专利名称：特异性免疫抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型免疫抑制剂，特别是针对在器官移植的排斥反应中使用的的特异性免疫抑制剂。
免疫应答反应是阻碍器官移植和破坏移植物的主要障碍。这些应答反应最初是由T细胞介导的。它们可以是Th细胞，可以是CD8+T CTL细胞，也可以两者共同介导。(抗体参与了异种移植的超急排斥反应和原因尚不明确的慢性排斥反应)。尽管免疫系统对外源性器官或物质的识别所引起的免疫应答反应对器官移植产生许多困难，但对于那些已经丧失了功能的器官除了移植没有更有效的方法。而几乎所有的器官移植、骨髓移植都需要长时间使用免疫抑制剂。
日前临床使用的免疫抑制剂是环孢霉素A(CyA)和FK506，两者都是非特异性广谱型抑制剂，它们不仅抑制CD4+T细胞，也抑制CD8+T细胞。而在器官移植的急性排斥反应和加速型排斥反应中起主要作用的是CD4+T细胞。接受器官移植的患者几乎一生要接受免疫抑制剂的治疗。长期使用非特异性抑制剂将使患者的免疫系统受到破坏，增加患感染和肿瘤的风险。着手开发那些特异性抑制CD4+T细胞，而不抑制或少抑制CD8+T细胞的免疫抑制剂，是21世纪医学和免疫学界要解决的主要项目之一。有人在体内外的实验中发现，超抗原可以诱导免疫耐受，但大部分研究集中在基础工作方面。这些文献包括linda S.Cauley,Keith A Cauley,Fillipa Shub,et alTransferable anergySuperantigen treatment induces CD4+T cell tolerance that is reversible and requiresCD4-CD8-cells and interferon γ J.Exp.Med.186(1),71-81,1997、Toufic Renno,MichaelHahne and H.Robson MacdonaldProliferation is a prerequisite for bacterialsuperantigen-induced T cell apoptosis in vivo J.Exp.Med.181(6)2283-2287,1995以及Z.Q.Wang,T.Orlikowsky A.dudhane,V.Trejo et alStaphylococcal enterotoxin B-induced T-cellanergy is mediated by regulatory T cells Immunology 94,331-339,1998。在动物体内使用超抗原，使其在细胞移植中发挥免疫抑制作用，达到嵌合体出现的工作尚未见报道。
本发明的目的是开发天然蛋白的特异性免疫抑制功能，研制一种抑制CD4+T细胞的特异性免疫抑制剂。
本发明研制的免疫抑制剂的主要活性成分是S-6菌株发酵代谢的一种超抗原物质—金黄色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcal enterotoxin B(即SEB)，即分子量在28366-29000的SEB蛋白，使用剂量为1-3mg/kg，并辅之以药物可接受的载体、赋形剂等。
本发明的免疫抑制剂用小鼠进行了体内的效果实验，选用两种MHC遗传背景不同的小鼠进行细胞移植，实验步骤为(A)对受者鼠注射超抗原SEB，然后再注射供体鼠淋巴细胞；(B)检查细胞转移后的7,14,2l,28,40天受者鼠体内嵌合体出现水平(流式细胞技术)；(C)检查受体鼠淋巴细胞的体外免疫应答反应(混合淋巴细胞培养)；(D)检查对T细胞抑制的特异性(流式细胞技术)。
实验证明1．超抗原SEB在体内有免疫抑制剂功能。
2．在异种细胞移植中，SEB具有针对CD4+T细胞的特异性免疫抑制剂作用，而不影响CD8+T细胞的数量。
3．在免疫系统完善条件下进行异种细胞移植，SEB能诱导供、受体的组织相容性抗原嵌合体出现，同时淋巴细胞应答反应能力下降。
4．在受体鼠免疫系统完全正常条件下进行异种细胞移植，超抗原可以使供体淋巴细胞在受者体内生存40天以上，即嵌合体存在时间在21-40天以上。
5．混合淋巴细胞培养结果证明，外周淋巴细胞移植时使用超抗原SEB可以降低宿主的排斥反应。
6．使用浓度低，比常用的免疫抑制剂的蛋白浓度低10-20倍以上。且无须连续注射，注射一次的持续抑制时间达7-21天。
实施例l免疫抑制剂的制备本实验使用的免疫抑制剂超抗原SEB(即金黄色葡萄球菌肠毒素B,Staphglo coccalentelotoxin B)系S-6菌球固体发酵产生。经CM-纤维和CM-SEA抗血清亲和层柱提纯。并经真空干燥，在4℃保存。电泳鉴定SEB纯度达到90％前后。SEB分子量为28366～29000，等电点8.6,C-末端残基赖氨酸，N-末端残基谷氨酸。分装1mg/支。
实施例2超抗原SEB在体内的抑制效果实验1．实验目的对实验动物进行不同剂量的SEB给药，检查SEB在体内是否能特异性地抑制CD4+T细胞而不影响CD8+T细胞、当CD4+T细胞受到抑制时，体外混合淋巴细胞反应中的应答反应是否会下降，以及SEB的合适浓度和抑制效应的持续时间。
2．实验动物C57BL/J小鼠。所有动物实验均在军事医学科学院实验动物中心的无特殊感染动物室(SPF)完成。
3．方法与步骤1)将实施例1所述SEB用无菌生理盐水溶解，用0.22ml孔径的滤器(Sigma购入)除菌过滤，制备成1mg/ml液体。
2)将实验动物分成四个组，分别注射1.0、1.5、2.5、3.0mg/kg的SEB，不注射SEB的动物作为对照。
3)在注射SEB之后的第7,14,21,28天，分别取出实验小鼠的肝脏，脾脏，制成单细胞悬浮液。用荧光抗体染色，用流式细胞技术测定细胞亚群的水平。判断SEB在体内是否有特异性抑制效应，以及抑制效应的合适浓度和持续时间。与此同时做体外混合淋巴细胞培养，观察体外对异源性抗原(异种淋巴细胞)的反应性是否也降低。
4)将上述接受不同剂量SEB的鼠的肝，脾制成的单细胞细胞悬液在体外做混合淋巴细胞培养，检查在CD4+T细胞受到抑制时，受体淋巴细胞对异源性抗原的反应性是否降低，如果降低则说明SEB有特异性抑制效应。
表1不同剂量的SEB在体内对CD4+T细胞的抑制率和时间
结果显示SEB能特异性抑制CD4+T细胞，抑制效应出现的的时间是第7-21天，抑制效应的高峰期在用药后的第21天。
表2 1.5mg/kgSEB在体内对CD4+T，和CD8+T细胞的抑制率(％)
结果显示1.5mg/kg的SEB在体内仅影响CD4+T细胞的数量，而不影响CD8+T细胞的数量，说明SEB在体内能特异性抑制CD4+T细胞而不抑制CD8+T。
表3不同浓度SEB注射后的体外混合淋巴细胞反应性
从表1和表3可以看出，SEB在1mg/kg-3mg/kg剂量下，随抑制率的升高，淋巴细胞对外源性抗原的应答反应下降。结果显示1-1.5mg/kg的SEB投入后第21天，受体淋巴细胞对外源性抗原的应答反应能力下降，而3.0mg/kg剂量组与外源性抗原的应答反应性没有降低。
实施例3细胞移植实验1．实验动物C57BL/J小鼠H-2，基因型为H-2Kb阳性，H-2Kd阴性(H-2Kb+/H-2Kd-)。此鼠作为细胞移植的受体鼠。BABL/C小鼠作为细胞移植的供体鼠。其H-2基因型为H-2Kd阳性H-2Kb阴性(H-2Kb-/H-2kd+)。所有的动物实验均在军事医学科学院实验动物中心的SPF室完成。
2．实验步骤1)将供体鼠(BABL/C，基因型H-2Kd+)的脾脏在无菌条件下取出。用玻片轻轻磨碎，加5ml RPMI1640培养基用300目无菌尼龙膜过滤，制成悬浮单个细胞，1000转/7分钟离心，收集细胞部分。加入1ml Tris-NH4Cl裂解液，室温静置1～5分后，离心1000转/7分钟，去除Tris-NH4Cl液，加生理盐水离心洗二次后，制备成浓度2.5×108～1×108个细胞/ml的悬浮液，以0.2ml体积静脉注射给C57BL/J(基因型H-2Kb+)。
2)接受细胞移植的鼠在移植前后分别静脉注射1.0、1.5、2.5、3.0mg/kg的SEB。
3)用流式细胞测定技术检查细胞移植后1～50天的CD4+T、CD8+T,CD4/H-2KbH-2Kb,CD4/H-2Kd的水平，以证明在进行异种淋巴细胞移植时①SEB在体内是否特异性地抑制CD4+T细胞，而不影响CD8+T细胞的数量。
②SEB在体内对CD4+T细胞的抑制强度，能达到使供体鼠基因H-2Kd在受体体内出现嵌合体水平。
③当嵌合体大量出现时，受体鼠淋巴细胞对异原性抗原(供体鼠淋巴细胞)的识别能力下降。体外混合淋巴细胞培养的结果显示出细胞增殖下降。
4)体内注射1-2次SEB，对CD4+T细胞的抑制能力能持续7-21天；给药剂量为1.0-3.0mg/kg水平。
测定上述细胞用荧光抗体(Sigma公司购入)染色后，用流式细胞仪测定并记录结果。
将BABL/C鼠的肝脏用实施例2所述方法制成5×107细胞/ml，静脉移植给C57BL/J鼠，在移植前、后注射3.0mg/kgSEB，在转移细胞之后的不同时间用流式细胞技术检查细胞移植后受体中是否有供体的H-2Kd蛋白以及嵌合体出现的时间和强度(％)。
表4细胞移植后的第21天受体鼠肝脏中H-2Kd的百分数
结果显示进行异源性淋巴细胞移植时SEB能抑制体内排斥反应使嵌合体出现。
表5 SEB诱导嵌合体(H-2Kd)的出现的时间和数量(％)
表5结果显示注射了超抗原SEB的小鼠在细胞移植后的第21天嵌合体出现，随时间延长嵌合体增加。移植后的第40天嵌合体达到高峰，随后下降。意味着注射一次SEB的有效时间长达21-40天。
实施例4混合淋巴细胞培养方法C57BL/J小鼠在细胞移植前、后接受高剂量SEB，7天之后将BABL/C小鼠的外周淋巴细胞5×107个细胞注射给受体鼠，细胞移植后的第7-50天，取出受体鼠肝，脾脏，用常规方法将脾细胞处理成5×107-5×106个细胞/ml的悬浮液。加到96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。作为刺激原的细胞是BABL/C鼠脾细胞。细胞用RPMI1640培养基悬浮成1×107-5×106个细胞/ml置-20℃冻置1-2小时后，离心2000转/20分钟，收集碎片，用RPMI培养基将体积恢复原状，取0.1ml置于受体脾细胞的培养孔中，置37℃ 5％CO2孵箱中培养6天，MTT(四甲基偶氧唑盐，50mlMTT溶于10mlPBS除菌过滤后，使用)。染色490mu测定OD值，记录受体淋巴细胞的增殖状况。在嵌合体大量出现时，受体细胞对外源性细胞的反应性下降。证明了SEB在体内能特异性抑制CD4+T细胞，其抑制强度可以达到在受体鼠免疫系统完全不受破坏的条件下进行细胞移植，能使使嵌合体出现。嵌合体出现的同时受体淋巴细胞对外源性识别下降，证明了SEB在体内起到了特异性免疫抑制剂的作用。
表6细胞移植后的第21天受体鼠肝脏中H-2Kd的百分数和混合淋巴细胞培养的增殖指数
结果证明在做异种细胞移植时使用超抗原SEB，在细胞移植后的21-40天内的肝脏中可以检出供体鼠的H-2Kd蛋白，即在受体鼠体内出现H-2Kb/H-2Kd嵌合体。与此同时受体对H-2Kd抗原的应答反应能力下降。
权利要求
1．一种在器官移植的排斥反应中使用的免疫抑制剂，其特征是该免疫抑制剂的主要活性成分是金黄色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcal enterotoxin B。
2．权利要求1所述的免疫抑制剂，其特征是所述超抗原的使用剂量是1-3mg/kg。
全文摘要
本发明提供了一种针对在器官移植的排斥反应中使用的特异性免疫抑制剂。该免疫抑制剂的主要活性成分是一种超抗原物质－金黄色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcalenterotoxin B(即SEB)。经实验证明,在异种细胞移植中,本发明的免疫抑制剂仅抑制CD文档编号A61K39/085GK1310023SQ0110399
公开日2001年8月29日 申请日期2001年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者陈钰 申请人:陈钰