先天性免疫系统指导的疫苗的制作方法

专利名称：先天性免疫系统指导的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型疫苗、该疫苗的生产和使用该疫苗的方法。更特定而言地，本发明提供包含了一种分离的病原体关联的分子范型(PathogenAssociated Molecular Pattern)(PAMP)和一种抗原的独特疫苗分子。更加特定而言地，本发明提供包含了一种分离的PAMP和一种抗原的新型融合蛋白质，以至于用这些融合蛋白质接种提供了天然T-细胞激活所需的两种信号。本发明的新型疫苗提供了一种制备并利用单一分子来诱导加强的T-细胞免疫反应的有效途径，该反应激活了适应性免疫反应的其他方面。本发明的方法和组合物提供了设计、生产和使用以特定抗原为目标的疫苗的有力途径，其中的抗原包括与选择的病原体、肿瘤、变态反应原和其他疾病相关分子有关联的抗原。
背景技术：
所有在下文中提到的文章、专利和其他材料均明确地在此处引用作为参考。
1.免疫多细胞生物对感染性介质发展了两个常规的免疫系统。这两个系统为先天性的或天然的免疫(也称为“先天性免疫”)和适应性(获得性)或特异性免疫。两个系统之间的主要差异在于它们识别感染性介质的机制。
先天性免疫系统利用一套种系编码的受体来识别在微生物中存在的保守的分子范型。这些分子范型出现在微生物某些构成成分中，包括脂多糖类、肽聚糖、脂磷壁酸质、磷脂酰胆碱、细菌-特异性蛋白质，包括脂蛋白、细菌DNA、病毒单链和双链RNA、未甲基化的CpG-DNA、甘露聚糖和许多其他细菌和真菌细胞壁的成分。这样的分子范型也可以出现在其他分子如植物生物碱中。这些先天性免疫识别的目标由于是由微生物而不是由感染的宿主生物生产的而被称为病原体关联的分子范型(PAMP)。(Janeway等人(1989)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.541-13；Medzhitov等人(1997)Curr.Opin.Immunol.944-9)。
将先天性免疫系统中识别PAMPs的受体称为范型识别受体(PRRs)。(Janeway等人(1989)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.541-13；Medzhitov等人(1997)Curr.Opin.Immunol.944-9)。这些受体在结构上有变化并属于几个不同的蛋白质家族。这些受体中的一些直接识别PAMPs(例如CD14、DEC205、collectins)，而其他的(例如补体受体)则识别由PAMP识别得到的产物。这些受体家族的成员通常可以划分为三类1)在血浆中循环的体液受体；2)在免疫细胞表面表达的内吞受体和3)可在细胞表面或细胞内表达的信号受体。(Medzhitov等人(1997)Curr.Opin.Immunol.944-9；Fearon等人(1996)Science 27250-3)。
细胞的PRRs是表达于先天性免疫系统的效应细胞上的，包括在适应性免疫中行使专业的呈递抗原细胞(APC)功能的细胞。这样的效应细胞包括但不局限于巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞和上皮。这种表达方式使得PRRs可以直接诱导先天效应物机制(innate effector mechanism)，并且也如下文所述通过诱导一组内源信号如炎症细胞因子和趋化因子的表达而将感染性介质的存在向宿主生物发出警报。后一项功能使得可以有效地动员效应物的力量以抗击侵入物。
相反，只在脊椎动物中发现的适应性免疫系统使用两种类型的抗原受体，这些受体是在每一生物个体的发育中通过体细胞机制(somaticmechanism)而产生的。这两类抗原受体为T-细胞受体(TCR)和免疫球蛋白受体(IgR)，它们分别在两种特化的细胞类型中表达，即T-淋巴细胞和B-淋巴细胞。这些抗原受体的特异性是在淋巴细胞的成熟过程中通过体细胞基因重排、受体亚基的随机配对以及在重排中模板非依赖性地向编码区添加核苷酸而随机地产生的。
新近研究证明先天性免疫系统在控制适应性免疫系统的启动和适当细胞效应物反应的诱导中起着至关紧要的作用。(Fearon等人(1996)Science 27250-3；Medzhitov等人(1997)Cell.91295-8)。实际上，已经确认原初T-淋巴细胞的激活需要两种不同的信号一种是由TCR识别的特定抗原肽，另一种是所谓的共刺激信号B7，它在APCs上表达并被在T-细胞上表达的CD28分子识别。(Lenschow等人(1996)Annu.Rev.Immunol.14233-58)。原初CD4+T-淋巴细胞的激活需要两种信号(即特定抗原和B7分子)都在相同的APC上表达。如果一个原初CD4 T-细胞在没有B7信号存在时识别了抗原，该T-细胞将通过细胞凋亡而死亡。因此，B7分子在APCs上的表达控制了原初CD4 T-淋巴细胞是否被激活。由于CD4 T-细胞控制具细胞毒素功能的CD8 T-细胞的激活和具产生抗体能力的B-细胞的激活，B7分子的表达则决定一个适应性免疫反应是否被激活。
新近研究还证明先天性免疫系统在控制B7的表达中起着至关紧要的作用。(Fearon等人(1996)Science 27250-3；Medzhitov等人(1997)Cell.91295-8)。如同前面提到的，先天性免疫识别是由识别PAMPs的PRRs介导的。PRRs对PAMPs的识别导致控制多种诱导型免疫反应基因表达的信号通路的激活，其中上述基因包括编码激活淋巴细胞所必需的信号如B7、细胞因子和趋化因子的基因。(Medzhitov等人(1997)Cell.91295-8；Medzhitov等人(1997)Nature 388394-397)。由PRR通过识别PAMPs而诱导B7表达，从而解释了自身/非自身的辨别并确保通常只有特异于微生物衍生的抗原的T-细胞被激活。该机制通常避免了特异于自身抗原的自身反应淋巴细胞的激活。
最近鉴定了控制B7分子和细胞因子表达的先天性免疫系统的受体。(Medzhitov等人(1997)Nature 388394-397；Rock等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95588-93)。这些受体属于类Toll受体(TLRs)家族，这样命名是因为它们与果蝇Toll蛋白质同源，该蛋白质参与果蝇胚胎的背腹图式发育和成体蝇的免疫反应。(Lemaitre等人(1996)Cell86973-83)。在哺乳动物生物体中，显示这样的TLRs识别诸如细菌产物LPS、肽聚糖和脂蛋白之类的PAMPs。(Schwandner等人(1999)J.Biol.Chem.27417406-9；Yoshimura等人(1999)J.Immunol.1631-5；Aliprantis等人(1999)Science 285736-9)。
2.疫苗开发传统上使用疫苗作为一种对抗由感染性介质导致的疾病的方式。然而，随着疫苗技术的进步，疫苗已经被用于另外的用途，其中包括但并不局限于哺乳动物生育的控制、激素作用的调节以及肿瘤的预防或治疗。
用于对抗疾病的疫苗的首要目的是诱导对特殊微生物的免疫记忆。更通常地，需要疫苗来诱导对特定抗原的免疫反应，不论它们属于微生物还是由肿瘤细胞或其他有病的或异常的细胞所表达的。具有特异于抗原的表面受体的B-和T-淋巴细胞的分裂和分化形成了特异性和记忆。
为了使一种疫苗可以诱导保护性的免疫反应，它必须满足以下必要条件1)它必须包含接种疫苗后成为保护性免疫的目标的特定抗原或其片段；2)它必须以一种可被免疫系统识别的形式来呈递这样的抗原，例如，一种在免疫识别前对降解有抗性的形式；以及3)它必须激活APCs来向CD4+T-细胞呈递抗原，而CD4+T细胞则诱导B-细胞分化和其他的免疫效应物功能。
常规的疫苗包含减毒的或杀死的微生物如病毒或细菌的悬液，它们自身不能诱导严重的感染，但当接种到宿主中后能够抵消未修饰的(或有毒力的)物种。现在该术语的使用已被扩展而基本上包括任何目的在于积极的免疫预防的制剂(例如杀死的有毒力的微生物菌株或活的减毒的(变异体或突变体)微生物菌株的制剂；微生物的、真菌的、植物的、原生动物的或后生动物的衍生物或产物；合成的疫苗)。疫苗实施例包括但不局限于对抗天花接种的牛痘病毒、预防破伤风的破伤风类毒素(tetanus toxoid)、预防百日咳(pertussis)的整体失活的细菌、预防链球菌所导致的肺炎的多糖、以及预防乙型肝炎的重组蛋白质。
尽管减毒的疫苗通常是免疫原性的，但是它们的使用是有限制的，这是因为它们的功效通常需要对毒力的分子决定因子的特定的、详尽的知识。此外，在疫苗中减毒的病原体的使用与多种危险因子有关联，这在大多数情况下阻止了它们在人类中的安全使用。
另一方面，合成疫苗的问题在于它们经常是无免疫原性的或无保护性的。利用可用到的佐剂来增加合成疫苗的免疫原性经常由于该佐剂自身诱导的不能接受的副作用而不是一种选择。
佐剂被定义为任何增加混合的抗原的免疫原性的物质。尽管化学药品如明矾经常被认为是佐剂，但是它们行使与载体相似的作用，它们很可能是通过稳定抗原和/或促进抗原与抗原呈递细胞的相互作用而作用的。最好的佐剂是那些模仿微生物的能力而激活先天性免疫系统的。纯的抗原因为不能诱导激活淋巴细胞所必需的共刺激信号(例如B7.1或B7.2)而不能诱导免疫反应。因此，佐剂活性的一个关键机制归因于由属于佐剂常规成分的微生物的或类微生物的携带PAMPs的成分诱导共刺激信号。(Janeway等人(1989)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.541-13)。如同上文所讨论的，PRRs对这些PAMPs的识别诱导了淋巴细胞激活(例如B7)和分化(效应物细胞因子)所必需的信号。
因为经常以较抗原多的摩尔的量使用佐剂并从而在许多没有与目标抗原接触的细胞中触发了先天性的免疫反应，该非特异性诱导先天性免疫系统以产生激活适应性免疫反应所必需的信号的反应产生了过度的炎症反应，这使得许多非常有效的佐剂在临床上不适用。最近已经批准明矾可用作临床佐剂(尽管它具有相对有限的功效)，这是因为它不是一种先天性免疫刺激物从而不会导致过度的炎症。然而，一种包括先天性免疫刺激物而又以一种不引起过度炎症的方式使用的疫苗将远远比包含抗原和佐剂如明矾的疫苗有效。将抗原与一种PAMP如细菌脂蛋白(BLP)融合可以使两种信号的化学计量最优化并调整它们对相同APC的作用，从而使当抗原与包含有先天性免疫刺激物的佐剂混合以增加其免疫原性时而产生的不需要的过度炎症反应减到最小。另外，本发明的嵌合构建体将阻止未摄入抗原的APCs的激活。在不存在目标抗原的摄入和呈递时，这样的APCs的激活可导致诱导自身免疫反应，这又是与常用的先天性免疫刺激佐剂相联系的问题之一，该问题阻止或限制了这些佐剂在人类中的应用。特别地，本发明的嵌合构建体展示了常规的补充了佐剂的疫苗所预期的基本免疫特征或性质，但该嵌合构建体不诱导佐剂经常诱导的过度的炎症反应。因而，本发明描述的疫苗方法使不想要的副作用(例如过度的炎症反应、自身免疫)减到最小或消除，并仍然诱导十分有效的特定免疫反应，提供了一种对包含抗原和佐剂混合物的疫苗的良好替代方案。
3.可选择的疫苗策略用作疫苗的免疫刺激复合物。免疫刺激复合物(ISCOMS)是包含Quil-A、胆固醇、活性皂苷佐剂和磷脂的可诱导广泛的系统性免疫反应的笼状结构物。(Mowat等人(1999)Immunol.Lett.65133-140；Smith等人(1999)J.Immunol.162(9)5536-5546)。ISCOMS适合于重复将不同抗原给予一个个体，这是因为这些复合物允许抗原进入到MHC I和II加工通路中。(Mowat等人(1991)Immunol.72317-322)。
已经将ISCOMS与修饰的可溶性蛋白质缀合物一起使用。(Reid等人(1992)Vaccine 10(9)597-602)。这些复合物也产生一种Th1型反应，正如这样一种疫苗所预期的那样。(Morein等人(1999)Methods1994-102)。
然而，与本发明的分子相反，ISCOMS是更为复杂的结构，导致了重复性和剂量的潜在问题；它们也不含有抗原和PAMP之间的缀合物。由于ISCOMS不特异性地指向APCs，它们的使用则可导致毒性和缺乏特异性的问题。
多重抗原重组疫苗。多个美国专利公开了由多重抗原肽(MAPs)组成的用作疫苗的嵌合蛋白质。例如，Klein等人被授予了一组专利(例如美国专利号6,033,668；6,017,539；5,998,169；和5,968,776)，其中描述了编码多聚体杂合体(multimeric hybrids)的基因，该杂合体包含连接到来自第二个病原体的免疫原性区域的来自第一个抗原的蛋白质的免疫原性区域。虽然专利集中在人副流感/呼吸道合胞病毒蛋白质嵌合体，但第一和第二抗原可更广泛地选自细菌和病毒病原体。尽管Klein等人期望的疫苗是融合蛋白质，但是所有的成员肽都是根据它们作为抗原的功效(即被TCR或IgR识别)而不是根据抗原与PAMPs的配对来选取的，因此该疫苗不是设计来刺激先天性免疫系统的。
Sinugalia(美国专利号5,114,713)公开了由来自Plasmodiumfalciparum(P.falciparum)的环子孢子蛋白的肽组成的疫苗，该肽可作为可与B-细胞抗原决定部位偶联的通用T-细胞抗原决定部位，例如衍生自病原性介质(例如细菌、病毒、真菌或寄生虫)的表面蛋白质。这些组合的肽可通过重组方式制备。这些通用T-细胞抗原决定部位已知不是PAMPs，它们是通过适应性免疫系统而不是通过先天性免疫系统作用的。
Russell-Jones等人(美国专利号5,928,644)公开了衍生自大肠杆菌(E.coli)的TraT蛋白质的T-细胞抗原决定部位，该蛋白质是用于制取杂合分子以提高对各种目标包括寄生虫、可溶性因子(例如LSH)和病毒的免疫反应的。因而，这些构建体提供了增加疫苗的抗原性的复杂程度的策略，从而促进了强化的或多重适应性免疫反应。然而，已知抗原决定部位并不是PAMPs，并且它们是通过适应性免疫系统而不是通过先天性免疫系统作用的。
因而，前述的发明在目的、概念、策略和作用模式上都与本发明有显著的差异。
4.对本发明新型疫苗的总的看法本发明新型疫苗包含与一种或多种抗原组合的一种或多种分离的PAMPs。在本发明的疫苗中所用的抗原可为任何类型的抗原(例如包括但不局限于病原体相关的抗原、肿瘤相关的抗原、变态反应相关的抗原、神经缺陷相关的抗原、心血管疾病相关的抗原、类风湿性关节炎相关的抗原、其他疾病相关的抗原、激素、妊娠相关的抗原、胚胎抗原和/或胎儿抗原等)。可由本发明生产的多种类型的抗原的例子在

图1中提供。
在一个优选实施方案中，疫苗是重组蛋白质、重组脂蛋白或重组糖蛋白，它们含有PAMP(例如BLP或鞭毛蛋白)和一种或多种抗原。制备本发明融合蛋白质的基本概念在图1中提供。
将本发明的疫苗给予人或动物后，该疫苗将与APCs如树突细胞和巨噬细胞相互作用。这种相互作用将有两个结果首先，疫苗的PAMP部分将与PRR如TLR相互作用并刺激一个信号通路，例如NF-κB，JNK和/或p38通路。其次，由于PAMP与TLRs和/或其他模式识别受体的相互作用，重组疫苗将依赖细胞类型、重组疫苗的大小和PAMP的特性通过吞噬作用、内吞作用或巨型胞饮作用(macropinocytosis)而摄入到树突细胞和巨噬细胞中。
TLR-诱导的信号通路的激活将导致树突细胞和巨噬细胞以及在某些情况下B-细胞对细胞因子、趋化因子、粘着分子和共刺激分子表达的诱导。疫苗的摄入将导致融合到PAMP的抗原的加工以及它们被MHC类型I和MHC类型II分子的呈递。这将产生原初T-细胞激活所必需的两种信号——特定抗原信号和共刺激信号。另外，由疫苗诱导的趋化因子(由于PAMP与TLR的相互作用)将招募原初T-细胞到APC和细胞因子如IL-12，它们将诱导T-细胞分化为Th-1效应细胞。结果，将诱导出强的T-细胞免疫反应，后者再依次激活适应性免疫反应的其他方面，例如抗原特异性B-细胞和巨噬细胞的激活。
因而，本发明的新型疫苗提供了对一种或多种特定抗原产生免疫反应而没有通常与常规疫苗相关联的不利的副作用的有效途径。
发明概述本发明通常涉及疫苗、制备疫苗的方法和使用疫苗的方法。
更明确地，本发明提供了包含一种分离的PAMP、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物和抗原或其免疫原性部分或免疫原性衍生物的疫苗。本发明一个优选的疫苗的例子是一种融合蛋白质，其包含一种PAMP、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物以及抗原或其免疫原性部分或免疫原性衍生物。
本发明的疫苗可包含任何PAMP肽或蛋白质，包括但不局限于如下的PAMPs肽聚糖、脂蛋白和脂肽、鞭毛蛋白、外膜蛋白(OMPs)、外表面蛋白质(OSPs)、细菌细胞壁的其他蛋白质成分和其他PRR配体。
本发明的一种优选的PAMP是BLP，包括由在图15中阐明的多肽SEQID NO2编码的BLP。除蛋白质PAMPs之外，在本发明中也有用的是任何非蛋白质PAMP的肽模拟物。
本发明中有用的抗原包括但不局限于那些微生物相关的和其他疾病相关的抗原，后者包括但不局限于那些变态反应原相关的和癌相关的。疫苗的抗原成分可衍生自，但不局限于细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物、后生动物、肿瘤、恶性细胞、植物、动物、人、变态反应原、激素和淀粉状蛋白-β肽。抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物可由肽、多肽、脂蛋白、糖蛋白、粘蛋白等组成。
本发明的各种疫苗包括但不局限于1)一种或多种PAMPs、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物，其结合于一种或多种抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物；2)一种PAMP/抗原融合蛋白质，包含一种或多种PAMPs、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物，以及一种或多种抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物；和3)一种修饰的抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物，其包含一段融合到脂化(lipidation)或糖基化的一致序列的前导序列，所述一致序列进一步融合到抗原或其免疫原性部分或免疫原性衍生物。
本发明也包含这样的疫苗，该疫苗进一步包含一种药学上可接受的包括但不局限于明矾的载体。
更明确地，本发明提供了包含一种或多种PAMPs、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物，以及一种或多种抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物的融合蛋白质。本发明融合蛋白质的PAMP结构域可由氨基酸、氨基酸多聚体、肽聚糖、糖蛋白和脂蛋白或任何其他合适的成分组成。本发明的融合蛋白质所用的一种优选的PAMP是BLP，包括由多肽SEQ ID NO2编码的BLP。鞭毛蛋白是本发明的融合蛋白质所用的另一种PAMP，并由访问号P04949(大肠杆菌鞭毛蛋白)和A24262(沙门氏菌鞭毛蛋白)提供(但并不局限于此)。本发明的融合蛋白质中有用的抗原结构域包括但不局限于Eα(一种衍生自小鼠MHC类型II I-E的肽抗原)、李斯特菌溶胞素、PSMA、HIV gp120、Ra5G和TRP-2。在一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白质包括一个包含以下成分的构建体一段发出脂化或糖基化一致序列的信号的前导序列，一段脂化和/或糖基化一致序列和抗原。更明确地，本发明的融合蛋白质包括一个包含前导序列-CXXN-抗原的构建体，其中的前导序列是一致序列脂化的信号，其中的X指任何氨基酸，优选地为丝氨酸。本发明中有用的前导肽的例子包括但不局限于那些选自肽SEQ ID NO3(如图15所示)、SEQ ID NO4(如图16所示)、SEQID NO5(如图17所示)、SEQ ID NO6(如图18所示)和SEQ ID NO7(如图19所示)的肽。
在另一个实施方案中，本发明也提供了一种包含分离的PAMP和抗原的融合蛋白质，其中的抗原是自身抗原。
本发明进一步提供了重组生产本发明的融合蛋白质的方法。因而，本发明提供了包含编码本发明的嵌合构建体的核苷酸序列的重组表达载体以及用这样的重组表达载体转化的宿主细胞。任何能够表达本发明的融合蛋白质的细胞都适合用作宿主细胞。这样的宿主细胞包括但不局限于细菌、酵母、昆虫、植物和动物细胞。对某些PAMPs如BLP而言宿主细胞更优选地为细菌细胞。更加优选地，宿主细胞是一种可适当地修饰(例如脂化、糖基化)融合蛋白质的PAMP结构域的细菌细胞，当必须或想要进行此类修饰时。
本发明也提供了用本发明的疫苗使动物获得免疫的方法，其中这样的方法包括但不局限于以肠胃外的、静脉内的、口服的、使用栓剂或通过粘膜表面而给予疫苗。在一个优选实施方案中被预防接种的动物是人。
免疫反应可以利用任何合适的方法来测量，包括但不局限于直接测量外周血淋巴细胞、天然杀伤细胞细胞毒性测定、细胞增殖测定、免疫细胞和亚型的免疫测定和对细胞介导的免疫的皮肤试验。
本发明也提供了通过给予本发明的一种疫苗并从而刺激TLR-介导的信号通路来治疗易对变态反应原产生变态反应的病人。
本发明还提供了通过给予本发明的一种疫苗来治疗易感或患有Alzheimer症的病人，其中目标抗原是一种与Alzheimer症有关联的肽或蛋白质，包括但不局限于淀粉状蛋白-肽。
本发明进一步地提供了一种在动物中刺激先天性免疫反应并从而加强对于外源或自身抗原的适应性免疫反应的方法，该方法包含与外源或自身抗原共同给予PAMP。
本发明也提供了一种包含与外源或自身抗原结合的PAMP的疫苗，可在动物中刺激先天性免疫反应并从而加强对外源或自身抗原的适应性免疫反应而不导致不想要的炎症水平。
另外，本发明提供了一种包含与外源或自身抗原结合的PAMP的疫苗，当给予了治疗有效量时，该疫苗可在动物中刺激先天性免疫反应并从而加强对外源或自身抗原的适应性免疫反应而不导致不想要的炎症水平。
本发明也提供了一种包含给予个体一种疫苗的步骤的治疗方法，该疫苗包含与外源或自身抗原结合的PAMP，可在动物中刺激先天性免疫反应并从而加强对外源或自身抗原的适应性免疫反应而不导致不想要的炎症水平。
本发明额外的实施方案对本领域中疫苗制备和疫苗实施的技术人员而言是众所周知的。本发明中这样明显的变化也是本发明者所期望的。
附图简述图1表示根据本发明的可选择的融合蛋白质的例子。这些融合蛋白质的变更和组合也可根据本发明的方法而制备。
图2表示产生不同的重组蛋白质疫苗的基本要点，其中的疫苗含有不同的抗原和一个触发先天性免疫反应的信号(PAMP)。每一抗原由疫苗中央部分的不同形状来代表。
图3表示BLP/Eα构建体。
图4表示BLP/Eα以剂量依赖性模式激活NF-κB。
图5表示以BLP/Eα刺激的树突细胞中IL-6的生产。
图6表示树突细胞激活的诱导和疫苗抗原通过MHC类型II通路的加工和呈递。
图7表示体外嵌合构建体BLP/Eα对特定T-细胞的免疫刺激作用。
图8表示体内嵌合构建体BLP/Eα对特定T-细胞增殖的作用。
图9表示CpG-诱导的B-细胞的激活依赖于MyD88。MyD88-/-，MyD88缺陷细胞；ICE-/-，caspase-1-缺陷细胞；B10/ScCr，衍生自C57BL/10ScCr小鼠的TLR4缺陷细胞；TLR2-/-，TLR2缺陷细胞。
图10表示在CpG刺激和CpG-DNA-诱导的IkBα降解中，由巨噬细胞生产IL-6是通过一个依赖于MyD88的信号通路介导的。
图11表示当用CpG寡核苷酸刺激时，野生型的和B10/ScCr树突细胞但不是来自MyD88-/-动物的树突细胞生产IL-12。
图12表示鞭毛蛋白融合体对NF-κB的激活。
图13表示鞭毛蛋白融合体在巨噬细胞中对NF-κB的诱导。
图14表示RAW κB细胞中的NF-κB活性图15表示SEQ ID NO3。
图16表示SEQ ID NO4。
图17表示SEQ ID NO5。
图18表示SEQ ID NO6。
图19表示SEQ ID NO7。
图20表示SEQ ID NO10。
图21表示SEQ ID NO11。
发明详述1.总体描述本发明公开了一种基于本发明者在先天性免疫领域的新近发现的疫苗设计新策略。该方法不局限于任何特定的抗原或其免疫原性部分或其衍生物(例如微生物相关的、变态反应原相关的或肿瘤相关的等)，也不局限于任何特定的PAMP或其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物。因此，术语“疫苗”在此处一般意义上用于指任何包括本发明特征的治疗的、免疫原性的或免疫刺激的组合物。在这里有关疫苗的一个更详细的定义在别处公开。
适应性免疫反应的激活需要特定的抗原或其衍生物和一种可以诱导B7在APCs上表达的信号(如PAMP)。本发明在一个单一的嵌合构建体中组合了适应性免疫反应的诱导所必需的两种信号——一种由先天性免疫系统识别的信号(PAMP)和一种由抗原受体识别的信号(抗原)。
根据本发明，PAMP和抗原都不必由多肽组成。然而，或者PAMP或者抗原或者两者可以是一种肽或多肽。在本发明的一个实施方案中，当PAMP或其免疫原性部分或其衍生物和抗原或其免疫刺激部分或其衍生物为多肽时，可用重组DNA技术来生产嵌合构建体以用于疫苗。可选择地，当肽模拟物用于替代非蛋白质抗原，例如多糖或核酸等，和/或非蛋白质PAMP如脂多糖、CpG-DNA、细菌DNA、单链或双链病毒RNA、磷脂酰胆碱、脂磷壁酸质等时，重组技术也可用于生产一种蛋白质嵌合构建体。本发明在一个实施方案中考虑在嵌合构建体的重组生产中使用BLP、细菌外膜蛋白(OMP)、细菌外表面蛋白质A(OspA)、鞭毛蛋白和其他DNA编码的PAMPs。已知这些PAMPs可诱导先天性免疫反应的激活，因此特别适用于疫苗制剂。(Henderson等人(1996)Microbiol.Rev.60316-41)。此外，已显示BLP可被TLRs识别。(Aliprantis等人(1999)Science285736-9)。描述了用BLP作为PAMP/抗原融合蛋白质的PAMP结构域的方法的细节；然而先天性免疫系统的任何诱导物都同样适合本发明的目的。
在另一个实施方案中，一种或多种PAMP模拟物替代了融合蛋白质中的PAMP。
本发明进一步提供了生产嵌合构建体的方法，其中PAMP或其免疫刺激部分或其衍生物，或者抗原或其免疫原性部分或其衍生物，或者PAMP与抗原两者是非蛋白质。通常，这些方法使用化学方法来将PAMP结合到抗原上，从而生产非蛋白质嵌合构建体。
本发明进一步提供了在肽疫苗合成中利用重组DNA技术的途径。许多在目的病原体存在的表面抗原可不受核酸编码的指导，这是由于它们不是蛋白质(例如脂多糖)或具有低的蛋白质含量(例如肽聚糖)。
本发明考虑使用这些表面抗原或其免疫原性蛋白质或其衍生物的肽模拟物，以及在疫苗中的肽模拟物的使用。
如在此处更详细讨论的，本发明考虑包含嵌合构建体的疫苗，其中的嵌合构建体包含至少一种抗原或其免疫原性部分或衍生物以及至少一种PAMP或其免疫原性部分或衍生物。因而，本发明包含含有融合蛋白质的疫苗，其中一种或多种蛋白质抗原连接到一种或多种蛋白质PAMP或PAMP的肽模拟物上。优选地，融合蛋白质具有最大的免疫原性并仅诱导适度的炎症反应。
在目标抗原或目标抗原的结构域具有相对低的分子量，并由于其小的个体而没有足够的免疫原性时，抗原或抗原结构域可充当半抗原，并可与较大的载体分子结合，以至于结合分子的分子量将足够高以引起对该抗原的强烈的免疫反应。在本发明的一个实施方案中，抗原自身充当载体分子。在本发明的另一个实施方案中，PAMP充当载体分子。在另外一个实施方案中，半抗原通过融合或结合而与疫苗的PAMP或抗原结构域结合以引起对半抗原的抗体反应。在另外一个实施方案中(不具有限制性)，当抗原和PAMP两者的分子量都低时，优选将PAMP和抗原与第三个充当载体的分子结合。这样的载体分子可以是匙孔血蓝蛋白或本领域技术人员公知的许多半抗原的载体分子中的任何一个。在另外一个实施方案中，融合蛋白质含有抗原或抗原结构域、PAMP或PAMP的一部分或PAMP模拟物以及载体蛋白质或载体肽。这样的载体蛋白质再一次可为匙孔血蓝蛋白或本领域技术人员公知的许多半抗原的载体蛋白质或载体肽中的任何一个。通过利用多重抗原蛋白质和/或相同或不同抗原蛋白质的多重结构域和/或前述的一些组合来增加抗原或抗原决定部位的数量是本发明所考虑的。也考虑的是其中的PAMPs或PAMP衍生物或PAMP模拟物的数量增加的融合蛋白质。确定PAMP对抗原结构域的最适比例以使免疫原性最大化而使炎症反应最小化是在技术人员的技术范围内的。
2.定义“适应性免疫”指适应性免疫系统，其中涉及两类在每一个体发育中通过体细胞机制产生的受体。如在此处所使用的，“适应性免疫系统”指细胞和体液免疫两者。适应性免疫系统的免疫识别是由抗原受体介导的。
“适应性免疫反应”指一种包括上述“适应性免疫系统”特征的反应。
“衔接分子”指一种可以短暂地与一些TLRs结合的分子，通过先天性免疫系统的分子介导免疫刺激，并介导细胞因子诱导的信号发放。“衔接分子”包括但不局限于骨髓分化标记88(MyD88)。
“变态反应原”指可诱导变态反应或过敏反应的抗原或抗原的一部分或衍生物。
“氨基酸多聚体”指蛋白质或肽和其他含有至少两个以肽键连接的氨基酸的多聚体，其中这样的多聚体或者不含有非肽键或者含有一种或多种非肽键。如在此处所用的，“蛋白质”包括多肽和寡肽。
“抗原”指一种特定地由适应性免疫系统的抗原受体识别的物质。因而，如在此处所用的，术语“抗原”包括抗原、具免疫原性的抗原衍生物或部分以及衍生自抗原的免疫原性分子。优选地，本发明所用的抗原是分离的抗原。本发明中特别有用的抗原包括但不局限于那些病原体相关的、变态反应原相关的或疾病相关的。
“抗原决定簇”指抗原上给定抗原受体结合的区域。
“抗原呈递细胞”或“APC”或“专业抗原呈递细胞”或“专业APC”是一种功能在于通过摄入、加工及在其表面表达抗原而触发适应性免疫反应的免疫系统细胞。这样的效应细胞包括但不局限于巨噬细胞、树突细胞和B细胞。
“抗原受体”指适应性免疫系统的两类抗原受体T-细胞受体(TCR)和免疫球蛋白受体(IgR)，它们分别在两种特化的细胞类型T-淋巴细胞和B-淋巴细胞中表达。免疫球蛋白受体的分泌形式称为抗体。抗原受体的特异性是在淋巴细胞通过体细胞基因重排、受体亚基的随机配对以及在重排中模板非依赖性地向编码区添加核苷酸的过程而成熟时随机产生的。
“嵌合构建体”指包含抗原和PAMP或PAMP模拟物的构建体，其中的抗原和PAMP包含诸如氨基酸、氨基酸多聚体、核苷酸、核苷酸多聚体、糖类、糖类多聚体、脂类、脂类多聚体或其他合成的或天然存在的化学药品或化学药品多聚体之类的分子。如此处所用的，“嵌合构建体”指其中的抗原包含一类与PAMP或PAMP模拟物联合的分子的构建体，该PAMP或PAMP模拟物可包含相同类型的分子也可包含不同类型的分子。
“CpG”指一种二核苷酸，其中一个未甲基化的胞嘧啶(C)残基紧靠在鸟嘌呤(G)残基的5’处。如此处所用的，“CpG-DNA”指一种合成的重复CpG、含有CpG基元的完整细菌DNA或其含有CpG的衍生物。CpG-DNA对B-细胞的免疫刺激作用是通过TLR介导的，并依赖于“蛋白质衔接分子”。
“衍生物”指任何在结构上与原来的分子或化合物相关的衍生的分子或化合物。如此处所用的，“衍生物”包括肽模拟物(例如PAMP模拟物)。
“结构域”指具有自身功能的蛋白质的部分。单一蛋白质中结构域的组合决定了它的总体功能。一个“抗原结构域”包含一种抗原或抗原的免疫原性部分或衍生物。一个“PAMP结构域”包含PAMP或PAMP模拟物或者PAMP或PAMP模拟物的免疫刺激部分或衍生物。
“融合蛋白质”和“嵌合蛋白质”均指任何包含两种或多种结构域的蛋白质融合体，其中的结构域选自蛋白质、肽、脂蛋白、脂肽、糖蛋白、糖肽、粘蛋白、粘肽，这样使得至少两个结构域或者来自不同的物种或者由不同基因编码，或者使得两个结构域中的一个是天然存在的而第二个结构域不是天然存在的，或者也使得两个结构域中的一个类似一种天然存在的分子而另一个不类似同一分子。术语“融合蛋白质”也指一种经过修饰而含有一段氨基酸序列的抗原或其免疫原性部分或衍生物，其中的氨基酸序列可导致对该氨基酸序列或其部分序列的翻译后修饰，其中翻译后修饰的序列是PRR的一种配体。作为另外一种对融合蛋白质的定义，在前面句子中，导致翻译后修饰而形成PRR的一种配体的氨基酸序列可包含一个一致序列，或者该氨基酸序列可包含一种前导序列和一个一致序列。
“半抗原”指一种自身无免疫原性但可结合抗原受体并可与较大的载体分子结合而具有免疫原性的小分子。
“与…关联”指两种相同或不同化学个体间的一种可逆的联合而形成一种更复杂的物质。
“与…结合”指两种相同或不同化学个体间的一种可逆的或不可逆的(例如共价的)联合而形成一种更复杂的物质。
“免疫刺激”指分子激活适应性免疫系统或者先天性免疫系统的能力。如此处所用的，“抗原”是能够刺激适应性免疫系统的分子例子，而PAMPs或PAMP模拟物是能够刺激先天性免疫系统的分子例子。如此处所用的，每一免疫系统的“激活”包括体液和/或细胞免疫反应中对抗免疫刺激分子的成分的生产。
“先天性免疫”指先天性免疫系统，它与“适应性免疫系统”不同，使用一套种系编码的受体来识别在微生物中存在的保守的分子范型。
“先天性免疫反应”指包含上述“先天性免疫系统”特征的反应。
“分离的”指相对于混和物或天然存在的材料而言，分离的或基本上提纯的物质、细胞、组织或亚细胞成分。
“连接体”指任何将一种化学部分与其他化学部分相连接的化学个体。因而，那些化学地或物理地连接PAMP和抗原的即为连接体。连接体例子包括但不局限于复杂或简单的烃、核苷、核苷酸、核苷酸磷酸酯(nucleotide phosphate)、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、氨基酸、小肽(small peptide)、多肽、糖类(例如单糖、二糖、三糖)和脂类。连接体的额外例子在此处包括的详述部分提供。不限制地，本发明也考虑使用肽键或氨基酸或肽连接体来连接多肽PAMP与多肽抗原。本发明进一步考虑通过重组DNA程序来制备这样连接的分子。连接体也可以行使间隔区的功能。
“恶性的”指侵入性的、扩散性的肿瘤。
“微生物”指太小以至于不能用肉眼看到的活生物体。微生物包括但不局限于细菌、真菌、原生动物、细微的藻类以及病毒。
“模拟物”指一种与第二种分子非常类似的分子，并具有与第二种分子相似的作用或功能。
“部分”指一个分子中的一个组成部分。虽然通常在单个分子中有两个部分，但是在单个分子中也可以有多于两个的部分。
“分子范型”指一种化学结构或基元，它一般是微生物或某些其他生物体的成分，但一般不由正常人细胞或其他正常动物细胞产生。分子范型发现于或由下列类型的分子组成脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸质、磷脂酰胆碱、脂蛋白、细菌DNA、病毒单链或双链RNAs、某些病毒糖蛋白、未甲基化的CpG-DNA、甘露聚糖和许多其他细菌、真菌和酵母的细胞壁成分等。
“非蛋白质嵌合构建体”或“非蛋白质嵌合体”指一种其中的抗原或PAMP或PAMP模拟物或者它们中的两个或多个不是氨基酸多聚体的“嵌合构建体”。
“病原体关联的分子范型”或“PAMP”指一种在微生物中而不在人类中发现的分子范型，当结合了PRR时它可以触发先天性免疫反应。因而，如此处所用的，术语“PAMP”包括任何这样的微生物分子范型，且不局限于那些与病原性微生物或微生物相关联的。如此处所用的，术语“PAMP”包括PAMP、免疫刺激的PAMP衍生物或部分以及衍生自任何PAMP的任何免疫刺激分子。这些结构体或其衍生物是先天性免疫反应的潜在起始物，并因此是包括Toll受体和TLRs的PRRs的配体。“PAMPs”是发现于或由一些分子组成的免疫刺激结构体，这些分子包括但不局限于脂多糖；磷脂酰胆碱；聚糖，包括肽聚糖；磷壁酸质，包括脂磷壁酸质；蛋白质，包括脂蛋白和脂肽；外膜蛋白(OMPs)，外表面蛋白质(OSPs)和其他细菌细胞壁的蛋白质成分和鞭毛蛋白；细菌DNAs；病毒单链或双链RNAs；未甲基化的CpG-DNA；甘露聚糖；分枝杆菌细胞膜；膜孔蛋白；以及多种其他细菌和真菌细胞壁成分，包括那些发现于酵母中的。额外的PAMP例子在此处包括的详述部分提供。“PAMP/抗原缀合物”指共价或非共价地连接的抗原和PAMP或PAMP模拟物。缀合物可包含蛋白质PAMP或抗原和非蛋白质PAMP或抗原。
“PAMP/抗原融合物”或“PAMP/抗原嵌合体”指在PAMP或PAMP模拟物与抗原之间形成的任何蛋白质融合物。
“被动免疫”指将抗体或接触过抗原的淋巴细胞给予个体以使其获得免疫。
“PAMP模拟物”指那些尽管不存在于微生物中，但由于可以结合PRR且该结合可触发先天性免疫反应而是PAMP类似物的分子。PAMP模拟物可以是天然存在的分子或部分或完全合成的分子。举个例子，但不局限于此，某些植物生物碱如紫杉醇是PRR配体，具有对先天性免疫系统的免疫刺激作用，因而表现为PAMP模拟物。(Kawasaki等人(2000)J.Biol.Chem.275(4)2251-2254)。
“范型识别受体”或“PRR”指先天性免疫系统受体家族的一种成员，当结合了PAMP、其免疫刺激部分或衍生物时它可启动先天性免疫反应。这个受体家族的成员结构上不同并属于几个不同的蛋白质家族。一些这种受体直接识别PAMPs(例如CD14、DEC205、collectins)，而其他的(例如补体受体)则识别由PAMP识别产生的产物。这些受体家族的成员通常可分为三类1)在血浆中循环的体液受体；2)在免疫细胞表面表达的内吞受体；和3)可在细胞表面或细胞内表达的信号受体。细胞的PRRs可在先天性免疫系统的效应细胞上表达，其中包括功能为适应性免疫中的专业APCs的细胞，也可以在诸如在感染时最先遇到病原体的表层上皮的细胞上表达。PRRs也可诱导一套内源信号的表达，例如炎症细胞因子和趋化因子。本发明有用的PRRs的例子包括但不局限于下面的C-型凝聚素(例如体液的如collectins(MBL)和细胞的如巨噬细胞C-型凝聚素、巨噬细胞甘露糖受体、DEC205)；含有富亮氨酸重复的蛋白质(例如Toll受体和TLRs、CD14、RP105)；清除剂(scavenger)受体(例如巨噬细胞清除剂受体、MARCO、WC1)；以及正五聚蛋白(例如C-反应蛋白质、血清、淀粉状蛋白P、LBP、BPIP、CD11b、C和CD18)。
“肽模拟物”指非常类似于非蛋白质分子且与非蛋白质分子具有相似作用或功能的蛋白质或肽。可选择的，肽模拟物可为非常类似于肽或蛋白质且与肽或蛋白质具有相似作用或功能的非蛋白质分子或非肽分子。
“药学上可接受的载体”指受体动物(一般是哺乳动物)可以耐受的载体。
“蛋白质嵌合构建体”指其中的抗原和PAMP或PAMP模拟物两者均为氨基酸多聚体的嵌合构建体。
“重组体”指通过剪接基因、基因衍生物或其他遗传材料而制得的遗传材料。如此处所用的，“重组体”也指由重组基因产生的产物(例如重组蛋白质)。
“间隔区”指任何位于两个化学部分之间用于物理地分隔此两个部分的化学个体。因而，位于PAMP或PAMP模拟物与抗原之间的化学个体即为间隔区。间隔区的例子包括但不局限于核酸(例如在两段转录的DNA之间的非转录DNA)、氨基酸、糖类(例如单糖、二糖、三糖)和脂类。
“强烈免疫反应”指由嵌合构建体诱导的免疫反应，它的强度与由与完全弗氏佐剂(CFA)混合的抗原诱导的反应大约相同或更高。
“治疗有效量”指在病人中可产生可测量的正作用的介质(例如疫苗)的量。
“类Toll受体”(TLR)指与黄猩猩果蝇(Drosophila melanogaster)的Toll蛋白质同源的受体蛋白质家族中的任何一个。TLRs也指I型跨膜信号受体蛋白质，其特征在于有一个胞外富亮氨酸重复结构域和一个胞内与白细胞介素1受体胞内部分同源的结构域。TLR家族包括但不局限于小鼠TLR2和TLR4及其同源物，特别是在其他物种包括人中的。本发明也定义了Toll受体蛋白质和TLRs，其中编码该蛋白质的核酸与编码Toll蛋白质和TLR蛋白质TLR2、TLR4和TLR家族中其他成员的核酸相比具有至少约70％的序列一致性，更优选地，具有至少约80％的序列一致性，更加优选地，具有至少约85％的序列一致性，再更优选地，具有至少约90％的序列一致性，最优选地，具有至少约95％的序列一致性。另外，本发明也考虑Toll受体和TLRs，其中这样的Toll受体和TLRs的氨基酸序列与Toll蛋白质和TLRs、TLR2、TLR4及其同源物的氨基酸序列相比具有至少约70％的序列一致性，更优选地，具有至少约80％的序列一致性，更加优选地，具有至少约85％的序列一致性，再更优选地，具有至少约90％的序列一致性，最优选地，具有至少约95％的序列一致性。
“肿瘤”指大量的以不同程度缺乏正常生长控制的增生细胞。如此处所用的，“肿瘤”包括缓慢增生的“良性”肿瘤(一种极端情况)到快速增生而侵入邻近组织的“恶性”肿瘤(另一种极端情况)。
“疫苗”指包含一种抗原和可选择的其他辅助分子的组合物，其目的在于将这样的组合物给予一个对象以刺激特定地对抗该抗原的免疫反应，并优选地造成免疫记忆，使得该对象在将来某时间遇到该抗原时可导致免疫反应的增强。其他辅助分子的例子为佐剂(它们是非特异性免疫刺激分子)和其他增强抗原的药物代谢动力学和/或药物动力学性质的分子。按照惯例，疫苗通常由作为抗原的导致疾病的生物体(适当地减毒或杀死的)或病原性生物体的一些部分组成。对减毒的生物体如减毒的病毒或减毒的细菌进行操作使得它们丧失在其天然宿主中生长的一些或全部能力。目前有一套用于制备疫苗的生物技术方法。(参见例如W.Bains(1998)《生物技术A到Z》(Biotechnology From A to Z)，SecondEdition，Oxford University Press)。各种方法包括但不局限于下面的1)由遗传上改变的病毒组成的病毒疫苗。可以设计病毒使得它们无害但仍可以在培养的动物细胞中复制(虽然有时无效率地)。另一种方法是将来自一种病原性病毒的蛋白质基因克隆入另一个无害的病毒中，使得结果所得的病毒具有病原性病毒的某些免疫学性质而不导致任何疾病。后一种方法的例子包括但不局限于，用肉类诱饵分配的用作狂犬病疫苗的改变的牛痘和腺病毒以及设计来生产血细胞凝集素和牛瘟病毒融合蛋白质的痘苗病毒；2)由细菌组成的增强的细菌疫苗，当其中的细菌死亡时用基因工程增强其作为疫苗的价值(例如对猪的大肠杆菌疫苗、对鲑鱼中疖点病的细菌疫苗)。重组DNA技术可用于删除细菌中的致病基因或将一个病原体中保护性的抗原决定部位转到一种安全的细菌中；3)生物药物疫苗由蛋白质或蛋白质的部分组成，该蛋白质或蛋白蛋的部分与病毒、真菌或细菌的外壳或细胞壁中的蛋白质相同，可以通过重组DNA方法制备；4)多重抗原肽(MAPs)是化学地附着的(通常是在聚赖氨酸骨架上的)肽疫苗，使得几种疫苗可以同时递送；5)聚蛋白疫苗由一种通过基因工程制备的单一蛋白质组成，以至于来自目的生物体的不同肽形成连续的多肽链的部分；和6)在转基因植物中生产的可用作食物以提供口服疫苗的疫苗(例如通过食用香蕉的疫苗递送)。
3.特定的实施方案A.融合蛋白质本发明部分地基于意外的发现，即包含PAMP和抗原的嵌合构建体的疫苗(例如融合蛋白质BLP/Eα)显示了常规疫苗在补充了佐剂后预期的基本免疫学特征或性质。
在一方面，本发明是基于BLP/Eα分别在巨噬细胞和树突细胞中诱导NF-κB的激活和IL-6的生产这一发现的，证明疫苗能够激活先天性免疫系统。BLP/Eα的活性与LPS的相当，并且其活性不是由内毒素的污染造成的，因为已经证明其不能被多粘菌素B抑制。
在另一方面，本发明是基于BLP/Eα融合蛋白质可诱导树突细胞的成熟这一发现的，这一点由共刺激分子B7.2在细胞表面表达的诱导所证实。此外，BLP/Eα适当地靶向抗原加工和呈递途径，并产生了一个功能性的Eα肽/MHC类型II复合物。这个结果是由使用特异于Eα肽和MHC类型II的复合物的抗体的FACS分析证实的。
此外，本发明是基于包含BLP/Eα嵌合构建体的重组疫苗可以在体外通过刺激树突细胞激活和生成T-细胞受体的特异配体(Eα/MHC-II)而激活抗原特异性T-细胞反应这一惊人的发现的。此外，用BLP/Eα对小鼠免疫的结果和作为结果而发生的抗原特异性T-细胞反应证明重组疫苗可在体内激活抗原特异性T-细胞反应。为进行比较，将小鼠用混合了完全弗氏佐剂(CFA)的Eα肽进行免疫。本发明的重组疫苗在小鼠中诱导了比由混合了CFA的Eα肽所产生的更强的免疫反应。
本发明还基于用包含本发明的嵌合构建体的重组疫苗进行免疫诱导了最小的炎症反应(与由佐剂诱导的相比)这一惊人发现。然而，如上文提到的，尽管诱异了减弱的炎症反应，该疫苗意外地诱导了强烈的免疫反应。因而，本发明描述的疫苗方法使不想要的副作用(例如过度的炎症反应)减到了最小而仍诱导十分有效的特异性免疫反应。本发明也提供了包含至少一种抗原分子或抗原结构域和至少一种PAMP或PAMP模拟物的融合蛋白质以用作疫苗。优选地，该融合蛋白质具有最大的免疫原性并只诱导适度的炎症反应。通过利用多重的抗原蛋白质和/或相同或不同抗原蛋白质的多重结构域和/或前述的一些组合来增加抗原或抗原决定部位的数量是本发明所考虑的。确定PAMP对抗原分子的最适比例以使免疫原性最大化而使炎症反应最小化或得到控制是在技术人员的技术范围内的。
利用融合系统来生产重组多肽具有几个优点。首先，异源蛋白质或肽通常被宿主的蛋白酶降解；这可通过利用一个基因融合表达系统而得以避免，尤其是对小肽。其次，已经为几种融合配偶体建立了通用且有效的提纯方案。利用一种融合配偶体作为亲和手柄可允许重组肽的快速分离。再次，通过使用不同的融合配偶体，可将重组产物定位于不同的区室或使其分泌；该策略可导致融合配偶体的提纯更容易和/或融合蛋白质的区室定向定位。
此外，有各种化学分解或酶解融合蛋白质的可用的方法可以提供获得大量想要的分解产物的有效策略。经常使用的融合系统是葡萄球菌A蛋白融合系统和合成ZZ变体，其具有IgG亲和性且被用于产生对短肽的抗体；谷胱甘肽S-转移酶融合系统(Smith等人(1998)Gene 60)；β-半乳糖苷酶融合系统；和trpE融合系统(Yansura(1990)Methods Enzym.18561)。一些这种系统是商业上可获得的试剂盒，包括载体、提纯成分和详细的说明书。
本发明也考虑具有对金属(金属离子)亲和基质的亲和力的修饰的融合蛋白质，借以通过在融合蛋白质序列中添加、缺失或替换而引入一种或多种特定的金属结合或金属螯合的氨基酸残基作为标记。最适地，将融合配偶体如抗原或PAMP序列修饰以使其含有金属螯合氨基酸标记；然而如果改变抗原和PAMP可以不对配体结合位点、活性位点或其他功能位点产生不利影响和/或不破坏蛋白质中重要的三级结构关系，则也可通过这种改变提供一个金属结合位点。这些金属结合残基或金属螯合残基可以是相同或不同的，且可以选自半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并定位以允许表达的融合蛋白质与金属结合或螯合。组氨酸是优选的金属结合残基。金属结合/螯合残基根据融合蛋白质的总体三级结构而定位，使得对金属的结合/螯合最大化且使对融合蛋白质的表达或蛋白质的生物活性的干涉最小化。
抗原、PAMP和标记的融合序列可选择性地含有连接肽。该连接肽可将标记与抗原序列或PAMP序列分隔开来。如果这样所用的连接肽编码一个以常规化学或酶方法可选择性分裂或消化的序列，那么该标记即可在提纯后与融合蛋白质的剩余部分分离。例如，在标记中选择的分裂位点可为酶分裂位点。合适的酶分裂位点的例子包括蛋白酶的切割位点，如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原酶和凝血酶。作为选择地，连接体中的分裂位点可以是当暴露于一种选择的化学药品中(例如溴化氰、羟胺或低pH)时能够分裂的位点。
在选择的分裂位点的分裂使得标记与抗原/PAMP融合蛋白质分离。于是可获得提纯形式的抗原/PAMP融合蛋白质，不含任何以前连接了以易于表达或提纯的肽片段。如果将分裂位点插入到本发明的融合序列中有用的连接体上，该分裂位点不限制本发明。任何想要的分裂位点都可用于此目的，其中的许多都是本领域所公知的。
本发明的融合蛋白质中可选择的连接肽可以充当除提供分裂位点之外的用途。如在一个实施例中，但并不限于此，可将连接肽插入到PAMP和抗原之间以防止或减轻两个结构域间的空间位阻。另外，连接肽可供给翻译后的修饰，包括但并不限于此，例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸盐化位点、羧化位点、脂化位点、糖基化位点等。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质含有一个在其氨基端或羧基端直接融合到PAMP序列上的抗原序列。在另一个实施方案中，本发明的包含抗原和PAMP序列的融合蛋白质在其氨基端或羧基端直接融合到一个标记序列上。结果所得的融合蛋白质是可溶性胞质融合蛋白质。在另一个实施方案中，融合蛋白质进一步包含一个在抗原序列和PAMP序列或标记序列之间插入的连接体序列。该融合蛋白质也是以可溶性胞质蛋白质生产的。
B.抗原如在此处所用的，“抗原”是任何在任一潜伏期(在人中通常为数天或数星期)后可诱导敏感性和/或免疫反应性状态，并且在体内或体外可显而易见地与敏化的对象的抗体和/或免疫细胞反应的物质。抗原的例子包括但不局限于(1)微生物相关的抗原，尤其是病原体如病毒、真菌或细菌的抗原、或衍生自它们的免疫原性分子；(2)“自身”抗原，共同包含细胞抗原(包括含有正常移植抗原和/或肿瘤相关的抗原的细胞)、RR-Rh抗原和特有于或特异于特殊细胞或组织或体液的抗原；(3)变态反应原相关的抗原，例如那些与环境变态反应原(例如草、花粉、霉、灰尘、昆虫和鳞屑)、职业变态反应原(例如乳汁、鳞屑、氨基甲酸乙酯、环氧树脂)、食物(例如有壳的水生动物、花生、蛋、奶制品)、药物(例如抗生素、麻醉剂)相关联的；和(4)疫苗(例如流感疫苗)。
T-淋巴细胞的抗原加工和对展示的肽的识别很大部分是依赖于抗原的氨基酸序列而不是抗原的三维结构的。因而，在本发明的疫苗中所用的抗原部分可含有抗原决定部位或目的特定结构域而不是全部序列。事实上，本发明的疫苗的抗原部分可包含一种或多种抗原的免疫原性部分或衍生物而不是整个抗原。此外，为了使B-淋巴细胞对抗原的空间抗原决定部位产生抗体反应，本发明的疫苗可含有具有完整三维结构的整个抗原或保持了抗原决定簇三维结构的抗原的部分。
1.病原体相关的抗原。病原体相关的抗原的特定例子包括，但不局限于牛痘、禽痘病毒、火鸡流感病毒、牛白血病病毒、猫白血病毒、禽流感、鸡肺病毒(chicken pneumovirosis virus)、犬细小病毒、马流感、FHV、新城疫病毒(NDV)、鸡/Pennsylvania/1/83流感病毒、感染性支气管炎病毒、登革病毒、麻疹病毒、风疹病毒、假狂犬病、EB病毒、HIV、SIV、EHV、BHV、HCMV、汉坦病毒、C.tetani、腮腺炎病毒、麻疹病毒(morbillivirus)、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒、流感病毒、沙门氏菌(Salmonella)、奈瑟球菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)、衣原体(Chlamydia)、包特菌属(Bordetella)和疟原虫属(Plasmodium)和弓形虫属(Toxoplasma)、隐球菌属(Cryptococcus)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、Diptheria、破伤风(Tetanus)、百日咳(Pertussis)、埃希氏菌属(Escherichia)、念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、内变形虫(Entamoeba)、贾第虫(Giardia)和Trypanasoma。
2.癌相关的抗原。本发明的方法和组合物也可用于生产对抗肿瘤关联的蛋白质抗原的疫苗，其中的抗原为黑素瘤关联的抗原、乳癌关联的抗原、结肠直肠癌关联的抗原、前列腺癌关联的抗原等。
在这样的疫苗中有用的肿瘤相关的或组织特异性蛋白质抗原的例子包括但不局限于选自下表中的抗原。
肿瘤为了产生增生细胞和恶性细胞，它们必须形成血管。防止肿瘤血管生成的策略在治疗上具有潜力。本发明的方法和组合物也可被用于生产对抗肿瘤血管生成的疫苗。这样的疫苗的目标抗原的例子为血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子受体等。
3.变态反应原相关的抗原。本发明的方法和组合物可被用于防止或治疗变态反应和哮喘。根据本发明，可将一种或多种蛋白质变态反应原连接到一种或多种PAMPs上，制得PAMP/变态反应原嵌合构建体，并将其给予对该抗原有变态反应的对象。因而，本发明的方法和组合物也可被用于构建可以抑制变态反应的疫苗。在这种情况下，变态反应原与一种结合到TLR上后可启动Th1反应的PAMP关联或结合，该PAMP包括但不局限于BLP或鞭毛蛋白。例如，通过TLR对先天性免疫的启动趋向于具有生产并分泌细胞因子如IL-12的特征，这引起了对象中一种所谓的Th1反应而不是一般的Th2反应，后者触发B-细胞产生免疫球蛋白E(一般变态和/或过敏反应的起始物)。树突细胞和巨噬细胞在PAMP结合到它们的TLRs上时产生的IL-12将指导T-细胞分化为Th1效应细胞。由Th1细胞产生的细胞因子如干扰素-γ将阻断产生IL-4的Th2细胞的分化，从而阻止了作为造成变态反应的原因的IgE同型抗体的产生。
本发明的方法和组合物中有用的变态反应原相关的蛋白质抗原的特定例子包括但不局限于衍生自花粉的变态反应原，例如那些衍生自诸如日本雪松(柳杉属，日本柳杉(Cryptomeria japonica))之类树的、那些衍生自诸如果园草(鸭茅属，鸭茅(Dactylis glomerata))之类草(禾本科)的、那些衍生自诸如豚草(豚草属，豚草(Ambrosiaartemisiifolia))之类杂草的；花粉变态反应原的特定例子，包括日本雪松花粉变态反应原Cry j 1(J.Allergy Clin.Immunol.(1983)7177-86)和Cry j 2(FEBS Letters(1988)239329-332)和豚草变态反应原Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3、Amb a I.4、Amb a II等；衍生自真菌(曲霉、念珠菌、交链孢属等)的变态反应原；衍生自螨(来自屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)等的变态反应原；螨变态反应原的特定例子，包括Der p I、Der p II、Der p III、Der p VII、Der f I、Derf II、Der f III、Der f VII等)的变态反应原；房屋灰尘；衍生自动物皮肤碎片、排泄物和毛发的变态反应原(例如猫变态反应原Fel d I)；衍生自昆虫的变态反应原(例如蛾、蝴蝶、摇蚊科等的鳞状毛或鳞，胡蜂科的毒物，例如金环胡蜂(Vespa mandarinia))；食物变态反应原(蛋、奶、肉、海产食品、豆类、谷类、水果、坚果和蔬菜等)；衍生自寄生虫(例如蛔虫和线虫，如异尖线虫(Anisakis))的变态反应原；以及基于蛋白质或肽的药物(例如胰岛素)。许多这些变态反应原都是商业上可获得的。
在另一个实施方案中，对慢性变态反应的预防治疗可通过给予一种蛋白质PAMP而实现。在一个优选实施方案中，预防性疫苗的PAMP是OMP，更优选地是OspA，最优选地是BLP。作为选择地，鞭毛蛋白可用作PAMP。
4.其他疾病抗原。本发明中还考虑的是对抗与除癌、变态反应和哮喘之外的疾病相关联的抗原的疫苗。如许多例子中的一个，但不限于此，称为“淀粉状蛋白-β肽”的β-淀粉样前体蛋白质的蛋白质分裂产物在细胞外的积聚与Alzheimer症的发病机理相关联。(Janus等人，Nature(2000)408979-982；Morgan等人，Nature(2000)408982-985)。因而，本发明疫苗中所用的嵌合构建体可包括淀粉状蛋白-β肽或淀粉状蛋白-β肽的抗原性结构域(作为构建体的抗原性部分)和PAMP或PAMP模拟物。在其方疾病的例子中，可以生产针对自身蛋白质或自身肽的疫苗，所述其它疾病列于下表中。
C.PAMPsPAMPs是由一大组微生物所共有的分立的分子结构。它们是微生物新陈代谢的保守产物，不易产生抗原变异性且区别于自身抗原。(Medzhitov等人(1997)Current Opinion in Immunology 94)。
PAMPs可由下列类型的分子组成或在其中发现，但不局限于这些分子鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)、膜孔蛋白、脂质A-关联的蛋白质(LAP)、脂多糖、菌毛蛋白质、未甲基化的CpG基元、细菌DNAs、双链病毒RNAs、甘露聚糖、细胞壁关联的蛋白质、热休克蛋白质、糖蛋白、脂质、细胞表面多糖、聚糖(如肽聚糖)、磷脂酰胆碱、磷壁酸(例如脂磷壁酸质)、分枝杆菌细胞壁成分/膜、细菌脂蛋白(BLP)、外膜蛋白(OMP)和外表面蛋白质A(Osp A)。(Henderson等人(1996)Microbiol.Review60316；Medzhitov等人(1997)Current Opinion in Immunology 94-9)。
本发明优选的PAMPs包括那些含有DNA-编码的蛋白质成分如BLP、奈瑟氏菌属膜孔蛋白、OMP、鞭毛蛋白和OspA的，因为这些可被用作融合配偶体以准备本发明优选的实施方案，即包含PAMP和抗原(优选地为自身抗原)的融合蛋白质。本发明所用的一种优选的PAMP是BLP，因为已知BLP可诱导先天性免疫反应的激活(Henderson等人(1996)Microbiol.Review 60316)并显示可以被TLRs识别(Aliprantis等人(1999)Sciences 285763)。类似地，也证实了鞭毛蛋白可诱导先天性免疫的性质(Eaves-Pyles等人(2001)J.Immunol.1661248；Gewirtz等人(2001)J Clin Invest.10799；Aderem，Presentation at KeystoneSymposium，Keystone，CO，2001)。
此外，本发明考虑可被先天性免疫系统识别的PAMPs的衍生物、部分、局部或肽来产生疫苗。如此处所用的，术语“PAMP的片段”、“PAMP的部分”、“PAMP的局部”和“PAMP的肽”均指整个PAMP分子中的免疫刺激部分。因而，在本发明的疫苗中所用的PAMPs可包含PAMP的一个免疫刺激部分或衍生物而不是整个PAMP，例如大肠杆菌胞壁质脂蛋白氨基酸1到24。
在另一个实施方案中，本发明考虑非蛋白质PAMPs的肽模拟物。多糖和肽聚糖的肽模拟物是本发明所用的肽模拟物的例子。本发明考虑用噬菌体选择方法来鉴定这些非蛋白质PAMPs的肽模拟物。例如，一种针对非蛋白质PAMP产生的抗体可被用于筛选含有随机短肽序列的噬菌体库。将选择的序列分离并测定以确定其作为本发明嵌合构建体中非蛋白质PAMP的蛋白质衍生物的有效性。这样的肽模拟物可用于生产此处所公开的重组疫苗。
在另外一个实施方案中，本发明考虑PAMP的模拟型(mimics)或PAMP的模拟物的类似物，其中氨基酸和/或肽的类似物分别替代了含有肽的PAMP或蛋白质PAMP的氨基酸和/或肽残基。
在另一个实施方案中，嵌合构建体是一个包含CpG或CpG-DNA和一种抗原的构建体。CpG或CpG-DNA可与蛋白质或非蛋白质抗原结合。另外，可制得模仿了CpG的结构、功能、抗原性或免疫原性性质的CpG或CpG-DNA的肽模拟物，并将其用于产生一种抗原-PAMP(其中PAMP是一种CpG肽模拟物)蛋白质嵌合构建体。该嵌合构建体可通过重组DNA技术制得，表达的融合蛋白质可被用于本发明的组合物和方法。
D.肽模拟物本发明也包括一种PAMP或抗原的三维结构的模拟物。特别地，本发明也包括非常类似非肽PAMPs和抗原的三维结构的肽。这样的肽分别向非多肽PAMPs或抗原提供了替换物，这是通过提供以下优点而实现的，如更经济的生产、更好的化学稳定性、增强的药学性质(半衰期、吸收性、效能、效力)和/或改变的特异性(例如广谱的生物活性)以及其他优点。
相反地，PAMP和/或抗原蛋白质的类似物可以这样合成以使得一种或两者部分或整个地由氨基酸和/或肽类似物组成。这样的类似物可含有非天然存在的氨基酸，或天然存在但在蛋白质中不常见的氨基酸，包括但不局限于D-氨基酸或如β-丙氨酸、鸟氨酸或刀豆氨酸等的氨基酸，其中许多都是本领域所公知的。作为选择地，PAMP和/或抗原的类似物可以这样合成以使得一种或两者部分或整个地由含有非肽键的肽类似物组成，其中许多例子都是本领域所公知的。这样的类似物当与天然存在的PAMP和/或抗原相比时，可提供更好的化学稳定性、增强的药学性质(半衰期、吸收性、效能和效力等)和/或改变的特异性(例如广谱的生物活性)以及其他优点。
在一种形式中，考虑的分子结构是模仿蛋白质二级结构元件的含有肽的分子。(参见如Johnson等人(1993)Peptide Turn Mimetics，inBiotechnology and Pharmacy，Pezzuto等人，(editors)Chapman andHall)。预期这样的分子可允许与天然分子相似的分子间相互作用。
在另一种形式中，肽类似物通常被作为非蛋白质药物而用于药物产生中，其性质与原来的肽的性质类似。这些类型的非肽化合物也被称为“肽模拟物”或“肽的模拟物(peptidomimetics)”(Fauchere(1986)Adv.Drug Res.15，29-69；Veber等人(1985)Trends Neurosci.8392-396；Evans等人(1987)J.Med.Chem.301229-1239)并通常用电脑化的分子模拟来开发。
与治疗上有用的肽在结构上类似的肽模拟物可被用于产生同等的治疗或预防作用。通常，肽模拟物在结构上与范例多肽类似(例如一种具有生化性质或药学活性的多肽)，但有一或多个肽键选择性地被由选自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、-CH2SO-等的键替代。(Morley(1980)Trends Pharmacol.Sci.1463-468(一般性评论)；Hudson等人(1979)Int.J.Pept.ProteinRes.14177-185(-CH2NH-、CH2-CH2-)；Spatola等人(1986)Life Sci.381243-1249(-CH2-S)；Hann(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1307-314(-CH＝CH-，顺式和反式)；Almquist等人(1980)J.Med.Chem.231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等人(1982)Tetrahedron Lett.232533(-COCH2-)；Holladay等人(1983)Tetrahedron Lett.244401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby(1982)Life Sci.31189-199(-CH2S-)；其中每一个都在此处引用作为参考)。
肽模拟物的标记通常涉及直接或通过一个间隔区(例如酰胺基团)以共价方式向肽模拟物的非干扰位置附加一种或多种标记，其中的非干扰位置是由定量的结构-活性数据和分子模拟所预测的。这样的非干扰位置一般是不与大分子形成直接接触的位置(例如，在本实施例中它们是PAMP-PRR复合物中的非接触位点)，其中肽模拟物结合于所述大分子上以产生治疗效果。肽模拟物的衍生(例如添加标记)不应在本质上干扰肽模拟物的想要的生物学或药学活性。
PAMP肽模拟物可由基于结构的药物设计通过用有机部分替代氨基酸而构建出来。(Hughes(1980)Philos.Trans.R.Soc.Lond.290387-394；Hodgson(1991)Biotechnol.919-21；Suckling(1991)Sci.Prog.75323-359)。
肽模拟物的设计可由鉴定能增强或减弱PAMP结合到其PRR的氨基酸突变来协助。可用的方法包括酵母双杂交方法(Chien等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889578-9582)和噬菌体展示方法。双杂交方法探测酵母中的蛋白质-蛋白质相互作用。(Fields等人(1989)Nature340245-246)。噬菌体展示方法探测固定化了的蛋白质与在噬菌体如λ和M13表面表达的蛋白质之间的相互作用。(Amberg等人(1993)Strategies 62-4；Hogrefe等人(1993)Gene 128119-126)。这些方法允许对蛋白质-蛋白质相互作用的正选择和负选择以及决定这些相互作用的序列的鉴定。
肽合成的常规方法是本领域所公知的。(Jones(1992)氨基酸和肽的合成(Amino Acid and Peptide Synthesis)，Oxford University Press；Jung(1997)组合肽和非肽文库手册(Combinatorial Peptide andNonpeptide LibrariesA Handbook)，John Wiley；Bodanszky等人(1993)肽化学实用教程(Peptide Chemistry-A Practical Textbook)，SpringerVerlag)。
E.鞭毛蛋白PAMPs细菌鞭毛是由结构蛋白质鞭毛蛋白组成的，该蛋白质在人和小鼠细胞中诱导趋化因子IL-8的表达和NF-κB的激活。此外，鞭毛蛋白通过类Toll受体TLR5激活哺乳动物细胞。这些发现，以及鞭毛蛋白在细菌中极其保守的事实显示鞭毛蛋白是一种可由先天性免疫系统识别的病原体关联的分子范型(PAMP)。
因为鞭毛蛋白是一种蛋白质和PAMP，它也适合用于产生重组融合疫苗。如同在下面实施例部分所描述的，检验了一系列的融合构建体激活哺乳动物先天性免疫系统的能力。在实验中，NF-κB的激活被用作示值读数(read-out)，因为它是指示触发类Toll受体的重要通路，并且已显示它是重组融合疫苗的一个性质。
F.PAMPs的保守变型本发明也考虑识别相应的PRRs的天然存在的蛋白质PAMPs、PAMPs肽和PAMPs肽模拟物的保守变型。这样的变型是PAMP模拟物的例子。保守的变型包括用一种氨基酸替代下述一组中的另一种氨基酸的突变1.小的脂肪族的、非极性的或轻度极性的残基Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；2.极性的、带负电荷的残基及其酰胺Asp、Asn、Glu和Gln；3.极性的、带正电荷的残基His、Arg和Lys；4.大的脂肪族的、非极性的残基Met、Leu、Ile、Val和Cys；和5.芳香族的残基Phe、Tyr和Trp。
所选择的替代类型可基于不同物种的PAMPs中氨基酸替代频率的分析(Schulz等人，蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978，pp.14-16)，也可基于由Chou和Fasman发展的结构形成潜力的分析(Chou等人(1974)Biochemistry 13211；Schulz等人，蛋白质结构原理(Principles in Protein Structure)，Springer-Verlag，1978，pp.108-130)以及基于由Kyte和Doolittle发展的蛋白质疏水性模式分析(Kyte等人(1982)J.Mol.Biol.157105-132)。
本发明也考虑不影响PAMP结合到其PRR能力的保守变型。本发明包括改变了总电荷、结构、疏水性/亲水性的PAMPs，这些改变是通过氨基酸替代、插入或缺失来产生的并且保持和/或改善与它们的受体结合的能力。优选地，突变的PAMP与其相应的野生型PAMP相比，具有至少约70％的序列一致性，更优选地，具有至少约80％的序列一致性，更加优选地，具有至少约85％的序列一致性，再更优选地，具有至少约90％的序列一致性，最优选地，具有至少约95％的序列一致性。
确定同源性百分比的众多方法是本领域所公知的。6.0版的GAP计算机程序可由威斯康星大学遗传计算机组(University of WisconsinGenetics Computer Group)提供，并利用了经由Smith和Waterman改进的Needleman和Wunsch的比对方法。(Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48443；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2482)。确定一致性百分比的众多方法也是本领域所公知的，一个优选的方法是使用也是由威斯康星大学遗传计算机组提供的FASTA计算机程序。
G.组合治疗本发明提供了治疗对象的方法，包括给予对象抗体或激活的免疫细胞而被动地使个体获得免疫，并给予一种包含本发明融合蛋白质的疫苗，优选地，其中所给予的抗体或激活的免疫细胞是针对疫苗的融合蛋白质的同一抗原的。这样的治疗可为顺序进行的，按照顺序或同时进行。这种组合治疗考虑使用针对PAMP/抗原融合体的抗原的单克隆或多克隆抗体。
本发明提供了治疗对象的方法，包括给予对象抗体或激活的免疫细胞而被动地使个体获得免疫，并给予一种包含本发明嵌合构建体的疫苗，优选地，其中所给予的抗体或激活的免疫细胞是针对与嵌合构建体的抗原相同的抗原的。这样的治疗可为顺序进行的，按照顺序或同时进行。这种组合治疗考虑使用针对PAMP/抗原嵌合构建体的抗原的单克隆或多克隆抗体。
本发明也考虑包含本发明的嵌合构建体的疫苗的使用与第二种非免疫指导的治疗相组合。这样的组合治疗的一个非限制性的实施例是包含本发明一种融合蛋白质的疫苗与一种化疗剂如抗癌化疗剂的组合。这样的组合治疗的一个进一步的非限制性的实施例是包含本发明一种融合蛋白质构建体的疫苗与一种抗血管生成剂的组合。这样的组合治疗的一个进一步的非限制性的实施例是包含本发明一种融合蛋白质的疫苗与一种放射治疗如抗癌的放射治疗的组合。这样的组合治疗的一个更加进一步的非限制性的实施例是包含本发明一种融合蛋白质的疫苗与外科方法如去除或减少血管封阻的外科方法的组合。
本发明也考虑的是多于一种的其他治疗手段与本发明的疫苗的组合。一个非限制性的实施例是本发明的疫苗与被动免疫疗法治疗和化疗治疗的组合。在这样的组合治疗中，治疗可为顺序的或同时的。
PAMP结构域可包含整个PAMP或PAMP的免疫刺激部分。优选地，融合蛋白质具有最大的免疫原性且诱导最小的炎症反应。这样的想要的性质例如可通过使用两种或多种不同的抗原和/或不同抗原的部分，和/或通过使用多于一个拷贝的相同抗原或相同抗原的部分，和/或通过两者的组合来得到。作为选择地，可用到两种或多种不同的PAMPs或不同PAMPs的部分，和/或两个或多个拷贝的相同PAMP或相同PAMP的部分，和/或两者的组合。一个进一步的实施方案考虑包含多重抗原和/或抗原的部分以及多重PAMPs和/或PAMPs的部分的融合蛋白质。确定PAMP对抗原结构域的想要的比例以使免疫原性最大化而使炎症反应最小化是在技术人员的技术范围内的。
利用融合系统来生产重组多肽具有几个优点。首先，异源蛋白质或肽通常被宿主的蛋白酶降解；这可通过利用一个基因融合表达系统而得以避免，尤其是对小肽而言。其次，已为几种融合配偶体建立了通用且有效的提纯方案。利用一种融合配偶体作为亲和手柄可允许重组肽的快速分离和纯化。再次，通过使用不同的融合配偶体，可将重组产物定位于不同的区室或使其分泌；该策略可导致融合配偶体的提纯更容易和/或融合蛋白质的区室定向定位。
此外，有各种化学分解或酶解融合蛋白质的可用的方法可以提供获得大量想要的肽的有效策略。经常使用的融合系统包括具有IgG亲和性且被用于产生对短肽的抗体的葡萄球菌A蛋白融合系统和合成ZZ变体；谷胱甘肽S-转移酶融合系统(Smith等人(1998)Gene 60)；β-半乳糖苷酶融合系统；和trpE融合系统(Yansura(1990)Methods Enzym.18561)。一些这种系统是商业上可获得的试剂盒，包括载体、提纯成分和详细的说明书。
本发明也考虑具有对金属离子亲和基质的亲和力的修饰的融合蛋白质，通过在融合蛋白质序列中添加、缺失或替换而以标记方式引入一种或多种特定的金属结合或金属螯合的氨基酸残基。最适地，将或为抗原或为PAMP结构域的融合配偶体修饰以使其含有一个附加的金属螯合氨基酸标记。然而如果改变抗原或PAMP结构域的序列可以不对配体结合位点、活性位点或其他功能位点产生不利影响和/或不破坏蛋白质中重要的三级结构关系，则也可通过这种改变提供一个金属结合位点。这些金属结合位点或金属螯合位点可以是相同或不同的，且可以选自半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并定位以允许表达的融合蛋白质与金属结合或螯合。组氨酸是优选的金属结合残基。金属结合/螯合残基根据融合蛋白质的总体三级结构定位，使得对金属的结合/螯合最大化且使对融合蛋白质的表达和其生物活性的干涉最小化。
抗原、PAMP和标记的融合序列可含有一个连接肽。该连接肽可将标记与抗原序列或PAMP序列分隔开来。如果这样所用的连接肽编码一个以常规化学或酶方法可选择性分裂或消化的序列，那么该标记即可在提纯后与融合蛋白质的剩余部分分离。例如，在标记中选定的分裂位点可为酶分裂位点。合适的酶分裂位点例子包括蛋白酶的分裂位点，如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原酶、凝血酶等。作为选择地，连接体中的分裂位点也可以是当暴露于一种选择的化学药品或条件例如溴化氰、羟胺、或低pH、或其他本领域中公知的化学药品或条件中时能够分裂的位点。
在选择的分裂位点的分裂使得标记与抗原/PAMP融合蛋白质分离。于是可获得提纯形式的抗原/PAMP融合蛋白质，不含任何以前连接了以易于表达或提纯的肽衍生物。如果将分裂位点插入到本发明的融合序列中有用的连接体上，该分裂位点不限制本发明。任何想要的分裂位点都可用于此目的，其中的许多都是本领域所公知的。
连接肽的另一个用途是在细胞内加工时指导抗原分裂以使得易于在APC表面呈递肽。合适的分裂位点可通过连接体插入，使得融合蛋白质在被APC内化前不被分裂。在这种情况下，这样一个肽分裂位点可通过连接体引入到PAMP和抗原之间以产生无PAMP的细胞内抗原。这样的定向分裂也可被独特地用于促进APC中特定肽的产生，已鉴定这些肽与特定的HLA单元型相互作用。作为选择地，来自单一抗原或多于一种抗原的不同结构域可被包含分裂位点的连接体隔离，以使得这些抗原决定部位可被适当加工以在APC表面呈递。
本发明的融合蛋白质中可选择的连接肽可以充当除提供分裂位点之外的用途。如在一个实施例中，但并不限于此，可将连接肽插入到PAMP结构域和抗原结构域之间以防止或减轻两个结构域间的空间位阻。另外，连接肽可给翻译后的修饰提供一些东西，包括但并不限于，例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸盐化位点、羧化位点、糖基化位点、脂化位点等。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质含有一个在其氨基端或羧基端直接融合到PAMP结构域或PAMP的免疫刺激部分上的抗原结构域或抗原的免疫原性部分。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含PAMP结构域、或PAMP的免疫刺激部分、或插入到抗原结构域或抗原的免疫原性部分中的并可在翻译后修饰而产生PAMP的序列。在另外一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含插入到PAMP结构域、或PAMP的免疫刺激部分、或可在翻译后修饰而产生PAMP的序列中的抗原结构域或抗原的免疫原性部分。另一个实施方案中，本发明的包含抗原和PAMP序列的融合蛋白质在其氨基端或羧基端直接融合到一个标记序列上。结果所得的融合蛋白质是可溶性胞质融合蛋白质。在另一个实施方案中，融合蛋白质进一步包含一个在抗原序列和PAMP序列或标记序列之间插入的连接体序列。该融合蛋白质也是以可溶性胞质蛋白质生产的。
H.重组技术蛋白质PAMPs、蛋白质抗原及其衍生物可利用标准肽合成技术生成。作为选择地，重组技术可被用于生成编码蛋白质PAMPs、蛋白质抗原及其衍生物的核酸分子。
编码PAMP/抗原融合体的核酸(如合成的寡-或多核苷酸)可很容易地由化学技术合成，例如Matteucci等人((1981)J.Am.Chem.Soc.1033185-3191)的磷酸三酯法或使用自动合成方法。另外，更大的核酸可容易地由众所周知的方法制备，如合成一组定义编码PAMP/抗原融合体的核酸的各种模块片段的寡核苷酸，随后连接这些寡核苷酸以构建完整的核酸分子。
本发明进一步提供了编码PAMP/抗原融合蛋白质的重组核酸分子。如在此处所用的，“重组核酸分子”指在体外经过分子操作的核酸分子。生成重组核酸分子的方法是本领域所公知的。(Sambrook等人(1989)分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Press)。在优选的重组核酸分子中，将一个编码PAMP/抗原融合体的核苷酸序列可操作地连接到一种或多种表达控制序列和/或载体序列上。
如本领域所公知的，本发明中编码PAMP/抗原融合体的核苷酸序列可操作地连接到的载体序列和/或表达控制序列的选择直接依赖于想要的功能性质(如蛋白质表达)和要转化的宿主细胞。本发明考虑的载体至少能够指导编码PAMP/抗原融合体的核苷酸序列复制或插入到宿主染色体，优选地也表达所述核苷酸序列。
用于调节可操作地连接的蛋白质编码序列表达的表达控制元件是本领域中公知的，并包括但不局限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子、转录终止子和其他调节元件。优选地，使用了一种易于控制的诱导型启动子，例如可对培养基营养作出响应的。
在一个实施方案中，包含一个编码PAMP/抗原融合体的核酸分子的载体将包括原核复制子，例如具有在所转化的原核宿主细胞如细菌宿主细胞中指导自主复制和使重组核酸分子维持在染色体内的能力的核苷酸序列。这样的复制子是本领域中公知的。另外，包括原核复制子的载体也可以包括一个其表达可授予一个可探测的标记如药物抗性的基因。一般的细菌药物抗性基因是那些授予对氨苄青霉素(Amp)或四环素(Tet)抗性的。
包括原核复制子的载体可进一步包括一个能够指导PAMP/抗原融合体在细菌宿主细胞如大肠杆菌中表达(转录和翻译)的原核或病毒启动子。启动子是一个由核酸序列形成的并且允许RNA聚合酶结合并发生转录的表达控制元件。与细菌宿主兼容的启动子序列一般是由含有便利的限制性位点以插入本发明的核酸片段的质粒载体提供的。一般这样的载体质粒是由Biorad Laboratories(Richmond，CA)提供的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329，由Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ提供的pPL和pKK223。
与真核细胞兼容的表达载体，优选地为那些与脊椎动物细胞兼容的载体，也可被用于表达含有编码PAMP/抗原融合体的核苷酸序列的核酸分子。真核细胞表达载体是本领域中公知的且有几个商业来源。一般地，这样的载体提供了插入想要的DNA片段的便利的限制性位点。一般这样的载体是pSVL和pKSV-10(Amersham Pharmacia Biotech)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)、pTDT1(ATCC，#31255)、此处所描述的载体pCDM8和其他类似真核表达载体。
用于构建本发明的重组分子的真核表达载体可进一步包括在真核细胞中有效的选择性标记，优选地为药物抗性选择性标记。一个优选的药物抗性标记是其表达导致新霉素抗性的基因，例如新霉素磷酸转移酶(neo)基因。(Southern等人(1982)J.Mol.Anal.Genet.1327-341)。作为选择地，选择性标记可位于不同的质粒上，将两个载体通过共转染宿主细胞而引入，并通过在针对选择性标记的合适药物存在时培养而选择。
本发明进一步提供了用编码本发明的PAMP/抗原融合蛋白质的核酸分子转化的宿主细胞。该宿主细胞可为原核的或真核的。可用于表达PAMP/抗原融合蛋白质的真核细胞是不受限制的，只要细胞系与细胞培养方法兼容，并与表达载体的增殖和融合蛋白质的表达兼容。优选的真核宿主细胞包括但不局限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选地为例如那些来自小鼠、大鼠、猴子或人成纤维细胞系的脊椎动物细胞。
任何原核宿主都可被用于表达重组核酸分子。优选的原核宿主为大肠杆菌。在PAMP为脂蛋白的实施方案中，PAMP/抗原融合蛋白质在细菌细胞中的表达是优选的。核酸在细菌细胞系里的表达是保证脂蛋白中的蛋白质部分合适的翻译后修饰所期望的。优选地，选择来表达PAMP/抗原融合体(例如脂蛋白/抗原融合体)的宿主细胞是天然地产生脂蛋白/抗原融合体中的脂蛋白的细胞。
用编码本发明的PAMP/抗原融合体的核酸分子转化合适的宿主细胞是通过一般依赖于载体和所用宿主系统类型的众所周知的方法实现的。至于原核宿主细胞的转化，电穿孔和盐处理方法是一般所采用的。(参见如Cohen等人(1972)Proc.Natl.Acad Sci.USA 692110；Maniatis等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982)；Sambrook等人(1989))。至于用含有rDNAs的载体转化脊椎动物细胞，电穿孔、阳离子脂或盐处理方法是一般所采用的。(参见如Graham等人，Virology(1973)52456；Wigler等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-76)。
成功转化的细胞，如含有编码本发明的PAMP/抗原融合体的核酸分子的细胞可通过众所周知的技术来鉴定。例如，由引入编码本发明的PAMP/抗原融合体的核酸分子而得来的细胞可被克隆以产生单一群体。来自该群体的细胞可被收获、裂解，它们的核酸成分可用如Southern(1975)(J.Mol.Biol.98503)或Berent等人(1985)(Biotech.3208)所描述的方法来检查重组分子的存在或者这些细胞产生的蛋白质可通过免疫学方法进行测定。
本发明进一步提供了使用此处所描述的一种核酸分子来生产PAMP/抗原融合蛋白质的方法。概括地，重组蛋白质的生产一般包括以下步骤。
首先，获得编码PAMP/抗原融合蛋白质的核酸分子。然后如上文所述，将该核酸分子优选地置于与合适的控制序列有效连锁的位置。用表达单位转化一个合适的宿主，将转化的宿主培养在允许生产PAMP/抗原融合蛋白质的条件下。可选择的，将融合蛋白质与培养基或细胞分离；融合蛋白质的回收和提纯在一些能够容忍些许杂质的情况下不是必需的。
前述的每一个步骤都可以多种方式进行。例如，想要的编码序列可以从基因组片段中获得并直接用于适当的宿主中。在多种宿主中可操作的表达载体的构建是通过复制子和控制序列的适当组合实现的。控制序列、表达载体和转化方法都依赖于用于表达基因的宿主细胞类型，且在前面详细讨论过。熟练的技术人员可容易地改装本领域中公知的任何宿主/表达系统，并与此处描述的核苷酸序列共同用于生产PAMP/抗原融合蛋白质。
内切核酸酶是能够切开核酸分子中的内部磷酸二酯键的核酸酶。核酸酶的例子包括但不局限于来自真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的S1内切核酸酶、脱氧核糖核酸酶(DNase I)和限制性内切核酸酶。作为DNA操作基础的切割和连接过程是用称为限制性内切核酸酶(进行切割)和连接酶(进行连接)的酶来完成的。如果没有正常地可用的适当的限制性内切核酸酶切割位点，则可以将这些切割位点添加到编码序列的末端以提供可切除的核酸序列插入到这些载体中。
另外，也可将限制性内切核酸酶切割位点插入到编码PAMP/抗原融合蛋白质的核酸序列中。优选地，将这些切割位点设计在编码相同或不同PAMPs的核苷酸序列之间、相同或不同抗原之间或编码PAMP和抗原的核苷酸序列之间。本领域技术人员公知的适当的切割位点包括但不局限于如下位点EcoR I、BamH I、Bgl/II、Pvu I、Pvu II、Hind III、HinfI、Sau3A、Alu I、Taq I、Hae III和Not I。(T.A.Brown(1996)基因克隆概论(Gene CloningAn Introduction)，Second Edition，Chapman& Hall，Chapter 449-83)。
I.缀合物本发明也包括包含两种或多种共价连接或非共价连接但相互关联的分子的“缀合物”。因而，本发明的疫苗包括PAMP/抗原缀合物，例如但不局限于如下的蛋白质/核酸缀合物、核酸/蛋白质缀合物、核酸/核酸缀合物、肽模拟物/核酸缀合物、核酸/肽模拟物缀合物、肽模拟物/肽模拟物缀合物、脂多糖/蛋白质缀合物、脂蛋白/蛋白质缀合物、RNA/蛋白质缀合物、CpG-DNA/蛋白质缀合物、核酸类似物/蛋白质缀合物和甘露聚糖/蛋白质缀合物。在将来鉴定的PAMPs也含有另一类化学药品的情况下，也可考虑含有这样的化学药品与抗原结构域的缀合物。
多肽、糖类和脂类与DNA的缀合方法是技术人员所公知的。参见如美国专利号4,191,668，4,650,625，5,162,515，5,700,922，5,786,461，6,060,056；和J.Clin.Invest.(1988)821901-1907。
非蛋白质PAMPs如CpG或CpG-DNA和脂多糖可与蛋白质或非蛋白质抗原通过常规技术而缀合。例如，PAMP/抗原缀合物可通过多聚体如PEG、聚D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrollidone)、免疫球蛋白和D-赖氨酸和D-谷氨酸的共聚物来连接。PAMP和抗原与多聚体连接体的缀合可以以任何数目的方式实现，一般包括一种或多种交联剂以及PAMP和抗原的功能基团。多肽PAMPs和抗原将含有氨基酸侧链如氨基、羰基或巯基，这些侧链充作将PAMP和抗原相互连接的位点。可将具有这样的功能基团的残基添加到PAMP或抗原上。这样的残基可通过固相合成技术或重组技术而整合入，这两种技术都是肽合成领域所公知的。
在糖或脂类似物的情况下，功能性氨基和巯基基团可通过常规化学方法整合入。例如，伯氨基基团可通过在氰基硼氢钠存在时与乙二胺反应而整合入，巯基可以通过半胱胺二氢氯化物(cysteaminedihydrochloride)的反应随后用标准二硫化物还原剂进行还原而引入。多聚体连接体如果还没有适当的功能基团时也可以一种相似的方式衍生以含有功能基团。异双功能交联剂如磺基琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯在增加缀合物中PAMPs或抗原的比例时也是有用的，它将D-赖氨酸和D-谷氨酸共聚物中D-赖氨酸残基的ε氨基基团连接到来自将要偶联的肽中氨基端残基的巯基侧链上。
J.疫苗制剂和递送本发明的疫苗含有一种或多种PAMPs、其免疫刺激部分或免疫刺激衍生物(例如由先天性免疫系统识别的结构域)和一种或多种抗原、其免疫原性部分或免疫原性衍生物(例如由适应性免疫系统识别的结构域)。因为根据定义PAMP模拟物具有结合PRRs并启动先天性免疫反应的能力，所以本发明考虑的疫苗制剂包括替代PAMP的PAMP模拟物。因而，本发明考虑包含嵌合构建体的疫苗，该嵌合构建体包括至少一个抗原结构域和至少一个PAMP结构域。在一个特定的实施方案中，本发明的疫苗包含BLP/Eα融合蛋白质。
包含本发明的嵌合构建体的疫苗可根据制备药学上有用的组合物的已知方法来制备，借此将嵌合构建体与药学上可接受的载体组合在一混和物中。一种组合物如果给予后可被受者忍受，且如果该组合物使得活性成分能够到达需要作用的位点时，即被称为“药学上可接受的载体”。无菌的磷酸缓冲盐溶液是药学上可接受的载体的一个例子。其他适当的载体是本领域技术人员所公知的。(Ansel等人，药学剂量形式和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System)，5thEdition(Lea & Febiger 1990)；Gennaro(ed.)，Remington’sPharmaceutical Sciences 18thEdition(Mack Publishing Company1990))。
其他几种可考虑的赋形剂的例子包括水、右旋糖、甘油、乙醇和其组合。本发明的疫苗可进一步含有辅助物质，例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或其他载体，包括但不局限于例如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)的试剂，通常用作磷酸缓冲盐溶液中的0.05到0.1％的溶液以增强其效力。
本发明的嵌合构建体也可通过结合到可溶性的免疫原性载体分子上而被用作疫苗。适当的载体分子包括蛋白质，其中包括匙孔血蓝蛋白，它是一种优选的载体蛋白质。利用标准方法可将嵌合构建体结合到载体分子上。(Hancock等人，“肽合成以用作免疫原(Synthesis of Peptidesfor Use as Immunogens)，”《分子生物学方法免疫化学规程》(Methodsin Molecular BiologyImmunochemical Protocols)，Manson(ed.)，pages 23-32(Humana Press 1992))。
此外，本发明考虑一种包含药学上可接受的注射型载体的疫苗组合物。本发明的疫苗可以以注射型溶液或悬浮液的形式在有或没有其他标准载体的情况下以常规载体的形式给予。所加入的载体可选自在免疫过程中提高总体免疫反应的试剂。
已提出以脂质体作为适当的载体。不溶性的铝盐即磷酸铝或氢氧化铝被用作人常规临床应用中的载体。还用到了多核苷酸和聚电解质和水溶性载体如胞壁酰二肽。
本发明的注射型疫苗的制备包括将嵌合构建体与胞壁酰二肽或其他载体混合。结果所得的混和物可在二缩甘露醇一油酸酯/角鲨烯或角鲨烷载体中乳化。按体积每份二缩甘露醇一油酸酯使用四份角鲨烯和/或角鲨烷。制备疫苗组合物的方法是本领域普通技术人员所公知的。(Rola，免疫试剂和诊断性皮肤抗原(Immunizing Agents and Diagnostic SkinAntigens)。记载于Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEdition，Gennaro(ed.)，(Mack Publishing Company 1990)pages1389-1404)。
可采用另外的药学载体来控制疫苗在治疗应用中的作用期。控制释放制剂可通过使用多聚体来复合或吸收嵌合构建体而制备。例如，生物兼容的多聚体包括聚(乙烯-共乙酸乙烯酯)(poly(ethylene-co-vinylacetate))基质和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基质。(Sherwood等人(1992)Bio/Technology 101446)。嵌合构建体从这样的基质中释放的速率依赖于构建体的分子量、在基质中的构建体的量和分散颗粒的大小。(Saltzman等人(1989)Biophys.J.55163；Sherwood等人，同上.；Ansel等人，药学剂量形式和药物递送系统(PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems)，5thEdition(Lea & Febiger1990)；和Gennaro(ed.)，Remington’s Pharmaceutical Sciences 18thEdition(Mack Publishing Company 1990))。嵌合构建体也可与聚乙二醇(PEG)结合以增加稳定性和扩充生物利用次数(例如Katre等人；美国专利号4,766,106)。
本发明的疫苗可以肠胃外方式给予。给予疫苗的通常模式为肌内、皮下和腹膜内注射。此外，给予可以是通过连续灌输或单一或多重大丸剂而进行。
也用到了基因枪来成功地送递质粒DNA以诱导对细胞内病原体的免疫，对于该病原体的保护主要是依赖于1型CD8.sup.+T-细胞的。(Kaufmann等人(1999)J.Immun.163(8)4510-4518)。
基因转移介导的接种方法已成为快速发展的领域，且用这样的接种方法本发明的组合物可用于治疗非感染性和感染性的疾病，非感染性疾病包括但不局限于遗传疾病。(参见如Eck等人(1996)基于基因的治疗(Gene-Based Therapy)，记载于Goodman & Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，Ninth Edition，Chapter 5，McGraw Hill)。
作为选择地，本发明的疫苗特别是用鞭毛蛋白作为PAMP的，可以用为引起粘膜表面免疫反应而设计的方式制备和送递。因而，疫苗组合物可通过如鼻或口(胃内)途径给予粘膜表面。其他给予模式包括栓剂和口服制剂。对于栓剂而言，粘合剂和载体包括聚亚烷基二醇(polyalkalene glycols)或甘油三酯。口服制剂包括通常所用的初始物(incipient)如药物级的糖精、纤维素和碳酸镁。这些组合物可为溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并含有约1到95％的嵌合构建体。该疫苗以与剂量制剂相一致的方式给予，并以有效的、保护性的和免疫原性的药物剂量给予。
所用疫苗的数量显然依赖于病人年龄、体重、身高、性别、总体医学状况、病史、治疗的状况及其严重程度和个体免疫系统合成抗体并产生细胞介导的免疫反应的能力而不同。一般地，向受者提供剂量在约1μg试剂/kg病人体重到100mg试剂/kg病人体重范围内的嵌合构建体，尽管也可以给予更低或更高的剂量。然而，活性成分的精确量依赖于从业者的判断。适当的剂量范围可由本领域的技术人员很容易地确定，且依赖于特定的构建体而在纳克嵌合构建体到克嵌合构建体级别上。优选地，活性成分的剂量范围为纳克到微克；更优选地，为纳克到毫克；最优选地为微克到毫克。初始给予和激发剂量的适当方案也是可变的，但可包括随后有后续给予的初始给予。剂量可依赖于给予的途径且根据对象的大小而变化。
本发明包括含有来自单一生物体例如来自一个特定病原体的抗原和PAMPs的疫苗。本发明也包括含有来自几个不同来源的抗原性材料和/或分离自几个不同来源的PAMP材料的疫苗。这样的组合疫苗含有如来自各种微生物或来自相同微生物的各种菌株的或来自各种微生物的组合的抗原和PAMPs。
为了治疗的目的，将抗原/PAMP融合蛋白质以药物有效的量给予哺乳动物。如果给予的量可以在受者中产生可测量的正作用，则称该疫苗制剂是以“药物有效的量”给予的。特别地，本发明的疫苗制剂如果在受者中引起可测量的体液和/或细胞免疫反应则可在受者中产生正作用。特别地，本发明考虑一个想要的药物有效的量，即其中疫苗可在受者中引起对目标抗原的可测量的体液和/或细胞免疫反应，但又既不导致过度的非特异性炎症也不导致对非目标抗原的自身免疫反应。
如在此处所用的，术语“治疗”指治疗处理和预防性或保护性处理两者。在一个实施方案中，本发明考虑使用公开的疫苗来治疗需要此类治疗的病人。病人可患有疾病，例如但不局限于癌、变态反应、感染性疾病、自身免疫疾病、神经疾病、心血管疾病或与变态反应关联的疾病。在另一个实施方案中，本发明考虑给予公开的疫苗来使病人对一些疾病产生被动免疫，这些疾病例如但不局限于癌、变态反应、感染性疾病、自身免疫疾病、神经疾病、心血管疾病或与变态反应关联的疾病。在另一个实施方案中，本发明考虑给予公开的疫苗来使病人对除前面句子中所提到的疾病之外的疾病产生免疫，其中目的在于除掉身体中的特定分子或特定细胞。一个非限制性的实施例为在心血管疾病中去除或防止斑点的沉积。
K.治疗/免疫增强本发明的疫苗可被用于增强需要该疫苗的动物的免疫，更特定地为哺乳动物，更加特定地为人(例如病人)。免疫增强是治疗诊断为如癌、免疫缺陷综合症、某些局部或全身的感染、麻风病、结核病、带状疱疹、疣、疱疹、疟疾、齿龈炎和动脉粥状硬化的病人的理想目标。
本发明的疫苗的优点为它们诱导了对目标抗原的强的免疫反应而只有最小的不良的炎症反应，以及只有最少的自身免疫疾病的情况。这样一个减轻了副作用的特性具有明显优于其他疫苗方法的优点，尤其是在对自身抗原起反应这方面，因为对于许多其他的疫苗策略而言，为了引起对自身抗原的强的反应，要使用强的佐剂，它们导致过度的炎症并可增加自身免疫疾病的危险。
如此处所用的，“免疫增强”指生物体对外源抗原或其他目标抗原如那些与癌关联的抗原的响应能力的任何增加，这包括增加了数量的免疫细胞、在那些经过免疫以攻击这样的抗原的细胞中探测并消灭这样的抗原的增加了的活性和能力。
免疫反应的强度可用标准检验来测量，包括但不局限于如下方法利用本领域已知的方法直接测量外周血淋巴细胞、天然杀伤细胞细胞毒性测定(Provinciali等人(1992)J.Immunol.Meth.15519-24)、细胞增殖测定(Vollenweider等人(1992)J.Immunol.Meth.149133-135)、免疫细胞和亚型的免疫测定(Loeffler等人(1992)Cytom.13169-174；Rivoltini等人(1992)Can.Immunol.Immunother.34241-251)和细胞介导的免疫的皮试(Chang等人(1993)Cancer Res.531043-1050)。对于测量免疫系统的强度的方法和分析的优秀文章参见如Coligan等人(Ed.)(2000)免疫学最新规程(Current Protocols inImmunology)，Vol.1，Wiley & Sons。
如同上述检验测量的，在免疫反应强度中任何统计上显著的增加都被认为是“增强的免疫反应”或“免疫增强”。使S-期T-细胞增加百分之五的增加已经通过本发明的方法实现了。增强的免疫反应也通过身体的现象如发烧和炎症来指示，尽管对于本发明的重组疫苗可能观测不到一种或这两种现象。增强的免疫反应特征也在于治愈全身性和局部感染，减少疾病症状，如肿瘤大小缩小，麻风病、结核病、疟疾、naphthousulcers、疱疹性和乳头状瘤疣、齿龈炎、动脉粥状硬化、AIDS的伴随症状如卡波西肉瘤、支气管感染等症状减轻。
L.疫苗生产本发明的程序可用于生成包含一种或多种目的抗原和一种或多种PAMPs的嵌合构建体。可以添加一个小的非免疫原性的抗原决定部位标记(例如His标记)以使在细菌中表达的融合蛋白质的提纯更容易。抗原与PAMP如BLP或鞭毛蛋白的组合提供了激活抗原特异性适应性和先天性免疫反应所必需的信号。
大量不同的包含不同抗原和PAMPs组合的融合蛋白质可利用本领域公知的重组DNA技术或缀合化学很容易地生成。通过利用相同的技术的此方法，几乎任何抗原都可以生成疫苗。因此，这种新方法是非常通用的。
利用细菌表达系统可生成大量的重组疫苗产物。产物可用标准技术从细菌培养物中提纯。因而该方法是极其经济和有成本效率的。作为选择的，重组疫苗产物可从酵母或其他真核细胞(包括但不局限于昆虫细胞或哺乳动物细胞)的培养物中生产并提纯。缀合的非蛋白质疫苗产品也可以以相对大的量化学生产，特别是当PAMP和抗原两者都可以由相对直接的提纯程序获得并然后以相对简单和有效的缀合化学缀合在一起时。
作为选择地，包含蛋白质成分和非蛋白质成分的嵌合构建体可通过用重组方法制备蛋白质成分和用化学方法制备非蛋白质成分然后用本领域中公知的连接体化学连接这两种成分而方便地获得，其中一些方法在此处描述。此外，由于本发明考虑的抗原和PAMPs可以是天然存在的，它们可被从它们的天然来源提纯然后化学地连接在一起。T-细胞和B-细胞抗原都可以此方法而被用于生成疫苗。
抗原和PAMP如BLP或鞭毛蛋白的融合使两种信号的化学计量达到最适状态，从而最小化了不想要的过度炎症反应(例如当抗原与佐剂混合以增加它们的免疫原性时所发生的过度炎症反应)。
抗原和PAMP如BLP的融合增加了响应于疫苗而激活的APC有结果地触发想要的适应性免疫反应的可能性。在没有摄入和呈递抗原时这样的APC的激活可导致自身免疫反应的诱导，这又是防止或限制其在人中使用的常用佐剂的问题之一。
在一个优选实施方案中，本发明的融合蛋白质包含抗原或其免疫原性部分，该抗原或其免疫原性部分被修饰以含有包含前导序列和一致序列的氨基酸序列，该氨基酸序列导致对一致序列或该序列的部分的翻译后修饰，其中翻译后修饰的序列是PRR的配体。修饰的抗原包括但不局限于含有细菌脂化一致序列CXXN(SEQ ID NO1)的抗原，其中X是任何氨基酸，但优选地为丝氨酸。众多前导序列是本领域所公知的，但优选的前导序列是由SEQ ID NO2中前20个氨基酸所描述的，其中SEQ IDNO2中的前20个氨基酸在SEQ ID NO3中阐明。额外的适当的前导序列在序列列表中的SEQ ID NO4-7中描述。优选的嵌合构建体包含融合到某一序列的前导序列，所述某一序列包含进一步融合到抗原上的细菌脂化一致序列SEQ ID NO1(例如前导序列-CXXN-抗原)。尽管抗原的这种修饰可被称为融合，但是该修饰可不通过融合DNA而通过经诱变向编码任何目的抗原的DNA中引入前导序列和随后的CXX序列而实现。在细菌宿主细胞中编码该嵌合构建体的核酸分子的表达产生了一种底物，先是由细菌蛋白酶作用，从修饰的抗原中切去前导序列，然后是细菌脂质转移酶作用，脂化包含脂化一致序列的序列或其部分。结果所得的产物是作为PRR配体并能够刺激先天性和适应性免疫系统两者的嵌合构建体或融合蛋白质。在此外一个实施方案中，嵌合构建体或融合蛋白质包含额外的极性或带电荷的氨基酸以增加嵌合构建体或融合蛋白质的亲水性而不改变构建体的免疫原性或免疫刺激性质。
不用进一步的描述，相信本领域的普通技术人员就可以用前面的描述和后面的说明性的实施例而实践本发明的方法。因此，下面的实施例特别地指出了本发明优选的实施方案，只是说明性的，而不应解释为以任何方式对公开内容的剩余部分的限制。其他普通和特定的构造对本领域的技术人员是显而易见的。
实施例实施例1.具抗原结构域和PAMP结构域的模型疫苗盒为了生产本发明的一个模型疫苗盒，我们将病原体关联的分子范型(PAMP)融合到特征化了的小鼠抗原Eα上。我们选择的PAMP即BLP已知可通过受体类Toll受体-2(TLR-2)刺激先天性免疫系统。
在疫苗盒中用于与目的抗原融合的细菌脂蛋白(BLP)蛋白质序列如下MKATK LVLGA VILGS TLLAG CSSNA KIDQL SSDVQ TLNAK VDQLS NDVNAMRSDV QAAKD DAARA NQRLD NMATK YRK(SEQ ID NO2)。前导序列包括SEQ ID NO2的第1位氨基酸到第20位氨基酸。在细菌中第一个半胱氨酸(SEQ ID NO2的第21位氨基酸)是脂化的。这个只能在细菌中发生的脂化对于BLP被Toll和TLRs识别是基本的。使C-末端的赖氨酸(SEQID NO2的第78位氨基酸)突变以增加重组疫苗的产量，因为该赖氨酸可与肽聚糖形成共价键。
为了有助于抗原的鉴定和提纯，在蛋白质的C-末端设计了一个六组氨酸标记。最终构建体如图3所示。
融合蛋白质在细菌中表达并由IPTG诱导。蛋白质可在8M尿素、20mM Tris、20mM NaCl、2％Triton-X-100、pH 8.0中裂解并用超声处理而提纯。将裂解物在相同的缓冲液中通过100ml Q-琼脂糖凝胶离子交换柱并用5倍柱体积的8M尿素、20mM Tris、20mM NaCl、0.2％Triton-X-100、pH 8.0洗涤。蛋白质由盐梯度洗脱(20mM NaCl到800mMNaCl)。阳性组分由利用针对组氨酸标记的抗体的免疫印迹法进行鉴定。收集这些组分并使其通过2ml的镍-琼脂糖柱。用相同缓冲液(10倍柱体积)充分洗涤柱子，然后用5倍柱体积的含有200mM NaCl、0.2％Triton-X-100、20mM咪唑、pH 8.0的磷酸盐缓冲液(20mM)洗涤。提纯的蛋白质在20mM磷酸盐缓冲液、200mM NaCl、0.1％Triton-X-100、250mM咪唑中洗脱，然后组分再次用免疫印迹法检验蛋白质。收集阳性组分并再次用含有0.1％Triton-X-100的磷酸缓冲盐透析过夜。通过多粘菌素B柱子去除样品中的任何内毒素污染，并在Amicon浓缩器中离心浓缩，然后用免疫印迹法和蛋白质浓度检验蛋白质的含量。
实施例2.在RAW细胞中NF-κB由BLP/Eα模型抗原的刺激为了检验模型抗原是否可以刺激免疫反应所必需的信号转导途径，我们测定了体外RAW小鼠巨噬细胞系中NF-κB的激活。我们发展了一种稳定的含有NF-κB-依赖型萤火虫荧光素酶基因的RAW细胞系。NF-κB的激活物对这些细胞的刺激导致荧光素酶的产生，该荧光素酶可通过使用发光计在细胞裂解物中进行测量。将细胞用指示量的BLP/Eα刺激5小时，然后收获用于荧光素酶测量。
作为对照，将RAW细胞在存在和不存在多粘菌素B(PmB)时用LPS刺激。PmB可使内毒素失活，且如所预期的，LPS+PmB样品中NF-κB的活性的激活减少98％。BLP/Eα也可以以如图4所示的剂量依赖型方式激活NF-κB，然而，用PmB处理不能使刺激以统计上显著的程度失活。这些结果暗示BLP/Eα对NF-κB的激活不归因于内毒素对制剂的污染。
实施例3.BLP/Eα模型疫苗体外诱导了树突细胞生产IL-6
有效的疫苗必须能够刺激树突细胞(DC)成熟并呈递抗原。为了检验BLP/Eα是否可诱导DC功能，我们检验了衍生自骨髓的DC在体外刺激后生产IL-6的能力。分离骨髓树突细胞，并在1％GM-CSF存在时使其在培养物中生长5天。5天后，将细胞以250,000细胞/孔转到96-孔的皿中，并用Eα肽(0.3μg/ml)、LPS(100ng/ml)+Eα肽(0.3μg/ml)或BLP/Eα处理。BLP/Eα能够在这些细胞中刺激IL-6的生产，如在夹层ELISA(图5)所测量的。
实施例4.BLP/Eα刺激了不成熟树突细胞的成熟为了确定BLP/Eα疫苗是否可由树突细胞加工和呈递，我们用疫苗刺激了树突细胞并检验了B7.2和结合到MHC类型II中的Eα肽在它们表面的表达。将培养的衍生自骨髓的树突细胞(5天)用Eα肽或BLP/Eα刺激，并用B7.2共刺激分子的抗体和/或识别结合到MHC类型II中的Eα肽的Yae抗体染色。由FACS进行分析(图6)。
实施例5.BLP/Eα模型疫苗体外刺激特定的T-细胞我们下一步分析由DC加工和呈递的BLP/Eα是否可以在体外刺激抗原特异性T-细胞的增生。将骨髓衍生的小鼠DC分离并以750,000细胞/孔培养在含有1％GM-CSF的培养基中。培养细胞6天后将DC收集、洗涤、记数，然后以250,000细胞/孔转到96-孔的皿中。将细胞用上面指出的抗原进行刺激，放置3天使其成熟。3天后，将DC重悬并以5,000或10,000细胞/孔培养在96-孔的皿中。将来自1H3.1 TCR转基因小鼠(1H3.1 TCR是特异于Eα肽的)淋巴结的T-细胞以100,000细胞/孔培养在DC上。将细胞在培养基中放置3天然后用0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷进行“脉冲”。24小时后收获细胞，并以cpm测量胸腺嘧啶脱氧核苷的整合(T-细胞的增生)(图7)。
实施例6.BLP/Eα在体内激活特定的T-细胞为了估计疫苗在体内产生特定的T-细胞反应的能力，我们向小鼠注射了融合蛋白质。三个小鼠注射如下
*完全弗氏佐剂小鼠#2的注射的爪垫在实验持续期间相当地肿胀，而小鼠#1和#3的爪垫表现正常。6天后，将小鼠无痛致死，收获有关联的排水(draining)淋巴结用于T-细胞增生测定。将T-细胞以400,000细胞/孔培养在96-孔的板中，并以所述的剂量用Eα肽或BLP/Eα再次刺激。将细胞放置48小时使其开始增生，在培养基中用0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷进行脉冲并于16小时后收获。胸腺嘧啶脱氧核苷的整合用β-平板读出器测量(beta-plate reader)(图8)。
实施例7.具有变态反应原相关的抗原的模型疫苗盒利用上面在生产BLP/Eα模型抗原中阐明的程序，用来自巨豚草(三裂叶豚草(Ambrosia trifida))的花粉变态反应原Ra5G制得了具有变态反应原相关的抗原的模型疫苗盒。Ra5G的氨基酸序列如下MKNIF MLTLF ILIIT STIKA IGSTN EVDEI KQEDD GLCYE GTNCG KVGKYCCSPI GKYCV CYDSK AICNK NCT(SEQ ID NO9)。
此变态反应原的氨基酸序列可与BLP的氨基酸序列(SEQ ID NO1)融合以生成BLP/Ra5G融合蛋白质。结果所得的重组疫苗将变态反应原置于IL-12诱导信号中，此情况中的PAMP是BLP。
当引入到对象中时，这种疫苗将生成变态反应原特异性的T-细胞反应，该反应由于IL-12在树突细胞和巨噬细胞中被BLP的诱导而将分化为Th1反应。
实施例8.具有肿瘤相关的抗原的模型疫苗盒利用上面在生产BLP/Eα模型抗原中阐明的程序，用模型肿瘤抗原酪氨酸酶相关的蛋白质2(TRP-2)制得了具有肿瘤相关的抗原的模型疫苗盒。TRP-2的核酸序列和相应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO10(如图20所示)和SEQ ID NO11(如图21所示)中提供。用于BLP融合的区域包括SEQ ID NO10中核苷酸编号840到核苷酸编号1040。T-细胞抗原决定部位包括SEQ ID NO10中核苷酸编号945到核苷酸编号968。
可被用于疫苗构建的TRP-2的区域如下所示LDLAK KSIHP DYVIT TQHWL GLLGP NGTQP QIANC SVYDF FVWLH YYSVRDTLLG PGRPY KAIDF SHQ(SEQ ID NO12)。
SEQ ID NO12的T-细胞抗原决定部位是VYDFFVWL(SEQ ID NO13)。
实施例9.CpG免疫刺激最近鉴定了TLRs家族是果蝇和哺乳动物生物体两者中先天性免疫识别的基本成分(Hoffmann等人(1999)Science 2841313-1318；Imler等人(2000)Curr.Opin.Microbiol.316-22)。果蝇Toll是探测真菌感染和抗真菌肽drosomycin诱导所必需的(Lemaitre等人(1996)Cell86973-983)。在小鼠中，已显示TLR2和TLR4分别介导细菌PGN和LPS的识别(Takeuchi等人(1999)Immunity11443-451)。果蝇和哺乳动物Toll家族中的其他成员的功能目前尚未可知，尽管预期至少它们中的一些也涉及先天性免疫识别。
此处描述的结果共同显示CpG-DNA对三类专业抗原呈递细胞(DC、巨噬细胞和B细胞)的免疫刺激作用是由MyD88的信号通路介导的。MyD88涉及通过Toll和IL-1受体家族的信号转导途径。细胞因子IL-1家族包括IL-1和IL-18的激活依赖于由caspase-1进行的加工，但在此处描述的所有实验中，缺失caspase-1对CpG-DNA诱导的细胞反应没有影响(Fantuzzi等人(1999)j.Clin.Immunol.191-11)。
我们检验了TLR2和TLR4是否涉及CpG-DNA的识别，发现是不涉及的，至少基于此处提供的分析。因此，我们相信CpG-DNA是由Toll受体而不是TLR2和TLR4识别的。表达内源性或转染的TLR1到TLR6的细胞系不对CpG-DNA响应(数据没有显示)，这暗示Toll家族的一些其他成员可介导CpG-DNA的识别。
虽然造成CpG-DNA识别的原因的Toll受体的特性此时仍然未知，CpG-DNA必须内化以发挥其刺激作用的事实(Krieg等人(1995)Nature374546-549；Stacey等人(1996)J.Immunol.1572116-2122)暗示介导识别的TLR可在细胞内区室如晚期内体(late endosome)、吞噬体或溶酶体中被表达。
实施例10.CpG和B-细胞激活将来自所述的小鼠品系的B-细胞从脾中通过补体杀死(complementkill)CD4+、CD8+和巨噬细胞来提纯。在不同量的刺激性CpG-DNA(硫代磷酸酯修饰的5’-TCCAT GACGT TCCTG ACGTT-3’(SEQ ID NO8))存在或不存在时以1×106细胞/毫升的浓度培养非粘着性细胞。48小时后，将细胞用[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷(0.5μCi/孔，NEN)进行脉冲16小时，并加工以用于β(beta)记数。
图9A所示的结果是三个独立实验的代表。衍生自caspase-1基因敲除小鼠的B-淋巴细胞响应于CpG的增生与野生型细胞相当(图9A)，暗示MyD88缺失的作用并不归因于IL-1/IL-18介导的信号传输的缺陷。这个结果显示CpG-DNA通过Toll家族的受体来传输信号。来自两种可获得的TLR缺陷小鼠品系的B-细胞都具有与野生型细胞类似的响应于CpG的增生(图9A)，其中的小鼠品系是带有自发地缺失TLR4基因的C57BL/10ScCr品系(Poltorak等人(1998)Science 2822085-2088；Qureshi等人J.Exp.Med.1999，189615-625)和TLR2基因敲除小鼠(Takeuchi等人(1999)Immunity11443-451)。这个结果和caspase-1缺陷细胞的正常反应一起暗示Toll家族的成员(而不是TLR2或TLR4)涉及CpG-DNA的识别。
实施例11.CD86和MHC类型II的CpG和B-细胞表达对B细胞中CpG诱导的CD86的表达和MHC类型II分子的增量调节进行检验以确定这些过程是否由MyD88信号通路介导的。用CpG-DNA刺激来自MyD88基因敲除小鼠和野生型littermate对照小鼠以及来自TLR4-缺陷小鼠的B-淋巴细胞。CD86和MHC类型II在细胞表面的表达是用FACS分析的。
B-细胞以如上所述制备并在有或没有10mM CpG时以3×106细胞/毫升培养12小时。刺激后，用流式细胞仪分析CD86和MHC类型II的表面表达。如图9B所示的结果代表门控的B-细胞。阴影区域代表刺激的细胞，而非阴影区域代表未处理的对照。如在图9B中所显示的，CpG-DNA强烈地诱导了CD86和MHC类型II在野生型和TLR4缺陷小鼠B细胞上的表达。相反地，该诱导在MyD88缺陷B-淋巴细胞中完全不发生。
实施例12.鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Tymphimurium)鞭毛蛋白和大肠杆菌鞭毛蛋白的克隆将全长鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)鞭毛蛋白和大肠杆菌鞭毛蛋白从各自的基因组DNA中克隆并在大肠杆菌中以重组蛋白质形式表达。鞭毛蛋白被单独表达，或与来自卵清蛋白的抗原性表位(SIINFEKL)、克隆自鼠B16细胞的酪氨酸酶-2蛋白质(TRP2)或含有Eα抗原决定部位的I-Eα蛋白质的C-末端片段一起作为融合蛋白质表达。另外，所有重组蛋白质含有一个C-末端的6x-组氨酸重复以助于提纯。
将诱导的细菌在含有Triton-X 100、甘油、咪唑、NaCl和Tris，pH＝8.0的温和裂解液中裂解以保持蛋白质的天然构象。通过使过滤的裂解液通过一个镍-NTA琼脂糖柱并随后在几个含有咪唑的缓冲液中充分洗涤以提纯融合蛋白质。提纯的蛋白质在250mM咪唑中洗脱，在多粘菌素B柱中经过两次以去除污染的脂多糖，然后于4℃在PBS中充分透析过夜。结果所得的提纯的蛋白质非常稳定，可在4℃保持活性达至少一个月。
实施例13.鞭毛蛋白体外测定体外测定是用提纯的鞭毛蛋白融合蛋白质以如下过程进行的将人293细胞系和鼠RAW细胞系用含有驱动荧光素酶转录的两个拷贝的Igκ NF-κB位点的报告基因进行转染(这个构建体被称为“pBIIxluc”)。将结果所得的细胞系(293LUC和RAWkb)培养在24-孔的皿上并在24小时后用鞭毛蛋白融合蛋白质或对照蛋白质(lacZ)进行处理，该对照蛋白质是在相同的载体中制备且用与鞭毛蛋白完全相同的方式提纯的。在处理5小时后得到细胞裂解液，并且检验该裂解液的荧光素酶活性以显示NF-κB的诱导。在本分析中，鞭毛蛋白显著地诱导了NF-κB，尤其在293细胞中，而对对照蛋白质没有影响，如图12和13所示。相信该诱导不归因于LPS的污染，这是因为如图12和14所示，多粘菌素B不抑制RAWκB细胞中的激活，且293LUC细胞不响应于LPS但是响应于鞭毛蛋白。
体外测定的结果证明鞭毛蛋白融合蛋白质保持了它们刺激类Toll受体的能力，且因此可以用于生成重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白质以进行接种。在鞭毛蛋白-抗原融合蛋白质中，相信鞭毛蛋白是通过触发类Toll受体而刺激先天性免疫系统的，而融合到鞭毛蛋白的抗原提供了由T和B淋巴细胞识别的抗原决定部位。
实施例14.在巨噬细胞中CpG和IL-6的生产将来自所述小鼠品系的巯基乙酸引起的腹膜渗出液贴壁细胞(PECs)用不同的刺激物处理24小时。IL-6向上清液的释放是用特定的使用抗小鼠IL-6单克隆抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析的。由于也显示CpG-DNA对巨噬细胞具有显著的刺激作用(Stacey等人(2000)Curr.Top.Microbiol.Immunol.24741-58；Lipford等人(1998)TrendsMicrobiol.6496-500；Stacey等人(1996)J.Immunol.1572116-2122)，在缺陷的巨噬细胞中检查了野生型和MyD88中IL-6由CpG诱导的表达。衍生自caspase-1基因敲除小鼠的细胞被用作IL-1介导的对IL-6的诱导的对照。响应于CpG刺激的IL-6的产生在MyD88-/-巨噬细胞中完全消失了，但在caspase-1、TLR2-和TLR4-缺陷细胞中是正常的(图10A)。由反向CpG序列(GpC)组成的寡核苷酸被用作对照，正如预期的，其不诱导可探测的IL-6的量(图10A)。
实施例15.CpG-DNA诱导的IκBα的降解我们下一步检验了NF-B信号通路的激活在MyD88-/-巨噬细胞中是否是缺陷的。将腹膜巨噬细胞用CpG-DNA或LPS刺激0、10、20、60和90分钟以作为对照，并在其后裂解。对每个时间点，将30mg总蛋白质进行SDS-PAGE电泳并以免疫印迹法分析IκBα蛋白质(图10B)。在野生型细胞中，LPS和CpG-DNA二者都可以诱导NF-κB激活，这由IκB蛋白质的降解所证实(图10B)。在MyD88-/-巨噬细胞中，虽然有延缓的动力学，但LPS仍然诱导IκB降解，这与发表的观察资料相一致(Kawai等人(1999)Immunity11115-122)。然而，与LPS不同，CpG-DNA不在MyD88-/-巨噬细胞中诱导IκB降解(图10B)。因此，虽然LPS和CpG-DNA两者都通过MyD88传输信号，但是由这些刺激物所起始的信号通路是不相同的，反映不同的TLRs可以激活交迭但不同的信号通路的可能性。
实施例16.CpG和IL-2在树突细胞中的生产已显示CpG-DNA为DC激活的有效诱导物(Sparwasser等人(1998)Eur.J.Immunol.282045-2054)。DC在适应性免疫反应的起始中起关键作用(Banchereau等人(1998)Nature 392245-252)。当在周边组织中与微生物衍生的产物(PAMPs)相互作用时，DC经历了称为成熟的发育改变(Banchereau等人(1998)Nature 392245-252)。DC成熟的特点为CD80和CD86分子在细胞表面表达的诱导，以及向淋巴组织的转移和细胞因子如IL-12的生产(Banchereau等人(1998)Nature 392245-252)。因此，我们检验了CpG-DNA对DC成熟的诱导是否是由MyD88信号通路介导的。MyD88-/-动物在用CpG寡核苷酸刺激时产生IL-12。野生型、B10/ScCr和MyD88-/-骨髓DC是从在DC生长培养基(RPMI 5％FC+1％GM-CSF)中培养5天的骨髓悬浮液制备的，并用10mm CpG或10mm GpC寡核苷酸刺激或不处理。在刺激24小时和48小时后获取上清液并用特定的捕捉抗体和探测抗体以ELISA来分析IL-12。
如图11所示的结果是来自三个独立进行的实验之一的。与发表的报告相一致，CpG-DNA在野生型小鼠DC中诱导了大量IL-12的分泌。然而，在衍生自MyD88基因敲除小鼠的DC中，对于CpG的刺激没有可探测的IL-12产生(图11)。如所预期的，来自TLR4缺陷小鼠的DC响应于CpG-DNA产生了野生型水平的IL-12(图11)。
实施例17.CpG/Eα嵌合构建体根据在美国专利号6,060,056中所描述的方法，将一个非蛋白质的PAMP即CpG通过PEG多聚物连接体和/或D-赖氨酸和D-谷氨酸的共聚体缀合到特征化的小鼠抗原Eα上。一个包含CpG40的CpG-DNA衍生物被用作非蛋白质PAMP。
下面参考的所有文章、专利和其他材料都是特定地在此处引用作为参考的。
虽然本发明已经参考特定实施方案进行了公开，但是显然在不背离本发明的真实意图和范围时本领域的其他技术人员可设计本发明的其他实施方案和变型。附加的权利要求应解释为包括所有这样的实施方案和相当的变型。
序列表<110>YALE UNIVERSITY<120>先天性免疫系统指导的疫苗<130>044574-5071-WO<140>尚未指定<141>2001-07-31<150>US 60/222,042<151>2000-07-31<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工的<220>
<223>脂化位点<220>
<221>变型<222>(2)..(3)<223>X＝任何氨基酸，优选地为丝氨酸<400>1Cys Xaa Xaa Asn1<210>2<211>78<212>PRT<213>大肠杆菌<220>
<221>misc_feature<223>BLP<400>2Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser20 25 30Asp Val Gln Thr Leu Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val35 40 45Asn Ala Met Arg Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg50 55 60Ala Asn Gln Arg Leu Asp Asn Met Ala Thr Lys Tyr Arg Lys65 70 75<210>3<211>20<212>PRT<213>大肠杆菌<220>
<221>misc_feature<223>BLP前导序列<400>3Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr1 5 10 15Leu Leu Ala Gly20<210>4<211>20<212>PRT<213>解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)<220>
<221>misc_feature<223>BLP前导序列<400>4Met Asn Arg Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr1 5 10 15Leu Leu Ala Gly20<210>5<211>19
<212>PRT<213>粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)<220>
<221>misc_feature<223>BLP前导序列<400>5Met Asn Arg Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser His1 5 10 15Ser Ala Gly<210>6<211>19<212>PRT<213>奇异变形菌(Proteus mirabilis)<220>
<221>misc_feature<223>BLP前导序列<400>6Met Lys Ala Lys Ile Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Ala Ser Gly Leu1 5 10 15Leu Ala Gly<210>7<211>16<212>PRT<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)<220>
<221>misc_feature<223>外表面蛋白质A<400>7Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala1 5 10 15<210>8
<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>CpG-DNA<400>8tccatgacgt tcctgacgtt20<210>9<211>73<212>PRT<213>三裂叶豚草<220>
<221>misc_feature<223>Ra5G豚草花粉变态反应原<400>9Met Lys Asn Ile Phe Met Leu Thr Leu Phe Ile Leu Ile Ile Thr Ser1 5 10 15Thr Ile Lys Ala Ile Gly Ser Thr Asn Glu Val Asp Glu Ile Lys Gln20 25 30Glu Asp Asp Gly Leu Cys Tyr Glu Gly Thr Asn Cys Gly Lys Val Gly35 40 45Lys Tyr Cys Cys Ser Pro Ile Gly Lys Tyr Cys Val Cys Tyr Asp Ser50 55 60Lys Ala Ile Cys Asn Lys Asn Cys Thr65 70<210>10<211>2182<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>misc_feature<222>(405)..(1958)<223>Tyrosinase-Related Kinase Protein 2 (TRP-2)
<220>
<221>misc_feature<222>(945)..(968)<223>T细胞抗原决定部位<220>
<221>misc_recomb<222>(840)..(1040)<223>连接到BLP以形成融合蛋白质的区域<400>10gcagcataat aagcagtatg gctggagcac tctgtaaatt aactcaatta gacagagcct60gatttaacaa ggaagactgg cgagaagctc ccctcattaa acctgatgtt agaggagctt120cggatgaaat taaatcagtg ttagttgttt gagtcacata aaattgcatg agcgtgtaca180catgtgcaca cgtgtaggct ctgtgattta ggtgggaatt ttgagaggag aggaaagggc240tagaactaaa cccaaagaaa aggaaagaag agaagaggaa aggaaagaaa aaagaaaagg300caatttgagt gagtaaaggt tccagaactc aggagtggaa gacaaggagt aaagtcagac360agaaaccagg tgggacgccg gccaggcctc ccaattaaga aggcatgggc cttgtgggat420gggggcttct gctgggttgt ctgggctgcg gaattctgct cagagctcgg gctcagtttc480cccgagtctg catgaccttg gatggcgtgc tgaacaagga atgctgcccg cctctgggtc540ccgaggcaac caacatctgt ggatttctag agggcagggg gcagtgcgca gaggtgcaaa600cagacaccag accctggagt ggcccttata tccttcgaaa ccaggatgac cgtgagcaat660ggccgagaaa attcttcaac cggacatgca aatgcacagg aaactttgct ggttataatt720gtggaggctg caagttcggc tggaccggcc ccgactgtaa tcggaagaag ccggccatcc780taagacggaa tatccattcc ctgactgccc aggagaggga gcagttcttg ggcgccttag840acctggccaa gaagagtatc catccagact acgtgatcac cacgcaacac tggctggggc900
tgctcggacc caacgggacc cagccccaga tcgccaactg cagcgtgtat gacttttttg960tgtggctcca ttattattct gttcgagaca cattattagg tccaggacgc ccctataagg1020ccattgattt ctctcaccaa gggcctgcct ttgtcacgtg gcacaggtac catctgttgt1080ggctggaaag agaactccag agactcactg gcaatgagtc ctttgcgttg ccctactgga1140actttgcaac cgggaagaac gagtgtgacg tgtgcacaga cgactggctt ggagcagcaa1200gacaagatga cccaacgctg attagtcgga actcgagatt ctctacctgg gagattgtgt1260gcgacagctt ggatgactac aaccgccggg tcacactgtg taatggaacc tatgaaggtt1320tgctgagaag aaacaaagta ggcagaaata atgagaaact gccaacctta aaaaatgtgc1380aagattgcct gtctctccag aagtttgaca gccctccctt cttccagaac tctaccttca1440gcttcaggaa tgcactggaa gggtttgata aagcagacgg aacactggac tctcaagtca1500tgaaccttca taacttggct cactccttcc tgaatgggac caatgccttg ccacactcag1560cagccaacga ccctgtgttt gtggtcctcc actcttttac agacgccatc tttgatgagt1620ggctgaagag aaacaaccct tccacagatg cctggcctca ggaactggca cccattggtc1680acaaccgaat gtataacatg gtccccttct tcccaccggt gactaatgag gagctcttcc1740taaccgcaga gcaacttggc tacaattacg ccgttgatct gtcagaggaa gaagctccag1800tttggtccac aactctctca gtggtcattg gaatcctggg agctttcgtc ttgctcttgg1860ggttgctggc ttttcttcaa tacagaaggc ttcgcaaagg ctatgcgccc ttaatggaga1920caggtctcag cagcaagaga tacacggagg aagcctagca tgctcctacc tggcctgacc1980tgggtagtaa ctaattacac cgtcgctcat cttgagacag gtggaactct tcagcgtgtg2040ctctttagta gtgatgatga tgatgcctta gcaatgacaa ttatctctag ttgctgcttt2100
gcttattgta cacagacaaa atgcttgggt cattcaccac ggtcaaagta aggtgtggct2160agtatatgtg acctttgatt ag2182<210>11<211>517<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>misc_feature<222>(181)..(188)<223>T细胞抗原决定部位<220>
<221>misc_recomb<222>(146)..(212)<223>连接到BLP以形成融合蛋白质的区域<400>11Met Gly Leu Val Gly Trp Gly Leu Leu Leu Gly Cys Leu Gly Cys Gly1 5 10 15Ile Leu Leu Arg Ala Arg Ala Gln Phe Pro Arg Val Cys Met Thr Leu20 25 30Asp Gly Val Leu Asn Lys Glu Cys Cys Pro Pro Leu Gly Pro Glu Ala35 40 45Thr Asn Ile Cys Gly Phe Leu Glu Gly Arg Gly Gln Cys Ala Glu Val50 55 60Gln Thr Asp Thr Arg Pro Trp Ser Gly Pro Tyr Ile Leu Arg Asn Gln65 70 75 80Asp Asp Arg Glu Gln Trp Pro Arg Lys Phe Phe Asn Arg Thr Cys Lys85 90 95Cys Thr Gly Asn Phe Ala Gly Tyr Asn Cys Gly Gly Cys Lys Phe Gly100 105 110Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala Ile Leu Arg Arg115 120 125Asn Ile His Ser Leu Thr Ala Gln Glu Arg Glu Gln Phe Leu Gly Ala130 135 140Leu Asp Leu Ala Lys Lys Ser Ile His Pro Asp Tyr Val Ile Thr Thr145 150 155 160
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Phe Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gln Tyr Arg Arg Leu485 490 495Arg Lys Gly Tyr Ala Pro Leu Met Glu Thr Gly Leu Ser Ser Lys Arg500 505 510Tyr Thr Glu Glu Ala515<210>12<211>68<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>SITE<222>(37)..(44)<223>T细胞抗原决定部位<220>
<221>misc_feature<223>TRP-2<400>12Leu Asp Leu Ala Lys Lys Ser Ile His Pro Asp Tyr Val Ile Thr Thr1 5 10 15Gln His Trp Leu Gly Leu Leu Gly Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln Ile20 25 30Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr Ser35 40 45Val Arg Asp Thr Leu Leu Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Lys Ala Ile Asp50 55 60Phe Ser His Gln65<210>13<211>8<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>SITE
<222>(1)..(8)<223>T细胞抗原决定部位<400>13Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu1 权利要求
1.一种包含分离的PAMP或其免疫刺激部分或其免疫刺激衍生物和抗原或其免疫原性部分或其免疫原性衍生物的融合蛋白质。
2.权利要求1的融合蛋白质，其中PAMP选自肽、蛋白质、脂蛋白和糖蛋白。
3.权利要求1的融合蛋白质，其中PAMP是PRR的配体。
4.权利要求1的融合蛋白质，其中抗原可从选自细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物、后生动物、肿瘤、恶性细胞、异常神经细胞、关节炎病灶、心血管病灶、植物、动物、人、变态反应原和激素的来源中获得。
5.权利要求1的融合蛋白质，其中的抗原是微生物相关的、变态反应原相关的或与异常人或动物细胞相关的。
6.权利要求1的融合蛋白质，其中PAMP和抗原是通过化学连接体连接的。
7.权利要求1的融合蛋白质，其中融合蛋白质进一步包含一种或多种另外的PAMPs或其免疫刺激部分或其免疫刺激衍生物，并且融合蛋白质的PAMPs、免疫刺激部分或免疫刺激衍生物或者是相同的或者是不同的。
8.权利要求1的融合蛋白质，其中疫苗进一步包含一种或多种另外的抗原或其免疫原性部分或其免疫原性衍生物，并且融合蛋白质的抗原、免疫原性部分或免疫原性衍生物或者是相同的或者是不同的。
9.权利要求1的融合蛋白质，其中融合蛋白质进一步包含一种或多种另外的PAMPs或其免疫刺激部分或其免疫刺激衍生物以及一种或多种另外的抗原或其免疫原性部分或其免疫原性衍生物，并且其中PAMPs、其免疫刺激部分或其免疫刺激衍生物和/或融合蛋白质的抗原、免疫原性部分或免疫原性衍生物或者是相同的或者是不同的。
10.权利要求1的融合蛋白质，其中融合蛋白质进一步包含一种或多种载体蛋白质。
11.权利要求1的融合蛋白质，其中PAMP和抗原是由间隔区分隔的。
12.权利要求1的融合蛋白质，其中的PAMP是BLP。
13.权利要求12的融合蛋白质，其中的BLP是SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.权利要求1的融合蛋白质，其中的抗原选自淀粉状蛋白-β肽、李斯特菌溶胞素、HIV gp120和p24、Ra5G和TRP-2、EGFR、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her-2neu、SPAS-1、TRP-1、酪氨酸酶、Melan A/Mart-1、gp100、BAGE、GAGE、GM2神经节苷脂、驱动蛋白2、TATA元件调节因子1、肿瘤蛋白质D52、MAGED、ING2、HIP-55、TGF-1抗细胞凋亡因子、MAGE-1、HOM-Mel-40/SSX2、NY-ESO-1EGFR、CEA、MAGE D、Her-2neu、NY-ESO-1、糖蛋白MUC1和MUC10粘蛋白、p53、EGFR、CDC27、丙糖磷酸异构酶、HLA-DRB1、HLA-DR1、HLA-DR6 B1、CD11a、LFA-1、IFNγ、IL-10、TCR类似物、IgR类似物、21-羟化酶、钙感觉受体、酪氨酸酶、LDL受体、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素B链、PC-1、IA-2、IA-2b、GLIMA-38和NMDA。
15.权利要求1的融合蛋白质，其中PAMP是一种非蛋白质PAMP的肽模拟物和/或抗原是一种非蛋白质抗原的肽模拟物。
16.一种包含前导序列、一致序列和抗原序列的融合蛋白质，其中的一致序列是糖基化或者脂化一致序列。
17.权利要求16的融合蛋白质，其中的一致序列是糖基化或者脂化一致序列。
18.权利要求16的融合蛋白质，其中的前导序列为一致序列的翻译后糖基化或者脂化提供信号。
19.权利要求18的融合蛋白质，其中的前导肽选自a)SEQ ID NO3的氨基酸序列；b)SEQ ID NO4的氨基酸序列；c)SEQ ID NO5的氨基酸序列；d)SEQ ID NO6的氨基酸序列；和e)SEQ ID NO7的氨基酸序列。
20.权利要求16的融合蛋白质，其中的一致序列是CXXN(SEQ IDNO1)。
21.权利要求17的融合蛋白质，其中的一致序列是CXXN(SEQ IDNO1)。
22.权利要求16的融合蛋白质，其中的抗原可从选自细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物、后生动物、肿瘤、恶性细胞、异常神经细胞、关节炎病灶、心血管病灶、植物、动物、人、变态反应原和激素的来源中获得。
23.权利要求16的融合蛋白质，其中的抗原是微生物相关的、变态反应原相关的或与异常人或动物细胞相关的。
24.一个含有编码权利要求1或16的融合蛋白质的核苷酸的重组载体。
25.含有权利要求24的重组载体的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其中的宿主细胞是选自细菌、酵母、植物、动物和昆虫这些宿主的细胞。
27.权利要求25的宿主细胞，其中的宿主细胞是天然地产生PAMP的细菌。
28.权利要求25的宿主细胞，其中的宿主细胞是使PAMP脂化的细菌。
29.一种生产包含PAMP或其免疫刺激部分或其免疫刺激衍生物和抗原或其免疫原性部分或其免疫原性衍生物的融合蛋白质的方法，该方法包括培养权利要求16的细胞和分离细胞生产的融合蛋白质。
30.一种包含权利要求1或权利要求16的融合蛋白质和药学上可接受的载体的疫苗。
31.权利要求30的疫苗，其中的抗原是与疾病相关联的。
32.权利要求30的疫苗，其中的抗原是变态反应相关的或与异常人或动物细胞相关的。
33.权利要求30的疫苗，其中的抗原是激素。
34.权利要求30的疫苗，其中的抗原是淀粉状蛋白-β肽。
35.权利要求30的疫苗，其中的PAMP是一种非蛋白质PAMP的肽模拟物。
36.权利要求30的疫苗，其中的抗原是一种非蛋白质抗原的肽模拟物。
37.一种包括给予动物权利要求30的疫苗的步骤的使动物免疫的方法。
38.一种包括给予哺乳动物权利要求30的疫苗的步骤的使哺乳动物免疫的方法。
39.权利要求38的方法，其中的哺乳动物是人。
40.权利要求37的方法，其中的疫苗是肠胃外给予的、静脉内给予的、口服给予的、利用栓剂给予的，或通过粘膜表面给予的。
41.权利要求39的方法，其中的抗原是淀粉状蛋白-β肽或其免疫原性部分。
42.权利要求39的方法，其中融合蛋白质是给予诊断为Alzheimer症的人的。
43.一种治疗对象的方法，包含给予该对象抗体或激活的免疫细胞和给予一种包含权利要求1或权利要求16的融合蛋白质的疫苗的步骤，其中抗体或激活的免疫细胞是针对融合蛋白质的抗原的。
44.权利要求43的方法，其中的抗体是单克隆的。
45.一种治疗对象的方法，包含给予一种包含权利要求1或权利要求16的融合蛋白质的疫苗和一种选自化疗剂和抗血管发生剂的试剂的步骤。
46.权利要求45的方法，其中的化疗剂是一种抗癌试剂。
47.一种治疗对象的方法，包含给予一种包含权利要求1或权利要求16的融合蛋白质的疫苗并结合外科或放射治疗。
48.一种包含分离的PAMP和抗原的融合蛋白质，其中的抗原是自身抗原。
49.权利要求48的融合蛋白质，其中的抗原选自淀粉状蛋白-β肽、TRP-2、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her-2neu、SPAS-1、TRP-1、酪氨酸酶、Melan A/Mart-1、gp100、BAGE、GAGE、GM2神经节苷脂、驱动蛋白2、TATA元件调节因子1、肿瘤蛋白质D52、MAGE D、ING2、HIP-55、TGF-1抗细胞凋亡因子、MAGE-1、HOM-Mel-40/SSX2、NY-ESO-1EGFR、CEA、MAGE D、Her-2neu、NY-ESO-1、糖蛋白MUC1和MUC10粘蛋白、p53、EGFR、CDC27、丙糖磷酸异构酶、HLA-DRB1、HLA-DR1、HLA-DR6 B1、CD11a、LFA-1、IFNγ、IL-10、TCR类似物、IgR类似物、21-羟化酶、钙感觉受体、酪氨酸酶、LDL受体、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素B链、PC-1、IA-2、IA-2b、GLIMA-38和NMDA。
50.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP选自肽、蛋白质、脂蛋白和糖蛋白。
51.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP是PRR的配体。
52.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP是脂化的。
53.权利要求48的融合蛋白质，其中的抗原可从选自肿瘤、恶性细胞、异常神经细胞、关节炎病灶、心血管病灶的来源中获得。
54.权利要求48的融合蛋白质，其中的抗原是与异常人或动物细胞相关的。
55.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP和抗原是由化学连接体连接的。
56.权利要求48的融合蛋白质，其中的融合蛋白质进一步包含一种或多种另外的PAMPs，且其中的PAMPs是相同或不同的。
57.权利要求48的融合蛋白质，其中的融合蛋白质进一步包含一种或多种另外的抗原，且其中的抗原是相同或不同的。
58.权利要求48的融合蛋白质，其中的融合蛋白质进一步包含一种或多种另外的PAMPs和一种或多种另外的抗原，且其中的PAMPs和/或抗原是相同或不同的。
59.权利要求48的融合蛋白质，其中的融合蛋白质进一步包含一种或多种载体蛋白质。
60.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP和抗原是由间隔区分隔的。
61.权利要求48的融合蛋白质，其中的PAMP是BLP、OMP、OSP、鞭毛蛋白或膜孔蛋白。
62.权利要求61的融合蛋白质，其中的PAMP是具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的BLP。
63.权利要求48的融合蛋白质，其中PAMP是一种非蛋白质PAMP的肽模拟物和/或抗原是一种非蛋白质抗原的肽模拟物。
64.一种在动物中刺激先天性免疫反应并从而增强对外源或自身抗原的适应性免疫反应的方法，包含与外源或自身抗原共同给予一种PAMP。
65.权利要求64的方法，其中先天性免疫反应是通过激活一种或多种类Toll受体来刺激的。
66.权利要求65的方法，其中的动物是一种哺乳动物。
67.权利要求66的方法，其中的适应性免疫反应是通过由于一种或多种类Toll受体的激活而导致的APCs的激活来增强的。
68.权利要求67的方法，其中的抗原是细菌、病毒、原生动物、后生动物或真菌来源的。
69.权利要求68的方法，其中的PAMP和抗原是以融合蛋白质的形式共同给予的。
70.权利要求69的方法，其中的PAMP选自细菌脂蛋白、细菌外膜蛋白、细菌外表面蛋白质、鞭毛蛋白或膜孔蛋白。
71.权利要求70的方法，其中的PAMP选自疏螺旋体属ospA、疏螺旋体属ospB、疏螺旋体属ospC、细菌脂蛋白的脂化的四肽和克雷伯氏菌属ompA。
72.权利要求71的方法，其中的PAMP是细菌脂蛋白的脂化的四肽。
73.权利要求70的方法，其中的自身抗原选自淀粉状蛋白-β肽、TRP-2、EGFR、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her-2neu、SPAS-1、TRP-1、酪氨酸酶、Melan A/Mart-1、gp100、BAGE、GAGE、GM2神经节苷脂、驱动蛋白2、TATA元件调节因子1、肿瘤蛋白质D52、MAGE D、ING2、HIP-55、TGF-1抗细胞凋亡因子、MAGE-1、HOM-Mel-40/SSX2、NY-ESO-1EGFR、CEA、MAGE D、Her-2neu、NY-ESO-1、糖蛋白MUC1和MUC10粘蛋白、p53、EGFR、CDC27、丙糖磷酸异构酶、HLA-DRB1、HLA-DR1、HLA-DR6 B1、CD11a、LFA-1、IFNγ、IL-10、TCR类似物、IgR类似物、21-羟化酶、钙感觉受体、酪氨酸酶、LDL受体、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素B链、PC-1、IA-2、IA-2b、GLIMA-38和NMDA。
74.权利要求67的方法，其中的抗原是一种自身抗原。
75.权利要求73的方法，其中的PAMP和抗原是以融合蛋白质的方式共同给予的。
76.权利要求74的方法，其中的PAMP选自细菌脂蛋白、细菌外膜蛋白、细菌外表面蛋白质、鞭毛蛋白或膜孔蛋白。
77.权利要求75的方法，其中的PAMP选自疏螺旋体属ospA、疏螺旋体属ospB、疏螺旋体属ospC、细菌脂蛋白的脂化的四肽和克雷伯氏菌属ompA。
78.权利要求77的方法，其中的PAMP是细菌脂蛋白的脂化的四肽。
79.权利要求75的方法，其中的自身抗原选自淀粉状蛋白-β肽、TRP-2、EGFR、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Her-2neu、SPAS-1、TRP-1、酪氨酸酶、Melan A/Mart-1、gp100、BAGE、GAGE、GM2神经节苷脂、驱动蛋白2、TATA元件调节因子1、肿瘤蛋白质D52、MAGE D、ING2、HIP-55、TGF-1抗细胞凋亡因子、MAGE-1、HOM-Mel-40/SSX2、NY-ESO-1EGFR、CEA、MAGE D、Her-2neu、NY-ESO-1、糖蛋白MUC1和MUC10粘蛋白、p53、EGFR、CDC27、丙糖磷酸异构酶、HLA-DRB1、HLA-DR1、HLA-DR6 B1、CD11a、LFA-1、IFNγ、IL-10、TCR类似物、IgR类似物、21-羟化酶、钙感觉受体、酪氨酸酶、LDL受体、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素B链、PC-1、IA-2、IA-2b、GLIMA-38和NMDA。
80.权利要求69的方法，其中的融合蛋白质与药学上可接受的佐剂一同配制。
81.权利要求48的融合蛋白质，其中的抗原选自血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子受体。
82.一种包含与外源或自身抗原缀合的PAMP的疫苗，该疫苗在动物中刺激先天性免疫反应从而增强对外源或自身抗原的适应性免疫反应但不导致不需要的炎症水平。
83.一种包含与外源或自身抗原缀合的PAMP的疫苗，当以治疗活性剂量给予时，该疫苗可在动物中刺激先天性免疫反应并从而增强对外源或自身抗原的适应性免疫反应但不导致不需要的炎症水平。
84.一种治疗方法，包含治予个体疫苗的步骤，该疫苗含有与外源或自身抗原缀合的PAMP，并且可在动物中刺激先天性免疫反应并从而增加对外源或自身抗原的适应性免疫反应但不导致不需要的炎症水平。
全文摘要
本发明提供新型疫苗、生产该疫苗的方法和使用该疫苗的方法。本发明的新型疫苗结合了激活天然的T－细胞所必需的信号——特异抗原和共刺激信号，导致了加强的特异性T－细胞免疫反应。
文档编号A61P37/00GK1549726SQ01814845
公开日2004年11月24日 申请日期2001年7月31日 优先权日2000年7月31日
发明者R·M·迈德齐托夫, R M 迈德齐托夫 申请人:耶鲁大学