按照料液比I g:5 mL加入磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L, pH 7.0)，于47°C下于超声功率500W下超声90 min，然后加入中性蛋白酶(酶活力彡5.0X 14 U/g)，于47°C保温2 h后，温度升至95°C并保持10 min;溶液温度降至37°C，pH调至7.8，加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5 X 14 U/g)保温3 h后，温度升至95°C并保持1min后，于10 000貧离心15 min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物。
[0021]2)虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备:将制备的酶解物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，于50 V以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到虾仁加工下脚料锌螯合肽。利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为:
①固定化锌离子层析柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10?20 mg/mL的溶液，以0.5?1.5 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3?5柱体积的水和0.1 mol/L NaCl洗脱，收集0.1 mol/L NaCl洗脱组分，即为亲和层析组分。
[0022]②凝胶柱层析:将上述胶原肽混合物(亲和层析组分)溶于双蒸水配成浓度为10?20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物(F3)(图1);
③RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45?55 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(所述RP-HPLC条件为:进样量8?10 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相:15%乙腈；洗脱速度0.5?0.8 mL/min ;紫外检测波长220 nm)，根据对Zn的螯合活性得I个高Zn螯合活性胶原肽(图2)。
[0023]④结构检测:Zn螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为 Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met (WGFTCffPM), ES I/MS 检测分子量为1027.20 Da (图 3)。
[0024]再优选，固定化锌离子层析柱填料的制备方法为:烧瓶内依次加入液体石蜡140mL，乙酸乙酯40mL，和Triton X-100 8 mL，搅拌30min后，加入100 mL 2%的壳聚糖乙酸溶液(乙酸浓度5%)，60 °C搅拌3 h，缓慢滴加40%的甲醛10 mL，反应30 min，再缓慢滴加50%的戊二醛7 mL，反应90 Hiin0用NaOH调pH至12?13，然后70 °C下继续搅拌2 h，过滤，分别用水、乙醇清洗，80 °C干燥至恒重后转移至烧瓶中，依次向烧杯中加入I mol/L NaOH150 mL，无水乙醇150 mL, NaBH4 8g，室温下搅拌，抽滤，水洗至中性，乙醇清洗，干燥至恒重，得交联壳聚糖。转移交联壳聚糖至烧瓶中，加入I mol/L NaOH 100 mL，搅拌，缓慢滴加环氧氯丙烷47 mL，室温下搅拌24 h，抽滤，分别用水、乙醇清洗，干燥后转移至烧瓶中，加Al mol/L NaOH 60 mL，缓慢滴加乙二胺25 mL，65?70°C下保温24 h后，蒸馏水清洗，抽滤，干燥，得到配基螯合壳聚糖。用超纯水悬浮配基螯合壳聚糖，装柱，用两倍柱体积的超纯水平衡，再用5倍柱体积的0.1 mol/L ZnCl2溶液以0.5?1.0 mL/min过柱后，用2?3倍柱体积超纯水清洗，得到壳聚糖锌离子固定化亲和层析填料。
[0025]再优选，所述RP-HPLC条件为:进样量8?10 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相:15%乙腈；洗脱速度0.5?0.8 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
[0026]Zn螯合胶原肽对锌离子的螯合作用采用EDTA滴定法测定。取螯合物100 mg于100 mL小烧杯中，加水50 mL，滴入HCl (6 mol/L)数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至100 mL，从中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入pH 10的NH3-NH4Cl缓冲液10 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴定至蓝色；记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
[0027]测定结果表明:纯化得到的Zn螯合胶原肽Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met(WGFTCWPM)对锌离子的螯合能力为83.56 μ g/mg，与胶原蛋白酶解产物(30.12 μ g/mg)相比其对Zn的螯合能力取得了出乎意料的效果，具有很好的补锌预期。
[0028]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
[0029]序列表
SEQUENCE LISTING
<110>浙江海洋学院 〈120〉虾仁下脚料锌螯合肽的用途 〈130〉 zjou-2015-wb0706 〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.5
〈210〉 I
〈211〉 8
〈212〉 PRT
〈213〉人工合成
〈400〉 I
Trp Gly Phe Thr Cys Trp Pro MetI5
【主权项】
1.虾仁下脚料锌螯合肽的用途，其特征是:该虾仁下脚料锌螯合肽用于制备制备补锌食品和保健食品的用途。2.根据权利要求1所述的虾仁下脚料锌螯合肽的用途，其特征是:所述的虾仁下脚料锌螯合肽的氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ES I/MS检测分子量为1027.20 Da0
【专利摘要】本发明涉及一种虾仁下脚料锌螯合肽用于制备补锌食品和保健食品的用途，具体讲是该虾仁下脚料锌螯合肽的氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS检测分子量为1027.20？Da。锌螯合胶原肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和锌，是一种理想的补锌物质。<b><u /></b>
【IPC分类】A23L1/305
【公开号】CN105192718
【申请号】CN201510399356
【发明人】赵玉勤, 徐银峰, 王斌, 陈荫, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年7月9日