专利名称：：5,3',5'－三羟基－7－甲氧基二氢黄酮用于制备药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及5，3’，5’-三羟基-7-甲氧基二氢黄酮在制药中的应用。由于生活水平的提高和医疗保健的不断进步，人均寿命越来越长，使世界人口老龄化的趋势越来越明显。据中国老年协会专家指出，我国老年人口迅速增长，1990年以来，我国老年人口以平均每年3.32％的速度增长，到1994年底，全国60岁以上老年人口总数已达到1.1亿，约占人中总数的9.5％。2000年，我国已成为“老年型”国家，随着老年人口增加，对老年性疾病的防治问题也越来越突出。因此，研制开发新的抗衰老及防治常见老年性疾病的新药，已成为当今医药学界的一个研究热点。老年性痴呆症、记忆衰退、高血脂症、脑缺血、动脉硬化、血栓形成、血小板聚集、糖尿病、病毒性传染病等是常见的老年性疾病，而且许多情况下是多种病症同时出现于同一病人身上。但是，现有的治疗这些疾病的药物普通存在着适用症单一、疗效不尽理想的问题。因此，研究开发一种上述多种老年性疾病具有良好的综合治疗效果的药物，这对方便老年性疾病的防治、保证老年人健康将具有十分重要的意义。本发明的目的是提供5，3’，5’-三羟基-7-甲氧基二氢黄酮的新的制药用途，所制成的药物对老年性痴呆症、记忆衰退、高血脂症、脑缺血、动脉硬化、血栓形成、糖尿病、乙型肝炎等多种常见疾病均具有良好的治疗效果。5，3’，5’-三羟基-7-甲氧基二氢黄酮(简称式I化合物)可从中药艾纳香(Blumeabalsamifera)叶中分离获得[中山大学学报，1988(2)，77-88]，其结构如下本发明通过实验证明，式Ⅰ化合物在治疗对脑室注射Aβ蛋白致小鼠痴呆模型、M-胆碱能抑制剂樟柳碱致小鼠脑记忆获得障碍模型小鼠的学习记忆均有明显的改善作用，能显著提高小鼠近期记忆和长期记忆能力，提示式Ⅰ化合物抗A痴呆及增强记忆作用，这对于治疗老年性痴呆具有重要意义。式Ⅰ化合物在抗脑缺血、降血脂、降胆固醇、抗血小板聚集、抑制血栓形成、抗动脉硬化、降血糖、抗乙型肝炎病毒等方面具有显著的效果，由此可知，以式Ⅰ化合物作为活性成份制备的药物，将对相应的病症具有良好的治疗效果，特别是对老年性痴呆症、记忆衰退、高血脂症、脑缺血、动脉硬化、血栓形成、血小板聚集、糖尿病、乙型肝炎等方面的常见老年性疾病具有良好的综合治疗效果。实验证明式Ⅰ化合物具有低毒性和高安全性，适宜作为药物应用。本发明的式Ⅰ化合物用于制备药物，可与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法而制得；可根据需要制成适当的剂型，如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或输液剂等。以式Ⅰ化合物为活性成份的药物，通常以口服方式使用，当然也可以采用注射等其它给药方式；其每天使用剂量一般为约0.001~20000毫克，成年人常用量为每天0.005~8000毫克，最常用剂量为0.01~5000毫克。每天一次或分数次给药。以下通过实验实例对本发明作进一步说明。实验实例1式Ⅰ化合物对小鼠急性毒性试验实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.101。实验动物NIH系小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A033；方法与结果选取健康NIH系小鼠，体重20±2g，20只，雌雄各半，对小鼠1次灌胃式Ⅰ化合物浓度为50mg·ml-1的悬浊液0.8ml/20g体重，连续观察7d，小鼠活动正常、敏捷，未引起死亡或异常反应，限于给受试样品浓度和体积不能再增大，故进行最大耐受量试验。另选择健康NIH系小鼠20只，体重20±2g，雌雄各半，每鼠灌胃式Ⅰ化合物悬浊液0.6ml·20g-1，每隔2h灌胃一次，共6次，此后连续观察7d，此期间让小鼠自由进食和饮水，观察期间小鼠活动正常、敏捷，未引起死亡或异常反应。小鼠限于给受试样品浓度和体积不能再增大不能测出LD50。故改作最大耐受量试验，结果如下小鼠灌服式Ⅰ化合物悬浊液，测得对式Ⅰ化合物最大耐受量不少于9g·kg-1体重，在最大耐受量给受试样品观察期间，小鼠活动敏捷，毛皮光滑，未见死亡。由此可知，式Ⅰ化合物的最大耐受量不小于9g／kg体重，属于实际无毒级化合物，服用安全。计算如下50×0.6×6×50=9g/kg体重；按体表面积计算，相当于70Kg成年人用量(100mg)的698倍(50×0.6×6×387.9÷100)，由此可知式Ⅰ化合物对人体服用安全。实验实例2式Ⅰ化合物对治疗老年性痴呆症的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.101。实验动物NIH系小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A033；实验药品致老年痴呆药物Amyloidβ-蛋白(Aβ1-42片段)，分子量4514.1，SigmaChemicalCo.出品，产品号[107761-42-2]；阳性对照药双益平(石杉碱甲片)，上海医科大学制药厂出品，批号981001。实验剂量双益平用0.5％CMC配成0.02mg/ml的溶液；式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，分别用0.5％CMC配成浓度为7.2mg/ml(高剂量)，2.4mg/ml(中剂量)，0.8mg/ml(低剂量)的溶液。方法与结果NIH系小鼠，分成6组，每组10只。雌雄各半，即式Ⅰ化合物低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组、空白对照组及正常对照组。Aβ所致小鼠痴呆模型各组NIH小鼠(正常组除外)，每只小鼠腹腔注射0.45％戊巴比妥钠0.1ml/10g体重麻醉。碘酒、酒精消毒头顶皮肤后，纵向正中切开颅顶皮肤，暴露颅骨，在bregzna点后2.0mm，左右旁开2.5mm处用注射器钻一小孔，以5μl注射器缓速注入2μlAβ溶液，浓度为7μg／μl，30分钟内注射完毕，留针5分钟，取出注射器，缝合皮肤。造模次日开始给药，连续30d每天灌胃一次。低剂量组小鼠每次灌注式Ⅰ化合物低剂量溶液0.5ml/只；中剂量组小鼠每次灌注式Ⅰ化合物中剂量溶液0.5ml/只；高剂量组小鼠每次灌注式I化合物高剂量溶液0.5ml/只；阳性对照组小鼠每次灌注配好的双益平溶液0.5ml/只；空白对照组小鼠每次灌注0.5％CMC溶液0.5ml/只。Y型迷宫实验Y型迷宫，有3个臂，相邻的两个臂夹角为120°，每臂为30cm×10cm×10cm。3臂中，只有一臂为安全区，迷宫底部铺以铜栅电极。安全区铺铜栅，但不导电。试验时将动物放在非安全区的一臂的顶端，然后给予电击，动物慌忙逃窜，最后偶然进入安全区，这时为训练一次，如此反复训练3次，记录第3次到达安全区所需的时间(s)。24h后，重复测试，记录到达安全区时间。每组小鼠均需完成此试验。跳台法实验跳台法实验的原理是反应箱底铺有通36V电的铜栅，动物受到电击。其正常反应是跳上箱内绝缘的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台，如此训练5min，并记录每只小鼠受到电击的次数，即错误次错误次数，以此作为学习成绩。24h后重复作试验，此即记忆保持试验。记录受电击的动物数，第一次跳下平台的潜伏期和3min的错误次数。具体做法是给药末次后次日开始训练。将动物放入反应箱内适应环境3min，然后立即通以36V的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台，以躲避伤害性刺激。小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上，如此训练5min(同一试验中所有小鼠训练时间相同)，记录每鼠后5min的错误次数，以此作为学习成绩。24h后重复作试验，即记忆保持试验。记录动物第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数，同时计算动物出现错误反应的频率。水迷宫法实验水迷宫装置按Morris法进行。水迷宫直径为60cm，水池深30cm，水深25cm，水温(26±1)℃，整体为一黑色铁桶。池壁上漆有白色的符号，如三角形、圆形、波浪形、长方形。并标有东、西、南、北4个入水点，将池分成四个相等的象限，分别为SW、NW、SE、NE象限。在SW象限正中放有一直径为10cm、高24cm的圆形活动黑色平台(E区)，平台低于水面1cm左右。训练期间迷宫外参照物的位置保持不变。整个实验历时三天，包括(1)定位航行试验历时3天，每天训练4次。训练时，操作者随机选择一个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，4次训练分别从不同象限放入水中。记录每鼠分别以4个不同点入水至找到水下平台所需时间(寻找平台潜伏期searchingplatformlatency，SPL)为学习记忆成绩。若小鼠在1min内未找到平台，实验者将鼠诱导至台上，此时SPL按60s计算。每次训练间隔为30s。(2)空间探索试验在第3天撤除水下平台后，任选一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在撤除水下平台后60s内跨越原水下平台相应位置次数(跨原平台次数crossingplatformtimes，CPT)及其占跨越各象限平台相应位置总次数的百分比(跨台百分率，crossingplatformpercentages，CPP)，检测小鼠空间定位学习记忆能力。各组小鼠于第30天用Morris水迷宫法进行空间学习、记忆力测试。表1式Ⅰ化合物对Aβ所致小鼠痴呆模型Y型迷宫实验的影响(x±SD)<tablesid="table1"num="001"><table>项目组别剂量(mg/kg)到达安全区所需时间(s)改善率(％)24h后到达安全区所需时间(s)改善率(％)动物数(n)空白对照组式Ⅰ化合物组双益平组正常对照组0.5％CMC6.4519.3558.05100.5％CMC67.1±23.159.0±36.9△54.7±40.8△23.2±12.0***20.1±11.5***13.5±6.6***----12.118.565.470.0----40.5±128.929.6±12.9△35.3±25.6△18.6+15.5*11.4±6.8**10.7+4.87*——26.912.154.171.8——91079910</table></tables>与空白对照组比较，△P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表2式Ⅰ化合物对Aβ所致小鼠痴呆模型跳台法实验的作用(x±SD)<tablesid="table2"num="002"><table>项目组别剂量(mg/kg)5min内受电击次数(n)减少率(％)24h后动物数(n)第一次跳下平台潜伏期(s)3min内错误总次数(n)3min内错误频率空白组式Ⅰ化合物双益平组正常组0.5％CMC6.4519.3558.05100.5％CMC3.6±1.71.9±1.3*3.0±2.2△1.4±1.3*1.0±1.1***1.5±0.8**——47.216.761.172.2——85.3±60.6106.5±50.3△74.8±58.2△117.8±62.9△102.6±44.9△127.0±55.8*16835371.7±1.60.8±1.1△0.4±0.8*0.5±0.5*0.3±0.7**0.8±0.7△91079910</table></tables>与空白对照组比较，△P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表3式Ⅰ化合物对老年痴呆小鼠模型Morris水迷宫法实验的影响(x±SD)<tablesid="table3"num="003"><table>项目组别剂量(mg/kg)SPL1d2d3d空白对照组式I化合物双益平组正常对照组0.5％CMC6.4519.3558.05100.5％CMC41．8±22.339.8±22.1△41.4±23.6△39.8±21.2△40.9±21.5△36.2±22.2△38.6±20.440.9±22.7△35.3±16.8△28.5±10.7△32.2±13.3△26.4±6.6*36.2±19.537.1±19.8△30.9±11.4△22.6±7.1*23.6±6.8△21.3±7.6**</table></tables>与空白对照组比较，△P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01老年性痴呆症是以大脑神经细胞死亡，神经纤维缠结，大脑神经细胞和脑血管出现老年性斑块为特征。往小鼠的海马区注射Aβ蛋白造成大脑神经细胞和脑血管形成老年性斑块，从而形成痴呆模型。由实验结果可知，式Ⅰ化合物能够对老年痴呆模型小鼠脑记忆的获得、巩固和再现均表现出明显的增强作用，提示具有抗痴呆作用。实验实例3式Ⅰ化合物对樟柳碱所致记忆障碍的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1999.203。实验动物NIH系小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号99A030；实验药品樟柳碱(Anisodine)，由Sigma公司生产，阳性对照药双益平(石杉碱甲片)，上海医科大学制药厂出品，批号981001达纳康(Tanakan)，由法国博福-益普生制药工业公司生产，进口药品注册证号X19990.156，生产日期09/1999。方法与结果选择健康NIH系小鼠70只，体重18～22g，雌雄各半，随机分成7组，每组10只，即正常对照组、空白对照组、式Ⅰ化合物低、中、高剂量组、双益平组、达纳康组。按表4剂量灌胃给受试样品，连续灌服30d。训练及测试前10min，除正常对照组小鼠外，各组小鼠腹腔注射樟柳碱5mg·kg-1体重，经跳台实验及“Y”型迷宫试验测定小鼠的学习记忆能力。表4式I化合物对樟柳碱致小鼠脑记忆获得障碍跳台模型的作用(x±SD，n=10)<tablesid="table4"num="004"><table>项目组别剂量(mg/kg)5min内受电击次数(n)减少率(％)24h后第一次跳下平台潜伏期(s)3min内错误总次数(n)3min内错误频率正常组空白组式I化合物双益平组达纳康组0.5％CMC0.5％CMC18060200.10431.21.8±0.6***4.6±1.50.8±0.9***1.1±1.1***1.1±1.1***1.6±1.3***1.9±1.5***————82.676.171.765.258.7142.1±46.5***66.6±23.7171.2±18.7***153.6±45.5***140.5±43.9***139.1±47.9***135.4±49.2***6252699100.60±0.8***2.5±1.30.2±0.4***0.6±1.0***0.9±1.0**0.9±1.1**1.0±1.2*</table></tables>与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表5式Ⅰ化合物对樟柳碱致小鼠脑记忆获得障碍Y型迷宫实验的作用(x±SD，n=10)<tablesid="table5"num="005"><table>项目组别剂量(mg/kg)到达安全区所需时间(s)改善率(％)24小时后到达安全区所需时间(s)改善率(％)正常组空白组式Ⅰ化合物双益平组达纳康组0.5％CMC0.5％CMC18060200.10431.210.0±2.8***21.7±8.05.3±2.5***6.4±1.8***8.6±4.4***7.6±3.6***9.1±3.9***--75.770.760.562.458.19.3±2.8***22.1±6.25.8±1.6***8.4±3.8***10.7±3.7***9.2±3.1***10.8±3.8***--73.561.851.758.451.3</table></tables>与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由实验结果可知，式Ⅰ化合物对M-胆碱能抑制剂樟柳碱所致脑记忆获得障碍模型小鼠学习记忆功能均有明显的改善作用。实验实例4对小鼠脑缺血模型的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1999.203。实验动物NIH系小鼠18-22g，60只，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号99A030；阳性对照药达纳康(Tanakan)，由法国博福-益普生制药工业公司生产，进口药品注册证号X19990.156，生产日期09/1999。方法与结果NIH系小鼠18-22g，雄雌各半，以戊巴比妥钠60mg·kg-1，ip麻醉，进行手术。将小鼠仰卧位固定，颈部正中切开皮肤约7m，分离两侧颈总动脉，并套以“O”号丝线，缺血时用动脉夹夹闭双侧颈总动脉2min，造成大脑缺血状态，缺血结束，松开动脉夹，恢复血液再灌注，短时间歇5min，如此反复二次。阻断颈总动脉血流后，缝合切口。加上尾端放血，放血量为总血量的10％以下。术毕从腹腔内注入适量的生理盐水以补充血容量。假手术组麻醉后分离双侧颈总动脉但不阻断血流，亦不放血。双侧颈总动脉完全阻断后，首先出现惊厥，体温降低，呼吸减慢，最后翻正反射消失。实验动物以体温降低和翻正反射消失为缺血阳性指标，无典型缺血指征者弃之不用。在缺血过程中、或手术后均会有动物死亡。恢复血液灌注后，动物翻正反射逐渐恢复，呼吸加快，3～5h基本恢复正常活动。手术后的动物随机分为5组式Ⅰ化合物低、中、高剂量组，达纳康组，模型组。另设假手术组。即每天给药一次至实验结束。给药剂量见表6。术后7天进行避暗试验。避暗实验装置被动回避性条件反射箱的设计实验采用36cm×12cm×12cm的反射箱，分明、暗两室。明室大小为11cm×32cm，其上方约20cm处悬一40W钨丝灯。暗室大小为17cm×32cm。两室之间有一直径为3cm的洞口，两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电，通常用电刺激强度为36～40V。避暗实验方法末次给药后次日开始训练。实验时将小鼠头部背向洞口放入明室，同时开始计时，动物穿过洞口进入暗室受到电击，立即停止计时，取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间，此即潜伏期，以此评价学习成绩。24h后重作测验，记录潜伏期和5min内的电击次数。以此评价记忆保持成绩。表6式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠脑记忆避暗实验的作用(x±s，n=10)*P<0．05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组；△P>0.05，#P<0.05vs假手术组表7式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠脑记忆跳台实验的作用(x±s，n=10)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组，△P>0.05，#P<0.05假手术组表8式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠血清中GSH-Px活力的影响(x±s，n=10)*P<0.05，***P<0.001vs模型组；△P>0.05，###P<0.05vs假手术组表9式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠脑和血清中SOD活力的影响(x±s，n=10)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组；△P>0.05，#P<0.05vs假手术组表10式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠血清中LDH活力的影响(x±s，n=10)***P＜0.001vs模型组；##P＜0.01，###P＜0.05vs假手术组由实验结果可知式Ⅰ化合物对脑缺血再灌注损伤小鼠的学习记忆功能均有明显提高作用，能够明显降低抑制血清中乳酸脱氢酶(LDH)的活力、显著升高脑和血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活力、血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的作用，提示式I化合物具有抗脑缺血作用。实验实例5对大鼠体内血栓形成的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.103。实验动物SD系雄性大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A033；实验药品阳性对照药立平脂(LIPANTAYL)，由法国科尼大药厂出品，批号批号104940499。实验方法选择健康S.D.系大鼠，体重275±2Dg，雄性，共50只，随机分成5组，每组10只，即式Ⅰ化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(立平脂组)和空白对照组。式Ⅰ化合物、阳性对照药用0.5％羧甲基纤维素钠配成相应浓度悬浮液。按表23连续给受试样品15d，第16d禁食12h，给受试样品1h后，用4％戊巴比妥钠42mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧体位固定动物手术台上，进行颈动脉-颈静脉环插管手术；将大鼠气管分离，插入一短塑料管，随时将气管分泌物从套管中吸出。剖离左颈总动脉，右侧颈外静脉，取一段聚乙烯软质塑料细管(长管为7.3cm，内径0.15cm，管厚为0.03cm)，内放一根8cm长的医用缝合线，塑料管两端用小管将肝素钠水溶液(50U/ml)充满聚乙烯管。将聚乙烯管的一端插入右侧颈外静脉，而另一端插入左颈总动脉，结扎固定。准备好后，打开血流，血流从左颈总动脉流至聚乙烯管内，返回右外侧静脉管，准确开放血流15min后，立即中断血液，迅速取出丝线，用电子分析天平称总湿重。总湿重量减去丝线重得血栓湿重。表11式I化合物对大鼠血栓形成的抑制作用(x±SD，n=10)与空白对照组比**p＜0.01，***p＜0.001对大白鼠血小板聚集率(体内法)的影响实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.103。实验动物SD系大鼠，雄雌各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A033；实验药品阳性对照药立平脂(LIPANTAYL)，由法国科尼大药厂出品，批号批号104940499。选择健康S.D.系大白鼠，50只，体重200±20g，雄性，随机分成5组，每组10只，即式Ⅰ化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(立平脂组)及空白对照组，按表26剂量给受试样品20d。实验前禁食12～18h，实验前1．5h再给受试样品一次。实验时用戊巴比妥钠溶液(30mg/kg体重)腹腔注射麻醉后解剖分离颈总动脉，插入聚乙烯管取血，用3.8％枸椽酸钠作抗凝剂(抗凝剂血体积为1∶9)，800rpm离心5min，吸取上层乳白色的富血小板血浆(PRP)，剩余部分再以3000rpm离心10min，取上清液即贫血小板血浆(PPP)，用PPP调PRP，使血小板记数为60～90万/mm3。按比浊法，为了消除不同血小板数量的影响，用同一血样的PRP和PPP作为纵生标(血小板聚集率)的零点和顶点，以PPP为100％，PRP为0％，这样的相对测量就排除了血小板数量的影响。每支比浊管加入20μlPRP，用20μl诱导剂(4mMAA，或0.2M/LpH7.4磷酸缓冲液配制3.0μMADP或CaCl21％)，诱导血小板聚集，10min内测定血小板聚集率。表12式I化合物对大鼠血小板聚集率的影响(x±SD，n=10)<tablesid="table10"num="012"><table>项目组别给样品浓度(mg/ml)给受试样品体积(ml/100g)经AA诱导血小板聚集率(％)经ADP诱导血小板聚集率(％)CaCl2诱导血小板聚集率(％)空白对照组式Ⅰ化合物组0.5％CMC0.451.01.087.74±5.7258.59±4.68***75.22±5.4656.42±5.26***88.35±4.5857.16±7.34***1.354.051.01.047.86±5.65***33.29±4.67***43.48±5.64***32.57±4.62***46.79±5.87***36.25±5.57***阳性对照组8.041.056.74±4.88***58.46±5.29***54.77±7.67***</table></tables>与空白对照组相比***p＜0.001由大鼠血栓形成及血小板聚集实验结果可知，式Ⅰ化合物具有明显的抗血栓形成作用及血小板聚集作用，提示其具有抗动脉硬化作用。实验实例6对大鼠脂代谢紊乱预防性给药模型的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.103。实验动物SD系雄性大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A033；实验药品阳性对照药立平脂(LIPANTAYL)，由法国科尼大药厂出品，批号批号104940499。实验试剂胆固醇试剂盒，甘油三酯试剂盒，脂蛋白试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，均由上海市荣盛生物试剂厂提供，批号分别为980206，9801019，9803019，9801016。实验方法选取健康S.D.系大白鼠，雄性，200±20g，共90只，在实验环境下给普通饲料喂养，观察6d，无发现异常。然后剪尾取血，分离血清，测定其各项血脂指标，淘汰异常血脂指标的动物，选取血脂指标正常者进行随机分组，分为式I化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(立平脂组)、正常对照组及高脂对照组，每组10只。各组大鼠每天上午灌服高脂食物(80％猪油+4％胆酸钠+4％胆固醇+12％蛋黄粉)20ml/kg体重，每天晚上正常对照组及高脂对照组灌服用0.5％羧甲基纤维素钠溶液3ml/100g体重，而其余各组大鼠分别灌服相应不同式I化合物或阳性对照药(用0.5％羧甲基纤维素钠配成悬浮液)。连续灌服30d。第31d禁食12h，提供饮水。将各组大鼠摘眼取血，分离血清测定各项血脂指标。表13式Ⅰ化合物对大鼠脂代谢率紊乱预防性给药血脂指标的影响(x±SD，n=10)与高脂对照组相比△P＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001对大鼠脂代谢紊乱治疗性给药模型的药理作用选择健康S.D.系大白鼠，雄性，200±20g，在实验环境下给普通饲料喂养，观察6d，无发现异常。然后剪尾取血，分离血清，测定其各项血脂指标，淘汰异常血脂指标的动物，选取血脂指标正常者，共80只，随机选出10只，作为正常对照组，供给食物和饮水，剩下70只作高脂模型组，这批大鼠每天上午定时灌服高脂食物(80％猪油+4％胆酸钠+4％胆固醇+12％蛋黄粉)20ml/kg体重，连续灌服30d。第31d禁食12h，剪尾取血，分离血清，测定甘油三酯TC含量，挑出高于600mg/dl的大鼠50只，随机分为5组，即式Ⅰ化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(立平脂组)及高脂对照组，每组10只。每天晚上正常对照组及高脂对照鼠灌服3ml/100g体重羧甲基纤维素钠溶液，而其余各组大鼠分别灌服相应不同浓度式Ⅰ化合物或阳性对照药(以0.5％羧甲基纤维素钠配成悬浮液)。连续给受试样品25d，第26d禁食12h，将大鼠取血测定各项血脂指标。表14式Ⅰ化合物对大鼠脂代谢率紊乱治疗性给药血脂指标的影响(n=10，x±SD)与高脂对照组相比△P＞0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由大鼠脂代谢紊乱预防性给药及治疗性给药模型实验结果表明式Ⅰ化合物能够显著降低大鼠的总胆固醇、甘油三酯、脂蛋白含量，同时增强高密度脂蛋白胆固醇含量，说明式Ⅰ化合物对高血脂症、高胆固醇症具有明显的治疗及预防作用。实验实例7式Ⅰ化合物对糖尿病模型的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供，批号为1998.103。实验试剂四氧嘧啶(Alloxan)，由SigmaChemicalCo生产，佐脲霉素(Streptozocin)，由AldrichChemicalCo生产；血糖试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，由保定长城临床试剂公司生产，批准文号(93)Ⅱ药准学D-21-7号。实验动物NIH系小鼠，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号98A030；方法与结果选择健康NIH系小鼠，雄性，18～22g，80只，随机选择10只小鼠作为正常对照组，另外70只禁食12h后，腹腔注射四氧嘧啶250mg/Kg体重，6h后灌服2.5g/Kg的葡萄糖液，使小鼠安全渡过低血糖相，随后小鼠提供食物和饮水，36h后再禁食12h，从小鼠眼眶静脉取血，测定腹腔注射四氧嘧啶小鼠的血糖值，选择血糖值大于200mg/dl的小鼠50只，随机分成5组，即高血糖对照组、式Ⅰ化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(格列本脲组)，连同正常对照组，按表28剂量灌胃，连续给受试样品12d。末次给受试样品前禁食12h，小鼠给受试样品后1h眼眶静脉取血，采用血糖测定试剂盒测定血糖含量。选择健康NIH系小鼠，雌性，18～22g，80只，随机选择10只小鼠作为正常对照组，另外70只禁食12h后，腹腔注射链脲霉素250mg/Kg体重，6h后灌服2.5g/Kg的葡萄糖液，使小鼠安全渡过低血糖相，随后小鼠提供食物和饮水，36h再禁食12h，从小鼠眼眶静脉取血，测定腹腔注射链脲霉素小鼠的血糖值，选择血糖值大于200mg/dl的小鼠50只，随机分成5组，即高血糖对照组、式I化合物低、中、高剂量组、阳性对照组(格列本脲组)，连同正常对照组，按表29剂量灌胃，连续给受试样品12d。末次给受试样品前禁食12h，小鼠给受试样品后1h眼眶静脉取血，采用血糖测定试剂盒测定血糖含量。表15式Ⅰ化合物对四氧嘧啶所致小鼠糖尿病模型的药理作用(x±SD，n=10)与高血糖对照组相比**p＜0.01，***p＜0.001表16式Ⅰ化合物对链脲霉素所致小鼠糖尿病模型的药理作用(x±SD，n=10)与高血糖对照组相比***p＜0.001由四氧嘧啶所致小鼠糖尿病模型及链脲霉素所致小鼠糖尿病模型实验结果可知，式Ⅰ化合物具有明显的降血糖作用。实验实例8式Ⅰ化合物对乙肝病毒的药理作用实验样品式Ⅰ化合物，由中山大学药学系药物化学研究室提供。速消净，广东省东莞市南方消毒剂厂生产，批号0504，临用时用双蒸水配制成0.25％的浓度，即有效氯浓度为250PPM。实验动物新西兰兔，由中山医科大学实验动物中心提供，自由饮水，普通兔饲料喂养。实验试剂HBsAg标准品，HBsAg浓度为1μg/L、2μg/L、5μg／L，由卫生部临床检验中心提供，批号9812。小牛血清，成都市华星生化制品厂生产，批号981228。HBeAg酶联诊断试剂盒，深圳月亮湾生物工程有限分司生产，批号9908002。HbsAg强阳性血清，由广州中医药大学第一附属医院检验科提供，为20份高效价HBsAg强阳性血清(HBsAg、HBeAg、抗-HBc、HBVDNA均为阳性)混合而成，置-20℃冰箱保存备用。方法与结果含药血清的制备选取16只体重为2.0±0.2kg的新西兰兔，随机分成式Ⅰ化合物低、中、高剂量组和空白组，每组4只，雌雄各半。低、中、高剂量组分别灌胃给药0.4g/kg、0.8g/kg、1．6g/kg式Ⅰ化合物，每天1次，药物总量相当于70kg成年人每日临床用量的1、3、9倍，空白组灌服给药同体积的1％CMC，连续7天。于最后一次给药后1h，心脏采血，无菌分离血清，部分血清经56℃30min灭活，部分不灭活，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用。HBsAg阳性血清中HBsAg含量的标定将HBsAg强阳性血清用含20％小牛血清的生理盐水1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……1∶16384的倍比稀释，随后用ELISA法检测各样品和1μg／L、2μg／L、5μg／LHBsAg标准品的P/N值，重复做3次，每次均做双份平行实验。最后根据HBsAg浓度--P/N值标准曲线求出HBsAg强阳性血清中的HBsAg浓度，置-20℃冰箱保存备用。空白血清灭活与否对HBeAg的影响取灭活空白兔血清、未灭活空白兔血清、含20％小牛血清的生理盐水各200μl分别与50μ1500μg/LHBsAg阳性血清在37℃下作用4h，每个样品均做10孔，然后用HBeAg酶联诊断试剂盒检测作用后HBeAg的P/N值，并进行t检验分析。含药血清和药物粗制剂对HbeAg的体外抑制作用取低、中、高剂量含药血清和低、中、高剂量式Ⅰ化合物、有效氯浓度250PPM的速消净、空白兔血清各200μl分别与50μ500μg/LHBsAg阳性血清在37℃下作用4h，每个样品均做10孔，然后用HBeAg酶联诊断试剂盒检测作用后HBeAg的P/N值，并进行t检验分析。空白血清灭活与否对HbeAg的影响灭活空白兔血清、未灭活空白兔血清分别与500μg/LHBsAg阳性血清在37℃下作用4h，检测作用后HBeAg的P/N值，结果未灭活空白兔血清对HBeAg具有抑制作用(P＜0.05)，且未灭活空白兔血清和灭活空白兔血清对HBeAg的影响有显著性差异(P＜0.05)，故在以下的实验中将家兔的空白血清和含药血清均进行56℃30min灭活处理。表17空白血清灭活与否对HBsAg的影响(x±SD)注与含20％小牛血清的生理盐水比较△P＜0.05；与灭活空白兔血清比较*P＜0.05。表18不同剂量的含药血清对HBeAg的抑制作用(x±SD)注与灭活空白兔血清比较△P＞0.05，*P＜0.01。表19式Ⅰ化合物和含药血清对HBeAg的抑制作用(x±SD)注与灭活空白兔血清比较△P＞0.05，*P＜0.01由实验结果可知，式化Ⅰ合物对乙肝病毒具有明显的抑制作用，且随着血清中药物浓度的升高抑制作用增强。权利要求1.式Ⅰ化合物—5，3’，5’-三羟基-7-甲氧基二氢黄酮在制备用于治疗老年性痴呆症、记忆衰退、高血脂症、脑缺血、动脉硬化、血栓形成、血小板聚集、糖尿病、乙型肝炎的药物中的应用。全文摘要本发明涉及式Ⅰ化合物－5,3’,5’－三羟基－7－甲氧基二氢黄酮在制药中的应用。用式Ⅰ化合物制备的药物,用于老年性痴呆症、高血脂症、脑缺血、动脉硬化、血栓形成、血小板聚集、糖尿病、乙型肝炎具有良好的治疗功效。文档编号A61K31/352GK1284331SQ0011727公开日2001年2月21日申请日期2000年7月19日优先权日2000年7月19日发明者许东晖,许实波申请人:中山大学