专利名称：一种成纤维细胞生长促进剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种成纤维细胞生长促进剂技术领域和其应用的技术领域。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供上述成纤维细胞生长促进剂的应用。
本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为该种成纤维细胞生长促进剂，其特征在于为具有下式结构的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
上述的海藻低聚寡糖是来自于红藻琼胶的降解寡聚糖，以5个琼二糖或新琼二糖的聚合单位以下的寡糖为主，即1≤n≤5。
本发明所要解决的再一个技术问题的技术方案是将上述成纤维细胞生长促进剂在预防紫外线造成皮肤损伤的护肤化妆品应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于1、采用天然的海藻原料，原料广泛；2、制备工艺简单，无需基因工程方法或者昂贵的蛋白质纯化方法；；3、单纯的小分子碳水化合物，不是蛋白质，不会变性，更适合在护扶的化妆品上使用，安全可靠有效；4、成本经济，适合其推广使用。总之，海藻寡糖来自于纯天然海藻原料，制备工艺简单，产品安全无毒，具有明显的成纤维细胞保护作用。根据本发明，可以将海藻寡糖作为特效生物活性成分添加到各类化妆、护肤品中，可以祛除防止紫外线辐射引起的皮肤损伤与皱纹，使皮肤弹性增强、有光泽并富于生气。
实施例之一1.琼胶寡糖的降解制备将琼胶样品配置成1.5％溶液，在50℃恒温水浴中加入盐酸至终浓度0.37mol/L，搅拌条件下反应4h，反应结束后以NaOH中和，加入4倍体积的乙醇，静置过夜，减压过滤，滤液减压浓缩至近干。降解产物经Sephadex G-10柱脱盐，脱盐后的产物冷冻干燥，得率为35％。
2.琼胶寡糖的组成分析(薄层色谱法)样品溶解于50％乙醇中，在硅胶板上点样，展开剂采用正丁醇/乙醇/水(3∶1∶1)，显色剂采用百里酚-硫酸，喷雾后100℃显色5min，出现粉红色斑点，标准寡糖样品包括半乳糖、3，6-内醚半乳糖、新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖。斑点主要集中在新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖以及更高分子量的寡糖斑点。
3.琼胶寡糖对成纤维细胞生长促进活性测定本实验在青岛大学医学院附属医院进行。
(1)成纤维细胞第10代体外培养的人体成纤维细胞。
(2)胶寡糖样品将0.5g样品溶解于2.5ml蒸馏水中，经过0.2μm滤膜过滤，4℃保存。
(3)在24孔细胞培养板上接种细胞，细胞密度为1×105个/ml，在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培育20h后，加入样品溶液，然后在同样条件下培育60min，培育结束后，在每个孔内加入5mg/ml MTT(Sigma产品)200μl，同样条件下再培育4h，弃去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均匀，以1∶3转移到96孔板(每孔100μl)，采用酶标仪在550nm读取吸光度，共进行9组平行样品测定。
(4)对成纤维细胞的生长促进作用按照下式计算生长促进率(％)＝[(A-A0)/A0]×100％]其中，A为样品组的吸光度；A0为空白对照组的吸光度。结果见表1，可以证明，琼胶寡糖对人体成纤维细胞具有明显的生长促进作用。
表1琼胶寡糖对成纤维细胞的生长促进作用
实施之二1.从食品级琼胶降解制备琼胶寡糖采用食品级市售琼胶配置成1％溶液，加入2216E固体培养基，经过琼胶降解微生物降解2d，过滤后，在降解产物中加入3倍乙醇，离心后将溶液旋转浓缩，冷冻干燥。
2.琼胶寡糖的分离制备将上述降解产物120mg，加入0.02％叠氮化钠抗菌剂，上Sephadex G-25凝胶柱(900×26mm)，室温下用恒流泵以40ml/h流速含有0.02％叠氮化钠的水溶液洗脱，以部分收集器收集流分，每次收集6ml，用硫酸苯酚法检测各试管中的糖浓度，结合薄层色谱检测，得到二糖寡聚度为1-5的组分，合并洗脱液，旋转浓缩后冷冻干燥。
3.琼胶寡糖对成纤维细胞紫外辐射氧化损伤的保护活性测定采用与实施例1基本相同的检测方法同样测定，在24孔细胞培养板上接种细胞，细胞密度为1×105个/ml，在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培育20h后，加入样品溶液，然后在同样条件下培育30min，然后用UVA辐射5s，辐射强度为1.91×10-3J/cm2，另外一组则用UVB辐射20s，辐射强度为1.176×10-4J/cm2，辐射结束后，再培育30min，然后在每个孔内加入5mg/ml MTT(Sigma产品)200μl，同样条件下再培育4h，弃去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均匀，以1∶3转移到96孔板，每孔100μl，采用酶标仪在550nm读取吸光度，共进行9组平行样品测定。采用与实施例1一样的数据处理方式计算成纤维细胞的生长率。
结果见表2，通过对所得数据进行统计学分析可以得出结论UVA短时间照射5s，对成纤维细胞不仅没有抑制作用，而且具有一定的生长促进作用，但是UVB确实能够造成对成纤维细胞的损伤作用，而琼胶寡糖样品确实对紫外线造成的人体成纤维细胞的氧化性损伤具有明显的保护作用，而且这种保护作用成显著的量效关系。
表2琼胶寡糖对紫外辐射损伤的成纤维细胞的保护与生长促进作用
作为本实施例的变更1.琼胶的来源可以是石花菜、江蓠、紫菜等红藻。按照藻类资源的不同，在提取琼胶的工艺上有所不同。
2.琼胶寡糖的制备可以采用酸水解法，也可以采用酶水解法。精制琼胶寡糖的方法可以采用Sephadex G-25凝胶色谱，也可以采用乙醇沉淀除去多糖后再脱盐制备，或者采用分子截留值为3000的膜超滤方法制备。
权利要求
1.一种成纤维细胞生长促进剂，其特征在于为具有下式结构的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
2.根据权利要求1所述的成纤维细胞促进剂，其特征在于所述的海藻低聚寡糖是来自于红藻琼胶的降解寡聚糖，以5个琼二糖或新琼二糖的聚合单位以下的寡糖为主，即1≤n≤5。
3.一种根据权利要求1所述的成纤维细胞生长促进剂，其特征在于在预防紫外线造成皮肤损伤的护肤化妆品方面应用。
全文摘要
本发明涉及下式的海藻低聚寡糖作为成纤维细胞生长促进剂,它具有作为紫外线氧化损伤保护剂的新用途,具有下式结构的低聚寡糖,来自于红藻琼胶的降解产物,可以进一步开发成为作为具有成纤维细胞生长促进作用及紫外线氧化损伤保护作用的护肤化妆品,其中n=1－10。
文档编号A61P17/16GK1387857SQ02111990
公开日2003年1月1日 申请日期2002年6月6日 优先权日2002年6月6日
发明者严小军, 周成旭, 范晓 申请人:严小军