专利名称：一种新型纤溶酶原激活剂(tpa)突变体的结构与用途的制作方法
溶栓治疗是处理急性心肌梗塞的重大进展。组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogenactivator，TPA)是血中纤溶系统的生理性激活剂。由于TPA与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。TPA与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身之纤维蛋白溶解、疗效高等优点。由德国勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)生产的CHO细胞表达的重组人TPA(CHO-TPA，阿替普酶，alteplase，actilyse)已成功地用于急性心肌梗塞等血栓性疾病。但作为溶栓剂，TPA亦有不足之处。如在体内可被肝细胞快速清除，在血浆中存在纤溶酶原激活剂抑制剂可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1-5分钟)，使临床溶栓治疗时为维持有效浓度需大剂量(100mg)静脉滴注，增加了系统性纤溶引起出血的危险。因此研制特异性好、半衰期长、用量小、使用方便的新型t-PA受到关注。
TPA分子结构与其特定的功能特性有关。天然TPA由527个氨基酸组成(Pennica D，etal.Nature 301214，1983)，指状区(F，氨基酸1-99)与高纤维蛋白结合有关；kringle 1区(K1，氨基酸100-175)为肝脏受体结合部位；kringle2区(K2，氨基酸176-261)为低纤维蛋白结合区；蛋白酶区(P，氨基酸262-527)对纤溶酶原有专一性，为PAI-1结合位点；碳水化物区为血浆清除TPA的介导物。几种新纤溶酶原激活剂都是在此发现基础上设计的。通过对天然组织型纤溶酶原激活剂(TPA)分子进行结构改造，开发出了组织型纤溶酶原激活剂重组变异体K2P、瑞替普酶(reteplase)、n-PA及TNK等。
Weldenstrom M等(Weldenstrom M，et al.Gene.99243-248，1991)报道了TPA突变体K2P(氨基酸1-5和174-527，Asn177Ser和Asn184Gln)在肠杆菌中的表达。KohnertU等在TPA突变体K2P的基础上研制了瑞替普酶(Kohnert U，et al.Protein Engineering593，1992，专利号EP 0 382 174 A1)。瑞替普酶是一含355个氨基酸的单链分子，在大肠杆菌中表达。它不具有碳水化物链、指状区、表皮生长因子区和kringle1区，只含有kringle2区和丝氨酸蛋白酶区(氨基酸1-3和176-527)，整个分子的性质因此大大改变。首先它与纤维蛋白的结合率远低于天然TPA，并且是可逆结合，未结合的瑞替普酶能进入血凝块，促进纤维蛋白溶解。其次，清除率较低，半衰期较长(18分钟)，从而降低了维持治疗水平所需要的药量(20-40mg)，并可通过静脉注射给药(2分钟内注入)。Martin等(Martin U，et al.JACC 19433，1992)比较了瑞替普酶、阿替普酶(alteplase)、黑色素瘤TPA(melanoma TPA)和尿激酶的体外溶血块活性。结果表明，瑞替普酶和阿替普酶的最大溶栓能力在等价浓度时是相近的。Martin等的研究表明，与阿替普酶相比，瑞替普酶溶解富血小板血浆凝块和陈旧凝块的能力较低。这正是瑞替普酶减少出血的原因，因为封闭损伤血管壁的血凝块是陈旧血凝块。与阿替普酶不同，瑞替普酶主要通过肾脏清除。临床试验显示重组变异体瑞替普酶(reteplase)在60分钟时梗塞相关冠状动脉的总开放率和完全开放率优于阿替普酶，而安全性相当。基于瑞替普酶的上述优点，美国FDA在1998年批准了瑞替普酶上市。但瑞替普酶结构中仍包含有PAI-1结合位点，人体血液中的PAI-1能与其结合而抑制其活性。体外实验显示5U/ml的PAI-1可使5ng/ml的瑞替普酶失活。而有报道心肌梗塞等血栓病人血中PAI-1浓度高于正常人，所以必然降低瑞替普酶的效果，增加其用量。
本发明的目的是根据TPA的结构特点，在瑞替普酶的基础上将PAI-1位点氨基酸进行突变，构建具有TPA活性且其活性不被PAI-1抑制的新一代TPA突变体。本发明的主要内容是参照文献(Pennica D，et al.Nature 301214，1983)从人骨髓瘤细胞中分离总RNA，按文献报道的t-PA cDNA序列设计引物用RT-PCR法扩增出全长编码区序列，克隆于pUC18载体，经测序完全正确。参照文献(Kohnert U，et al.Protein Engineering593，1992，专利号EP 0 382 174 A1)用PCR法扩增出瑞替普酶的DNA(TPA氨基酸1-3和176-527)，并克隆于大肠杆菌表达载体。经过测序证明序列完全正确后，将瑞替普酶DNA中PAI-1结合位点，核苷酸序列373-384的AAG CAC AGG AGG改变为GCGGCC GCG GCG，使相应的氨基酸KHRR突变为AAAA，构建了新的TPA突变体，并克隆于大肠杆菌表达载体。经过测序证明序列完全正确后，转化大肠杆菌，在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的30％，以包涵体形式存在。经蛋白质复性，得到了有活性的TPA突变体。将新的TPA突变体，克隆于比赤酵母分泌型表达载体，在培养上清中得到高活性(2000U/ug)的TPA突变体。建立了t-PA纤溶酶原水解活性及PAI-1抑制TPA活性等测定方法。在大肠杆菌和比赤酵母表达的新的TPA突变体5ng/ml与PAI-1 15U/ml室温反应15分钟后TPA活性无抑制，而天然CHO-TPA活性全部被抑制。制备并纯化了兔抗CHO-TPA抗体。用免疫印迹法显示在大肠杆菌和比赤酵母表达的瑞替普酶突变体能被抗CHO-TPA抗体识别。
新的TPA突变体的DNA序列含有1068个核甘酸碱基，包含起始密码ATG，具体序列(5’-3’)如下1atgtcttaccaaggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacg 6061 cacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggc 120121 aaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattac 180181 tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg 240241 acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag 300301 cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct 360361 gccatctttgccgcggccgcggcgtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc 420421 atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac 480481 cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa 540541 tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac 600601 attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc 660661 cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc 720721 tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct 780781 catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc 840841 accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac 900901 gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact 960961 ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac 10201021 accaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg 1068
新的TPA突变体的氨基序列如下(M为起始的蛋氨酸)(M)1 SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL PWNSMILIGK VYTAQNPSAQ51 ALGLGKHNYC RNPDGDAKPW CHVLKNRRLT WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP101 QFRIKGGLFA DIASHPWQAA IFAAAAASPG ERFLCGGILI SSCWILSAAH151 CFQERFPPHH LTVILGRTYR VVPGEEEQKF EVEKYIVHKE FDDDTYDNDI201 ALLQLKSDSS RCAQESSVVR TVCLPPADLQ LPDWTECELS GYGKHEALSP251 FYSERLKEAH VRLYPSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGDTR SGGPQANLHD301 ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC GQKDVPGVYT KVTNYLDWIR351 DNMRP根据本发明，所列出的TPA突变体的DNA序列以及由此编码的氨基酸序列可以在大肠杆菌和酵母中表达出的纤溶酶原水解活性的TPA突变体，且其纤溶酶原水解活性不被PAI-1抑制。说明核苷酸序列373-384和其相对应的氨基酸序列影响PAI-1结合活性，而不影响其纤溶酶原水解活性。该突变体裁有可能成为活性好、用量少的治疗血栓性疾病的新型生物工程药物。
本发明的实施对严重危害人类健康的心肌梗塞和脑血栓等血栓性疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。结合
本发明的具体实施方法图1.截短形式的tPA重组质粒mtPA-pET28a的构建图2.缺失PAI-1位点的TPA突变体表达质粒mtPA4A-pAC177-pET28a构建图3.天然tPA截短形式片段PCR产物的琼脂糖电泳图4.重组质粒mtPA-pet28a阳性克隆的酶切鉴定图5.原核表达重组质粒mtPA4A-pAC177-pET28a的酶切鉴定图6.TPA突变体在大肠杆菌表达的SDS-PAGE图7.大肠杆菌表达的TPA突变体的活性图8.PAI-1对CHO-TPA及大肠杆菌表达TPA突变体活性的影响图9.真核(酵母)表达TPA突变体重组质粒pPIC 9K/mtPA4A的构建图10.真核(酵母)表达TPA突变体重组质粒pPIC 9K/mtPA 4A的鉴定图11.TPA突变体重组质粒在真核细胞中表达的Western-blot图12.真核(酵母)表达TPA突变体的活性图13.PAI-1对CHO-TPA及真核(酵母)表达TPA突变体活性的影响实施例一tpA突变体在大肠杆菌中的表达材料与方法1.天然tpA截短形式片段的制备1.1模板，含全长TPA cDNA序列的puc18质粒(由本实验室构建)1.2引物设计上游引物P1(5’CATGCC ATG GGG TCT TAC CAG GGA AAC AGTGAC 3′33个nt)含有NdeI酶切位点和ATG翻译起始密码子及甘氨酸密码GGG；下游引物P2(5’CGG GAT CCT CAC GGT CGC ATG TTG TCA C 3’，28个nt)含有BamHI酶切位点和TGA终止密码子。1.3 PCR扩增扩增产物为截短形式的tPA基因片段含天然tPA氨基酸1-3和176-527。2.截短形式的tPA重组质粒的构建(图1)将PCR扩增产物进行酚抽提，然后与pET28a载体，分别用NcoI/BamHI进行双酶切，用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切片断，酚抽提。DNA的酶切，连接及转化均参照Sambrook方法进行。感受态细胞为自制的E.coliDH5a。3.克隆鉴定3.1酶切鉴定将转化长出的菌落进行小提质粒，用NcoI/BamHI双酶切进行初步鉴定。3.2序列分析将阳性菌落摇菌、中提质粒，经DNA自动测序仪进行序列核实。命名为mtPA-pET28a4.对重组质粒mtPA-pET28a的改建4.1 去除ATG启动子之后多出的3个G设计引物P35’CAT GCC ATG GCT TAC CAGGGA AAC AGT GAC 3’，30个nt。以mtPA-pet28a重组质粒为模板，用P3和P2进行扩增，产物用NcoI/BamHI双酶切，再与已经NcoI/BamHI双酶切的pET-28a进行连接、转化，小提质粒酶切鉴定及测序核实。4.2将ATG启动子之后的G突变为T设计引物P45’GGA GAT ATA CCA TGT CTTACC AGG GAA AC 3’，29个nt；5’GTT TCC CTG GTA AGA CAT GGT ATA TCT CC3’，29个nt；以4.1改建的质粒为模板，用P4和P5进行PCR扩增，反应条件95℃，30s，之后95℃，30s，55℃/min，68℃/3min，共12个循环，产物立即放冰上2min，将1ul DpnI(20V)内切酶加入PCR产物中，37℃1h。取DpnI消化的PCR产物1ul转化DH5α感受态细胞，取转化菌落小提质粒，用NcoI/BamHI双酶切，未切下条带的样品即为突变成功，因NcoI位点已缺失，将阳性菌落进行测序核实。命名为tPA-pET28a5.快速定位突变构建缺失PAI-1位点的TPA突变体5.1模板为本室构建的TPA-pET28a重组质粒5.2引物设计为去除天然tPA截短形式片断中的PAI-1结合部点，特设计一对引物。P3(5’GCT GCC ATC TTT GCC GCG GCC GCG GCG TCG CCC GGA GAG CGG 3’，42个nt)。5.3 PCR扩增反应条件为95℃ 30s，之后95℃30s，55℃/min，68℃ 12min，共18个循环。然后将产物置冰上2min冷却。5.4转化加1ul DpnI内切酶到PCR扩增产物中，混匀，37℃/h，取DpnI消化后的PCR产物1ul转化DH5a感受态细胞。命名为mtPA4A-pET28a5.5定位突变鉴定酶切鉴定将转化长出的菌落进行小提质粒，用SacII/BamHI双酶切进行初步鉴定。序列分析将阳性菌落摇菌，中提质粒，经DNA自动测序仪进行序列核实。6.tPA突变体在大肠菌中的表达6.1构建pAC177-pET28a表达载体(图2)将pACYC177用PvuI/BglI双酶切，回收1929bp片断，将mtPA4A-pet28a以PvuI/BglI双酶切，回收4kb片断，连接片断后转化大肠菌TOP10感受态细胞，在Amp板上摇选，转化菌落小提质粒，用XbaI/HindIII双酶切鉴定，再将阳性克隆质粒转化表达菌BL21(DE3)。命名为mtPA4A-pAC177-pET28a6.2tPA突变体在大肠菌中的表达，挑选单个菌落接种于含Kan的2×YT培养基中37℃振摇过夜，次日按1％比例将菌液扩大培养至吸光度A600达0.5-0.6时，加入IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达4h后收获菌液。6.3表达鉴定取少量诱导前，诱导后菌液加含有DTT的SDS样品缓冲液，95℃5min，进行SDS-PAGE鉴定。6.4复性、纯化4000rpm离心3分钟收集菌体，超声波1’×5破碎细菌。12000rpm×20’离心收集沉淀，并用前述洗液洗涤三次，将包含体溶于50mM Tris-HCl，pH8.0-8M脲10mM DTT室温30min后，1∶10稀释于50mM Tris-HCl，pH8.0-0.7M Arg-10mM GSSG-2mMGSH。室温4h，对50mM Tris-HCl，pH8.0透析过夜，上Lysine亲和层析柱，亲和层析柱以50mMTris-HCl，pH8.0平衡，上柱后用含0.5NaCl的柱平衡液冼杂蛋白，再以含0.2M 6-氨基己酸的平衡液洗脱tPA。7.tPA活性测定方法取不同量的tPA(0.1-2.5ug/ul)加0.1MTris-HCl，pH8.5-0.15％Tween-80至50ul，与50ul 4mM的chromozymtpa(Boehrmger Mannheim)溶液和450ul缓冲液混匀，37℃不同时间，加10％柠檬酸250ul终止反应，以水为对照测A405，按下列公式计算tPA活性。 8.PAI-1对TPA活性的抑制作用取tPA或其突变体5ng在50ul反应体积中与不同浓度的PAI-1(Technoclone公司/奥地利)25℃反应15分钟。加Chromozymtpa底物50ul，缓冲液450ul 37℃反应30min，加柠檬酸250ul终止反应，以水为对照测A405。结果1.天然tPA截短形式片段的特异性根据设计的引物，PCR产物的扩增长度为1kb。实际扩增片段经琼脂糖电泳分析与设计长度一致(图3)。2.重组质粒(mtPA-pet28a)阳性克隆的鉴定2.1酶切鉴定转化菌落小提质粒，经NcoI/BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后显示两个条带，一为pet28a空载体5.4kb，另一mtpA约1kb，符合预期大小(图4)。2.2克隆片段的核酸序列分析经序列分析结果显示，所测片断核酸序列与文献报道的完全一致。3.定位突变后序列鉴定序列分析结果显示，突变部位碱基序列由AAG CAC AGG AGG改为GCG GCC GCG GCG，去除了PAI-1结合位点。4.原核表达重组质粒的鉴定转化菌落小提质粒，经XbaI/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳后显示两个条带，一为pAC177-pet28a的约为4.9Kb条带，一为mtpA4A约1Kb的条带(图5)。5.重组质粒在大肠杆菌中的表达将诱导表达的全菌进行SDS-PAGE，经考马斯亮蓝R-250染色，结果见图，在分子量约为40×103D处可见一染色蛋白带，TPA突变体占菌体总蛋白的30％。TPA突变体主要以包涵体形式存在于沉淀中(图6)。6.表达产物活性的测定从图7中看出TPA突变体对底物的水解随着时间的增加而增加，在60min内呈线性关系，与等量的CHO-TPA相比对底物的水解活性较低。7.PAI-1对CHO-TPA及TPA突变体活性的影响从图8中看出，随着PAI-1浓度的增加，天然CHO-TPA的活性逐渐降低，当PAI-1浓度为15U时天然CHO-TPA的活性降到了2.1％。而TPA突变体活性未受到PAI-1的抑制，当PAI-1浓度为15U时，TPA突变体活性仍保持在100％以上。实施例二tPA突变体在真核细胞(酵母)中的表达材料与方法材料细胞和培养基酵母菌株GS115，大肠菌TOP 10F’，载体pPIC9K以及酵母培养基，原生质体制备试剂，转化试剂均购自invitrogen的多拷贝Pichia表达试剂盒。方法1.tPA突变体片段的制备1.1模板为本室构建的tPA突变体mtPA4A-pET28a1.2引物设计上游引物P5(5’GCT ACG TAT CTT ACC AGG GAA ACA GTG AC 3’，29个nt)，含有SnaBI酶切位点。下游引物P6(5’TCC CCT AGG TCA CGG TCG CAT GTT GTCAC 3’，29个nt)，含有AvrII酶切位点和TGA终止密码子。1.3 PCR扩增扩增产物为截短形式的tPA基因片段(天然tPA氨基酸1-3和176-527)，其中氨基酸296-299进行了点定位突变。2.酵母表达重组质粒pPIC 9K/mtPA4A的构建(图9)将PCR扩增产物进行酚抽提，之后与pPIC 9K载体分别用SnaBI/AvrII进行双酶切，用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，酚抽提，DNA的酶切，连接及转化均参照Sambrook方法进行。感受态细胞为大肠杆菌TOP10F’。3.克隆鉴定3.1酶切鉴定将转化长出的菌落进行小提质粒，用SnaBI/AvrII双酶切进行初步鉴定。3.2序列分析将阳性菌落摇菌，中提质粒，经DNA自动测序仪进行序列核实。4.酵母菌转化及筛选4.1转化前DNA的制备经中提质粒纯化的pPIC 9k/mtPA4A用SalI单酶切，进行线性化处理，酶切后进行酚抽提，乙醇沉淀及冷冻干燥。4.2圆生质体的制备参照Invitrogen试剂盒说明书操作，简述之。取新鲜GS115单菌落在TPD培养基中扩增培养，取部分菌细胞确定酶解酶消化的最佳时间，然后制备圆生质体。4.3 Pichia转化将10ug DNA加入到100ul圆生质体中，置室温10min，加1ml新鲜配制的PEG/CaT，轻微混合，室温10min，室温离心750×g 10min，仔细吸去上清，用150ulSDS重悬转化细胞，室温20min，再加850ul 1M山梨糖醇，最后取300ul圆球质体-DNA液与10ml RD顶部琼脂混合铺板，29℃培养4-6天。4.4 G418抗性筛选转化后第6天，用牙签挑取单菌落到100ul YPD液中混匀，再分别在含G418不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml，0.75mg/ml，1mg/ml)的YPD平板上划线，29℃培养4天。4.5.Mut4和Mut5转化的筛选参照Invitrogen试剂盒说明书操作，先制备MD及MM平板，用无菌牙签挑取单菌落在MM平板及MD平板上划线，30℃培养2天，观察结果。5.重组Pichia菌的表达挑取单菌落到25ml MGYk 29℃振摇过夜，次日晨将过夜菌加入10ml BMMY培养基中诱导表达过夜，第三天培养基中补充甲醇到终浓度0.5％，继续振摇，48h后收集样品。6.表达产物的鉴定6.1抗tpA多抗的制备及免疫印迹取约1.5kg重的白兔两只，每只兔用rhCHO-tPA 1mg与完全佐剂，背部皮下多点注射，间隔7-10天重复注射rhCHO-tPA 1mg不完全佐剂，连续5次，取血测效价＞132(双扩)，放血，制备血清。将10mgCHO-tpA偶联于5ml CNBr活性的Sepharose 4B上。将免疫血清过柱，用10mM Tris-HCl pH8.0-0.15M NaCL平衡柱并洗脱杂蛋白。特异性抗tPA抗体用10mM甘氨酸-盐酸pH3.0-0.15M NaCl洗脱，用1M Tris-HCl，pH9.5中和至pH7.0。
将及酵母菌表达的tPA突变体上清液不同量上样，10％SDS-PAGE，转移至硝酸纤维素膜上，用1％BSA室温封闭30分。加抗CHO-tPA抗体(1∶500稀释)37℃反应30分。冼涤3次后，加碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃反应30分，冼涤3次，加入NBT和BCIP底物液显色。6.2活性鉴定同实施例一中方法。6.3 PAI-1对TPA活性抑制作用同实施例一中方法。结果1.重组质粒(pPIC 9K/mtPA 4A)鉴定1.1用SnaBI/AvrII双酶切鉴定其重组质粒DNA，可得到一约9.3kb条带和一约1kb的条带(图10)。1.2克隆片段的核酸序列分析 对克隆片段的全长序列分析结果显示，所测片段的核酸序列与设计的结果完全一致。2.含高拷贝重组基因菌株的筛选经G418筛选得到了6个在含1mg/ml G418 YPD平板上生长的菌株。3.重组质粒在真核细胞中的表达将诱导表达的细胞上清2-10ul上样，做Western blot(图11)，在Mr约为40×103D可见一染色蛋白带。3.表达活性检测从图12中看出TPA突变体对底物的水解随着时间的增加而增加，在60min内呈线性关系，与等量的CHO-TPA相比对底物的水解活性较低。4.PAI-1对酵母表达的tPA突变体的活性抑制作用从图13中看出，随着PAI-1浓度的增加，天然CHO-TPA的活性逐渐降低，当PAI-1浓度为15U时天然CHO-TPA的活性降到了2.1％。而TPA突变体活性未受到PAI-1的抑制，当PAI-1浓度为15U时，TPA突变体活性仍保持在100％以上。
权利要求
1.TPA突变体的核苷酸序列(5’-3’)1atgtcttaccaaggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacg 6061 cacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggc 120121 aaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattac 180181 tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg 240241 acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag 300301 cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct 360361 gccatctttgccgcggccgcggcgtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc 420421 atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac 480481 cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa 540541 tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac 600601 attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc 660661 cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc 720721 tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct 780781 catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc 840841 accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac 900901 gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact 960961 ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac 10201021 accaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg 1068
2.TPA突变体的氨基酸序列(M为起始的蛋氨酸)(M)1 SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL PWNSMILIGK VYTAQNPSAQ51 ALGLGKHNYC RNPDGDAKPW CHVLKNRRLT WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP101 QFRIKGGLFA DIASHPWQAA IFAAAAASPG ERFLCGGILI SSCWILSAAH151 CFQERFPPHH LTVILGRTYR VVPGEEEQKF EVEKYIVHKE FDDDTYDNDI201 ALLQLKSDSS RCAQESSVVR TVCLPPADLQ LPDWTECELS GYGKHEALSP251 FYSERLKEAH VRLYPSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGDTR SGGPQANLHD301 ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC GQKDVPGVYT KVTNYLDWIR351 DNMRP
3.权利要求书1中的核苷酸序列373-384和其相对应的氨基酸序列影响PAI-1结合活性。
4.根据权利要求书1中的核苷酸序列和权利要求书2中的氨基酸序列以及 3所构建的TPA突变体，在原核和真核等表达系统的表达。
5.根据权利要求书4中TPA突变体表达产物及其制剂在心肌梗塞和脑血栓等相关性血栓性疾病的治疗中的应用。
全文摘要
本发明是根据TPA的结构特点,在将TPA分子中指状区和Kringle1区去掉的基础上,将TPA分子中PAI－1结合位点氨基酸进行突变,构建具有TPA活性且其活性不被PAI－1抑制的新一代TPA突变体。主要内容是扩增出天然TPA氨基酸1－3和176－527的DNA序列。将TPA DNA中PAI－1结合位点,核苷酸序列373－384的AAG CAC AGG AGG改变为GCG GCC GCG GCG,使相应的氨基酸KHRR突变为AAAA,构建了新的TPA突变体,并克隆于大肠杆菌表达载体。在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在。经蛋白质复性,得到了有活性的TPA突变体。将新的TPA突变体,克隆于比赤酵母分泌型表达载体,在培养上清中得到高活性的TPA突变体。在大肠杆菌和比赤酵母表达的新的TPA突变体与PAI－1反应后TPA活性无抑制。说明核苷酸序列373－384和其相对应的氨基酸序列影响PAI－1结合活性,而不影响其纤溶酶原水解活性。故本发明涉及针对一种新型TPA突变体的核苷酸序列和结构及其成为治疗活性好、用量少的治疗心肌梗塞和脑血栓等血栓性疾病的新型生物工程药物。
文档编号A61P9/00GK1381460SQ02100558
公开日2002年11月27日 申请日期2002年2月5日 优先权日2002年2月5日
发明者朱美财, 李文, 占志, 王荫静, 刘成刚 申请人:中国人民解放军空军总医院