞中表达时，其抑制靶基因的表达。可与本发明联合使用的可活化DNA分子包括那些编码或起显性抑制剂作用的分子，如可翻译或非翻译有义序列，其能在稳定转化的植物中破坏基因功能，以阳性鉴定一种或多种植物正常生长和发育必需的基因。一种优选的可活化DNA序列是反义DNA序列。靶基因优选地编码一种蛋白质，如生物合成酶、受体、信号转导蛋白质、结构基因产物或植物生长或生存必需的转运蛋白质。在一个优选实施方案中，靶基因编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。反义序列与靶基因的相互作用的结果导致靶基因表达基本上被抑制，从而杀死植物，或至少抑制正常植物生长或发育。
可活化DNA构建体一种重组DNA构建体，包含一种与可活化DNA序列有效连接地合成启动子，当其导入细胞(期望地，植物细胞)中时不表达，即为沉默的，除非存在一种能结合并活化该合成启动子的完整杂合转录因子。将可活化的DNA构建体导入细胞、组织或植物以形成能表达可活化DNA序列的稳定转基因品系。
辅因子酶催化反应中所需要的天然反应物，如有机分子或金属离子。辅因子是例如NAD(P)、核黄素(包括FAD和FMN)、叶酸、钼蛋白(molybdopterin)、硫胺素、生物素、硫辛酸、泛酸和辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、磷酸吡哆醛、泛醌、甲基萘醌。任选地辅因子可再生和重利用。
偶联合成一种酶促生物合成，其中终产物通过两个或多个顺序酶促步骤合成，其中在生物化学途径的一个或多个分支中用于第一个酶促步骤的底物补加入反应混合物中，通过第一个酶转化为中间产物，该中间产物被第二个酶或多个酶转化成终产物而无需添加中间产物。
“嵌合”用于表示一种诸如载体或基因的DNA序列，其由通过重组DNA技术相互融合的不同来源的一个以上DNA序列构成，得到一种非天然存在的、尤其是不存在于待转化的植物中的DNA序列。
“DNA改组.”DNA改组是在DNA分子中导入(优选随机地)突变或重排的方法，或者优选随机地产生两个或多个DNA分子之间的DNA序列交换。得自DNA改组的DNA分子是这样的改组DNA分子，其是来自至少一个模板DNA分子的非天然存在的DNA分子。改组DNA编码一种相对由模板DNA编码的酶而言经修饰的酶，优选地具有相对于模板DNA编码的酶而言改变的生物学活性。
酶活性在此处是指酶催化底物转化为产物的能力。一种酶的底物包括酶的天然底物，也包括天然底物的类似物，其也可被酶转化为产物或产物类似物。酶的活性的测量是通过例如，在一定时间阶段后测定反应中产物的量，或是通过测定在一定时间阶段后反应混合物中剩余底物的量。也可通过测定一定时间阶段后反应混合物中剩余的反应未使用之辅因子的量，或通过测定在一定时间阶段后反应混合物中使用的辅因子的量的方法测定酶活性。还可通过测定在一定时间阶段后反应混合物中剩余自由能或富含能量分子供体的量(ATP，磷酸烯醇式丙酮酸，乙酰磷酸或磷酸肌酸)，或通过测定在一定时间阶段后反应混合物中使用的自由能或富含能量分子供体的量(ADP，丙酮酸，乙酸或肌酸)测定酶的活性。
表达是指植物中内源基因或转基因的转录和/或翻译。在反义构建体中，例如，表达可仅指反义DNA的转录。
基因是指编码序列和相关的调节序列，其中编码序列被转录为RNA，如mRNA、rRNA,、tRNA、snRNA或是反义RNA。调节序列的例子是启动子序列，5’和3’非翻译序列及终止序列。其它可存在的元件是例如内含子。
除草剂一种用于杀死或抑制植物、植物细胞、植物种子或植物组织的生长的化学物质。
异源DNA序列一种DNA序列，其不与将导入该DNA序列的宿主细胞天然相关，包括非天然存在的固有DNA序列的多重拷贝。
同源DNA序列一种DNA序列，其与待导入的宿主细胞天然相关。
抑制物一种灭活蛋白质的酶促活性的化学物质，所述蛋白质如对于植物生长或生存必需的转运蛋白质、生物合成酶、受体、信号转录蛋白质，结构基因产物或转运蛋白。在本发明上下文中，抑制物是一种灭活植物HMP-P激酶/TMP-PP酶之酶促活性的化学物质。当应用于植物、植物细胞、植物种子或植物组织时，此处所用术语“除草剂”定义一种抑制物。
等基因的除了可因存在或不存在转基因不同之外遗传上相同的植物。
分离的在本发明上下文中，分离的DNA分子或分离的酶是DNA分子或酶，由于人工其离开自身天然环境而存在，并因此不再是天然产物。一种分离的DNA分子或酶可以纯化形式存在或存在于非天然环境如转基因宿主细胞。
成熟蛋白质天然靶定于一种细胞器如叶绿体且在该处除去转运肽的蛋白质。
最小启动子启动子元件，尤其是TATA元件，其无活性或在无上游活化时具有大大降低的启动子活性。存在适当转录因子时，最小启动子起作用以允许转录。
修饰的酶活性与植物中天然存在不同的酶活性(即在无直接或间接人类对这种活性操作时天然存在的酶活性)，其耐受抑制天然存在的酶活性的抑制物。
有效连接是指，如果两个序列如此排列使得调节序列可影响编码DNA序列的表达，则调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列可称为“可操作地连接”或“与之相关联”。
植物是指任何植物，尤其是种子植物。
植物细胞是指植物的结构和生理单元，包括原生质体和细胞壁。
植物细胞可呈分离的单细胞或培养的细胞形式，或作为高等有序单元如例如植物组织或植物器官的一部分。
植物材料是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养、或任一其它部分或植物产物。
前蛋白天然靶定于细胞器如叶绿体的蛋白质，并仍旧含有其转运肽。
重组DNA是指一种利用重组DNA技术结合在一起的DNA序列的组合。
重组DNA技术是指用于将DNA序列连接在一起的方法，如Sambrook等，1989,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press中所述。
显著增加一种超过测量技术固有的误差范围的酶促活性的增加，优选为约两倍或两倍以上于抑制物存在下的野生型酶活性的酶活性增加，更优选约5倍或5倍以上，更优选约10倍或10倍以上。
明显低于是指酶促反应产物的量变化超过测量技术固有的误差范围，优选为抑制物不存在下的野生型酶活性的1/2或1/2以下，更优选约1/5或1/5以下，更优选约1/10或1/10以下。
更广义讲，术语“基本上相似”当用于指核苷酸序列，是指一种相应于参比核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应序列编码一种与参比核苷酸序列编码的多肽具有基本上相同结构和功能的多肽，例如，仅存在不影响多肽功能的氨基酸改变。期望的，基本上相似的核苷酸序列编码由参比核苷酸序列编码的多肽。基本上相似核苷酸序列与参比核苷酸序列之间的相同性百分比期望为至少85％，更期望地至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，甚至更优选至少99％。利用Skmith-Waterman序列排列比较算法进行序列比较(见，如Waterman，M.S.计算机生物学导言图谱、序列和基因组(Introduction to Computational Biology:Maps,sequences andgenomes),Chapman & Hall,London:1995,ISBN 0-412-99391-0,或访问http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)。以如下参数使用localS程序(1.16版)匹配1，错配罚0.33，开区罚2，延伸区罚2。一个与参比核苷酸序列“基本上相似”的核苷酸序列可在如下条件下与参比核苷酸序列杂交7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用1X SSC,0.1％SDS,65℃洗涤；更期望地，7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃，用0.5X SSC,0.1％SDS,65℃洗涤；甚至更期望地在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用0.2X SSC,0.1％SDS,65℃洗涤；优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA,50℃,用0.1X SSC,0.1％SDS,65℃洗涤。
术语“基本上相似”，当此处用于蛋白质时，是指相应于参比蛋白质的蛋白质，其中蛋白质具有与参比蛋白质基本上相同的结构和功能，如例如，仅存在不影响多肽功能的氨基酸改变。当用于蛋白质或氨基酸序列时，基本上相似的序列与参比蛋白质之间的相同性百分比期望为至少65％，更期望地至少75％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％。
底物底物是一种在其中酶天然行使其功能的生物化学途径中酶天然识别并转化为产物的分子，或是该分子的修饰形式，其也能被酶识别并在类似天然存在的反应之酶促反应中转化为产物。
合成的是指一种包括不存在于天然序列中的结构特征之核苷酸序列。例如一种G+C含量及单子叶和/或双子叶基因正常密码子分布十分相似的人工序列被称为合成的。
耐受当接触一种抑制物或除草时剂仍继续正常生长或行使功能的能力。
转化一种将异源DNA导入细胞、组织或植物的方法。应理解转化的细胞、组织或植物不仅涵盖转化方法的终产物，也包括其转基因子代。
转基因用重组DNA分子稳定地转化，所述分子优选包含与目标DNA序列有效连接的适当的启动子。
本发明的一个目的是提供鉴定新除草剂或改进的除草剂的方法。本发明的另一个目的是提供利用这种新或改进的除草剂抑制植物(如杂草)生长的方法。本发明的另一方面是提供改进的作物植物，其耐受所述新或改进的除草剂。
本发明首次公开了芥属(Arabidopsis)HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的正确核苷酸序列。编码前蛋白的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1，编码推定的成熟蛋白质之核苷酸序列示于SEQ ID NO:3。芥属HMP-P激酶和TMP-PP酶前蛋白之正确的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，推定的成熟芥属HMP-P激酶和TMP-PP酶之正确的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。因此，本发明包含来源于植物的核苷酸序列，其编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。在一个优选实施方案中，这类核苷酸序列来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，在另一个优选实施方案中，这类核苷酸序列与示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似，编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列与示于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。
HMP-P激酶与TMP-PP酶是从头硫胺素生物合成途径(见下)中的酶促步骤。从头硫胺素生物合成最终导致硫胺素焦磷酸的形成(也称为硫胺素二磷酸或维生素B1)，此辅因子的形式见于数种酶中(Schellenberger等，1997，酶学方法(Meth.Enz.),279,131-146)。此从头生物合成途径见于细菌、酵母和植物中，但人类中不存在。(Begley,T.P.,1996，国家产品报道(Natl.Prod.Rep.),13,177-186)。HMP-P激酶的酶促活性催化2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶单磷酸(HMP-P)的焦磷酸化，形成2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。在大肠杆菌中，此步骤由thiD基因编码的蛋白质进行。TMP-PP酶酶促活性相应于硫胺素焦磷酸从头生物合成中的其后至最终步骤，催化4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑单磷酸(THZ-P)和HMP-PP的偶联，以形成硫胺素单磷酸(TMP)。在大肠杆菌中，此步骤由thiE基因编码的蛋白质进行。
由HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的正确核苷酸序列的知识，本发明人显示，需要提供外源硫胺素以保证生长的硫胺素营养缺陷型突变体在其HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的编码序列中存在突变。这毫无疑问地在分子水平证明了该基因的重要性。由这类知识，可能开发出筛选可抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化学品的筛选方法。由于HMP-P激酶或TMP-PP酶基因编码的酶的重要性，还期望这类化学品抑制植物的生长或生存，因此是潜在的优良除草剂。因而本发明的一个目的是提供利用纯化的HMP-P激酶或TMP-PP酶鉴定其抑制物的方法，所述抑制物可用作除草剂以抑制不期望的植被生长，例如在作物生长的田间中，尤其是农业经济上重要的作物，诸如玉米和其它谷物类作物，如小麦、燕麦、黑麦、高粱、稻、大麦、黍、草皮草和饲料草等，以及棉花、甘蔗、甜菜、油籽油菜和大豆等。
本发明包括一种嵌合基因，其包含与编码本发明HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列有效连接的启动子。本发明还包括一种重组载体，其包含根据本发明的所述嵌合基因，其中所述载体可被稳定地转化入宿主细胞。本发明还包括一种宿主细胞，其包含根据本发明的载体，其中所述核苷酸序列在该细胞中可表达。优选地是一种根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种真核细胞。更优选的是根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞。还优选地是一种宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种原核细胞。更优选的是根据本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
还包括的是分离的参与硫胺素生物合成的植物蛋白质，其中所述蛋白质具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。优选的是一种分离的蛋白质，其中所述植物是拟南芥。更优选的是根据本发明的蛋白质，其中所述蛋白质具有HMP-P激酶活性。尤其优选的是一种根据本发明的蛋白质，其中所述蛋白质包含与SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。尤其优选的是一种蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
优选根据本发明的蛋白质，其中所述蛋白质具有TMP-PP酶活性。更优选的是一种根据本发明的蛋白质，其中所述蛋白质包含与SEQ IDNO:2中所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。尤其优选的是一种蛋白质，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，本发明描述了一种鉴定待测化学品之抑制植物生长或生存的能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化其产物合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的待测化学品和酶与用于第一反应混合物中的底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中酶的活性低于(期望明显低于)第一反应混合物中酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存的能力。在一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶来自植物，优选为拟南芥。在另一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，HMP-P激酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶磷酸(HMP-P)，在另一个优选实施方案中，TMP-PP酶的底物是4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。在又一个优选实施方案中，TMP-PP酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。在又一个优选实施方案中，酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。在又一个优选实施方案中，酶的活性通过测量反应混合物中来自ATP的ADP测定。本发明还描述了一种检定方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化其产物合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中待测化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中酶的活性；其中，若第二反应混合物中偶联的酶活性明显低于第一反应混合物中的酶活性，化学品能抑制酶活性。
本发明还描述了一种鉴定待测化学品的抑制植物生长和生存的能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存的能力。在一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶来自植物，优选为拟南芥。在另一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，HMP激酶的底物是HMP，在另一个优选实施方案中，TMP-PP酶的底物是THZ-P。在又一个优选实施方案中，酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。本发明还描述了一种检定方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，化学品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之酶活性。本发明还描述了一种鉴定待测化学品的抑制植物生长和生存的能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存的能力。在一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶来自植物，优选为拟南芥。在另一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ IDNO:2氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，HMP-P激酶的底物是HMP-P，在另一个优选实施方案中，THZ激酶的底物是THZ。在又一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。本发明还描述了一种检定方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与THZ激酶底物和HMP-P激酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，化学品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之活性。
在另一个优选实施方案中，本发明描述了一种鉴定具有抑制植物中HMP-P激酶或TMP-PP酶活性能力的化学品的方法，包括如下步骤a)获得转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，优选稳定转化的，其包含编码具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶之非天然核苷酸序列，且能过量表达HMP-P激酶或TMP-PP酶的酶促活性；b)将化学品应用于转基因植物、植物细胞、组织或其部分，以及等基因的非转化植物、植物细胞、组织或其部分；c)测定转基因及非转化植物、植物细胞、组织应用化学品后的生长或存活；d)比较转基因及非转化植物、植物细胞、组织应用化学品后的生长或存活。期望地，化学品抑制非转基因植物、植物细胞、组织或其部分的生长或存活，而不明显抑制等基因的转基因植物、植物细胞、组织或其部分的生长或存活。在一个实施方案中，编码具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶的核苷酸序列来自植物，优选为拟南芥，期望地与示于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似。在另一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由编码示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列之核苷酸序列编码。在又一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶具有与示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
本发明还包括具有修饰的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的植物、植物组织、植物种子和植物细胞，其因此耐受在正常水平下对天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性为抑制性的除草剂的抑制。
本发明涵盖的除草剂耐受植物包括否则可能成为抑制性除草剂潜在靶标的那些植物，尤其是上述农业经济上重要的作物。根据本实施方案，植物、植物组织、植物种子或植物细胞用一种重组DNA分子转化，优选稳定转化。所述重组DNA分子包含与核苷酸编码序列有效连接的在植物中有功能的适当启动子，其中核苷酸编码序列编码修饰的HMP-P激酶或TMP-PP酶，修饰的酶耐受正常情况下可抑制野生型未修饰的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性之浓度的除草剂的抑制作用。修饰的HMP-P激酶或TMP-PP酶活性也可由增加野生型除草剂敏感的HMP-P激酶或TMP-PP酶表达来赋予植物，表达的增加是通过向植物提供野生型HMP-P激酶或TMP-PP酶基因的多重拷贝或者是在强度高于野生型启动子的控制下过量表达野生型HMP-P激酶或TMP-PP酶基因来实现的。如此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞可通过传统筛选方法筛选，由此分离、表征并培育了除草剂耐受品系。或者，也可使用随机或定点突变产生除草剂耐受品系。
因此，本发明提供了用含有从植物分离的核苷酸序列的DNA分子转化的植物、植物组织、植物种子或植物细胞，所述核苷酸序列编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中该酶具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中DNA分子赋予植物、植物组织、植物种子或植物细胞耐受一定量的除草剂，该除草剂的量正常情况下抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。根据本实施方案的一个实施例，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的的氨基酸序列。
本发明还提供了抑制植物生长的方法，包括将在植物中抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化学品应用于植物的步骤。在与此相关的方法，本发明涉及一种在含有种植的作物种子的作物或植株的田间选择性抑制杂草生长的方法，包括如下步骤(a)种植除草剂耐受作物或作物种子，其是耐受抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的除草剂之植物或植物种子；以及(b)向田间的作物或作物种子和杂草应用一定量的除草剂，所用量抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中，除草剂抑制杂草的生长，而不明显抑制作物的生长。
通过研究下面的发明描述及非限制性实施例，本领域技术人员可知晓本发明的其它方面及优点。
已经从拟南芥中鉴定了一些需要外源硫胺素或硫胺素前体(即4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑(THZ)和/或2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶(HMP))的专性有机营养缺陷型(organoauxotrophic)突变体，并绘制了4个基因座位置(Li和Redei,1969，生物化学遗传学(Biochemical Genetics),3,163-170)。一个基因座th1作图位于染色体1(Koomneef和Hanhart,1981，芥属信息服务(Arab.Info.Service),18,52-58)。尽管在嘧啶和噻唑前体之间的该区组及th1突变体中硫胺素的确切位置不能由Koomneef和Hanhart确定，后来通过生物化学方法显示th1突变体缺乏TMP-PP酶酶促活性(Komeda等，1988，植物生理(Plant Physiol.),88,248-250)。
近来，覆盖染色体1的该区域之BAC序列(BAC F19G10)已提交至GenBank。该BAC上，一个基因具有与大肠杆菌thiD和thiE的氨基酸序列明显类似的序列(BAC序列上核苷酸位置46133-48657)。基于此信息，发明人分离了芥属cDNA，其编码一种具有两个功能性结构域的新蛋白质N-末端结构域的氨基酸序列(至SEQ ID NO:1中大约核苷酸906，或SEQ ID NO:2的氨基酸302)与HMP-P激酶(thiD)具有同源性，C末端结构域的氨基酸序列(从SEQ ID NO:1的大约核苷酸925，或SEQ ID NO:2的氨基酸309)与TMP-PP酶(thiE)具有同源性。也在SEQ ID NO:1的前99个核苷酸中预测了一个推定的叶绿体转运肽(SEQ ID NO:2前33个氨基酸)。
发明人还获得了来自两种不同th1突变体的HMP-P激酶/TMP-PP酶序列，CS79和CS3530(芥属保藏中心，诺丁汉，英国)。他们发现在两种突变体的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中均存在突变。CS79在SEQ ID NO:1的位置188处具有由C至T的单核苷酸改变，这将SEQID NO:2中位置63的氨基酸从丝氨酸变为苯丙氨酸。CS3530具有在SEQ ID NO:l中位置259-265或位置260-266上的7核苷酸缺失，这将SEQ ID NO:2中位置87的氨基酸从异亮氨酸变为天冬酰胺。在该突变体中，天冬酰胺87的密码子后跟随13个氨基酸的密码子，然后是阅读框中的TGA终止密码子。突变应导致仅有100个氨基酸的蛋白质的翻译，所述蛋白质仅含有一小部分与thiD同源的结构域，缺乏与thiE同源的结构域。这些结果显示，硫胺素营养缺陷型表型是由于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中的突变，毫无疑问地表明HMP-P激酶/TMP-PP酶基因对于植物至关重要，很有可能代表了除草剂的良好靶点。
基于cDNA序列，发明人进一步发现在BAC克隆中预测的不正确的剪接接头。第一个预测的剪接接头不正确地导致在SEQ ID NO:1位置383处添加了内含子序列的24个碱基(图2)，第二个预测的剪接接头不正确地导致在SEQ ID NO:1位置1066和1089之间24个碱基的删除及9个错误碱基的添加。基于此推定，HMP-P激酶/TMP-PP酶基因无操作性(inoperative)，将不能用于本发明的用途。
HMP-P激酶/TMP-PP酶基因还进一步称为编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶。由此优选表示编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的单一多肽之HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。在另一个优选实施方案中，由HMP-P激酶/TMP-PP酶基因编码的单一多肽具有HMP-P激酶活性和TMP-PP酶活性。
已经于1998年7月8日将编码成熟HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO:3所示)保藏于依用于专利程序目的之国际承认的微生物保藏单位的布达佩斯条约建立的国际保藏单位之农业研究机构保藏中心(NRRL),1815 N,University Street,Peoria,Illinois 61604，美国，克隆名称aththiDE-ctp，保藏号NRRL B-30040。
对于在宿主生物中HMP-P激酶/TMP-PP酶的重组生产，将编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列插入一种设计用于所选宿主的表达盒，并导入重组产生其的宿主中。适合所选宿主的特定调节序列如启动子、信号序列、5’和3’非翻译序列及增强子的选择属于本领域技术人员的知识水平之内。所得含有与正确阅读框连接的各个元件之分子可被插入能转化入宿主细胞的载体中。用于蛋白质重组产生的合适的表达载体及方法为本领域周知，对于宿主而言，诸如大肠杆菌、酵母和昆虫细胞(见如，Luckow和Summers，生物/技术(Bio/Technol.),6:47(1988))。特定例子包括质粒，诸如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)、pFLAG(InternationalBiotechnologies,Inc.,New Haven,CT)、pTrcHis(Invitrogen,La Jolla,CA)、和杆状病毒表达载体，例如那些来自Autographica californica核多角体病毒(AcMNPV)基因组的。一种优选的杆状病毒/昆虫系统是pVl1l392/Sf21细胞(Invitrogen,La Jolla,CA)。
在一个优选实施方案中，编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列来自真核生物，如酵母，但优选来自植物。在又一个优选实施方案中，核苷酸序列与示于SEQ ID NO:1或SEQID NO:3中的核苷酸序列相同或基本上相似，或编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列与示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。示于SEQ ID NO:l的核苷酸序列编码芥属HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，编码芥属推定成熟HMP-P激酶/TMP-PP酶的示于SEQ ID NO:3的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ IDNO:4。在又一个优选实施方案中，核苷酸序列来自原核生物，优选细胞，如大肠杆菌。在这种情况中，具有HMP-P激酶活性的酶及具有TMP-PP酶活性或具有TMP-PP酶活性的酶分别由thiD和thiE基因编码。
利用多种标准技术分离和纯化重组产生的HMP-P激酶/TMP-PP酶。可使用的具体技术取决于使用的宿主生物，酶是否设计为分泌的，以及其它本领域技术人员熟悉的这类因素(见，如，Ausubel,F.等，编，第16章，当代分子生物学方法，John Wiley & Sons,Inc.(1994))。
重组产生的HMP-P激酶/TMP-PP酶可用于多种用途。例如，其可用于体外检定方法，以筛选其靶位未鉴定的已知除草剂化学品，用来确定是否其抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。这类体外检定方法也可用作更一般的筛选，以鉴定抑制这类酶促活性的化学品，因此其为新除草剂候选物。另外，重组生产的HMP-P激酶/TMP-PP酶可用于阐明这些分子的复杂结构，进一步表征其与已知抑制剂的关系，以合理设计新抑制性除草剂以及除草剂耐受型酶。
一种用于鉴别由必需植物基因编码的酶(如HMP-P激酶/TMP-PP酶)之抑制物的体外检定方法，包括步骤a)在怀疑为酶功能抑制物存在时，将具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与其底物反应；b)将存在怀疑的抑制物时的酶促反应速率与同样条件下不存在怀疑抑制物时的酶促反应速率比较；以及c)测定是否怀疑的抑制物抑制HMP-P激酶的酶促活性或TMP-PP酶的酶促活性。对HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的抑制作用通过检定方法中TMP合成的降低或完全抑制来确定。在一个优选实施方案中，通过在候选抑制物存在和不存在的条件下，采用荧光检测比较在体外检定方法中合成的TMP的量，进行这种测定。在另一个优选实施方案中，这种测定是通过在候选抑制物存在和不存在的条件下，采用吸光度检测比较在体外检定方法中形成的ADP的量。优选的HMP-P激酶底物为2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶磷酸(HMP-P)。优选的TMP-PP酶底物为2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)和4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。
通过使用偶联的HMP激酶/HMP-P激酶/TMP-PP酶检定方法增加HMP-P激酶可接触的HMP-P的量，由此增加检定方法的检测极限，得到改进的筛选抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化学品的方法。这类偶联检定方法包括步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存的能力。在一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶来自植物。在又一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在又一个优选实施方案中，HMP激酶的底物是HMP，在又一个优选实施方案中，TMP-PP酶的底物是THZ-P。在又一个优选实施方案中，酶的活性通过测定反应混合物中产生的TMP测量。
另外，通过使用偶联的THZ激酶/HMP-P激酶/TMP-PP酶检定方法增加TMP-PP酶可接触的THZ-P的量，由此增加检定方法的检测极限，得到改进的筛选抑制HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的化学品的方法。这类偶联检定方法包括步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存的能力。在一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶来自植物。在又一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在又一个优选实施方案中，HMP-P激酶的底物是HMP-P，在又一个优选实施方案中，THZ激酶的底物是THZ。在又一个优选实施方案中，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通过测定反应混合物中产生的TMP测量。
在一个实施方案中，将例如通过体外筛选鉴定之待选除草剂以多种浓度应用于植物。待选除草剂优选地喷施于植物。待选除草剂应用后，记录其对植物的作用(例如死亡或生长抑制)。
在又一个实施方案中，一种筛选HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性抑制物的检定方法使用转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，所述材料能过量表达具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的核苷酸序列，其中HMP-P激酶和TMP-PP酶在转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞中有酶促活性。核苷酸序列优选来自真核生物，诸如酵母，但优选来自植物。在一个优选实施方案中，核苷酸序列与示于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列相同或基本上相似，或编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其氨基酸序列与示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相同或基本上相似。在又一个优选实施方案中，核苷酸序列来自原核生物，优选细菌，如大肠杆菌。在这种情况下，具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶分别由thiD和thiE基因编码。
然后将化学品应用于转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，及应用于等基因的非转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，在应用化学品后测定转基因及非转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞的生长或生存，并比较。
本发明还涉及耐受除草剂的植物、植物组织、植物种子和植物细胞，所述除草剂抑制这些植物中天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中耐受是通过改变的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性赋予的。通过向植物提供额外的野生型除草剂敏感的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因、通过在植物中表达经修饰的除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶或通过这些技术的组合，增加野生型除草剂敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶，由此改变的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性可赋予本发明植物。代表性植物包括除草剂以其正常目的向植物应用的任何植物。优选为农业经济上重要的作物，如棉花、大豆、油籽油菜、甜菜、玉米、稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、黍、草皮草和饲料草等通过表达增加实现改变的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，导致植物细胞中HMP-P激酶/TMP-PP酶的水平至少足够克服由除草剂引起的生长抑制。表达的酶的水平一般至少是天然表达量的两倍，优选至少5倍，更优选至少10倍。表达增加可由于野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的多重拷贝；基因内编码序列的多重出现(即基因扩增)或植物细胞中内源基因的非编码序列、调节序列中的突变。具有这类改变的基因活性之植物可通过本领域周知的植物直接筛选得到(见美国专利5162602和美国专利4761373，此处引入作为参考)。这些植物也可通过本领域周知的基因工程方法获得。通过用重组或嵌合DNA分子转化植物细胞也可实现除草剂敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的表达增加，其中所述DNA分子包含能够在植物细胞中驱动相关结构基因表达的启动子，该启动子与编码HMP-P激酶/TMP-PP酶的同源或异源结构基因有效连接。优选地，转化是稳定的，由此提供可遗传的转基因性状。B．经修饰的除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶的表达根据本实施方案，用含有在植物中有功能的、与编码序列有效连接的适当启动子之重组DNA分子稳定地转化植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中所述编码序列编码一种除草剂耐受形式的HMP-P激酶/TMP-PP酶。除草剂耐受形式的酶具有至少一个氨基酸置换、添加或删除，其赋予对抑制未经修饰的天然存在形式的酶之除草剂的耐受。通过常规筛选技术可筛选如此产生的转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，由此可分离、表征和培育除草剂耐受品系。下面描述获得编码除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因之方法。
一种一般方法包括对微生物的直接或间接诱变方法。例如，一种遗传可操作的微生物如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)可通过用如UV光或甲磺酸乙基酯或甲基酯进行体内随机诱变。诱变方法例如Miller,分子遗传学实验(Experiments in Molecular Genetics),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1972)；Davis等，高等细菌遗传学(Advanced Bacterial Genetics),Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1980)；Sherman等，酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1983)；和美国专利4,975,374中所述。选择用于诱变的微生物含有正常的抑制物敏感型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，且依赖与该基因赋予的活性。于抑制未修饰基因的浓度之抑制物存在下突变的细胞生长。筛选在抑制物存在下比未突变微生物的菌落生长好的突变微生物菌落(即，显示对抑制物的抗性)，用于进一步分析。通过克隆或PCR扩增分离来自这些克隆的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，阐明其序列。编码改变的基因产物的序列然后被克隆回微生物中，以证实其赋予抑制物耐受的能力。
一种获得含有植物HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之突变除草剂耐受等位基因的方法包括植物中直接筛选。例如，通过将以本领域周知的方法灭菌之种子种在含有浓度递增的抑制物之简单基本盐培养基的平板上，测定突变的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因对植物如芥属、大豆或玉米的生长抑制作用。这种浓度在每100万份中0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、110、300、1000和3000份的范围内。可重复性检测到明显抑制生长的最低浓度用于随后的实验。对本领域人员而言最低浓度的测定是常规操作。
利用植物材料的诱变增加在筛选群体中出现抗性等位基因的频率。突变的种子材料来自多种来源，包括化学或物理诱变种子，或化学或物理诱变花粉(Neuffer,用于生物研究的玉米，Sheridan编.Univ.Press,Grand Forks,ND,pp.61-64(1982))，其然后用来对植物传粉，并收集得到的M1突变体种子。一般地，对于芥属，由用化学方法(如甲磺酸乙酯)或用物理方法(γ射线或快中子)突变的种子生长得到的植物之后代种子-M2种子(Lehle Seeds,Tucson,AZ)以最多10000种子/平板(10cm直径)，在含有用于筛选耐受型之适当浓度抑制物的基本盐培养基上种板。持续生长并在种板后7-21天保持绿色的幼苗被移植入土壤，生长至成熟并结籽。测试这些种子的子代对除草剂的耐受。如果耐受性状为显性，其种子分离为3∶1/抗性∶敏感型的植物被假定为在M2代抗性杂合。产生全部抗性种子的植物被假定为在M2代抗性纯合。这种对完整种子和其M2子代种子筛选的突变也可对其它种属进行，例如大豆(见如美国专利5084082)。或者，待筛选除草剂抗性的突变种子可通过用经化学或物理手段诱变的花粉传粉而获得。
除草剂耐受的遗传基础是修饰的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因这一理论的证实通过如下所示进一步确立。首先。以基于SEQ ID NO:？所示芥属cDNA编码序列的引物，或更优选地基于来自用于产生耐受等位基因的植物之未改变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因序列的引物，利用PCR分离来自显示对抑制物抗性的植物之HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的等位基因。在对等位基因测定序列以确定编码序列中存在突变后，测试等位基因其赋予植物对抑制物抗性的能力，该植物中已用推定的赋予耐受性的等位基因转化。这类植物可为芥属植物或其生长对HMP-P激酶/TMP-PP酶抑制物敏感的任何其它植物。第二，相对于已知限制性片段长度多态性(RFLP)绘制插入的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因图谱(见，例如Chang等，美国国家科学院院报85:6856-6860(1988)；Nam等，植物细胞(Plant Cell)1:699-705(1989))。利用相同标记独立地绘制HMP-P激酶/TMP-PP酶抑制物耐受性状图谱。当耐受是由于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因中的突变时，耐受性状绘制在与HMP-P激酶/TMP-PP酶基因位置不可区分的位置。
另一种获得HMP-P激酶/TMP-PP酶基因除草剂耐受型等位基因的方法是通过在植物细胞培养物中筛选。将植物组织外植体如，胚、叶盘等，或活跃生长的愈伤组织，或目标植物的悬浮培养物于存在浓度递增的抑制性除草剂(或适用于实验室环境的抑制物类似物)之培养基中生长。在不同培养物中记录到不同的生长程度。在某些培养物中，长出的快速生长变体集落甚至在正常抑制性浓度的抑制物存在下仍持续生长。在用抑制物接触组织或细胞之前，用化学或物理方法处理可增加这类快速生长变体出现的几率。如前述分离并测试推定的赋予耐受性的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的等位基因。然后将这些鉴定为赋予除草剂耐受性之等位基因进行基因工程改造，以利于表达及转化入植物。或者，可从含有这些等位基因的组织或细胞培养物中再生植物。
还有一种方法包括，在细菌或酵母中诱变野生型除草剂敏感的植物HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，随后在含有抑制性浓度抑制物的培养基上培养微生物，然后筛选在抑制物存在下生长的那些菌落。更具体地，将一种植物cDNA，例如编码HMP-P激酶/TMP-PP酶的芥属cDNA克隆入否则会缺乏所选基因活性的微生物。然后通过数种本领域已知的化学或酶学方法将转化的微生物进行体内诱变或体外诱变，例如亚硫酸氢钠(Shortle等，酶学方法(Methods Enzymoi.)100:457-468(1983)；甲氧基氨(Kadonaga等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)13:1733-1745(1985)；寡核苷酸定向饱和诱变(Hutchinson等，美国国家科学院院报，83:710-714(1986)；或多种聚合酶错误掺入方法(见，如，Shortle等，美国国家科学院院报，79:1588-1592(1982)；Shiraishi等，基因64:313-319(1988)；和Leung等，技术(Technique)1:11-15(1989)。挑选在正常抑制性浓度的抑制物存在下生长的菌落，重复划线加以纯化。纯化其质粒，并通过将其重新转化入缺乏HMP-P激酶/TMP-PP酶基因活性的微生物，测试赋予抑制物耐受性的能力。由此确定通过此测试之质粒cDNA插入片段的DNA序列。
也可利用包括体外重组(也称为DNA改组)的方法获得除草剂抗性HMP-P激酶/TMP-PP酶。通过DNA改组，将突变(优选随机突变)导入HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。DNA改组也导致HMP-P激酶/TMP-PP酶基因内序列的重组和重排，或者两个或多个不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之间序列的重组和交换。这些方法使得产生以百万计的突变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。筛选突变基因或改组基因中是否存在期望的性质，如对除草剂改进的耐受性，以及赋予对不同种类的抑制物化学的广谱耐受性。这样的筛选在本领域技术人员的常规操作范围内。
本发明涵盖了一种改组DNA分子，其中所述DNA分子编码具有增强的除草剂耐受性之HMP-P激酶/TMP-PP酶，所述除草剂抑制由模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，所述改组DNA分子由此模板DNA分子衍生。此外，还涵盖一种由改组模板DNA分子获得的突变DNA分子，所述模板DNA分子编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中，所述突变DNA分子编码具有增强的除草剂耐受性之HMP-P激酶/TMP-PP酶，该除草剂抑制由所述模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在一个优选实施方案中，由至少一种模板HMP-P激酶/TMP-PP酶基因形成突变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因，其中模板HMP-P激酶/TMP-PP酶基因已被切割成期望大小的双链随机片段，并包含将所得双链随机片段群体加入一种或多种单链或双链寡核苷酸的步骤，其中所述寡核苷酸包括一个与双链随机片段相同区和一个与双链随机片段异源的区域；将所得双链随机片段和寡核苷酸变性成为单链分子；将所得单链分子群体与聚合酶在这样的条件下温育，该条件可导致所述单链分子在该相同区域退火，以形成退火片段对，所述相同区域足以使退火片段对的一方引发另一方的复制，由此形成一种突变的双链多核苷酸；再重复第二和第三步至少两个循环，其中进一步循环的第二步中所得混合物包括来自在先循环第三步骤中的突变双链多核苷酸，进一步的循环形成又一突变的双链多核苷酸；其中，突变的双链多核苷酸是具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶基因，所述除草剂抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在又一个优选实施方案中，由至少两种非相同的编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之模板DNA分子形成突变的编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之DNA分子，包含如下步骤向模板DNA分子加入至少一种含有与各个模板DNA分子相同的区域之寡核苷酸；将所得混合物变性成为单链分子；将所得单链分子群体与聚合酶在这样的条件下温育，该条件可导致寡核苷酸与模板DNA分子退火，其中用于聚合酶起聚合作用的条件是获得相应于模板DNA分子的一部分的聚合化产物；再重复第二和第三步至少两个循环，其中第三步中获得的延伸产物能引发模板DNA分子在下一循环中用于聚合作用；由此形成突变的双链多核苷酸，其包含来自不同模板DNA分子的序列；其中，突变的双链多核苷酸编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
在一个优选实施方案中，在双链随机片段群体中双链随机片段单一种类的浓度小于总DNA的1％(重量)。在又一个优选实施方案中，模板双链多核苷酸包含至少约100种多核苷酸。在又一个优选实施方案中，双链随机片段的大小从约5bp至5kb。在又一个优选实施方案中，方法的第四步包括重复第二和第三步的步骤至少10个循环。这种方法在例如Stemmer等，(1994)自然，370:389-391，美国专利5,605,793和Crameri等，(1998)自然391:288-291以及WO 97/20078中有描述，此处引入作为参考。
在又一个优选实施方案中，任何两个或多个不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的组合通过例如Zhao等，(1998)自然杂志生物工程分册(Nature Biotechnology)16:258-261中所述，由参差延伸方法(StEP)体外诱变。两种或多种HMP-P激酶/TMP-PP酶基因用作PCR扩增的模板，PCR反应的延伸循环优选地在低于聚合酶最佳聚合温度的温度下进行。例如，当使用最佳温度约为72℃的热稳定聚合酶时，延伸反应的温度期望低于72℃，更优选地低于65℃，优选低于60℃，更优选地延伸反应的温度是55℃。此外，延伸反应的PCR反应循环持续时间期望地少于通常本领域所用时间，更期望地少于30秒，优选其少于15秒，更优选地延伸反应的持续时间为5秒。在每一次延伸反应中仅有短DNA片段被聚合，使得延伸产物的模板开关在每次变性和退火循环后的起始DNA分子之间，由此在延伸产物中产生多种不同形式。PCR反应的最佳循环数目取决于待诱变的HMP-P激酶/TMP-PP酶编码区长度，优选地多于40个循环，更优选多于60个循环，优选使用高于80个循环。如使用本领域周知的方法测定每一HMP-P激酶/TMP-PP酶基因组合的最佳延伸条件和最佳PCR循环数目。其它PCR反应参数基本上与本领域常用的相同。扩增反应的引物优选地设计为与位于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因编码序列外的DNA序列退火，例如与含有HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的载体之DNA序列退火，由此，用于PCR反应的不同HMP-P激酶/TMP-PP酶基因优选地包含在分别的载体中。引物期望地与位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶编码序列距离不超过500bp的序列退火，优选与位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶编码序列距离不超过200bp的序列退火，更优选地与位于和HMP-P激酶/TMP-PP酶编码序列距离不超过120bp的序列退火。优选地，HMP-P激酶/TMP-PP酶编码序列由限制性位点包围，所述位点包括在PCR反应中扩增的DNA序列，由此可方便扩增产物克隆入适当的载体。
在又一个优选实施方案中，具有粘性末端的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因片段如WO98/05765所述制备。粘性末端由如下方法制备，通过将相应于HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的一部分之第一种寡核苷酸与第二种寡核苷酸连接，所述第二种寡核苷酸不存在于该基因或相应于如下基因的一部分，所述基因不和相应于第一种寡核苷酸的基因相邻，其中第二种寡核苷酸含有至少一种核糖核苷酸。利用第一种寡核苷酸作为模板，第二种寡核苷酸作为引物制备双链DNA。切除核糖核苷酸。位于核糖核苷酸5’侧的核苷酸也被去除，导致双链片段具有粘性末端。通过与所得新基因序列组合的连接随机重新装配这类片段。
任何HMP-P激酶/TMP-PP酶基因或任何HMP-P激酶/TMP-PP酶基因组合可用于本发明的体外重组。例如，HMP-P激酶/TMP-PP酶基因来自植物，如拟南芥，例如HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如SEQID NO:1或SEQ ID NO:3中所示。其它适合体外重组的基因有来自细菌如大肠杆菌thiD或thiE基因的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因(Vander Horn等，(1993)细菌学杂志，175,982-992；Backstrom等，(1995)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)117,2351-2352)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)thiD基因(Petersen和Downs(1997)细菌学杂志，179,4894-4900)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)thiD gene(Akiyama和Nakashima(1996)，当代遗传学(Curr.Genet.)30,62-67；Ouzonis和Kyrpides(1997)分子进化杂志(J.Mol.Evol.)45,708-711)或酿酒酵母thiE基因(Nosaka等，(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269,30510-30516)，在此引入作为参考。在本发明中使用完整HMP-P激酶/TMP-PP酶基因或其部分。如上述获得的突变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因文库被克隆入适当的表达载体，所得载体转化入适当宿主，例如藻类，如衣藻类，酵母或细菌中。适当地宿主优选为原本缺乏HMP-P激酶活性的宿主，如大肠杆菌菌株NI500(遗传学贮藏中心(Genetic Stock Center),New Haven,美国)，或缺乏TMP-PP酶活性的宿主，例如大肠杆菌菌株NI400(Nakayama和Hayashi(1972)细菌学杂志，112:1118-1126)。用含有突变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因文库的载体转化的宿主细胞在含有抑制性浓度的抑制物的培养基上培养，选择在抑制物存在下生长的菌落。挑选在正常情况下抑制性浓度的抑制物存在下生长的菌落，重复划线加以纯化。纯化其质粒，测定通过此测试的质粒cDNA插入片段之DNA序列。
一种鉴定耐受抑制物的经修饰的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因之检定方法可以如鉴定HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性抑制物相同的检定方法(抑制物检定方法，见上)进行，除了进行如下修改第一，突变的HMP-P激酶/TMP-PP酶在一个反应混合物中替代抑制物检定方法中的野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶。第二，各反应混合物中均存在野生型酶的抑制物。第三，比较突变活性(存在抑制物和突变酶的活性)及未突变活性(存在抑制物和野生型酶的活性)，测定当与未突变活性相比，是否观察到突变活性中酶活性显著增加。突变活性是存在适当底物及抑制物时任何突变酶的测量活性。未突变活性是存在适当底物及抑制物时任何野生型酶的测量活性。显著增加定义为一种超过测量技术固有的误差范围的酶促活性的增加，优选为约两倍或两倍以上于在抑制物存在下的野生型酶活性的活性增加，更优选约5倍或5倍以上，更优选约10倍或10倍以上的增加。
除了用于产生除草剂耐受型植物，编码除草剂耐受HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因也可用作植物细胞转化方法中的选择标记。例如，用转基因转化的植物、植物组织、植物种子或植物细胞也可用编码一种能被植物表达的、改变的HMP-P激酶/TMP-PP酶的基因转化。转化的细胞被移入培养基中，其中含有足以抑制不表达经修饰的酶之植物细胞生存的量的酶抑制物，在此，仅有转化的细胞可存活。此方法适用于任何能用经修饰的HMP-P激酶/TMP-PP酶编码基因转化的任何植物细胞，并能与任何目标转基因一起使用。转基因及修饰的基因之表达可由在植物细胞中有功能的相同启动子或分别的启动子驱动。
优选的是形成突变的本发明HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的方法。
还优选的是形成所述突变HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的方法。
更优选的是形成突变的本发明突变的DNA分子的方法，其中一个模板DNA分子来自真核生物。尤其优选的是本发明的方法，其中所述真核生物是植物。
更优选的是本发明的方法，其中所述模板DNA分子的种类与SEQID NO:1所示的核苷酸序列相同或基本上类似。
更优选的是由本发明方法获得的编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之突变DNA分子，其中所述突变DNA分子编码具有增强的除草剂耐受性的HMP-P激酶/TMP-PP酶，所述除草剂抑制由所述模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
利用常规重组DNA技术，可将一种野生型或除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因整合入植物或细菌细胞中。通常，这包括利用本领域标准克隆方法将编码HMP-P激酶/TMP-PP酶的DNA分子插入一种对于该DNA分子而言为异源(即非正常存在)的表达系统。载体含有对于插入的蛋白质编码序列在含有所述载体的宿主细胞中转录和翻译必需的元件。可使用大量本领域已知的载体系统，例如质粒、噬菌体病毒和其它修饰的病毒。表达系统的组分也可被修饰以增加表达。例如，可利用截短的序列、核苷酸置换或其它修饰。可利用本领域已知的表达系统在适当条件下转化任何作物的植物细胞。含有野生型或除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的转基因优选被稳定转化并整合入宿主细胞的基因组。在另一个优选实施方案中，含有野生型或除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的转基因位于自主复制的载体上。自主复制的载体例子为病毒，尤其是双生(gemini)病毒。转化细胞可再生为完整植物，使得HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的所选形式赋予转基因植物除草剂耐受性。A．构建植物表达盒的要求首先在表达盒中于可在植物中表达的适当启动子之后装配准备在转基因植物中表达的基因序列。这些表达盒也可包含转基因表达所需或选择的其他任何序列。这些序列包括但不限于，例如，转录终止子、增强表达的外部序列，如内含子、关键序列和用于将基因产物导向至特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至上述植物转化载体中。下面是典型表达盒的不同成分的描述。1．启动子在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，此选择将反映基因产物积累的希望的位置。或者，所选的启动子可在多种诱导条件下引导基因表达。启动子在其强度即促进转录的能力方面不同。根据使用的宿主细胞系统，可使用本领域所知的多种适当启动子中的任一种。例如，CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子可用于组成型表达。例如，来源于烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1启动子可用于调节型表达(见，例如，美国专利号5,689,044)。2．转录终止子多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责超出转基因之外的转录终止及其正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶及双子叶植物中。3．增强或调节表达的序列已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的基因结合使用而增强其在转基因植物中的表达。例如，多种内含子序列如玉米Adh1基因的内含子，显示能增强表达，尤其是在单子叶植物细胞中。另外，已知多种由病毒衍生的非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植物细胞中特别有效。4．编码序列优化通过改变用于在目的作物种类中最佳表达的编码序列，可以遗传改造所选基因的编码序列。修饰编码序列以实现在特定作物种中最佳表达的方法是众所周知的(见，例如，Perlak等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:3324(1991)；Koziel等人，生物技术(Bio/technol.)11:194(1993))。
5．细胞内基因产物的导向已知存在于植物中的多种用于导向基因产物的机制，已或多或少表征了控制这些机制发挥功能的序列。例如，基因产物向叶绿体的导向由见于多种蛋白质氨基末端的信号序列控制，其在叶绿体输入过程中被切割，以产生突变蛋白质(如Comai等，生物化学杂志，263:15104-15109)(1988)。其它基因产物定位于其它细胞器，如线粒体和过氧化物酶体如Unger等，植物分子生物学，13:411-418(1989)。编码这些产物的cDNA也可被操纵，以影响异源基因产物向这些细胞器的导向。此外，已表征了引起基因产物向其它细胞元件的导向之序列。氨基末端序列负责向ER、质外体的定向，以及从糊粉细胞的胞外分泌(Kohlar和Co)植物细胞2:769-783(1990)。此外，氨基末端序列及羧基末端序列负责基因产物的液泡产物(Shinshi等，植物分子生物学，14:357-368，(1990))。通过上述适当导向序列与目标转基因序列的融合，可能将转基因产物导向任何细胞器或细胞单元。B．植物转化载体的构建可用于植物转化的多种转化载体为植物转化领域的技术人员所公知，并且与本发明有关的基因可与任何这些载体结合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的目标种。对于某些目标种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素及相关抗生素抗性的nptⅡ基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19:259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304:184-187(1983))、赋予除草剂phosphinothricin抗性的bar基因(White等人，核酸研究18:1062(1990),Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79:625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学4:2929-2931)、允许在甘露糖存在下进行正选择的manA基因(Miles和Guest(1984)基因32:41-48；美国专利号5,767,378)、赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7):1099-1104(1983))、和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)。1．适用于农杆菌属(Agrobacterium)转化的载体许多载体可用于应用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。它们一般带有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))的载体和pXYZ。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物。(见，例如，美国专利号5,639,949)。2．适用于非农杆菌转化的载体不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的载体外，也可应用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于待转化的种类的优选。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(见，例如，美国专利号5,639,949)。C．转化技术目的编码序列被克隆到表达系统中后，即被转化到植物细胞中。植物转化和再生的方法在本领域中众所周知。例如，Ti质粒载体已用于外源DNA的送递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。另外，也可用农杆菌属的细菌转化植物细胞。
用于双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞对外源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的送递、或显微注射来完成。在所有情况中，都用本领域公知的标准技术使转化的细胞再生为整个植物。
大多数单子叶植物种的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术向原生质体中直接转移基因，对愈伤组织的粒子轰击，以及农杆菌介导的转化。
本发明野生型或改变形式的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因可用来向植物细胞的多种变体赋予除草剂耐受性，包括那些裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。尽管基因可被插入任何落入本发明范围的植物细胞，尤其是在作物植物细胞，如稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃著、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、豌豆、豆、菊苣、莴苣、卷心菜、菜花、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、西葫芦、南瓜、倭瓜、黄瓜、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。
野生型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的高水平表达和/或除草剂耐受型HMP-P激酶/TMP-PP酶基因的表达赋予植物的除草剂耐受性，以及其它对生产和质量重要的特征，均可通过本领域周知的育种方法和技术掺入到植物品系中。
当除草剂耐受性HMP-P激酶/TMP-PP酶基因等位基因通过在作物植物或植物细胞培养物中的直接筛选获得时，其中由所述植物细胞培养物可再生作物植物，可利用传统育种技术将其移入商品化的变体中，以培育除草剂耐受性作物，而无需遗传工程化等位基因并将其转化入植物。序列表中的序列简述SEQ ID NO:1，芥属HMP-P激酶/IMP-PP酶前蛋白的DNA序列SEQ ID NO:2，芥属HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:3，推定的成熟芥属HMP-P激酶/TMP-PP酶的DNA序列SEQ ID NO:4，推定的成熟芥属HMP-P激酶/TMP-PP酶的氨基酸序列SEQ ID NO:5，寡核苷酸aththiDEforSEQ ID NO:6，寡核苷酸aththiDErevSEQ ID NO:7，寡核苷酸aththiDEfor-ctp保藏克隆 保藏号 保藏日期aththiDE-ctpNRRL B-300401998年7月8日将参照下列详细的实施例进一步描述本发明。提供这些实施例的目的仅仅是说明，除非另外指明而不意在限制。
或者，通过偶联反应方法定量ADP的形成。在这种情况中，加入3.5单位丙酮酸激酶，4.7单位的乳酸脱氢酶，1.0mM磷酸烯醇式丙酮酸和0.2mM NADH，于340nm测量吸光度。实施例3偶联HMP激酶与HMP-P激酶和TMP-PP酶活性检定分析HMP激酶检定分析通过检测同时形成的ADP跟踪HMP向HMP-P的转化。利用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(试剂酶)，检测在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的转化，跟踪ADP的形成。在340nm监测。丙酮酸激酶和PEP促进ATP由ADP的再生。ATP是HMP激酶和HMP-P激酶均需要的底物。检定分析缓冲液为添加了10 mM MgCl2的50 mM Tris-HCl,pH 7.5(缓冲液A)。HMP-P激酶和TMP-PP酶为检定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。HMP-P由在相同反应混合物中HMP向HMP-P的转化产生。如果加入NADH，利用HMP激酶检定分析可跟踪这种转化。当HMP向HMP-P转化进行充分时(约50mM)，加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和THZ-P。在HMP-P产生后加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和THZ-P，确保在所有反应孔中初始HMP-P浓度恒定。通过Kawasaki等，(1990)细菌学杂志，172,6145-6147的方法鉴定形成的TMP的量。在TMP产生足够的时间后(一般15分钟)，用偏磷酸或TCA终止酶反应。在碱性条件下氧化TMP。用激发波长360±10nm和发射波长430±10nm测量所得thiachrome衍生物的荧光。检定方法无论酶的来源均用相同方法进行检定分析。在300ml的96孔微滴板中进行检定分析。总检定分析反应体积为100ml。以比例混合底物使得终浓度为(微滴板中)HMP(100 mM),ATP(1000 mM),PEP(1000 mM)，及NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合试剂酶和HMP激酶以同时加入。每个反应的ADP检测/再生混合物的推荐量为1.0单位丙酮酸激酶和1.0单位乳酸脱氢酶。这可用作指导，并依经验调整酶量。在HMP激酶反应以约5mM/分钟的速度反应完成后(在10-15分钟之内)，加入THZ-P至终浓度50mM，并加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定间隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性决定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)终止反应。离心培养板，沉淀蛋白质，将上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，随后加入100ml的1M NaOH。用激发波长360±10nm和发射波长430±10nm通过荧光光度微滴板读数计读取孔板值。使用单磷酸硫胺素为标准。
单磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals。利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶学方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。实施例4偶联的THZ激酶和HMP-P激酶与TMP-PP酶活性检定分析A．THZ激酶检定分析通过检测同时形成的ADP跟踪THZ向THZ-P的转化。利用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(试剂酶)，检测在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的转化，跟踪ADP的形成。在340nm监测。丙酮酸激酶和PEP促进ATP由ADP的再生。ATP是THZ激酶和HMP-P激酶均需要的底物。检定分析缓冲液为添加了10 mM MgCl2的缓冲液A。B．HMP-P激酶和TMP-PP酶为检定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。THZ-P由在相同反应混合物中THZ向THZ-P的转化产生。如果加入NADH，利用THZ激酶检定分析可跟踪这种转化。当THZ向THZ-P转化进行充分时(约20mM)，加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和HMP-P。在THZ-P产生后加入HMP-P激酶、TMP-PP酶和HMP-P，确保在所有反应孔中初始THZ-P浓度恒定。通过Kawasaki等，(1990)细菌学杂志，172,6145-6147的方法鉴定形成的TMP的量。在TMP产生足够的时间后(一般15分钟)，用偏磷酸或TCA终止酶反应。在碱性条件下氧化TMP。用激发波长360±10nm和发射波长430±10nm测量所得thiachrome衍生物的荧光。C．检定方法无论酶的来源均用相同方法进行检定分析。在300ml的96孔微滴板中进行检定分析。总检定分析反应体积为100ml。依比例混合底物使得终浓度为(微滴板中)THZ(50 mM),ATP(5mM),PEP(1000mM)，和NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合试剂酶和HMP激酶以同时加入。每个反应的ADP检测/再生混合物的推荐量为1.0单位丙酮酸激酶和1.0单位乳酸脱氢酶。这可用作指导，并依经验调整酶量。在THZ激酶反应以约5mM/分钟的速度反应完成后(在5-10分钟之内)，加入HMP-P至终浓度100mM，并加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定间隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性决定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)终止反应。离心培养板，沉淀蛋白质，将上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，随后加入100ml的1M NaOH。用激发波长360±10nm和发射波长430±10nm通过荧光光度微滴板读数计读取孔板值。使用单磷酸硫胺素为标准。
单磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals.利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶学方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。实施例5偶联的HMP激酶、THZ激酶和HMP-P激酶和TMP-PP酶活性检定分析HMP激酶和THZ激酶检定分析通过检测同时形成的ADP跟踪HMP向HMP-P以及THZ向THZ-P的转化。利用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(试剂酶)，检测在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)存在下NADH向NAD+的转化，跟踪ADP的形成。在340nm监测。丙酮酸激酶和PEP促进ATP由ADP的再生。ATP是HMP激酶和HMP-P激酶均需要的底物。检定分析缓冲液为添加了10 mM MgCl2的缓冲液A。HMP-P激酶和TMP-PP酶为检定分析HMP-P激酶和TMP-PP酶，需要提供底物HMP-P和THZ-P。HMP-P和THZ-P由在相同反应混合物中HMP向HMP-P的转化以及THZ向THZ-P的转化产生。如果加入NADH，利用HMP激酶和THZ激酶检定分析可跟踪这种转化。当HMP向HMP-P转化以及THZ向THZ-P转化进行充分时(分别为约50mM和20mM)，加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。在HMP-P和THZ-P产生后加入HMP-P激酶和TMP-PP酶，确保在所有反应孔中这些底物的初始浓度恒定。通过Kawasaki等，(1990)细菌学杂志，172,6145-6147的方法鉴定形成的TMP的量。在TMP产生足够的时间后(一般15分钟)，用偏磷酸或TCA终止酶反应。在碱性条件下氧化TMP。用激发波长360+10nm和发射波长430±10nm测量所得thiachrome衍生物的荧光。检定方法无论酶的来源均用相同方法进行检定分析。在300ml的96孔微滴板中进行检定分析。总检定分析反应体积为100ml。依比例混合底物使得终浓度为(微滴板中)HMP(100mM),THZ(50 mM),ATP(5mM),PEP(1000 mM)，和NADH(200 mM)。10X底物混合物可以10ml/孔移入。也可混合试剂酶和HMP激酶以同时加入。每个反应的ADP检测/再生混合物的推荐量为1.0单位丙酮酸激酶和1.0单位乳酸脱氢酶。这可用作指导，并依经验调整酶量。在HMP激酶和THZ激酶反应以约5mM/分钟的速度反应完成后(在10-15分钟之内)，加入HMP-P激酶和TMP-PP酶。一定间隔后(由HMP-P激酶和TMP-PP酶的活性决定)，加入50 mL 10％(w/v)偏磷酸或20％(w/v)三氯乙酸(pH 1.4)终止反应。离心培养板，沉淀蛋白质，将上清液移入另外的微滴板。加入50ml的0.3M溴化氰，混合，随后加入100ml的1M NaOH。用激发波长360±10nm和发射波长430±10nm通过荧光光度微滴板读数计读取孔板值。使用单磷酸硫胺素为标准。
单磷酸硫胺素、ATP、PEP、NADH、偏磷酸、三氯乙酸、溴化氰和NaOH可得自Sigma Chemicals。利用Schellenberger等，(Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.(1967)348,501-505)的方法合成HMP，依照Leder等，(1970)酶学方法，18A,166-167的方法合成THZ-P。实施例6通过DNA改组体外重组HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如实施例6所述通过PCR扩增编码前蛋白的拟南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因。基本上如Stemmer所述(1994)PNAS 91:10747-10751用DNaseⅠ处理得到的DNA片段，从反应混合物中除去PCR引物。无引物进行PCR反应，随后是带引物进行PCR反应，均如Stemmer et al.(1994)PNAS 91:10747-10751所述。将所得DNA片段克隆入pTRC99a (Pharmacia,Cat no:27-5007-01)，利用Biorad基因脉冲仪按制造商指示转化入大肠杆菌菌株NI500(遗传学贮藏中心，New Haven，美国)或大肠杆菌菌株NI400(Nakayama和Hayashi(1972)细菌学杂志，112:1118-1126)。在含有抑制性浓度的抑制物存在的培养基中生长转化的细菌，挑选在有抑制物存在时生长的菌落。挑取在正常抑制性浓度的抑制物存在下生长的菌落，反复划线纯化。纯化其质粒，确定通过此测试的质粒cDNA插入片段的DNA序列。实施例7参差延伸方法体外重组HMP-P激酶/TMP-PP酶基因各自将编码成熟蛋白质的拟南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大肠杆菌thiD克隆入pBluescript载体的多接头。基本上如Zhao等，(1998)自然杂志生物工程分册，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)进行PCR反应。用适当的限制性酶消化扩增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突变的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如实施例6所述筛选。B．各自将编码成熟蛋白质的拟南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大肠杆菌thiE克隆入pBluescript载体的多接头。基本上如Zhao等，(1998)自然杂志生物工程分册，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)进行PCR反应。用适当的限制性酶消化扩增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突变的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如实施例6所述筛选。C．各自将编码成熟蛋白质的拟南芥HMP-P激酶/TMP-PP酶基因及大肠杆菌thiD和thiE克隆入pBluescript载体的多接头。基本上如Zhao等，(1998)自然杂志生物工程分册，16:258-261所述，利用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)进行PCR反应。用适当的限制性酶消化扩增的PCR片段，并克隆入pTRC99a，突变的HMP-P激酶/TMP-PP酶基因如实施例6所述筛选。实施例8稻胚胎发生细胞悬浮液的起始和维持将Japonica水稻品种“Taipei 309”的具有乳状胚乳的未成熟小穗脱壳，用70％(v/v)乙醇表面消毒1分钟，6％次氯酸钙20分钟，随后用无菌蒸馏水洗三次。在含有3％蔗糖、2mg/l 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D),pH5.8的0.35％琼脂糖固化MS培养基(Murashige和Skoog,1962)上28℃培养分离的未成熟胚。一周后，通过每周转移到新鲜培养基上分开并培养由盾盖(scntella)产生的愈伤组织物质。开始4周后，将3-4个愈伤组织转移到含有20ml R2培养基(R2盐和维生素[Ohira等人，1973]、lmg/l 2,4-D、500mg/l 2-吗啉代乙烷磺酸[MES]、3％蔗糖，pH5.8)的50ml培养瓶中。培养物在暗光下28℃保存于220转/分的旋转式摇床上，每周将培养基替换为等量的新鲜培养基。选择快速分裂、脆的愈伤组织，通过将2ml细愈伤组织悬液转移到20ml R2培养基中将其传代培养到一个新容器中。
使细胞覆盖500μm网状隔板，将其置于含有颗粒的过滤单元之下14cm。在部分真空(2×104pa)下用50毫秒的单次8巴压力脉冲释放颗粒。
如下培养原生质体。室温下将样品铺板于6cm培养皿中。再过5-15分钟，加入含有1.2％SeaPlaque琼脂糖和mg/l 2,4-D的3mlKM-8p培养基。充分混合琼脂糖和原生质体，使培养基成凝胶。B．以一个或多个如下改变重复上述方法(1)将原生质体制品的电阻调节至0.5-0.7K；(2)使用的PEG是具有MW4000的PEG。
(3)不加入PEG，或加入一半体积的12％PEG。
(4)以3秒间隔进行脉冲。
(5)在电穿孔后将原生质体在碟中种板，置于冷却至室温16℃的碟上。
(6)在电穿孔步骤后将原生质体置于试管中，用10ml的6/7强度的KMC溶液或用W5溶液(包含380 mg/l KCl,18.375 g/l CaCl2x2H2O,9g/l NaCl；9g/l葡萄糖，pH 6.0)洗涤，然后于60xg离心10分钟，于0.3ml KM培养基中重悬，如A所述种板。
(7)不加胎牛胸腺载体DNA。实施例15用PEG处理转化玉米原生质体A．在上述最后一步中将原生质体重悬于含有12-30 mM MgCl2的0.5M甘露醇溶液。如上述进行45℃热休克5分钟。将原生质体分配入用于在离心管中转化的等份中，每管0.3ml悬浮原生质体。在随后10分钟内加入DNA和PEG溶液(MW6000,40％含有0.1MCa(NO3)2和0.4M甘露醇；用KOH调至pH8-9)，终浓度达到20％PEG。将等份样品不时温和振摇，温育30分钟，然后将原生质体种板于培养皿中(每个直径6cm培养皿0.3ml初始原生质体悬浮液)，如所述培养。
B．重复此步骤，在上述PEG溶液中温育30分钟后洗涤原生质体，方法是以2-3分钟间隔加入0.3ml W5溶液洗涤5次。离心原生质体悬浮液，除去上清液，如所述培养原生质体。
C．重复上述步骤，将PEG终浓度修饰为13-25％之间。实施例16由原生质体再生愈伤组织在琼脂糖中含有原生质体的平板于26℃置于黑暗中。14天后，从原生质体得到集落。将含有集落的琼脂糖转移至9cm直径培养皿的表面，所述培养皿含有带2mg/l 2,4-D用0.24％Gelrite酸化的N6培养基30ml。该培养基称为2N6。再次在26℃于黑暗中培养愈伤组织，每两周将愈伤组织小片传代至新鲜固体2N6培养基上。实施例17转化的玉米愈伤组织筛选重复上面的实施例，为了筛选转化的细胞，将100mg/l或200mg/l潮霉素B加至2N6培养基。实施例18玉米植物的再生A．将愈伤组织置于2N6培养基上维持，置于ON6(含有N6培养基，不含2,4-D)和N61培养基(含有N6培养基，含0.25mg/l 2,4-D和10mg/l细胞分裂素)以引发再生。在光照下(用白色荧光灯16小时/日光以840-8400 lx)培养ON6和N61培养基上生长的愈伤组织。两周后将在N61培养基上生长的愈伤组织转移到ON6培养基，因为在N61培养基上延长生长是有害的。每两周传代愈伤组织，即使愈伤组织将再次转移到相同培养基配方上。在约4-8周出现小植物。一旦小植物至少有2cm高，将其转移到GA7容器的ON6培养基上。在2-4周形成根，当根充分形成足以支持生长时，将小植物移入泥炭罐中的土壤，前4-7天在阴影中生长。通常在移植体上倒扣一透明塑料杯2-3天是有益的，以帮助硬化。一旦形成植物，如正常玉米植物处理，在温室中生长至成熟。为了获得子代植物，自花传粉或与野生型杂交。
B．重复上述实施例，为维持愈伤组织加入培养基中100mg/l或200mg/l潮霉素B。实施例19将DNA导入双色高粱(Sorghum bicolor)原生质体基本如上面的玉米所述，制备高粱悬浮液FS 562的原生质体，最后一次洗涤后在如下溶液中以107/ml重悬0.2 M甘露醇，0.1％MES,72 mM NaCl,70 mM CaCl2,2.5 mM KCl,2.5 mM葡萄糖，用KOH调节pH为5.8，以1.6-2×106/ml的密度。以1ml等份将原生质体悬浮液分配入塑料一次性小管中，如所述加入10μg DNA。当测量下述电穿孔仪471电极装置之间该点的溶液电阻时范围在6内。为了转化，将DNA加入10微升无菌蒸馏水中，用如Paszkowski等，1984所述除菌。温和混匀溶液，于室温(24-28℃)经历400V/cm的脉冲，利用471电极装置BTX-Transfector300电穿孔仪，衰减指数常数为10ms。B．重复上述步骤，进行如下一个或多个修改(1)使用电压为200 Vcm-1，或在100 Vcm-1与800 Vcm-1之间。(2)指数衰减常数为5 ms、15 ms或20 ms。(3)25μl无菌水中50μg剪切的胎牛胸苷DNA与质粒DNA一起加入。(4)在使用前用适当的限制性酶(如BamHⅠ)处理，使质粒DNA线性化。
转化后以2×106/ml的密度将原生质体培养于KM-8p培养基中，不加固化剂。实施例20将DNA导入Glycine max的原生质体如Tricoli等，(1986)、或Chowhury和Widholm(1985)或Klein等，(1981)所述的方法制备Glycine max原生质体。基本上如上所述将DNA导入这些原生质体。如Tricoli等，(1986)、或Chowhury和Widholm(1985)或Klein等，(1981)所述培养原生质体，不加入藻酸固化培养基。
上述公开的实施方案为阐明性的。本发明的公开将使本领域技术人员拥有本发明的多种变形。所有这些显而易见的和可预见的变形均由所附的权利要求所涵盖。
序列表<110>Novartis AG<120>筛选除草化合物的方法及其用途<130>PH/5-30565/A/CGC2013<140><141><150>US 09/109,254<151>1998-06-30<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1569<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(1566)<223>芥属HMP-P激酶/TMP-PP酶前蛋白的cDNA编码序列<400>1atg aat agc tta gga gga att agg agt tgg ccg gcg aat tgg aga agt48Met Asn Ser Leu Gly Gty Ile Arg Ser Trp Pro Ala Asn Trp Arg Ser1 5 10 15acg acg gcg tca atg acg acg acg gag agc gtt aga aag gta ccg caa96Thr Thr Ala Ser Met Thr Thr Thr Glu Ser Val Arg Lys Val Pro Gln20 25 30gtt tta aca gtg gcg gga tca gat tcc ggc gcc gga gct gga att caa144Val Leu Thr Val Ala Gly Ser Asp Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gln35 40 45gcc gac ctt aaa gtc tgc gca gct cgt ggt gtg tat tgc gct tcc gtc192Ala Asp Leu Lys Val Cys Ala Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ala Ser Val50 55 60ata acc gca gtc act gct cag aac act cga gga gtt caa tct gtt cat240Ile Thr Ala Val Thr Ala Gln Asn Thr Arg Gly Val Gln Ser Val His65 70 75 80ctt crt cct ccg gaa ttt arc tct gaa cag ctc aaa tcc gtc crc tct288Leu Leu Pro 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Leu Val Lys Gly Gly Asp Leu Pro195 200 205gac tea tca gat tca gta gat gtt tac ttt gat ggc aag gag ttt cat672Asp Ser Ser Asp Ser Val Asp Val Tyr Phe Asp Gly Lys Glu Phe His210 215 220gaa ctc cgt tct cct cgc ata gct aca aga aat act cat ggg act ggt720Glu Leu Arg Ser Pro Arg Ile Ala Thr Arg Asn Thr His Gly Thr Gly225 230 235 240tgc act ttg gct tcc tgt att gca gct gag ctt gca aaa ggc tct tcc768Cys Thr Leu Ala Ser Cys Ile Ala Ala Glu Leu Ala Lys Gly Ser Ser245 250 255atg ctc tca gcc gtc aag gtg gct aaa cgc ttt gtc gat aat gcc cta816Met Leu Ser Ala Val Lys Val Ala Lys Arg Phe Val Asp Asn Ala Leu260 265 270gat tac agc aaa gat att gtc att ggc agt ggg atg caa gga cct ttt864Asp Tyr Ser Lys Asp Ile Val Ile Gly Ser Gly Met Gln Gly Pro Phe275 280 285gac cat ttt ttt ggt ctt aag aag gat cct caa agt tct cga tgc agc912Asp His Phe Phe Gly Leu Lys Lys Asp Pro Gln Ser Ser Arg Cys Ser290 295 300ata ttc aat cca gat gac ctg ttt cta tat gct gtt aca gat tct aga960Ile Phe Asn Pro Asp Asp Leu Phe Leu Tyr Ala Val 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Glu Leu Ala Lys Gly Ser Ser245 250 255Met Leu Ser Ala Val Lys Val Ala Lys Arg Phe Val Asp Asn Ala Leu260 265 270Asp Tyr Ser Lys Asp Ile Val Ile Gly Ser Gly Met Gln Gly Pro Phe275 280 285Asp His Phe Phe Gly Leu Lys Lys Asp Pro Gln Ser Ser Arg Cys Ser290 295 300Ile Phe Asn Pro Asp Asp Leu Phe Leu Tyr Ala Val Thr Asp Ser Arg305 310 315 320Met Asn Lys Lys Trp Asn Arg Ser Ile Val Asp Ala Leu Lys Ala Ala325 330 335Ile Glu Gly Gly Ala Thr Ile Ile Gln Leu Arg Glu Lys Glu Ala Glu340 345 350Thr Arg Glu Phe Leu Glu Glu Ala Lys Ala Cys Ile Asp Ile Cys Arg355 360 365Ser His Gly Val Ser Leu Leu Ile Asn Asp Arg Ile Asp Ile Ala Leu370 375 380Ala Cys Asp Ala Asp Gly Val His Val Gly Gln Ser Asp Met Pro Val385 390 395 400Asp Leu Val Arg Ser Leu Leu Gly Pro Asp Lys Ile Ile Gly Val Ser405 410 415Cys Lys Thr Pro Glu Gln Ala His Gln Ala Trp Lys Asp Gly Ala Asp420 425 430Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Val Phe Pro Thr Asn Thr Lys Ala Asn Asn435 440 445Arg Thr Ile Gly Leu Asp Gly Leu Lys Glu Val Cys Glu Ala Ser Lys450 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1．一种编码参与硫胺素生物合成的酶的核苷酸序列，其中所述酶具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
2．权利要求1的核苷酸序列，其中所述酶含有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
3．权利要求1的核苷酸序列，其中所述酶含有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
4．权利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与示于SEQ IDNO:1的核苷酸序列相同或基本上相似。
5．权利要求1的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列示于SEQ IDNO:1。
6．一种含有与权利要求1的核苷酸序列有效连接的启动子之嵌合基因。
7．一种含有权利要求7的嵌合基因之重组载体，其中所述载体能被稳定地转化入宿主细胞。
8．一种含有权利要求14的载体的宿主细胞，其中所述核苷酸序列在所述细胞中可表达。
9．一种参与硫胺素生物合成的植物蛋白质，其中所述蛋白质具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
10．权利要求9的蛋白质，其中所述酶含有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
11．权利要求9的蛋白质，其中所述蛋白质含有示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
12．一种鉴定待测化学品的抑制植物生长和生存能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化其产物合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的待测化学品和酶与用于第一反应混合物中的底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中酶的活性明显低于第一反应混合物中酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存能力。
13．权利要求12的方法，其中所述酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
14．权利要求12的方法，其中所述HMP-P激酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶磷酸(HMP-P)。
15．权利要求12的方法，其中所述TMP-PP酶的底物是4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑磷酸(THZ-P)。
16．权利要求12的方法，其中所述TMP-PP酶的底物是2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶焦磷酸(HMP-PP)。
17．权利要求12的方法，其中所述酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。
18．一种抑制非期望植被生长的方法，包括向非期望的植被应用由权利要求12的方法鉴定的化学品的步骤。
19．一种植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其包含编码具有HMP-P激酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述核苷酸序列赋予植物、植物组织、植物种子或植物细胞耐受一定量的由权利要求12的方法鉴定的化学品，所述一定量为正常情况下抑制野生型植物中HMP-P激酶活性的量。
20．一种可通过如下方法获得的植物，包括用分离的DNA分子转化植物或植物的亲本，其中分离的DNA分子包含编码HMP-P激酶活性的酶之核苷酸序列，且能够在所述植物中表达核苷酸序列，从而赋予该植物对由权利要求12方法鉴定的化学品的耐受性。
21．一种包含如下步骤的检定方法(a)于酶能够催化其产物合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物或TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中酶的活性；其中，若第二反应混合物中偶联的酶活性明显低于第一反应混合物中的酶活性，则化学品能抑制酶活性。
22．一种鉴定待测化学品的抑制植物生长和生存能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存能力。
23．权利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶来自植物。
24．权利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
25．权利要求22的方法，其中HMP激酶的底物是HMP。
26．权利要求22的方法，其中TMP-PP酶的底物是THZ-P。
27．权利要求22的方法，其中具有HMP-P激酶或TMP-PP酶活性的酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。
28．一种用分离的DNA分子转化的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子赋予植物、植物细胞、植物种子或植物组织对一定量的由权利要求22方法鉴定的化学品的耐受性，所述一定量为正常情况下抑制植物中HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的量。
29．一种可通过如下方法获得的植物，包括用分离的DNA分子转化植物或植物的亲本，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能够在所述植物中表达核苷酸序列，从而赋予该植物对由权利要求22方法鉴定的化学品的耐受性。
30．一种包括如下步骤的检定方法(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有HMP激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP激酶底物和TMP-PP酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，则化学品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之酶活性。
31．一种鉴定待测化学品的抑制植物生长或生存能力之方法，包括如下步骤(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与HMP-P激酶底物和THZ激酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性；且(d)当在第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性时，选择待测化学品的抑制植物生长或生存能力。
32．权利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶来自植物。
33．权利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
34．权利要求31的方法，其中HMP-P激酶的底物是HMP-P。
35．权利要求31的方法，其中THZ激酶的底物是THZ。
36．权利要求31的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性之酶的活性通过测量反应混合物中产生的TMP测定。
37．一种抑制非期望植被生长的方法，包括向非期望的植被应用由权利要求31的方法鉴定的化学品的步骤。
38．一种用分离的DNA分子转化的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子赋予植物、植物细胞、植物种子或植物组织对一定量的由权利要求31的方法鉴定的化学品之耐受性，所述一定量为正常情况下抑制植物中HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的量。
39．一种可通过如下方法获得的植物，包括用分离的DNA分子转化植物或植物的亲本的步骤，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性和/或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能够在所述植物中表达核苷酸序列，从而赋予该植物对由权利要求31方法鉴定的化学品的耐受性。
40．一种包括如下步骤的检定方法(a)于酶能够催化TMP偶联合成的条件下，将第一反应混合物中具有THZ激酶活性的酶和具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶与THZ激酶底物和HMP-P激酶底物混合；(b)在相同条件下，将第二反应混合物中的化学品和酶与底物混合，保持如在第一反应混合物中的相同时间；(c)测定在第一和第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的活性；其中，若第二反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性明显低于第一反应混合物中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶活性，则化学品能抑制具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之活性。
41．一种鉴定具有除草剂活性的化学品的方法，其中所述化学品抑制植物中HMP-P激酶或TMP-PP酶活性，包括如下步骤(a)获得转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，其中包含一种编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的分离的核苷酸序列，且能过量表达HMP-P激酶活性或TMP-PP酶的酶促活性；(b)将化学品应用于转基因植物、植物组织、植物种子或植物细胞，以及等基因的非转化植物、植物细胞、组织或其部分；(c)测定转基因及非转化植物、植物细胞、组织应用化学品后的生长或存活；(d)比较转基因及非转化植物、植物细胞、组织应用化学品后的生长或存活；其中，化学品抑制转基因植物、植物细胞、组织或其部分的生长或存活，而不明显抑制等基因的非转基因植物、植物细胞、组织或其部分的生长或存活。
42．权利要求41的方法，其中具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶由与示于SEQ ID NO:1的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列编码，或具有与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。
43．一种抑制非期望植被生长的方法，包括向非期望的植被应用由权利要求22或41中任一种方法鉴定的化学品。
44．一种用分离的DNA分子转化的植物、植物细胞、植物种子或植物组织，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述DNA分子赋予植物、植物细胞、植物种子或植物组织对一定量的由权利要求41的方法鉴定的化学品的耐受性，所述一定量为正常情况下抑制植物中HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的量。
45．一种可通过如下方法获得的植物，包括用分离的DNA分子转化植物或植物的亲本的步骤，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，且能够在所述植物中表达核苷酸序列，从而赋予该植物对由权利要求41方法鉴定的化学品耐受性。
46．一种在含有种植的作物种子的作物或植株的田间选择性抑制杂草生长的方法，包括如下步骤(a)种植除草剂耐受作物或作物种子，其是用分离的DNA分子转化的植物或植物种子，其中分离的DNA分子包含编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在所述植物或植物种子中表达；以及(b)向田间的作物或作物种子和杂草应用一定量的除草剂，所用量抑制天然存在的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，其中，除草剂抑制杂草的生长，而不明显抑制作物的生长。
47．一种改组DNA分子，其中所述改组DNA分子编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由一种模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性，所述改组DNA分子由该模板DNA分子衍生。
48．一种通过改组编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的模板DNA分子获得的突变DNA分子，其中所述突变DNA分子编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
49．一种从编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的模板DNA分子形成编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的突变DNA分子的方法，其中所述模板DNA分子已被切割为双链随机片段，所述方法包括如下步骤(a)向所得双链随机片段群体中加入至少一种单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一个与模板DNA分子相同的区域以及一个与模板DNA分子异源的区域；(b)将所得双链随机片段和寡核苷酸变性成为单链分子；(c)将所得单链分子群体与聚合酶在这样的条件下温育，该条件可导致所述单链分子在所述相同区域退火，以形成退火片段对，所述相同区域足以使退火片段对的一方引发另一方的复制，由此形成一种突变的双链多核苷酸；(d)再重复第二和第三步至少两个循环，其中进一步循环的第二步中所得混合物包括来自在先循环第三步骤中的突变双链多核苷酸，进一步的循环形成进一步突变的双链多核苷酸；其中，突变的双链多核苷酸编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
50．权利要求49的方法，其中一种模板DNA分子来自真核生物。
51．权利要求49的方法，其中所述真核生物是植物。
52．权利要求49的方法，其中所述模板DNA分子的种类与SEQ IDNO:1所示核苷酸序列相同或基本上相似。
53．由权利要求49的方法获得的突变DNA分子，其编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中所述突变的DNA分子编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
54．一种从编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶的至少两种不相同模板DNA分子形成编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶之突变DNA分子的方法，包括如下步骤(a)向模板DNA分子中加入至少一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一与各个模板DNA分子相同的区域；(b)将所得混合物变性成为单链分子；(c)将所得单链分子群体与聚合酶在这样的条件下温育，该条件可导致寡核苷酸与模板DNA分子退火，其中用于聚合酶的聚合作用的条件是获得相应于模板DNA分子的一部分的聚合化产物；(d)再重复第二和第三步至少两个循环，其中第三步中获得的延伸产物能引发模板DNA分子在下一循环中用于聚合作用；由此形成突变的双链多核苷酸，其包含来自不同模板DNA分子的序列；其中，突变的双链多核苷酸编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
55．权利要求54的方法，其中一种模板DNA分子来自真核生物。
56．权利要求54的方法，其中所述真核生物是植物。
57．权利要求54的方法，其中所述模板DNA分子的种类与SEQ IDNO:1所示核苷酸序列相同或基本上相似。
58．由权利要求54的方法获得的突变DNA分子，其编码具有HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性的酶，其中所述突变的DNA分子编码具有对除草剂增强的耐受性之HMP-P激酶或TMP-PP酶，所述除草剂抑制由该模板DNA分子编码的HMP-P激酶活性或TMP-PP酶活性。
全文摘要
本发明公开了利用重组产生的具有HMP－P激酶活性或TMP－PP酶活性的酶筛选除草剂活性的化学品的方法，所述化学品用于鉴定抑制不期望植被生长的用途。此外，本发明提供了利用编码具有HMP－P激酶活性或TMP－PP酶活性的酶之基因在植物、植物组织、植物种子和植物细胞中培育除草剂耐受性的方法，以及利用这类转基因植物选择性抑制作物田间中杂草的生长之方法。
文档编号C12N9/12GK1317051SQ99808108
公开日2001年10月10日 申请日期1999年6月28日 优先权日1998年6月30日
发明者J·Z·勒文, S·L·波特, M·W·鲍尔 申请人:辛根塔参与股份公司