一种四联益生菌制剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种四联益生菌制剂及应用，属于保健食品/药品技术领域。 技术背景
[0002] 益生菌是指能够改善宿主肠道菌群生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活 菌制剂及其代谢产物。益生菌是获得微生物，当摄入足够数量时，对宿主起有益健康作用。 因此，益生菌在工业、农业、医药、食品和饲料等与人类生活密切相关的重要领域中应用价 值很高。近年来，国内外研制出多种益生菌活菌制剂，其基本指导思想就是用人或动物的正 常生理菌群的菌株，经过筛选和培养，通过各种途径，制成各种剂型的活菌制剂，然后再以 投入方式使其回到原来环境，从而发挥其自然的生理作用。我国对益生菌用于保健食品和 药品的研宄起步较晚，20世纪90年代才开始将双歧杆菌用于各种保健食品中。目前市场上 出现的益生菌保健产品剂型大致分为三类，即胶囊剂，如美常安、聚克、整肠生、贝飞达、丽 珠肠乐等；颗粒剂和散剂，如妈咪爱、培菲康、常乐康等；片剂，如促菌生、金双歧、思连康、 乳酸菌素等。
[0003] 双歧杆菌和乳杆菌是人们研宄最多的两种益生菌。双歧杆菌是健康人体肠道内定 植数量占优势的一类菌群。人们已对双歧杆菌对人体肠道菌群的调节功效进行了大量研 宄。研宄表明，高水平的适宜双歧杆菌在肠道通常可以阻止病原体的致病作用，从而可以纠 正肠道菌群失调引起的腹泻。乳杆菌同样也被广泛地用于调节人体肠道菌群、改善肠道功 能的研宄。尽管人们已经广泛的研宄了益生菌，但是在应用方面，大多数都是通过单株、双 珠或者最多三株益生菌联用，例如整肠生为单一的地衣芽孢杆菌单一菌剂；妈咪爱为屎肠 球菌和枯草杆菌二联菌制剂；培菲康为双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌三联菌制剂；很少有 超过四种种，产品的使用范围比较狭窄，不能适应更广泛的人群的不同肠道特征，大大限制 了益生菌的应用。另外，双歧杆菌和一些菌株都是专性厌氧菌，它们在肠道内定植需要一个 缺氧环境，而人体肠道是一个微需氧环境，所以上述的一些杆菌在肠道内定植有困难，因此 菌种在肠道内存活性不好，停留时间短，容易排出，使得制剂的疗效受到影响。再者利用双 歧杆菌等制备的微生态制剂的疗效主要依靠制品中功能菌的存在，因为双歧杆菌是专性厌 氧菌，对空气和温度十分敏感，菌种在生产、运输和保存过程中容易失活。为了使产品中的 活菌数保持一定的活菌数，国内外的研宄者在微生物高密度培养、优化冻干保护剂、微胶囊 技术、多层包埋技术以及在产品中添加抗氧化因子等方面做了大量的研宄。但从目前市场 上销售的微生态制剂产品来看，大多数含有双歧杆菌的产品都没有解决常温保存的问题。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种四联益生菌制剂，所采取的技术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种四联益生菌制剂，该制剂中菌粉占产品的重量百分比 为：
[0006] 动物双歧杆菌菌粉3. 0 % -8. 0 %，
[0007] 干酪乳杆菌菌粉3. 0 % -8. 0 %，
[0008]粪肠球菌菌粉0? 5 % -2. 0 %，
[0009]蜡样芽孢杆菌菌粉0? 1 % -0? 5 %，
[0010] 其他组分为辅料；
[0011] 其中，所述动物动物双歧杆菌菌种保藏号为CGMCC No. 4521，分类命名为 Bifidobacterium animalis，保藏地点为中国科学院微生物研宄所普通微生物中心，保藏 日期为2010年12月29日，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心；
[0012] 所述干酪乳杆菌菌种保藏号为CGMCC No. 4520,分类命名为Lactobacillus casei，保藏地点为中国科学院微生物研宄所普通微生物中心，保藏日期为2010年12月29 日，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0013] 所述粪肠球菌菌种保藏号为CGMCC0460. 3,保藏地点为中国科学院微生物研宄所 普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日；
[0014] 所述蜡样芽孢杆菌菌种保藏号为CGMCC0460. 4,保藏地点为中国科学院微生物研 宄所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日。
[0015] 其中，粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌已公开。
[0016] 所述动物双歧杆菌，对喹诺酮类、氨基糖苷类和单环0 _内酰胺类抗生素具有耐 受性；所述干酪乳杆菌对糖肽类、单环内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受 性。
[0017] 所述辅料为填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂和/或营养强化剂。
[0018] 所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、三硅酸镁和/或氢氧化铝。
[0019] 所述矫味剂为乳糖和蔗糖；所述崩解剂为淀粉；所述粘合剂为蔗糖；所述抗酸剂 为三硅酸镁和氢氧化铝；所述润滑剂为滑石粉；所述营养强化剂包括维生素、矿物质、益生 元和/或膳食纤维。
[0020] 所述辅料占产品的重量百分比为：
[0021] 淀粉 8%-30%，
[0022] 乳糖 5 %-20%，
[0023] 微晶纤维素10%-50%，
[0024] 蔗糖 10%-30%，
[0025] 三硅酸镁 5 %-15%，
[0026] 氢氧化铝1 %-5%，
[0027] 滑石粉 5%-20%。
[0028] 所述菌剂的剂型为片剂、散剂或胶囊。
[0029] 一种所述菌剂的制备方法，步骤如下：
[0030] 1)原辅料预处理；分别将原辅料过50-200目筛；
[0031] 2)混合制备；将蔗糖粉与淀粉共同过50目筛后加入批混机，再将剩余辅料依次 加入批混机内，最后加入混合菌粉，四种冻干菌粉与辅料在混匀机中混合50分钟结束后放 料；
[0032] 3)成型：将步骤2)混合后的样品进行成型处理，包装后获得成品。
[0033] 所述菌剂每克菌剂含有动物双歧杆菌活菌数和干酪乳杆菌菌数在1 x 108CFU以 上，粪肠球菌活菌数在1 x 107CFU以上，蜡样芽胞杆菌活菌数在1 x 106CFU以上。
[0034] 所述菌剂在食品工业、制药工业中应用。
[0035] 本发明有益效果：
[0036] 1.本发明制备的益生菌制剂富含四种益生菌和多种益生元，能够促进益生菌在人 体内的增殖，调节人体肠道菌群，有益于人体健康。本发明制备的四联益生菌活菌制剂能够 促进益生菌在人体内的增殖，调节人体肠道菌群，有益于人体健康。
[0037] 2.本发明制备的四联益生菌制剂的活菌数高，每片剂中动物动物双歧杆菌菌粉活 菌数可达4. 5X108CFU/g，干酪乳杆菌菌粉活菌数可达4. 3X108CFU/g，粪肠球菌菌粉活菌 数可达4. 1X107CFU/g，蜡样芽孢杆菌菌粉活菌数可达1. 0X106CFU/g，，并且益生菌的存货 时间长，室温下储藏24个月后四种菌的活菌数依然保持稳定，动物动物双歧杆菌活菌数为 3. 8X108CFU/g，干酪乳杆菌的活菌数为7. 8X108CFU/g，粪肠球菌的活菌数为2. 2X107CFU/ g，蜡样芽胞杆菌的活菌数1. 〇X106CFU/g。本发明制备的四联活菌制剂解决了常温不耐储 藏的问题，与市售益生菌产品相比本发明制备的产品在室温下贮藏稳定性更好。
[0038] 3.本发明制备的四联益生菌制剂的加工工艺简单，对生产设备的要求低，可操控 性强，适于规模化生产。
【附图说明】
[0039] 图1为实施例5所制备的制剂中各菌在贮藏过程中活菌数变化。
[0040] 图2为实施例5四联益生菌制剂中动物双歧杆菌在4°C和25°C条件下储藏24个 月的活菌数变化。
[0041] 图3为实施例5四联益生菌制剂中干酪乳杆菌在4°C和25°C条件下储藏24个月 的活菌数变化。
[0042] 图4为实施例5四联益生菌制剂中粪肠球菌在4°C和25°C条件下储藏24个月的 活菌数变化。
[0043] 图5为实施例5四联益生菌制剂中蜡样芽孢杆菌在4°C和25°C条件下储藏24个 月的活菌数变化。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0045] 以下实施例中所述方法，未经特殊说明，均为常规方法。
[0046] 以下实施例中所述试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域中常规试剂和仪器可 从商业渠道获取。
[0047] 实施例1菌株的分离筛选、鉴定和培养
[0048] 1?菌种的采集
[0049] 动物双歧杆菌和粪肠球菌，均分离自杭州市江干区健康人体肠道。动物双歧杆菌 菌种保藏号为CGMCCNo. 4521，保藏地点为中国科学院微生物研宄所普通微生物中心，保藏 日期为2010年12月29日；粪肠球菌菌种保藏号为CGMCC0460. 3,保藏地点为中国科学院 微生物研宄所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日；干酪乳杆菌菌种保藏号为 CGMCC No. 4520，保藏地点为中国科学院微生物研宄所普通微生物中心，保藏日期为2010年 12月29日；蜡样芽孢杆菌菌种保藏号为CGMCC0460. 4,保藏地点为中国科学院微生物研宄 所普通微生物中心，保藏日期为2000年6月20日。
[0050] 动物双歧杆菌、干酪乳杆菌均采自杭州市江干区20名2-6岁的健康儿童，男女各 10名，均无胃肠病史，采样前两周内均为服用任何抗菌类药物。采样时用无菌玻璃棒挑取自 然排出的新鲜粪便4-10g，置于无菌平皿中，迅速放入厌氧罐中，带回实验室分离。动物双 歧杆菌和干酪乳杆菌均在2010年3月采集。另外，粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌菌种信息已公 开。
[0051] 2?分离鉴定
[0052] 将采集的菌株样品通过生理生化鉴定方法和16S rRNA基因扩增、克隆和测序方 法，
[0053] 最后得到的四株菌分别为动物动物双歧杆菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和蜡样芽孢 杆菌。将分离纯化好的菌种于2-8°C下保存。
[0054] 3.菌株的培养
[0055] 3. 1动物双歧杆菌的培养
[0056] 培养动物双歧杆菌所使用的培养基为TPY培养基。所述培养基各成分的含量 (g/500ml)的组分为：酪蛋白胨5g、大豆蛋白胨10g、葡萄糖2. 5g、酵母浸膏1. 5g、磷酸氢二 钾lg、氯化镁〇? 25g、硫酸锌0? 125g、氯化钙0? 075g、D-泛酸钙0? 0