专利名称：硫氧还蛋白和谷物加工的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于谷物加工特别是玉米湿磨和大豆加工，以增强蛋白质和淀粉回收的新方法，以及用于这种方法的新转基因植物。
硫氧还蛋白(TRX)和硫氧还蛋白还原酶(TR)是利用NADPH还原蛋白质中二硫键的酶。蛋白质二硫键在谷物加工效率和从谷物加工中回收产物的质量等方面起重要作用。开发去除或降低谷物中蛋白质二硫键的量的有效方法将大大增加加工效率。另外，牲畜饲料中的谷物性能还受到分子内及分子间二硫键的影响谷物可消化性、营养可得性和抗营养因子(如，蛋白酶、淀粉酶抑制剂等)的中和通过降低二硫键的程度均可增加。
转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶在玉米及大豆中的表达，以及硫氧还蛋白在谷物加工(如湿磨)中的用途有新颖性，且提供了另一种在工业加工过程中降低种子蛋白质中二硫键的方法。本发明因此提供了带有改变的储存蛋白质质量的谷物，以及在工业加工或动物消化过程中(以下均称为“加工”)加工性能质量上不同于正常谷物的谷物。
硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的递送方法避免了在加工中形成用于添加的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的外部来源需要。通过谷物提供硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的第二个优点是在加工之前或作为额外的加工步骤，不必物理性破坏种子的完整性以使酶与种子的储存或基质蛋白质接触。
提供了在谷物加工中利用硫氧还蛋白的三种模式1)在种子发育过程中表达和作用以改变收获的谷物之组成和质量；2)在种子发育过程中表达(但无活性)以改变经加工时的产物质量；3)谷物中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的产生用于在加工过程中通过添加改变其他谷物产品的质量。
本发明因此提供了一种在谷物制粉方法中增加淀粉和蛋白质分离效率的方法，包括在补加的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶存在下于高温中浸渍谷物，和分离谷物中的蛋白质和淀粉成分的步骤。
一种如上述的方法，其中谷物包括来自转基因植物的谷物，其中转基因表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，特别是热稳定的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶。
一种如上述的方法，其中植物选自双子叶植物或单子叶植物，特别是来自谷类，尤其特别是来自玉米(Zea mays)和大豆。
本发明还提供了转基因植物。
特别是，本发明提供了一种包含编码硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的异源DNA序列的植物，所述DNA序列稳定地整合入植物的核或质体DNA。
一种如上述的植物，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是热稳定的。
一种如上述的植物，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶选自SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
一种如上述的植物，其中植物选自玉米和大豆。
本发明还提供了一种植物可表达的表达盒，其含有与在植物中有功能的启动子和终止子序列有效连接的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶编码区。
一种如上述的植物可表达的表达盒，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是热稳定的。
一种如上述的植物可表达的表达盒，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
本发明还提供了一种制备包含高水平的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，包括用如上述的表达盒转化植物。
一种制备包含高水平的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，包括给含有异源表达盒的第一种植物用来自含有异源表达盒的第二种植物的花粉授粉，其中所述第一种植物的表达盒中含有反式激活蛋白调节的启动子，其调节且与编码硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的DNA序列有效连接，第二种植物的表达盒中含有与编码反式激活蛋白的DNA序列有效连接的启动子，所述反式激活蛋白能调节该反式激活蛋白调节的启动子，该方法中还包含从如此授粉的植物中回收谷物。
此外，本发明提供了根据本发明的植物或植物材料作为动物饲料的用途。
此处所述的本发明适用于所有谷物作物，特别是玉米、大豆、小麦和大麦，更特别的是玉米和大豆，尤其是玉米。转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶在谷物中的表达是改变待谷物加工的原料(种子)质量，改变来自谷物加工的原料质量，在加工中最大化特定种子成分产量(提高效率)，改变加工方法以及从制粉物流中产生种子来源的级分或成分之新用途的方法。湿磨法湿磨法是一种分离谷物(更常见地为谷类，例如玉米)的淀粉、蛋白质和油成分的方法。此处其与仅简单地将谷物研磨成粉的干磨法不同。湿磨法中第一步通常是浸渍，其中谷物在小心控制的条件下浸泡于水中，以软化谷粒，且促进成分的分离。含油的胚漂浮在水性溶液的表面，且被移出，通过加水、脱水、研磨、筛选、离心和洗涤的方法，将淀粉与蛋白质分离并被纯化。难点在于将淀粉颗粒从构成谷物胚乳的蛋白质及细胞壁之复杂基质中松开。据信，这种困难的一个原因是分子内或分子间二硫键的存在，其使蛋白质不易溶解，且对蛋白酶不敏感，抑制淀粉颗粒从谷物中的蛋白质基质中释放。目前，用于减少这些键的主要方法使将谷物在二氧化硫存在下浸渍，但是这种方法成本高，有害环境且不甚有效。
一些突变赋予了玉米谷粒胚乳的蛋白质基质有益的作用(粉状和不透明)，但破坏了谷粒完整性。转基因硫氧还蛋白表达提供了一些这样的优点，而不产生与这类突变相关的谷粒完整性问题。
硫氧还蛋白的收获后或加工依赖性活性具有同样的有益作用。例如，在一个实施方案中，硫氧还蛋白酶被导向细胞区室中并在其中累积。在种子物理破坏后发生蛋白质还原。在另一个实施方案中，经过浸渍休眠的胚乳硫氧还蛋白被活化。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种表达热稳定的转基因硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的植物，如来自高嗜热生物的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶，例如除非在高温下(如，高于50℃)否则无明显活性的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。在一个实施方案中，在胚乳中热稳定的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶与通过其他热稳定酶的表达之糖化作用协同。饲料应用转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶在谷物中的表达也可用于改善尤其是动物饲料中与可消化性相关的谷物特性。饲料蛋白质对蛋白酶的敏感性是时间及蛋白质构型的函数。谷粒破碎作为蒸汽制片(steamflaking)常常用于饲料配制中。这些方法均设计用于有益于谷粒的可消化性。在动物胃中更易破坏其完整性的松软谷粒是期望的。蛋白质间构象的约束和交联是蛋白酶敏感性的主要决定因素。由增加的硫氧还蛋白表达修饰这些键可有助于消化。玉米干磨法/粗玉米粉在制粒生产和粗玉米粉生产中蛋白质含量和质量是重要的决定因素。二硫键的减少改变了玉米粉的性质，使得其适于用做小麦替代品，尤其是由高蛋白质白玉米变种制备的玉米粉。大豆破碎半数以上的美国大豆作物被破碎或研磨，所得低脂大豆粉或脱脂大豆粉(或粗粒)中的蛋白质质量对于随后的加工非常重要。大豆加工物流的蛋白质产量及质量经济上十分重要，且主要取决于蛋白质构象。通过在水溶性蛋白质级分中增加转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达增加硫氧还蛋白活性增加了蛋白质溶解性，由此增加蛋白质产量。在碱性条件下通过脱脂大豆粉的水性提取促进回收。通过转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达增加硫氧还蛋白活性，还降低了对有效提取所需的pH，由此降低了加入的氢氧化钙或氢氧化钠，并且减少了随后用于酸沉淀加入的酸，实现了无碱性破坏的蛋白质有效回收，降低了水的消耗及加工工厂的废物排放(含有主要的生物耗氧量)。
蛋白质的氧化还原状况影响大豆蛋白质提供的功能性，如溶解性、水吸收、粘度、凝聚/粘附、胶凝和弹性。通过如上述增加硫氧还蛋白活性增强了在大豆蛋白质浓缩物生产和大豆蛋白质分离物蛋白酶水解过程中的纤维去除。类似地，如上关于玉米所述，通过转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达增加硫氧还蛋白活性，提高了动物饲料中酶活化大豆粉的功能性，大豆粗粉级分蒸汽制粉级分的可溶性。
尽管优选靶定于细胞区室中的且为热稳定的转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，如上述，提供了在种子发育过程中以及加工过程中蛋白质修饰的方法，以避免遇到对作为种子发育过程中硫氧还蛋白活性的结果之储存蛋白质积累的明显不利作用。另外，作为加工酶可加入硫氧还蛋白，因为(与玉米湿磨法相反)直到谷物完整性被破坏之前(破碎和油提取)不需要破坏二硫键。用于异源表达的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的选择硫氧还蛋白，硫氧还蛋白还原酶和蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因见于真核生物、真细菌以及古细菌，包括嗜高温生物，如詹氏甲烷球菌(Methanococcus iannaschii)和闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)。特定基因的选择部分取决于预期的目的。为了本发明的方法，优选的硫氧还蛋白具有以下特性1.热稳定性来自嗜高温生物的硫氧还蛋白和相关蛋白质在高温下(＞50℃)发现有增加的稳定性，且在室温下相对地低活性。从嗜高温生物例如从古细菌(如，詹氏甲烷球菌和闪烁古生球菌)或其他嗜高温生物中表达TRX和/或TR，优选地用于在种子发育过程中表达，使得直到谷物被浸渍时或在高温下加工时硫氧还蛋白活性才明显增加。大多数谷物加工方法包括或适于高温步骤。因此优选热稳定的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。热稳定的是指，在高温下酶优势活化，例如，高于40℃，最优选高于50℃，例如对于湿磨法为45-60℃，甚至更高，如45-95℃。2.底物敏感性也可通过选择优先作用于某些蛋白质(如基质中的结构蛋白质)且对关键的代谢酶有低活性的硫氧还蛋白，降低种子发育过程中的不期望的作用。多种TRX显示与在氧化还原控制下的酶的不同的反应性。因此，能选择主要作用于期望的靶标，最小化过量表达的副作用。
合适的热稳定的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶包括如下来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO1；gi|1591029)MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO2；gi|2649903)(trx-1)MPMVRKAAFYAIAVISGVLAAVVGNALYHNFNSDLGAQAKIYFFYSDSCPHCREVKPYVEEFAKTHNLTWCNVAEMDANCSKIAQEFGIKYVPTLVIMDEEAHVFVGSDEVRTAIEGMK来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO3；gi|2649838)(trx-2)MVFTSKYCPYCRAFEKVVERLMGELNGTVEFEVVDVDEKRELAEKYEVLMLPTLVLADGDEVLGGFMGFADYKTAREAILEQISAFLKPDYKN来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO4；gi|2649295)(trx-3)MDELELIRQKKLKEMMQKMSGEEKARKVLDSPVKLNSSNFDETLKNNENVVVDFWAEWCMPCKMIAPVIEELAKEYAGKVVFGKLNTDENPTIAARYGISAIPTLIFFKKGKPVDQLVGAMPKSELKRWVQRNL来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO5；gi|2648389)(trx-4)MERLNSERFREVIQSDKLVVVDFYADWCMPCRYISPILEKLSKEYNGEVEFYKLNVDENQDVAFEYGIASIPTVLFFRNGKVVGGFIGAMPESAVRAEIEKALGA来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白(trxB)序列(SEQ ID NO6gi|1592167)MIHDTIIIGAGP GGLTAGIYAMRGKLNALCIE KENAGGRIAEAGIVENYPGFEEIRGYELAEKFKNHAEKFKLPIIYDEVIKIETKERPFKVITKNSEYLTKTIVIATGTKPKKLGLNEDKFIGRGISYCTMCDAFFYLNKEVIVIGRDTPAIMSAINLKDIAKKVIVITDKSELKAAESIMLDKLKEANNVEIIYNAKPLEIVGEERAEGVKISVNGKEEIIKADGIFISLGHVPNTEFLKDSGIELDKKGFIKTDENCRTNIDGIYAVGDVRGGVMQVAKAVGDGCVAMANIIKYLQKL来自闪烁古生球菌的硫氧还蛋白序列(SEQ ID NO7；gi|2649006)(trxB)MYDVAIIGGGPAGLTAALYSARYGLKTVFFETVDPVSQLSLAAKIENYPGFEGSGMELLEKMKEQAVKAGAEWKLEKVERVERNGETFTVIAEGGEYEAKAIIVATGGKHKEAGIEGESAFIGRGVSYCATCDGNFFRGKKVIVYGSGKEAIEDAIYLHDIGCEVTIVSRTPSFRAEKALVEEVEKRGIPVHYSTTIRKIIGSGKVEKVVAYNREKKEEFEIEADGIFVAIGMRPATDVVAELGVERDSMGYIKVDKEQRTNVEGVFAAGDCCDNPLKQVVTACGDGAVAAYSAYKYLTS。
编码用于本发明的蛋白质之基因优选地通过利用植物优选的密码子反编译而设计，以增加G-C含量和去除有害序列，如下详述。蛋白质的活性可通过DNA重排或其他方法增强，如下述。因此，本发明包含来自这些蛋白质的蛋白质，尤其是与保留了硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶活性的蛋白质基本上相似的蛋白质。
为了在种子中构建硫氧还蛋白表达用于在谷物发育中的活性，优选指导TRX和TR的种子特异性表达的启动子，其靶向于储存物，使得酶对储存蛋白质有期望的作用，这在一些应用中是期望的。但是，在本发明中，通常期望在种子中构建硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达，用于在谷物形成过程中的累积且无活性。利用了数种策略，以产生表达转基因硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶而对正常种子发育无明显损害的种子。如(i)使活性硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶区室化，使得其不与靶蛋白质明显相互作用，例如通过导向于造粉体或在造粉体中表达。采用质体靶向序列指导在造粉体中的积累。或者，利用分泌信号将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶导向于细胞壁的胞外位置中。或最终，在单子叶植物中，利用在种子发育过程中于细胞类型(如糊粉)中表达将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶与胚乳中其余的储存成分分隔。
(ii)从嗜热生物中构建硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的表达。在发育过程中在室温下(在田间最高为38-39℃)没有或几乎没有活性的酶不太会引起问题。因此优选地，酶主要在高温下有活性，例如，高于40℃，对于湿磨法最优选地为45-60℃，甚至更高，例如，45-90℃。
(iii)将硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶置于诱导型启动子控制之下，例如化学诱导型启动子，创伤诱导型启动子或反式激活蛋白-调节的启动子，其经表达反式激活蛋白的植物授粉后被活化。
(iv)利用具有对于特定硫氧还蛋白还原酶有特异性需求的硫氧还蛋白，使得硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的活性分别通过适当的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的获得而被适当的调节。例如，在不同植物中表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶，使活性组合仅在经表达互补性(complimentary)酶的植物授粉后的种子中可得。或者，将硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶局限于细胞中，例如在质体、液泡或质外体中，如上述，使得直到谷物被加工时才可得。谷物加工方法本发明因此提供了一种利用硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶增强淀粉从蛋白质基质中分离的新方法。在第一个实施方案中，发现硫氧还蛋白在多种种子加工应用中有用，包括湿磨法、干磨法、油料种子加工、大豆加工、小麦加工和面粉/生面团质量，最优选地是谷物，尤其是玉米的湿磨。
因此，本发明提供了一种方法·以改进湿磨效率或增加制粉产量，·以增加淀粉和蛋白质的分离效率，·以增加从谷物中的淀粉和可溶性蛋白质的产量，或·以增加蛋白质在水中或其他溶剂中的溶解性，该方法包括在补加有硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的存在下浸渍谷物，且分离谷物中的淀粉和蛋白质成分。
一般地，浸渍在制粉前进行，但可在其后进行，在提取工艺方法中可能有一次以上的制粉或浸渍步骤，在浸渍过程中或浸渍后的过程中增加从种子中的蛋白质产量。优选地，通过在由其上收获谷物的植物中表达转基因可提供补充性的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶。
本发明进一步提供·硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶在一种方法中的用途，所述方法用于在例如上述任一方法中改善制粉效率或增加淀粉或蛋白质的制粉产量·浸渍水，其中包含由有效量的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶以促进谷物中淀粉与蛋白质分离·谷物，其已经接触有效量的硫氧还蛋白以促进淀粉与蛋白质的分离；和·淀粉或蛋白质，其已经通过上述方法被生产。
可通过向浸渍水中补加硫氧还蛋白还原酶和/或NADPH，增强上述方法中硫氧还蛋白的活性。通常存在于浸渍水中用于湿磨法的其他成分也可存在，如产生乳酸的细菌。优选地，浸渍在约52℃温度下进行22-50小时，因此期望在这些条件下硫氧还蛋白稳定。谷物可以是双子叶植物种子，例如，油料种子，如大豆、向日葵或canola，优选为大豆；或者谷物可以是单子叶植物种子，例如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦或稻，最优选玉米。
硫氧还蛋白可以是带有硫醇基的任一蛋白质，其可被可逆地氧化形成二硫键，且在硫氧还蛋白还原酶存在下被NADPH还原。优选地，硫氧还蛋白衍生于嗜热生物，如上所述。用于本发明的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶在一种经工程化的微生物中(如酵母或曲霉属(Aspergillus))稳定地产生，或者在经工程化的能进行极高表达的植物(如在大麦)中表达，例如在糖化过程中有活性的启动子(如高pIα淀粉酶启动子或其他赤霉素依赖性启动子)控制下。然后将硫氧还蛋白(呈分泌的或提取的形式或与生产生物或其部分相结合)加入浸渍水中。
作为添加硫氧还蛋白于浸渍水中的替代方法或补充，可在待制粉的种子中直接表达酶。优选地，在谷物成熟或受控工艺过程中表达酶。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种在转基因生物(如植物，例如谷物类，如大麦或玉米；或微生物中，例如酵母或曲霉属)中以工业规模生产硫氧还蛋白的方法，例如，这样一种方法，包括培养带有表达硫氧还蛋白嵌合基因的转基因生物，且任选地分离或提取硫氧还蛋白的步骤。
一种利用转基因植物的方法，所述转基因植物在种子成熟或萌发阶段产生增加量的硫氧还蛋白，使得在种子发育过程中或在浸渍工艺中通过内源性合成的硫氧还蛋白影响该种子中的蛋白质的质量，由此消除或降低在制粉前用外源性化学剂或酶处理的需要。
一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物在种子成熟或萌发阶段产生增加量的硫氧还蛋白，使得在种子发育过程中或在浸渍工艺中通过内源性合成的硫氧还蛋白影响该种子中的蛋白质的质量，由此消除或降低在制粉前用外源性化学剂或酶处理的需要。
一种用于将谷物制粉的方法，其利用含有硫氧还蛋白的转基因种子，得到高淀粉及可溶性蛋白质的产量。硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶在转基因植物中的表达本发明还包含一种转基因生物，所述生物在其基因组中具有一种嵌合表达盒，所述表达盒包含一种在启动子可操纵地控制下编码热稳定的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的编码区。
优选地，转基因生物是一种植物，其以该种植物中非天然存在的形式表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶，或其以该种植物非天然存在的高水平表达硫氧还蛋白。优选地，在种子发育过程中在种子中表达硫氧还蛋白，且因此优选在种子特异性启动子的控制下。任选地，硫氧还蛋白的表达置于可诱导的或反式激活蛋白调节的启动子的控制下，使得期望时，通过化学诱导或与反式激活蛋白杂交可活化表达。通过与液泡靶向序列融合将硫氧还蛋白适当地靶定于植物的液泡中。
在本发明中，将硫氧还蛋白序列与在植物中有活性的启动子融合，且转化入核基因组或质体基因组。启动子优选为种子特异性的启动子，如γ-玉米醇溶蛋白启动子。启动子可另外为化学诱导的启动子，如烟草PR-la启动子，或可以是化学诱导的反式激活蛋白调节的启动子，其中反式激活蛋白在化学诱导的启动子控制下；但是，有些情况中，组成型启动子如CaMV 35S或Gelvin启动子也可使用。带有化学诱导的启动子，转化入植物的硫氧还蛋白基因的表达可在适当的时机通过叶面施用化学诱导剂激活。
或者，硫氧还蛋白编码序列在反式激活蛋白调节的启动子控制下，且通过将用该序列转化的植物与表达反式激活蛋白的第二种植物杂交，可实现表达。在本方法的优选形式中，含有硫氧还蛋白编码序列的第一种植物是种子亲代，且为雄性不育的，而表达反式激活蛋白的第二种植物是授粉者。在种子中硫氧还蛋白的表达是通过将第一种植物与第二种植物间作，例如使得第一种植物被第二种授粉，且通过用由第二种亲代之反式激活蛋白基因表达的反式激活蛋白激活反式激活蛋白调节的启动子，在第一种植物的种子中表达硫氧还蛋白。
本发明因此提供了一种在例如硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白非天然表达的植物中表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白的植物，例如，一种含有编码硫氧还蛋白的异源DNA序列的植物，所述DNA序列稳定地整合入其核或质体DNA，优选地在一种可诱导型启动子控制下，例如，化学可诱导的启动子，例如与诱导型启动子有效连接，或者在反式激活蛋白调节的启动子控制下，其中，相应的反式激活蛋白在诱导型启动子控制下，或在第二种植物中表达，使得通过与第二种植物杂交，可激活启动子；其中硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶优选为热稳定的；这种植物也包括其种子，其中种子任选地经处理(如primed或包衣)和/或被包装，例如，置于具有使用说明的袋中，包括从中收获的种子，例如用于上述的制粉方法中。
本发明的转基因植物可任选地包含用于增强硫氧还蛋白还原酶和/或NADPH产生的基因。
本发明还提供一种生产硫氧还蛋白的方法，包括培养如上述的硫氧还蛋白表达植物一种生产淀粉核和/或蛋白质的方法，包括从如上述收获的种子中提取淀粉或蛋白质；及一种湿磨法，包括如上述浸渍表达硫氧还蛋白的植物之种子，且从中提取淀粉和/或蛋白质。
本发明还提供了·一种植物表达盒，其包含编码硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的区域，优选地硫氧还蛋白来自嗜热生物，例如来自，例如如上述来自詹氏甲烷球菌或闪烁古生球菌，其中编码区优选地经优化以含有植物偏好的密码子，所述编码区与在植物中有功能的启动子和终止序列连接，其中启动子优选为种子特异性启动子或诱导型启动子，例如化学诱导型启动子或反式激活蛋白调节的启动子，其由核反式激活蛋白调节(例如，当反式激活蛋白是T7 RNA聚合酶时为T7启动子，其表达任选地在诱导型启动子控制下)。
·一种载体，其含有这种植物中可表达的表达盒；·一种用这种载体转化的植物；或·一种转基因植物，在其基因组例如其核或质体基因组中包含这种植物可表达的表达盒。
本发明还包含一种生产含有高水平硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，包括包括给含有异源表达盒的第一种植物用含有异源表达盒的第二种植物授粉，其中所述第一种植物中的表达盒含有反式激活蛋白调节的启动子，其调节且与编码硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的DNA序列有效连接，第二种植物中的表达盒含有与编码反式激活蛋白的DNA序列有效连接的启动子，所述反式激活蛋白能调节该反式激活蛋白调节的启动子；该方法还包含从如此授粉的植物中回收谷物。定义为确保说明书及权利要求书的清楚及一致的理解，提供如下定义在此使用的“表达盒”意思是能在植物细胞中引导基因表达的DNA序列，包括有效地与目的编码区连接的启动子，此编码区有效地与终止区连接。编码区通常编码目的蛋白但也可编码目的功能性RNA，例如在有义或反义方向抑制了特定基因(如反义RNA)的表达的反义RNA或非翻译RNA。基因可以是嵌合的，意思是基因的至少一种成分对于基因的至少另一种成分是异源的。基因也可是天然发生的，但已以重组形式获得，可用于植物的基因转化。然而一般而言表达盒对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然发生，并且必须通过转化事件被引入宿主细胞或宿主细胞的祖先。
“核表达盒”是整合入宿主核DNA的表达盒。
“质体表达盒”是整合入宿主质体DNA的表达盒。在此描述的质体表达盒可任选地包含一个多顺反子操纵子，此操纵子包括位于单个启动子(如反式激活蛋白介导的启动子)的控制之下的两个或更多的目的顺反子编码序列，例如，其中一个目的编码序列编码抑制clpP或其它质体蛋白酶表达的反义mRNA，以此增强其它编码序列或目的序列表达的蛋白质的积累。
在此使用的“异源的”意思是“不同于天然来源的”。例如，如果用从其它生物尤其是从另一个种的生物衍生的基因转化植物，该基因对于该植物是异源的，并且对于该植物的携带该基因的后代也是异源的。
“同质体的”指一种植物、植物组织或植物细胞其中所有的质体遗传学上是相同的。当质体未被转化、突变或其它的基因改变时，这在植物中是正常状态。在不同的组织或发育的不同阶段，质体可有不同的形式，如叶绿体、前质体、黄化质体、造粉体、色质体等等。
“可诱导的启动子”是仅当植物接触某些特定的外部刺激物时才起始转录的启动子，这不同于组成型启动子或对特定组织或器官或发育阶段特异的启动子。对于本发明特别优选的是化学诱导型启动子和创伤诱导型启动子。化学诱导型启动子包括植物衍生的启动子，如系统获得的耐受途径中的启动子，例如PR启动子，如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4和PR-5启动子，尤其是烟草PR-1a启动子和拟南芥(Arabidopsis)PR-1启动子，当植物接触BTH和相关化学物时它们起始转录。见美国专利5，614，395，在此引入作为参考，以及WO98/03536，在此引入作为参考。化学诱导型的启动子也包括受体介导的系统，如由其它生物衍生来的系统，如类固醇依赖的基因表达、铜依赖的基因表达、四环素依赖的基因表达，以及尤其是应用保幼生长激素及其拮抗剂介导的果蝇(Drisophila)USP受体的表达系统，这在PCT/EP96/04224中有描述，在此引入作为参考，以及联合使用受体的系统，如PCT/EP96/00686中描述的，在此引入作为参考。创伤诱导型启动子包括蛋白酶抑制剂的启动子，如马铃薯的蛋白酶抑制剂II启动子，及其它参与创伤应答途径的植物衍生的启动子，如多酚氧化酶、LAP和TD的启动子。总的见C.Gatz，“基因表达的化学控制”，植物生理植物分子生物学年报，(Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.)(1997)4889-108，其内容在此引入作为参考。反式激活蛋白调节的启动子在下面详述，并且可通过将一种植物与表达反式激活蛋白的第二种植物杂交而诱导，所述植物含有在反式激活蛋白调节的启动子控制下的硫氧还蛋白基因。
“分离的DNA分子”是由于人工参与使核苷酸序列与其天然环境相分离而存在，且因此非天然产物。分离的核苷酸序列可以纯的形式存在或存在于非天然环境中，如转基因宿主细胞中。
“蛋白质”如此处所述为由相应核苷酸序列编码的完整蛋白质，或由相应核苷酸序列的一部分编码的蛋白质的一部分。
“分离的蛋白质”是由分离的核苷酸序列编码的蛋白质，因而非天然产物。分离的蛋白质可以纯的形式存在或存在于非天然环境，如转基因宿主细胞，其中在等基因转基因宿主细胞中蛋白质正常下不表达，或以不同形式或不同的量表达。
“植物”是指任一植物，或在任一发育阶段中的植物部分，是特别旨在涵盖被粉碎、破坏或处死的植物和植物材料，以及存活的植物，植物切条、细胞或组织培养物及种子。
DNA改组DNA改组是指在DNA分子中导入(优选随机导入)突变或重排，或在两个或列多DNA分子间产生(优选随机产生)DNA序列交换的方法。DNA改组所获得的DNA分子是至少来源于一个模板DNA分子的非天然存在的改组DNA分子。相对模板DNA编码的酶而言，改组DNA分子编码修饰的酶，而且优选具有改变的生物学活性。
最广义地来说，当在此对于核苷酸序列使用时，术语“基本上类似”意思是一种对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应的序列编码一种与参照核苷酸序列编码的多肽有基本上相同的结构和功能的多肽，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸改变。希望地，基本上相似的核苷酸序列编码参照核苷酸序列编码的多肽。基本上类似的核苷酸序列与参照核苷酸序列之间同一性的百分数希望地为至少80％，更希望地为至少85％，优选地至少90％。使用Smith-Waterman序列对比算法进行序列对比(见，例如，Waterman，M.S.《计算生物学介绍图谱、序列与基因组》。Chapman&Hall.伦敦1995.ISBN 0-412-99391-0，或http//www-hto.usc.edu/software/seqaln/indes.html)。localS程序1.16版使用下列参数区配1，罚错配0.33，开放罚区间(open-gap)2，扩展罚区间(extended-gap)2。
与参照核苷酸序列“基本上类似的”核苷酸序列在下列条件下可与参照核苷酸序列杂交7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA，50℃，用2×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗涤，更希望的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用1×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗涤，更希望的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.5×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗涤，优选的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.1×SSC、0.1％SDSD在50℃下洗涤，更优选的是7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA，50℃，用0.1×SSC、0.1％SDSD在65℃下洗涤。
当在此对于蛋白质使用时，术语“基本上类似”意思是一种对应于参照蛋白质的蛋白质，其中该蛋白质与参照蛋白质有基本上相同的结构和功能，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸变化。当用于蛋白质或氨基酸序列时，基本上类似的与参照蛋白质或氨基酸序列之间的同一性百分数希望地至少为80％。更希望地85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少90％。
“反式激活蛋白”是一种蛋白质，通过其本身或与一种或多种其它蛋白质的联合，能导致位于相应反式激活蛋白介导的启动子控制下的编码区转录。反式激活蛋白系统的实例包括噬菌体T7基因10启动子，其转录的激活依赖于特异的RNA聚合酶如噬菌体T7 RNA聚合酶。反式激活蛋白一般是RNA聚合酶或DNA结合蛋白，它能与特定的启动子相互作用以起始转录，方法是直接激活该启动子或灭活阻遏基因，如抑制阻遏蛋白的表达或积累。DNA结合蛋白可以是包含一个与适当转录激活蛋白结构域连接的结合区(如GAL4结合区)的嵌合蛋白。某些反式激活蛋白系统可具有多重反式激活蛋白，例如对于启动子识别、DNA结合、或转录激活不仅需要聚合酶而且需要特定亚单位(sigma因子)的启动子。反式激活蛋白优选地对于植物是异源的.微生物基因的修饰以优化在植物中的核表达如果希望，本申请中描述的克隆硫氧还蛋白基因可被修饰以用于在转基因植物宿主中表达。例如，衍生自微生物来源的基因在植物中的转基因表达，需要对这些基因加以修饰以实现并且优化其在植物中的表达。特别是，编码分隔的酶但其在天然微生物中被同一转录物编码的细菌开放阅读框，其在植物中在分隔的转录物上可被最好地表达。为达到这一点，个别分离每个微生物开放阅读框(ORF)，并在提供了开放阅读框5′末端的植物启动子序列和开放阅读框3′末端的植物转录终止子的表达盒内克隆。分离的开放阅读框序列优选地包括起始ATG密码子和终止STOP密码子，但可包括除起始ATG和STOP密码子之外的其它序列。另外，开放阅读框可被截短，但仍保留需要的活性；对特别长的开放阅读框，保留活性的截短形式可优选地用于在转基因生物中表达。
“植物启动子”和“植物转录终止子”意思是在植物细胞内有作用的启动子和转录终止子。这包括可从非植物来源如病毒(一个例子包括花椰菜花叶病毒或农杆菌Ti/Ri质粒的章鱼碱合酶基因)衍生的启动子和转录终止子。
在某些情况中，开放阅读框编码序列和相邻序列的修饰是不需要的，在这些情况中，足以分离包含目的开放阅读框的片段并将其插入植物启动子的下游。然而优选的，应尽可能少地留有或去除连接于ATG上游和STOP密码子下游的相邻微生物序列。实际中，这种结构依赖于限制位点的可用性。
其它情况中，衍生自微生物来源基因的表达可引起表达中的问题。这些问题在本领域中已经很好地表征，对特定来源如芽孢杆菌(Bacillus)衍生的基因尤为常见。这些基因的修饰可用本领域中众所周知的技术进行。以下问题是可能遇到的典型情况1.密码子使用植物中优选的密码子使用不同于特定微生物中优选的密码子使用。对比克隆的微生物开放阅读框内的密码子使用与植物基因中的使用(尤其是靶植物的基因)，将能鉴定开放阅读框内应优选地改变的密码子。一般植物进化趋向于单子叶植物的第三个碱基位置是核苷酸C和G的强烈偏好性，而双子叶植物在此位置经常使用核苷酸A或T。通过修饰基因以引入对特定靶转基因物种优选的密码子使用，可以克服许多以下描述的GC/AT含量和非常规剪接的问题。2.GC/AT含量植物基因一般具有多于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的开放阅读框序列在植物中能引起一些问题。首先，ATTTA的基元被认为导致信息的去稳定作用，并在许多短寿mRNA的3′末端被发现。其次，认为信息内不恰当的位置处聚腺苷酸化信号AATAAA的出现引起转录的提前截短。另外，单子叶植物可识别富含AT的序列作为剪接位点(见下)。3.与起始甲硫氨酸相邻的序列植物不同于微生物之处在于它们的信息没有确定的核糖体结合位点。更确切地，据信核糖体附着于信息的5′末端，并且扫描第一个可得到的ATG，在此开始翻译。然而，据信与ATG相邻的一定核苷酸有偏好性，并且可通过在ATG处包含真核共有翻译起始子增强微生物基因的表达。Ciontech(1993/1994目录，210页)建议序列GTCGACCATGGTC(SEQ IDNo8)作为在植物中表达大肠杆菌uidA基因的共有翻译起始子。另外，Joshi(NAR 156643-6653(1987))对比了许多与ATG相邻的植物序列，建议共有序列TAAACAATGGCT(SEQ ID No9)。在植物中表达微生物开放阅读框中遇到困难的情况下，在起始ATG处包含这些序列之一可改善翻译。在这些情况中，共有序列的最后三个核苷酸可能不适合包含在由于第二个AA残基的修饰引起的修饰过的序列中。与起始甲硫氨酸相邻的优选的序列在不同的植物种之间可以不同。对位于GenBank数据库中的14个玉米基因的调查提供了以下结果14个玉米基因中起始ATG之前的位点-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1C3846256010 7T3034321110A2314323723G6360654615
可对希望的待引入硫氧还蛋白基因的植物物种进行这种分析，并且修饰与ATG相邻的序列以引入优选的核苷酸。4.非正常剪接位点的去除从非植物来源克隆的基因和未对在植物中表达进行优化的基因也可能包含植物中识别为5′或3′剪接位点的基元，并被切割，因此产生截短的或缺失的信息。这些位点的去除可应用申请WO97/02352中描述的技术，在此引入作为参考。
编码序列和相邻序列的修饰技术为本领域周知。假使微生物开放阅读框的起始表达很低并且认为适合进行对上述序列的修饰，可根据本领域中众所周知的方法完成合成基因的构建。例如，描述于发表的专利公开EP0 385 962(Monsanto)，EP 0 359 472(Lubrizol)和WO93/07278(Ciba-Geigy)。在大多数例子中，优选地应用瞬时测定方案(在本领域中众所周知)测定基因构建体在转移至转基因植物之前的表达。
质体转化的主要优点是质体普遍能表达基本无修饰的细菌基因。不需要如上描述的密码子适应性改造等，并且质体能表达在单个启动子控制下的多个开放阅读框架。植物转化载体和选择性标记的构建多种转化载体可用于植物转化，本发明的基因可用于与这些载体中的任一个连接。所用载体的选择取决于优选转化技术和用于转化的目标物种。对某些靶物种，可优选不同的抗生素或除草剂筛选。通常用于转化的选择性标记包括nptII基因，其赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Viera&Messing，基因19259-268，(1982)；Bevan等，自然，304184-187(1983))，bar基因，其赋予对除草剂膦丝菌素的抗性(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，应用遗传学理论(Theor.Appl.Genet.)79625-631(1990))，hpt基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger&Dggelmam，分子细胞生物学42929-2931)，dhfr基因，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))，以及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，其赋予代谢甘露糖的能力，如US 5767378所述。构建植物表达盒的要求准备在转基因植物中表达的基因序列首先装配于位于合适的启动子之后并位于合适的转录终止子上游的表达盒中。这些表达盒然后可被容易地转移至上述的植物转化载体中。
1.启动子选择在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，此选择将反映硫氧还蛋白生物合成的希望的定位。本发明中，优选种子特异性启动子。另外，所选的启动子可在光诱导的或其它瞬时调节启动子之下驱动基因的表达。进一步的选择是所选的启动子可被外部刺激物，如应用特异的化学诱导剂或创伤诱导。这将提供仅当希望时才诱导硫氧还蛋白转录的可能性。
2.转录终止子多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责转基因和其正确的聚腺苷酸化之外的转录终止。合适的和已知在植物中起作用的转录终止子包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子。这些可用于单子叶植物和双子叶植物。
3.增强或调节表达的序列已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的基因结合使用以增强其在转基因植物中的表达。
已发现多种内含子序列能增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，发现当引入玉米细胞时，玉米Adhl基因的内含子显著增强位于同源启动子之下的野生型基因的表达。发现内含子1特别有效，且增强在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis等人，基因发育(GenesDevelep)11183-1200(1987))。在相同的实验系统中，玉米bronzel基因的内含子在增强表达上具有相似的效果。内含子序列已被常规引入植物转化载体，一般在非翻译前导序列中。
已知一定数量的由病毒衍生的非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植物细胞中尤其有效。特别是，烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达上已证明有效(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物学1565-79(1990))。
4.细胞内基因产物的定向已知植物中存在定向基因产物的多种机制，也已表征了控制这些机制作用的序列的一些细节。氨基末端序列负责定向于内质网、质外体以及从糊粉细胞的胞外分泌(Koehler和Ho，植物细胞2769-783(1990))。另外，氨基端序列联合羧基端序列负责基因产物的液泡导向(Shinshi等人，植物分子生物学14357-368(1990))。通过将以上描述的合适的定向序列与目的转基因序列融合，可能引导转基因产物至任何细胞器或细胞区室。所选的信号序列应该包含已知的切割位点，构建的融合体应考虑切割所需的切割位点之后的任何氨基酸。在某些情况中，可通过在切割位点与转基因ATG之间添加少量的氨基酸或替换转基因序列内的某些氨基酸来满足这一需要。
以上描述的细胞定向的机制不仅可与其同源启动子结合使用，而且可与异源启动子结合使用，从而实现启动子转录调节下的特异的细胞定向目的，此启动子具有与衍生定向信号的启动子不同的表达模式。表达盒构建的实施例本发明包括任何在植物中可表达的启动子调节之下的硫氧还蛋白基因的表达，而不论启动子的来源如何。
此外本发明包括任何植物可表达的启动子与任何硫氧还蛋白基因表达所需要或选择的其它序列的联合使用。这些序列包括但不限于，转录终止子、增强表达的外部序列(如内含子[如Adh内含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])、以及意在将基因产物定向于特定细胞器和细胞区室的序列。
可使用多种化学调节剂以诱导在根据本发明转化的植物中表达硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶编码序列。在本公开内容的上下文中，“化学调节剂”包括已知在植物中是PR-1a启动子的诱导物的化学试剂(述于US 5，614，395)，或其相关的衍生物。用于本发明的化学可诱导硫氧还蛋白基因的一组优选的调节剂基于苯并-1，2，3-噻二唑(BTH)结构，包括但不限于以下类型的化合物苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑硫代羧酸、氰苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-羧酸胺、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰肼、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰苯-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸胺、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸酰肼、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸烷基酯，其中烷基包含一至六个碳原子、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸正丙基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸苄基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸仲丁基酰肼，及其合适的衍生物。其它化学诱导型物包括，例如，苯甲酸、水杨酸(SA)、聚丙烯酸及其取代的衍生物；合适的取代基包括低级烷基、低级烷氧基、低级硫代烷基和卤素。用于本发明的化学可诱导DNA序列的另一组调节剂基于吡啶羧酸结构，如异烟酸结构，优选地是卤代异烟酸结构。优选的是二氯异烟酸及其衍生物，如低级烷基酯。此类化合物的合适的调节剂是如，2，6-二氯异烟酸(INA)及其低级烷基酯，尤其是甲酯。
组成型表达肌动蛋白启动子已知肌动蛋白的几个同工型在大多数细胞型中表达，因此肌动蛋白启动子是用作组成型启动子适当选择。尤其是，稻ActI基因的启动子已被克隆和表征(McElroy等人，植物细胞2163-171(1990))。发现此启动子的1.3kb片段包含水稻原生质体中表达所需的所有调节元件。此外，已构建了许多基于Actl启动子特异地用于单子叶植物的表达载体(McElroy等人，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)231150-160(1991))。它们引入了Actl-内含子1、Adhl 5′侧翼序列和(玉米醇脱氢酶基因的)Adhl-内含子1和CaMV35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Actl内含子或Actl 5′侧翼序列和Actl内含予的融合体。(GUS告基因的)起始ATG附近序列的优化也增强表达。McElroy等人(分子基因遗传学231150-160(1991))描述的启动子表达盒可被方便地修饰以用于硫氧还蛋白基因的表达，并且尤其适用于单子叶植物宿主中。例如，包含该片段的启动子可从McElroy结构中去除，用来替换pCGN1761ENX中的双35S启动子，然后该载体可用于特异基因序列的插入。然后可将构建的融合基因转移至合适的转化载体。在单独的报道中，也发现带有第一个内含子的水稻Actl启动子引导了在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等人，植物细胞报道(Plant CellRep.)12506-509(1993))。
组成型表达遍在蛋白启动子遍在蛋白是已知在许多细胞型中积累的另一种基因产物，它的启动子已从几个物种克隆，在转基因植物中使用(如向日葵-Binet等人，植物科学7987-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物学12619-632(1989))。玉米遍在蛋白已在转基因单子叶系统中加以研究，并且其序列和为单子叶植物转化构建的载体公开于专利公开文本EP 0 342 926中。进一步，Taylor等人(植物细胞报道12491-495(1993))描述了一种载体(pAHC25)，它包含玉米遍在蛋白启动子和第一个内含子，以及经微粒轰击引入时其在许多单子叶植物细胞悬液中的高活性。遍在蛋白启动子适于在转基因植物尤其是单子叶植物中表达硫氧还蛋白基因。合适的载体是pAHC25的衍生物或本申请中描述的通过引入合适的遍在蛋白启动子和/或内含子序列被修饰的任何转化载体。
根特异的表达本发明的表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的另一个模式是根表达，例如，从根作物如甜菜和马铃著中增加提取淀粉和糖。一种合适的根启动子由de Framond所描述(FEBS 290103-106(1991))，也在公开的专利申请EP 0 452 269中描述。此启动子被转移至合适的载体如pCGN1761ENX，以用于插入硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因及随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体。
创伤诱导型启动子创伤诱导型启动子也适用于硫氧还蛋白基因的表达。许多这种启动子已被描述(如Xu等人，植物分子生物学22573-588(1993)，Logemann等人，植物细胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22783-792(1993)，Firek等人，植物分子生物学22129-142(1993)，Warner等人，植物杂志(Plant J.)3191-201(1993))，并且均都适用于本发明。Logemann等人描述了双子叶马铃薯Wunl基因的5′上游序列。Xu等人显示双子叶植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中有活性。进一步，Rohrmeier和Lehle描述了创伤诱导型的且可用于使用标准技术分离同源启动子的玉米Wipl cDNA的克隆。相似地，Firek等人和Warner等人描述了单子叶植物药用芦笋(Asparagus officinalis)的创伤诱导型基因，它在局部创伤和病原体侵入部位表达。使用本领域众所周知的克隆技术，可将这些启动子转移至合适的载体，与本发明的硫氧还蛋白基因融合，并用来在植物创伤部位表达这些基因。
叶绿体定向的表达Chen和Jagend开放阅读框(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2682363-2367(1993))已描述了成功应用叶绿体转运肽来输入异源转基因。所使用的肽是烟草Nicotiana plumbaginifolia的rbcS基因的转运肽(Poulsen等人，分子基因遗传学205193-200(1986))。使用限制酶DraI和SphI，或Tsp509I和SphI，编码此转运肽的DNA序列可被从质粒prbcS-8B上切下并经操作以与如上描述的任何结构一起使用。DraI-SphI片段从相对于起始rbcS ATG的-58延伸至，并且包括，紧接输入切割位点之后的成熟肽的第一个氨基酸(也是甲硫氨酸)，而Tsp509I-SphI片段从相对于起始rbcS ATG的-8延伸至，并且包括，成熟肽的第一个氨基酸。因此，可将这些片段适当地插入任何所选的表达盒的多接头，产生与所选启动子(如35S，PR-1a、肌动蛋白、遍在蛋白等)的非翻译前导序列融合的转录融合基因，而能使硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因插入转运肽下游的正确的融合基因。双子叶植物的转化用于双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的运输、或显微注射来完成。这些技术的实例描述于Paszkowski等人，欧洲分子生物学会杂志EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykus等人，分子基因遗传学199169-177(1985)，Reich等人，生物技术41001-1004(1986)，以及Klein等人，自然32770-73(1987)。在每个例子中，应用本领域中已知的标准技术将转化的细胞再生为整个植物。
以其高转化效率和对许多不同种的广泛应用，农杆菌介导的转化是用于转化双子叶植物的优选的技术。用农杆菌常规转化的许多作物品种包括烟草、西红柿、向日葵、棉花、油籽油菜、葡萄、马铃薯、大豆、苜蓿和白杨(EP 0 317 511(棉花)，EP 0 249 432(西红柿)，WO87/07299(Brassica)，US 4，795，855(白杨))。农杆菌转化一般包括将携带目的外源DNA的二元载体(如pCIB200或pCIB2001)转移至合适的农杆菌菌株，这依赖于在共生Ti质粒上或染色体上由宿主农杆菌菌株携带的vir基因的完整性(如用于pCIB200和pCIB2001的CIB542株(Uknes等人，植物细胞5159-169(1993))。重组二元载体向农杆菌的转移通过三亲本交配方法完成，使用携带重组二元载体的大肠杆菌、携带质粒如pRK2013并能将重组二元载体转移至靶农杆菌株的辅助大肠杆菌菌株。另外，可通过DNA转化将重组二元载体转移至农杆菌(Hofgen和Willmitzer，核酸研究169877(1988))。
通过重组农杆菌转化靶植物种通常包括农杆菌与植物外植体的共培育，且依照在本领域众所周知的方案。转化的组织在带有在二元质粒T-DNA边界之间存在的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上再生。也可利用粒子轰击(biolistics)进行双子叶植物转化。对于大豆转化优选的方法见US 5024944。单子叶植物的转化大多数单子叶植物种类的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术直接将基因转移至原生质体，以及使用粒子轰击转移至愈伤组织。可用单种DNA或多种DNA(即共转化)进行转化，这些方法都适用于本发明。共转化的优点是避免了复杂的载体构建，以及产生具有目的基因和选择性标记的非连锁基因座的转基因植物，如果希望能在随后的子代中去除选择性标记的话。然而，使用共转化的一个缺点是分开的DNA种类整合入基因组的频率低于100％(Schocher等人，生物技术41093-1096(1986))。
专利申请EP 0 292 435([1280/1281]，Ciba-Geigy)、EP 0 392 225(CibaGeigy)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)描述了从玉米的一个优良近交系制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等人(植物细胞2603-618(1990))和Fromm等人(生物技术8833-839(1990))发表了使用粒子轰击转化A188-衍生的玉米株系的技术。此外，申请WO 93/07278(Ciba-Geigy)和Koziel等人(生物技术11194-200(1993))描述了经粒子轰击转化玉米的优良近交系的技术。此技术使用1.5-2.5mm长的未成熟的玉米胚，它是传粉后14-15天从玉米穗上切下的，并且使用PDS-1000He Biolistics装置用于轰击。
进行水稻的转化也可使用应用原生质体和粒子轰击的直接基因转移技术。用于Japonica-型和lndica-型的原生质体介导的转化已有描述(Zhang等人，植物细胞报道7379-384(1988)；Shimamoto等人，自然338274-277(1989)；Datta等人，生物技术8736-740(1990))。使用粒子轰击均可常规转化这两个类型(Christou等人，生物技术9957-962(1991))。
专利申请EP 0 332 581(Ciba-Geigy)描述了Pooideae原生质体的产生、转化和再生的技术。这些技术允许鸭茅属(Dactylis)和小麦的转化。而且，Vasil等人(生物技术10667-674(1992))描述了应用粒子轰击转入C型长期可再生愈伤组织细胞的小麦转化，Vasil等人(生物技术111553-1558(1993))和Weeks等人(植物生理1021077-1084(1993))也描述了应用粒子轰击未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织的小麦转化。然而，一个优选的用于小麦转化的技术，包括通过粒子轰击未成熟胚转化小麦，并包括基因输运前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。轰击前，任何数量的胚(长0.75-1mm)置于含3％蔗糖和3mg/12，4-D的MS培养基上(Murashiga和Skoog，Physiologia Plantarum 15473-497(1962))，用于可在暗处进行的体细胞胚的诱导。在选定的轰击日，从诱导培养基上移出胚，将其置于渗压剂上(即以希望的浓度一般是15％，添加了蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。将胚质壁分离2-3小时，然后轰击。一般是每个靶平板二十个胚，尽管不是关键的。用标准方法沉淀合适的携带基因的质粒(如pCIB3064或pSG35)于微米尺寸的金粒子上。每个胚平板用DuPont Biolistics氦装置轰击且用约1000psi的爆发压力，使用标准的80目的筛子。轰击后，将胚放回暗处回复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂中移出胚，将其放回诱导培养基，在再生之前放置约一个月。大约一个月后，将含发育的胚发生愈伤组织的胚外植体转移至再生培养基(MS+1mg/lNAA，5mg/lGA)，它另外包含适当的选择试剂(在pCIB3064的情况中是10mg/lbasta，在pSOG35的情况中是2mg/l氨甲喋呤)。约一个月后，将发育的苗转移至更大的被称为“GA7”无菌容器中，它含有半强度的MS、2％蔗糖和相同浓度的选择试剂。专利申请WO94/13822描述了小麦转化的方法，在此引入作为参考。质体转化质体转化技术在美国专利5,451,513、5,545,817和5,545,818中有广泛的描述，它们都由此明确地全面引入作为参考；在PCT申请WO95/16783号中有描述，由此全面引入作为参考；并在McBride等人(1994)美国国家科学院学报917301-7305中有描述，也在此全面引入作为参考。叶绿体转化的基本技术包括将侧翼为选择性标记的克隆的质体DNA区与目的基因一起引入合适的靶组织，如使用biolistics或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)。1到1.5kb的侧翼区，称为定向序列，方便了与质体基因组的同源重组，并且因此允许质体基因组特定区的替换或修饰。最初，叶绿体16S rRNA和赋予壮观霉素和/或链霉素的抗性的rps12基因中的点突变被用作转化的选择性标记(Svab，乙，Hajdukiewicz，P.，和Maliga，P.(1990)美国国家科学院学报878526-8530，在此引入作为参考；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物细胞4，39-45，在此引入作为参考)。这导致了稳定的同胞质转化体，其频率是每100次轰击靶叶大约产生一个转化体。这些标记间克隆位点的存在允许用于引入外源基因质体定向载体的产生(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)欧洲分子生物学会杂志12，601-606，在此引入作为参考)。获得转化频率的实质增加的方法是将隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替换为显性选择标记，编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷转移酶的细菌aadA基因(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美国国家科学院学报90，913-917，在此引入作为参考)。以前，这个标记已成功用于绿藻Chlamydomonas reinhardtii衣藻质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究19，4083-4089，在此引入作为参考)。用于质体转化的其它选择性标记在本领域中已知，并包括于本发明的范围中。一般，转化后需要大约15-20个细胞分裂周期来达到同质体状态。
通过同源重组，将基因插入每个植物细胞存在的环形质体基因组的所有几千个拷贝中的质体表达，利用优于核表达的基因的许多拷贝数使表达水平能轻易超过总可溶植物蛋白的10％。然而，这种高表达水平可造成潜在的存活问题，尤其是在植物生长和发育早期。表达对转基因植物的生存高度有害的生物活性酶或某些蛋白质也造成相似的问题，因为如果组成型地表达可能使其无法成功引入植物基因组。因此，一个方面，本发明把化学诱导型的烟草PR-1a启动子(US 5,614,395引入作为参考)控制下在核基因组中叶绿体定向噬菌体T7 RNA聚合酶的表达与T7基因10启动子/终止子序列调节的叶绿体报告转基因结合在一起。例如，当对于母体遗传的编码β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因的uidA基因同胞质的质体转化体被在细胞核中表达T7聚合酶的株系传粉时，获得携带两个转基因构建体但不表达GUS蛋白的F1植物。仅在对叶使用PR-1a诱导化合物苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)以后，才在这些植物的质体中引发大量酶活化的GUS的合成。序列表中的序列的简要描述SEQ ID NO1来自詹氏甲烷球菌的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO2来自闪烁古生球菌(trx-1)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO3来自闪烁古生球菌(trx-2)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO4来自闪烁古生球菌(trx-3)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO5来自闪烁古生球菌(trx-4)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO6来自詹氏甲烷球菌(trxB)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO7来自闪烁古生球菌(trxB)的硫氧还蛋白之蛋白质序列。
SEQ ID NO8 Clontech序列SEQ ID NO9 Joshi序列此处利用的标准重组DNA及分子克隆技术为本领域周知，例如，Sambrook等人，(1989)分子克隆，和Ausubel等人，(1994)当代分子生物学方法。实施例1用热稳定的硫氧还蛋白转化玉米表达来自詹氏甲烷球菌的热稳定的硫氧还蛋白基因具有如下序列MSKVKIELFTSPMCPHCPAAKRVVEEVANEMPDAVEVEYINVMENPQKAMEYGIMAVPTIVINGDVEFIGAPTKEALVEAIKKRL(SEQ ID NO1)
其是通过利用如美国专利5625136所述的玉米偏好密码子在种子特异性γ-玉米醇溶蛋白启动子控制下，且利用掺入在质粒pGIGUP的T-DNA边界之间的表达盒制备。该质粒的T-DNA边界含有由遍在蛋白质启动子驱动的植物可表达的bar基因以提供对膦丝菌素的抗性(Christensen等人，植物分子生物学杂志，18875-689，1992)。其还含有在编码序列N-末端密码子中的带有内含子的GUS基因β-葡糖醛酸酶，所述编码序列由来自章鱼氨酸及甘露氨酸合酶基因的嵌合启动子(SMAS)驱动(在带有甘露氨酸合酶基因结构域的活性序列上游的章鱼氨酸启动子的三聚体，Ni等人，植物杂志，7661-676，1995)。该内含子-GUS基因在植物细胞中表达GUS活性，但是在农杆菌(Agrobacterium)中不表达。另外，将来自詹氏甲烷球菌的热稳定的硫氧还蛋白克隆入质粒pNOV117，其含有由玉米遍在蛋白质启动子驱动的植物可表达的pmi基因，用于在甘露糖上筛选(Christensen等人，1992，Joersbo等人，1998)。
在这些实验中利用了根瘤农杆菌(A.Tumefaciens)LBA4404(pAL4404，pSB1)。pAIA404是一种卸甲(disarmed)辅助质粒。pSB1是一种宽宿主范围的质粒，其含有与pGIGUP和pNOV117同源的区域，和一个来自pTiBo542的侵入区的15.2kb KpnI片段(Ishida等人，1996；根瘤农杆菌介导的玉米的高效转化(Zea mays L.)，自然杂志生物技术分册，14，745-750)。利用电穿孔将质粒pGIGUP或pNOV117导入LBA4404(pAL4404，pSB1)，得到pGIGUP或pNOV117和pSB1的共整合。pNOV117的T-DNA含有由遍在蛋白质启动子驱动的甘露糖-6-磷酸异构酶基因(提供代谢甘露糖的能力)和上述的硫氧还蛋白基因。
农杆菌在补加了50mg/l壮观霉素和10mg/l四环素的YP培养基上生长3天(5g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，5g/lNaCl，15g/l琼脂，pH6.8)。用接种环收集细菌，并以密度范围109至5109个细胞/ml悬浮于N6液体培养基中。也可从YP培养基的过夜培养物中收集农杆菌细胞，并悬浮于N6液体培养基中。对于1升培养基，加入4g粉状N6盐(Sigma，St.Louis，MO)，30g蔗糖，100mg肌醇，2mg甘氨酸，1mg硫胺素，0.5mg pyrodoxine HCL，0.5mg烟酸，2mg 2，4-D(来自母液[1mg/mL]，在稀KOH中溶解2，4-D制得)。用lMKOH调节至pH6.0，加入3gGelrite，蒸汽灭菌。
自花授粉后约10-14天获得未成熟的玉米胚。将未成熟的合子胚以每板约25个未成熟胚的量分配到不同板中，板中含有能诱导和支持生胚愈伤组织形成的培养基。
将未成熟的胚接与含包括一种选择性标记物基因之Ti质粒的农杆菌种入板上，或接种入液体中。在接种农杆菌之前或接种后立即将未成熟胚铺板于含有硝酸银(10mg/l)的愈伤组织初始培养基中。每板上约放置25个未成熟胚。接种后16-72小时，将未成熟胚转移到含有硝酸银和头孢氨噻的愈伤组织初始培养基中。如下进行转化细胞的筛选利用甘露糖体外选择转化细胞。筛选可应用低至1g/L，在接种后2-20天并维持总共2-12周。如此获得的生胚愈伤组织在有或没有甘露糖存在下于标准再生培养基上再生。所有植物均用氯酚红(CR)测试对甘露糖的耐受。该试验利用了pH敏感指示剂染料显示在甘露糖存在下生长的细胞。生长的细胞在培养基中产生pH改变，其将指示剂氯酚红(CR)由红变黄。表达对甘露糖耐受的植物在此试验中可方便地鉴别。CR试验阳性的植物通过PCR鉴定甘露糖基因的存在与否。对于PCR试验阳性的植物利用Southern印迹分析。分析再生植物中硫氧还蛋白的表达。所述植物发育正常。在小规模湿磨法加工中分析鉴定了来自高表达植物的子代植物玉米谷物，与没有硫氧还蛋白转基因的相同基因型的玉米相比，测量了淀粉可提取性。表达硫氧还蛋白基因的玉米显示了比同种型非转化玉米明显较高的湿磨法加工之淀粉可得性。实施例2用热稳定的硫氧还蛋白及硫氧还蛋白还原酶转化玉米利用实施例1中所述的步骤，将玉米用如上述来自M.jannaschii的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶共转化。两个基因均在种子特异性的γ玉米醇溶蛋白启动子控制下。两个基因相连且位于pGIGUP或pNOV117的左和右边界之间，以增强两个基因作为单一插入片段掺入植物基因组中的可能性。
鉴定再生的植物是否表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。所述植物发育正常。在小规模湿磨法加工中分析鉴定了来自高表达植物的子代植物玉米谷物，与没有硫氧还蛋白转基因的相同基因型的玉米相比，测量了淀粉可提取性。表达硫氧还蛋白基因的玉米显示了比同种型非转化玉米明显较高的湿磨法加工之淀粉可得性。
序列表<110>Novartis AG<120>硫氧还蛋白及谷物加工<130>S-30758/A<140>09/213.208<141>1998年12月17日<160>9<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>85<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>1Met Ser Lys Val Lys Ile Glu Leu Phe Thr Ser Pro Met Cys Pro His1 5 10 15Cys Pro Ala Ala Lys Arg Val Val Glu Glu Val Ala Asn Glu Met Pro20 25 30Asp Ala Val Glu Val Glu Tyr Ile Asn Val Met Glu Asn Pro Gln Lys35 40 45Ala Met Glu Tyr Gly Ile Met Ala Val Pro Thr Ile Val Ile Asn Gly50 55 60Asp Val Glu Phe Ile Gly Ala Pro Thr Lys Glu Ala Leu Val Glu Ala65 70 75 80Ile Lys Lys Arg Leu85<210>2<211>119<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>2Met Pro Met Val Arg Lys Ala Ala Phe Tyr Ala Ile Ala Val Ile Ser1 5 10 15Gly Val Leu Ala Ala Val Val Gly Asn Ala Leu Tyr His Asn Phe Asn20 25 30Ser Asp Leu Gly Ala Gln Ala Lys Ile Tyr Phe Phe Tyr Ser Asp Ser35 40 45Cys Pro His Cys Arg Glu Val Lys Pro Tyr Val Glu Glu Phe Ala Lys50 55 60Thr His Asn Leu Thr Trp Cys Asn Val Ala Glu Met Asp Ala Asn Cys65 70 75 80Ser Lys Ile Ala Gln Glu Phe Gly Ile Lys Tyr Val Pro Thr Leu Val85 90 95Ile Met Asp Glu Glu Ala His Val Phe Val Gly Ser Asp Glu Val Arg100 105 110Thr Ala Ile Glu Gly Met Lys115<210>3<211>93<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>3Met Val Phe Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Tyr Cys Arg Ala Phe Glu Lys1 5 10 15Val Val Glu Arg Leu Met Gly Glu Leu Asn Gly Thr Val Glu Phe Glu20 25 30Val Val Asp Val Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Val35 40 45Leu Met Leu Pro Thr Leu Val Leu Ala Asp Gly Asp Glu Val Leu Gly50 55 60Gly Phe Met Gly Phe Ala Asp Tyr Lys Thr Ala Arg Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Glu Gln Ile Set Ala Phe Leu Lys Pro Asp Tyr Lys Asn85 90<210>4<211>134<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>4Met Asp Glu Leu Glu Leu IleArg Gln Lys Lys Leu Lys Glu Met Met1 5 10 15Gln Lys Met Ser Gly Glu Glu Lys Ala Arg Lys Val Leu Asp Ser Pro20 25 30Val Lys Leu Asn Ser Ser Asn Phe Asp Glu Thr Leu Lys Asn Asn Glu35 40 45Asn Val Val Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Met Pro Cys Lys Met50 55 60Ile Ala Pro Val Ile Glu Glu Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Lys Val65 70 75 80Val Phe Gly Lys Leu Asn Thr Asp Glu Asn Pro Thr Ile Ala Ala Arg85 90 95Tyr Gly Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ile Phe Phe Lys Lys Gly Lys100 105 110Pro Val Asp Gln Leu Val Gly Ala Met Pro Lys Ser Glu Leu Lys Arg115 120 125Trp Val Gln Arg Asn Leu130<210>5<211>105<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>5Met Glu Arg Leu Asn Ser Glu Arg Phe Arg Glu Val Ile Gln Ser Asp1 5 10 15Lys Leu Val Val Val Asp Phe Tyr Ala Asp Trp Cys Met Pro Cys Arg20 25 30Tyr Ile Ser Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asn Gly Glu35 40 45Val Glu Phe Tyr Lys Leu Asn Val Asp Glu Asn Gln Asp Val Ala Phe50 55 60Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Pro Thr Val Leu Phe Phe Arg Asn Gly65 70 75 80Lys Val Val Gly Gly Phe Ile Gly Ala Met Pro Glu Ser Ala Val Arg85 90 95Ala Glu Ile Glu Lys Ala Leu Gly Ala100 105<210>6<211>301<212>PRT<213>詹氏甲烷球菌<400>6Met Ile His Asp Ihr Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Gly Gly Leu Thr1 5 10 15Ala Gly Ile Tyr Ala Met Arg Gly Lys Leu Asn Ala Leu Cys Ile Glu20 25 30Lys Glu Asn Ala Gly Gly Arg Ile Ala Glu Ala Gly Ile Val Glu Asn35 40 45Tyr Pro Gly Phe Glu Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala Glu Lys Phe50 55 60Lys Asn His Ala Glu Lys Phe Lys Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Glu Val65 70 75 80Ile Lys Ile Glu Thr Lys Glu Arg Pro Phe Lys Val Ile Thr Lys Asn85 90 95Ser Glu Tyr Leu Thr Lys Thr Ile Val Ile Ala Thr Gly Thr Lys Pro100 105 110Lys Lys Leu Gly Leu Asn Glu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Gly Ile Ser115 120 125Tyr Cys Thr Met Cys Asp Ala Phe Phe Tyr Leu Asn Lys Glu Val Ile130 135 140Val Ile Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Asn Leu Lys145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Lys Val Ile Val Ile Thr Asp Lys Ser Glu Leu Lys165 170 175Ala Ala Glu Ser Ile Met Leu Asp Lys Leu Lys Glu Ala Asn Asn Val180 185 190Glu Ile Ile Tyr Asn Ala Lys Pro Leu Glu Ile Val Gly Glu Glu Arg195 200 205Ala Glu Gly Val Lys Ile Ser Val Asn Gly Lys Glu Glu Ile Ile Lys210 215 220Ala Asp Gly Ile Phe Ile Ser Leu Gly His Val Pro Asn Thr Glu Phe225 230 235 240Leu Lys Asp Ser Gly Ile Glu Leu Asp Lys Lys Gly Phe Ile Lys Thr245 250 255Asp Glu Asn Cys Arg Thr Asn Ile Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp260 265 270Val Arg Gly Gly Val Met Gln Val Ala Lys Ala Val Gly Asp Gly Cys275 280 285Val Ala Met Ala Asn Ile Ile Lys Tyr Leu Gln Lys Leu290 295 300<210>7<211>300<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>7Met Tyr Asp Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ala1 5 10 15Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Tyr Gly Leu Lys Thr Val Phe Phe Glu Thr20 25 30Val Asp Pro Val Ser Gln Leu Ser Leu Ala Ala Lys Ile Glu Asn Tyr35 40 45Pro Gly Phe Glu Gly Ser Gly Met Glu Leu Leu Glu Lys Met Lys Glu50 55 60Gln Ala Val Lys Ala Gly Ala Glu Trp Lys Leu Glu Lys Val Glu Arg65 70 75 80Val Glu Arg Asn Gly Glu Thr Phe Thr Val Ile Ala Glu Gly Gly Glu85 90 95Tyr Glu Ala Lys Ala Ile Ile Val Ala Thr Gly Gly Lys His Lys Glu100 105 110Ala Gly Ile Glu Gly Glu Ser Ala Phe Ile Gly Arg Gly Val Ser Tyr115 120 125Cys Ala Thr Cys Asp Gly Asn Phe Phe Arg Gly Lys Lys Val Ile Val130 135 140Tyr Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ile Glu Asp Ala Ile Tyr Leu His Asp145 150 155 160Ile Gly Cys Glu Val Thr Ile Val Ser Arg Thr Pro Ser Phe Arg Ala165 170 175Glu Lys Ala Leu Val Glu Glu Val Glu Lys Arg Gly Ile Pro Val His180 185 190Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Lys Ile Ile Gly Ser Gly Lys Val Glu Lys195 200 205Val Val Ala Tyr Asn Arg Glu Lys Lys Glu Glu Phe Glu Ile Glu Ala210 215 220Asp Gly Ile Phe Val Ala Ile Gly Met Arg Pro Ala Thr Asp Val Val225 230 235 240Ala Glu Leu Gly Val Glu Arg Asp Ser Met Gly Tyr Ile Lys Val Asp245 250 255Lys Glu Gln Arg Thr Asn Val Glu Gly Val Phe Ala Ala Gly Asp Cys260 265 270Cys Asp Asn Pro Leu Lys Gln Val Val Thr Ala Cys Gly Asp Gly Ala275 280 285Val Ala Ala Tyr Ser Ala Tyr Lys Tyr Leu Thr Ser290 295 300<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8gtcgaccatg gtc 13<210>9<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9taaacaatgg ct1权利要求
1.一种在谷物制粉方法中增加淀粉和蛋白质分离效率的方法，包括在补加的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶存在下于高温中浸渍谷物，以及分离谷物的蛋白质和淀粉成分的步骤。
2.权利要求1的方法，其中谷物包括来自转基因植物的谷物，其中转基因表达硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶。
3.权利要求2的方法，其中植物选自玉米(Zea mays)和大豆。
4.一种包含编码硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的异源DNA序列的植物，所述DNA序列稳定地整合入植物的核或质体DNA。
5.权利要求4的植物，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是热稳定的。
6.权利要求5的植物，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
7.权利要求4-6中任一项的植物，其中植物选自玉米和大豆。
8.一种植物可表达的表达盒，其含有与在植物中有功能的启动子和终止子序列有效连接的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶编码区。
9.权利要求8的植物可表达的表达盒，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶是热稳定的。
10.权利要求9的植物可表达的表达盒，其中硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
11.一种制备包含高水平的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，包括用权利要求8-10中的表达盒转化植物。
12.一种制备包含高水平的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的谷物的方法，包括给含有异源表达盒的第一种植物用含有异源表达盒的来自第二种植物的花粉授粉，其中所述第一种植物中的表达盒含有反式激活蛋白调节的启动子，其调节且与编码硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的DNA序列有效连接，第二种植物中的表达盒含有与编码反式激活蛋白的DNA序列有效连接的启动子，所述反式激活蛋白能调节该反式激活蛋白调节的启动子；该方法还包含从如此授粉的植物中回收谷物。
13.根据权利要求4-7中任一项的植物或植物材料作为动物饲料的用途。
全文摘要
本发明提供了加工谷物,特别是玉米和大豆的新方法,其利用硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶以增强淀粉和蛋白质的可提取性和回收。本发明还提供了表达热稳定的硫氧还蛋白和/或硫氧还蛋白还原酶的转基因植物。
文档编号C12N9/02GK1330720SQ99814535
公开日2002年1月9日 申请日期1999年12月15日 优先权日1998年12月17日
发明者M·B·拉纳汉 申请人:辛根塔参与股份公司