专利名称：哇巴因结合肽或蛋白质及其在治疗高血压中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于多肽或蛋白质的应用，尤其涉及一种哇巴因结合肽或蛋白质及其在治疗高血压中的应用。
高血压的防治是降低其心、脑、肾损害及降低其高致残率和高死亡率之最积极的方法；也与预防冠心病、脑卒中，减少糖、脂质代谢紊乱和糖尿病的发生、发展密切有关。尽管降压药物已有了长足进展，目前临床上用于降压治疗的降压药有6种(利尿剂、转换酶抑制剂、b-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、a—受体阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂)，但是各类药物有其各自独特的作用和适应症，有效地控制血压是降压治疗的首要目标。本课题组提出了哇巴因结合肽(蛋白质)(Ouabain conjugated peptide & protein，OCP)可通过特异性地与EO结合，拮抗体内高哇巴因水平或封闭EO与钠泵(即Na，K-ATPase)的结合位点，从而减少EO对钠泵的抑制，进而解除高血压的致病因子之一——含量过高的内源性钠泵抑制物对钠泵的抑制作用，达到降压目的。由于哇巴因结合肽(蛋白质)是针对高血压发病学因素的治疗，而不象目前临床上常用的降压药是针对周围靶器官的治疗，故有可能为高血压的治疗开辟新的领域。
本发明为了实现上述之目的，其采取的技术方案如下哇巴因结合肽或蛋白质通过“吸咐—洗脱—扩增”的方法，从噬菌体随机肽库中筛选出来的。随机选取的12个噬菌体蓝斑，经扩增、DNA的提取、测序分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽(OCP)。从噬菌体随机肽库中筛选出的氨基酸序列，是一种新发现的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)，并应用含有此序列的多肽或蛋白，即哇巴因结合肽(蛋白)用于体外生物学实验发现，其具有阻断或拮抗哇巴因抑制钠泵的作用，动物实验表明其可以降低高血压动物模型的血压，而且急性毒性作用小，可用于高血压的治疗。
1、哇巴因结合肽是通过生物淘洗的方法从噬菌体随机肽库中筛选出多肽或蛋白质。筛选哇巴因结合肽的具体方法是(1)卵清蛋白—哇巴因(OVA-Ouabain)耦联物的制备哇巴因加入NalO4后进行搅拌，加入卵清蛋白，搅拌，加入硼氢化钠形成等体积的饱和(NH4)2SO4溶液，最后溶解沉淀、透析。
(2)生物淘洗OUA-OVA耦联物包被酶标板后，加入TBST洗液和稀释噬菌体文库，弃去未与噬菌体结合的噬菌体，再加入glycine-HCl收集洗脱液。
(3)吸附实验OVA包被酶标板后，加入TBST洗液，将已经过淘筛的噬菌体加入酶标板，收集未与噬菌体结合的噬菌体。
(4)快速纯化噬菌体测序模板及测序噬菌体蓝斑扩增后，对噬菌体测序模板进行纯化、测序及序列分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽。
从噬菌体随机肽库中筛选出的多肽，即哇巴因结合肽，同源性分析发现筛选的多肽与哇巴因的功能性受体——钠泵的蛋白质序列无同源性。经过进一步的研究证实了哇巴因不仅能与钠泵结合，而且自然界中还存在其它能与哇巴因特异性结合的蛋白，即发现了一种新的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)，即哇巴因结合肽(蛋白质)。
2、哇巴因结合肽(OCP)生物学活性的鉴定(1)哇巴因对正常红细胞86Rb摄取的抑制作用在红细胞悬液中，加入不同浓度的哇巴因溶液和Ringer氏缓冲液，使之混合后，温育，再加入86RbCl溶液，温育，终止反应，然后离心、吸去上清液后，置入γ计数器内，测得红细胞摄入的86Rb。实验结果显示哇巴因对正常红细胞86Rb摄取有抑制作用。在一定范围内，哇巴因浓度越高，其对正常红细胞86Rb摄取的抑制作用就越大。
(2)OCP对哇巴因与钠泵结合的阻断作用在新鲜配制的红细胞悬液内，加入固定浓度的哇巴因溶液、不同浓度的OCP溶液和Ringer氏缓冲液后，进行混合，其余的实验操作同上。结果显示，OCP有阻断抑制红细胞86Rb摄入的作用，在一定范围内，OCP浓度越高，其对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻碍作用就越大。
3、哇巴因结合肽药理学实验(1)实验方法及结果如下“一肾一夹”高血压模型实验实验分为6组，即生理盐水组、硝普钠组、3个剂量的哇巴因结合肽组，每组8-10只。哇巴因结合肽用量分大、中、小三组(即23mg/kg，4.6mg/kg，2.3mg/kg)。
各组大鼠均经25％乌拉坦麻醉，颈动脉插管监测血压，待血压稳定后舌静脉给药，阳性对照药为硝普钠(静注剂量为0.3mg/kg体重)，阴性对照为生理盐水。
(2)动物药理学实验表明哇巴因结合肽的降压作用有以下特点降压效应与用药剂量有关，降压幅度和持续时间与用药剂量呈正相关；降压效果比常用降压药物硝普钠降压持续时间长；降压起效快，用药后2-5分钟起效。
4、哇巴因结合肽急性毒性实验选择18-22克体重的健康小鼠20只，雌雄各半，经尾静脉及腹腔两种途径一次注入最大浓度(230mg/Kg体重)的哇巴因结合肽。观察结果(1)试验即刻动物反应情况动物活动明显减少，但无抽搐及呼吸急促等发生。
(2)继续观察了10天，实验第一天动物饮食及活动明显减少，第二天好转，第三天恢复正常，观察10天无动物死亡。
结论最大耐受性试验显示，哇巴因结合肽的急性毒性作用小。
本发明与同类技术或产品在治疗高血压方面的应用情况相比，具有以下积极效果哇巴因结合肽(蛋白)是针对高血压发病学因素的治疗，其对高血压的治疗，效果好，副作用小。
四
图1是哇巴因对红细胞86Rb摄取具有抑制作用的体外生物学活性试验结果图；其中，横坐标表示哇巴因的浓度；纵坐标表示红细胞86Rb摄取率。
图2是哇巴因结合肽(OCP)对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻断作用的体外生物学活性试验结果图；其中，横坐标表示哇巴因结合肽的浓度；纵坐标表示红细胞86Rb摄取率。
图3是筛选出的噬菌体克隆的DNA测序图图中，第31-36位为EagI的酶切位点(CGGCCG)；第99-104位为KpnI的酶切位点(GGTACC)；第47-82位为插入的12肽的DNA序列。此序列的一致率最高66.7％。依据该序列的互补链，推导出多肽的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)。
(2)生物淘洗OUA-OVA耦联物包被酶标板后，加入TBST洗液和稀释噬菌体文库，弃去未与噬菌体结合的噬菌体，再加入glycine-HCl收集洗脱液。
(3)吸附实验OVA包被酶标板后，加入TBST洗液，将已经过淘筛的噬菌体加入酶标板，收集未与噬菌体结合的噬菌体。
(4)快速纯化噬菌体测序模板及测序噬菌体蓝斑扩增后，对噬菌体测序模板进行纯化、测序及序列分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽。
经过进一步的研究证实了哇巴因不仅能与钠泵结合，而且自然界中还存在其它能与哇巴因特异性结合的蛋白，即发现了一种新的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)，即哇巴因结合肽(蛋白质)。
2、哇巴因结合肽(OCP)生物学活性的鉴定(1)哇巴因对正常红细胞86Rb摄取的抑制作用在红细胞悬液中，加入不同浓度的哇巴因溶液和Ringer氏缓冲液，使之混合后，温育，再加入86RbCl溶液，温育，终止反应，然后离心、吸去上清液后，置入γ计数器内，测得红细胞摄入的86Rb。实验结果显示哇巴因对正常红细胞86Rb摄取有抑制作用。在一定范围内，哇巴因浓度越高，其对正常红细胞86Rb摄取的抑制作用就越大。
(2)OCP对哇巴因与钠泵结合的阻断作用在新鲜配制的红细胞悬液内，加入固定浓度的哇巴因溶液、不同浓度的OCP溶液和Ringer氏缓冲液后，进行混合，其余的实验操作同上，结果显示，OCP有阻断抑制红细胞86Rb摄入的作用，在一定范围内，OCP浓度越高，其对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻碍作用就越大。
3、哇巴因结合肽药理学实验(1)实验方法及结果如下“一肾一夹”高血压模型实验实验分为6组，即生理盐水组、硝普钠组、3个剂量的哇巴因结合肽组，每组8-10只。哇巴因结合肽用量分大、中、小三组(即23mg/kg，4.6mg/kg，2.3mg/kg)。
各组大鼠均经25％乌拉坦麻醉，颈动脉插管监测血压，待血压稳定后舌静脉给药，阳性对照药为硝普钠(静注剂量为0.3mg/kg体重)，阴性对照为生理盐水。
(2)动物药理学实验表明哇巴因结合肽的降压作用有以下特点降压效应与用药剂量有关，降压幅度和持续时间与用药剂量呈正相关降压效果比常用降压药物硝普钠降压持续时间长；降压起效快，用药后2-5分钟起效。
4、哇巴因结合肽急性毒性实验选择18-22克体重的健康小鼠20只，雌雄各半，经尾静脉及腹腔两种途径一次注入最大浓度(230mg/Kg体重)的哇巴因结合肽。观察结果(1)试验即刻动物反应情况动物活动明显减少，但无抽搐及呼吸急促等发生。
(2)继续观察了10天，实验第一天动物饮食及活动明显减少，第二天好转，第三天恢复正常，观察10天无动物死亡。
结论最大耐受性试验显示，哇巴因结合肽的急性毒性作用小。
从图1、图2中，可以看出哇巴因结合肽(蛋白)用于体外生物学活性试验的结果哇巴因溶液浓度越高时，其对正常红细胞86Rb摄取的抑制作用就越大，反之越小；哇巴因结合肽溶液浓度愈高时，其对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻断就愈强，反之愈弱。
总之，以上内容充分说明了哇巴因结合肽或蛋白质可用于治疗高血压。
权利要求
1.哇巴因结合肽或蛋白质，其特征在于其中含有(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)氨基酸系列。
2.哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用。
3.根据权利要求2所述的哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用，哇巴因结合肽或蛋白质是含有一种新发现的氨基酸序列(Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His-His-Arg-Pro-Trp-Thr)，并应用含有此序列的多肽或蛋白用于高血压的治疗。
4.根据权利要求1所述的哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用，其特征在于，哇巴因结合肽具有阻断或拮抗哇巴因抑制钠泵的作用，可由哇巴内结合肽(OCP)体外生物学活性实验证实。
5.根据权利要求1所述的哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用，其特征在于，哇巴因结合肽(蛋白)具有降低血压的作用，可由哇巴因结合肽药理学实验证实。
6.根据权利要求1所述的哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用，其特征在于，哇巴因结合肽急性毒性小，可由哇巴因结合肽急性毒性实验证实。
7.哇巴因结合肽或蛋白质的筛选方法，其特征在于(1)卵清蛋白—哇巴因(OVA-Ouabain)耦联物的制备哇巴因加入NalO4后进行搅拌，加入卵清蛋白，搅拌，加入硼氢化钠形成等体积的饱和(NH4)2SO4溶液，最后溶解沉淀、透析。(2)生物淘洗OUA-OVA耦联物包被酶标板后，加入TBST洗液和稀释噬菌体文库，弃去未与噬菌体结合的噬菌体，再加入glycine-HCl收集洗脱液。(3)吸附实验OVA包被酶标板后，加入TBST洗液，将已经过淘筛的噬菌体加入酶标板，收集未与噬菌体结合的噬菌体。(4)快速纯化噬菌体测序模板及测序噬菌体蓝斑扩增后，对噬菌体测序模板进行纯化、测序及序列分析，最后由多肽合成仪合成哇巴因结合肽。
全文摘要
本发明公开了一种哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用属于多肽或蛋白质的应用，尤其涉及一种哇巴因结合肽或蛋白质在治疗高血压中的应用。该发明克服了已有药物在治疗高血压中不能拮抗体内高EO水平在高血压发病中的作用的不足。该发明从噬菌体随机肽库中筛选出的含有新发现的氨基酸序列的多肽或蛋白，即哇巴因结合肽(蛋白质)用于体外生物学实验发现，其具有阻断或拮抗哇巴因抑制钠泵的作用，动物实验表明其可以降低高血压动物模型的血压，因此，该发明可用于高血压的治疗，同时具有疗效显著、副作用小等特点。
文档编号A61K38/22GK1397345SQ0211455
公开日2003年2月19日 申请日期2002年4月30日 优先权日2002年4月30日
发明者吕卓人, 张明娟 申请人:西安交通大学