专利名称：一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法
技术领域：
本发明涉及烟用香料制备技术领域，更具体地，本发明涉及一种利用休止细胞渥堆发酵处理烟梗制备烟用香料的方法。
背景技术：
发展中式卷烟，形成具有典型特色的产品，改善中式卷烟与国外卷烟的质量差距， 尤其是在卷烟抽吸香气方面的不足，提高国内外市场竞争力，是我国卷烟行业发展中需要解决的问题之一。在卷烟中添加香精香料，是一种能够有效改善卷烟抽吸品质的方式。其中，添加烟草来源的香料能够极为有效地提升卷烟自身特有香气的含量，同时也能在一定程度上降低焦油含量，而且，添加烟草来源的香料，由于其来源的一致性，具有较高的安全保障，所以，开发烟源香料成为烟用香料开发中的一个主要方向。在烟草工业中，烟梗常常被视为生产中的副产物。我国是一个卷烟消费和生产的大国，每年都有数十万吨的烟梗被废弃，既造成了环境污染，也是对生物资源的浪费。如何能够更进一步地利用烟梗，使原本的废物变废为宝，是我国乃至世界烟草行业都在密切关注的一个研究热点。科研人员对烟梗化学成分进行了研究和分析，尤其是分析了烟梗中的主要香气成分后，与烟叶的香气成分进行对比，发现烟梗中所含的致香成分和烟叶中的致香成分在种类上基本一致，所不同的仅仅是含量上有所差别。特别是烟梗中含有的天然植物素，例如主要的烟气特征香——烟碱、烟酸、茄尼醇等，具有较高的含量，在混合烟叶组配方中有极大的开发利用价值。目前国内烟草行业对于烟梗的利用，主要集中在将其制备成再造烟叶、膨胀梗丝等作为烟草原料添加到叶组配方中；或者是将其制备成烟梗提取物，作为再造烟叶的组成部分使用。就烟梗提取物来说，目前由于原料和制备工艺的限制，含有较高的木质素、蜡质等燃烧后会产生不良吸味的成分，烟香尚显不足。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术制备的烟梗提取物香气不足、抽吸品质不佳这一缺陷，提供一种可以有效减少烟梗提取物中的木质气，并补充甜香等优雅香气，以改善烟梗提取物的抽吸品质，有效提升烟草本香，降低刺激、增加烟梗提取物丰富性的利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法。本发明目的通过以下技术方案予以实现。—种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，其特征在于，方法如下
①休止细胞制备将分离自烟叶表面的产香菌株在LB液体培养基中扩大培养，离心弃去培养基后收集菌株待用；配制磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度控制在其渗透压可满足细胞生长所需渗透压；将离心收集的产香菌株全部接于磷酸盐缓冲液中，在20-37°C培养20-72 小时，制得休止细胞待用；
②微生物渥堆发酵处理在烟梗中加入2-5倍水灭菌，将休止细胞依照灭菌烟梗总质量按比例接菌，接菌量控制在总质量的0. 5-10% ；接菌后将烟梗和休止细胞混勻后在 20-37°C渥堆培养发酵M-120小时获得发酵产物；
③在发酵产物中加入水，加热提取并浓缩后制得最终发酵烟梗提取物，即为烟用香料。当发酵烟梗提取物中的杂质含量过多时，本发明还可将发酵烟梗提取物进一步进行乙醇回溶提取，以去除杂质。本发明所述产香菌株取自于烟叶表面的产香微生物。配制磷酸盐缓冲液的磷酸盐为磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，溶液PH值为 7. 0-7. 4 ；溶液浓度要求能够平衡菌株细胞渗透压，控制在20-70毫摩尔/升。本发明利用烟梗作为原料，以分离自烟叶表明的产香微生物作为出发菌株，通过独特的休止细胞培养技术，用固体渥堆发酵的方式进行产香代谢，产生了对后期的烟梗提取物制备起到积极作用的发酵物，可以有效减少烟梗提取物中的木质气，并补充甜香等优雅香气，改善了烟梗提取物的抽吸品质，有效提升烟草本香。将发酵产物制备烟梗提取物， 得到了抽吸品质明显改善的发酵烟梗提取物，应用于卷烟中起到了提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。本发明方法简便、成本低廉、具有操作性、规范性和可控性强的特点，且相对于常见的发酵烟梗提取物的制备方法，用本发明的方法制备时间明显缩短，更加便于实现大规模工业化生产。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明做进一步详细说明。所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，其特征在于，方法如下
①休止细胞制备将从取自于烟叶表面的产香微生物中分离出的产香菌株在LB液体培养基中扩大培养，离心弃去培养基后收集菌株待用；配制磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度控制在其渗透压可满足细胞生长所需渗透压，控制在20-70毫摩尔/升，溶液PH值为 7. 0-7. 4 ；配制磷酸盐缓冲液的磷酸盐为磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种；将离心收集的产香菌株全部接于磷酸盐缓冲液中，在20-37°C培养20-72小时，制得休止细胞待用；
②微生物渥堆发酵处理在烟梗中加入2-5倍水灭菌，将休止细胞依照灭菌烟梗总质量按比例接菌，接菌量控制在0. 5-10% (质量/质量)；接菌后将烟梗和休止细胞混勻后在 20-37°C渥堆培养发酵M-120小时获得发酵产物；
③在发酵产物中加入水，加热提取并浓缩后制得最终发酵烟梗提取物，即为烟用香料。如果发酵烟梗提取物中杂质较多，将发酵烟梗提取物进一步进行乙醇回溶提取， 去除发酵烟梗提取物中的杂质。实施例1
一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，方法如下 ①休止细胞制备选择一株分离自红大烟叶表面的产香微生物，如短小芽孢杆菌，提取产香菌株，在LB液体培养基中扩大培养后，离心弃去培养基后收集菌株并全部转接入浓度为40毫摩尔/升、PH值为7. 2的磷酸钠缓冲液中，其渗透压可满足细胞生长所需渗透压，在20°C培养72小时，制得休止细胞待用；
②微生物渥堆发酵处理将200g烟梗加入5倍水灭菌后将待用的休止细胞按照灭菌烟梗总质量10%的接种量接菌，充分混勻后在20°C下渥堆培养发酵M小时，获得发酵产物；
③加入发酵产物质量5倍的水，然后加热回流提取，过滤除去烟梗后经浓缩去除大部分水分，制得发酵烟梗提取物，即为本发明所需的烟用香料。实施例2
一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，方法如下
①休止细胞制备选择一株分离自津巴布韦烟叶表面的产香微生物，如掷孢酵母菌，提取产香菌株，在LB液体培养基中扩大培养后，离心收菌并全部转接入浓度为20毫摩尔/ 升、PH值为7. 0的磷酸钾缓冲液中，其渗透压可满足细胞生长所需渗透压，在37°C培养20 小时待用；
②微生物渥堆发酵处理将800g烟梗加入3倍水灭菌后将待用的休止细胞按照灭菌烟梗总质量的0. 5%的接种量接菌，充分混勻后在37°C下渥堆培养发酵120小时获得发酵产物；
③加入发酵产物质量4倍的水，然后加热回流提取，过滤除去烟梗后经浓缩去除大部分水分，制得发酵烟梗提取物，即为本发明所需的烟用香料。实施例3
一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，方法如下 ①休止细胞制备选择一株分离自巴西烟叶表面的产香微生物如小球菌，提取产香菌株，在LB液体培养基中扩大培养后，离心收菌并全部转接入浓度为70毫摩尔/升、PH值为 7. 4的磷酸二氢钠缓冲液中，在30°C培养48小时待用。②微生物渥堆发酵处理将IOOOg烟梗加入2倍水灭菌后，将待用的休止细胞按照灭菌烟梗总质量的2. 5%的接种量接菌，充分混勻后在32°C下渥堆培养发酵55小时获得发酵产物；
③加入发酵产物质量6倍的水，然后加热回流提取，过滤除去烟梗后经浓缩去除大部分水分，制得发酵烟梗提取物，再用2倍95%乙醇回溶提取，经浓缩后去除大部分乙醇，制得最终发酵烟梗提取物，即为本发明所需的烟用香料。实施例4
一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，方法如下
①休止细胞制备选择一株分离自秘鲁烟叶表面的产香微生物如枯草芽孢杆菌，提取产香菌株，在LB液体培养基中扩大培养后，离心收菌并全部转接入浓度为55毫摩尔/升、 PH值为7. 3的磷酸钠缓冲液中，于25°C培养35小时待用；
②微生物渥堆发酵处理将2000g烟梗加入3. 5倍水灭菌后，将待用的休止细胞按照灭菌烟梗总质量的5%的接种量接菌，充分混勻后在20°C下渥堆培养发酵48小时获得发酵产物；
③加入发酵产物质量4倍的水，然后加热回流提取，过滤除去烟梗后经浓缩去除大部分水分，制得发酵烟梗提取物，再用2倍95%乙醇回溶提取，经浓缩后去除大部分乙醇，制得最终发酵烟梗提取物，即为本发明制得的烟用香料。本发明所述产香微生物的选择、产香菌株的分离提取、磷酸盐缓冲液的配置、菌株接种、加热提取、浓缩、乙醇回溶提取等均可采用现有技术。 将本发明的发酵烟梗提取物作为烟用香料在烟草原料中添加，经过加香评吸实验结果表明，该发酵烟梗提取物具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。
权利要求
1.一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，其特征在于，方法如下①休止细胞制备将分离自烟叶表面的产香菌株在LB液体培养基中扩大培养，离心弃去培养基后收集菌株待用；配制磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度控制在其渗透压可满足细胞生长所需渗透压；将离心收集的产香菌株全部接于磷酸盐缓冲液中，在20-37°C培养20-72 小时，制得休止细胞待用；②微生物渥堆发酵处理在烟梗中加入2-5倍水灭菌，将休止细胞依照灭菌烟梗总质量按比例接菌，接菌量控制在总质量的0. 5-10%;接菌后将烟梗和休止细胞混勻后在 20-37°C渥堆培养发酵M-120小时获得发酵产物；③在发酵产物中加入水，加热提取并浓缩后制得最终发酵烟梗提取物，即为烟用香料。
2.根据权利要求1所述的一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，其特征在于，将发酵烟梗提取物进行乙醇回溶提取，去除发酵烟梗提取物中的杂质。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法， 其特征在于，所述产香菌株取自于烟叶表面的产香微生物。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法， 其特征在于，所述配制磷酸盐缓冲液的磷酸盐为磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，溶液PH值为7. 0-7. 4 ；溶液浓度要求能够平衡菌株细胞渗透压，控制在20-70毫摩尔/升。
全文摘要
一种利用休止细胞渥堆发酵烟梗制备烟用香料的方法，是将分离自烟叶表面的产香菌株在LB液体培养基中扩大培养，离心收集菌株待用；配制磷酸盐缓冲液，缓冲液的浓度控制在其渗透压可满足细胞生长所需渗透压；将产香菌株全部接于磷酸盐缓冲液中，在20-37℃培养20-72小时，制得休止细胞待用；然后在烟梗中加入2-5倍水灭菌，将休止细胞依照灭菌烟梗总质量的0.5-10%接菌；接菌后将烟梗和休止细胞混匀在20-37℃渥堆培养发酵24-120小时获得发酵产物；最后在发酵产物中加水，加热提取并浓缩后制得烟用香料。本发明可以有效减少烟梗提取物中的木质气，并补充甜香气，以改善烟梗提取物的抽吸品质，有效提升烟草本香，降低刺激、增加烟梗提取物丰富性。
文档编号A24B15/20GK102499462SQ20111037144
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者刘煜宇, 吴长伟, 张勃, 李仙, 毕薇, 端李祥, 郑琳 申请人:云南瑞升烟草技术(集团)有限公司