专利名称：一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法
技术领域：
本发明涉及到通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备人白细胞介素(IL-11)的方法，本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产人白细胞介素(IL-11)制备抗血栓药物的方法。
本发明提供了含有人白介素11的大肠杆菌质粒pUCIL-11，以人骨髓组织细胞mRNA为模板，通过RT-PCR扩增，在5’端引物引进Xho I酶切位点，在3’端引入BamHI位点，PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司)，构建质粒pUCIL-11。
本发明还提供了含人白介素11基因的杆状病毒转移质粒pBacIL-11。从pUCIL-11质粒用XhoI和BamHI酶切，将目的片段连在同样被Xho I和Bgl II酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司)，构建含人白介素11基因的杆状病毒转移质粒pBacIL-11(
图1)。
本发明还提供了含人白细胞介素11基因的重组家蚕杆状病毒BmBacIL11。将转移质粒pBacIL-11与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN，进行8轮空斑筛选和Southern点杂交筛选含人白介素11基因的重组杆状病毒BmBacIL11，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年8月6日，保藏编号为GMCC NO0602。
本发明还提供了人白细胞介素11基因在家蚕细胞、五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBaclL11感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBac IL11注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内，分别取24、48、72、96、120小时的家蚕幼虫和蛹淋巴血，经5000rpm 5分钟离心后取上清，稀释10倍后加等体积的2×蛋白上样缓冲液，取20ul进行12％的SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝R250染色，结果见图2，结果在家蚕细胞培养上清和细胞样品、幼虫和蛹中血液样品中都能检测得到表达产物的条带，其分子量大小与天然hIL-11的分子量相符，约为19ku。
本发明还对人白介素11的的表达产物进行了生物活性的鉴定。B9-11细胞经RPMI1640培养液洗涤2次，用全培养液(RPMI 1640培养液含10％FBS)调整细胞浓度为5×107/L，每孔100μl，加入96孔培养板，分别加入不同稀释的IL-11标准品和待测表达样品，设B9-11细胞加全培养液做阴性对照。细胞置37℃、5％CO2下培养三天，在培养终止前4小时加浓度为5mg/ml的MTT溶液，每孔100μl，培养终止后轻轻弃上清，每孔加入酸化异丙醇100μl溶解甲簪颗粒。用酶标仪测定OD值，比色波长为570nm。结果显示，将50ul重组杆状病毒BmBacIL11感染BmN家蚕细胞感染后不同时间测培养上清中的IL11活性，在感染的第3天达到8×104IU/106细胞。用BmBacIL11穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体，于感染后不同时间收集蚕血淋巴，高速离心后测血淋巴中的IL11的活性，在感染的120小时血淋巴中的IL11活性达到5.2×105IU/ml，在感染120小时蛹血淋巴的IL11活性达到8.0×105IU/ml。
本发明还提供了在家蚕幼虫表达的人白介素11进行纯化。发病3天后收集家蚕细胞，发病5天后收集家蚕幼虫和蛹血清，先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离，每次收集样品均经测活，确定其活性存在，进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化，获得纯度为99％的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达人白介素11制成口服药物。在家蚕细胞、幼虫和蛹体表达人白介素11，经过过滤(100 KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还对用家蚕幼虫和蚕蛹表达的人白介素11进行动物试验。取四周龄Balb/c小鼠(由浙江医学科学院动物中心提供)，♀♂各80只，体重均在16-18g左右，腹腔注射抗血小板抗体(购自浙江医科大学平喘药教研室)，剂量为3ml/kg，使小鼠血小板下降，腹腔注射抗血小板抗体24小时后开始给药，第一组每天每只注射0.5mg/kg纯化的人白介素11，每天给药一次，连续给药3天，第二组经口给药人白介素11口服药物，给药量为每20mg/kg，每天给药一次，连续给药7-10天，每天测定血小板变化(具体操作参照卫生部《新药临床前研究指导原则》)，结果表明所给药物都具有明确的升血小板作用。
综合所述，本发明的优点如下家蚕杆状病毒表达系统表达人白介素11具有表达效率高、表达后加工较完善等特点，因家蚕容易大量饲养、蚕体大，比其他昆虫杆状病毒表达系统具有更大的优越性，可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点，不会造成公害；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；家蚕生产的蛋白可以口服，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁，成为一条高效表达生产人IL-11的有效途径。
权利要求
1.一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于通过基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年8月6日，保藏编号为GMCC NO0602，并用该病毒接种家蚕细胞、幼虫和蛹进行表达人白细胞介素11。
2.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于所述的基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括人白细胞介素11基因的杆状病毒转移质粒pBac IL-11的构建是通过RT-PCR方法合成的人白细胞介素11基因片段，克隆进入经SmaI酶切的pUC19位点，将人白细胞介素11基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8中，获得的重组转移载体质粒pBac IL-11。
3.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于所述的基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括人白细胞介素11基因的重组家蚕杆状病毒BmBacIL11的构建是通过重组转移载体pBac IL-11 DNA与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞经8轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得重组病毒BmBacIL11。
4.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于所述的人白细胞介素11基因在家蚕细胞、幼虫和蛹中的表达是通过重组杆状病毒BmBacIL11感染家蚕细胞、五龄家蚕幼虫和蛹体表达产生。
5.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于还包括分离，纯化家蚕表达的人白细胞介素11的步骤。
6.根据权利要求5所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于还包括以家蚕为填充剂制备口服药物的步骤。
7.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，其特征在于还包括将表达人白细胞介素11的家蚕幼虫和蛹经冷冻干燥后制成口服药物的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法，属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)重组带有人白介素11基因，获得重组病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年8月6日，保藏编号为GMCC NO0602，将该重组病毒接种家蚕细胞、幼虫、蛹进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，制成注射和口服药物，经动物试验，均具有显著的增加小鼠血小板作用，成为一种制备增加血小板药物的新型方法，与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好。
文档编号A61P7/00GK1408372SQ0114218
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月17日 优先权日2001年9月17日
发明者张耀洲, 金勇丰, 吴祥甫, 郭锡杰 申请人:浙江中奇生物药业股份有限公司