专利名称：总藤黄酸制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂，特别是涉及总藤黄酸、含有它的制剂及其制备方法。
背景技术：
藤黄为藤黄科植物藤黄树分泌的干燥树脂，美国药典曾收载该品，其活性成分主要为藤黄酸等酸性有效部位，即总藤黄酸。1955年Amorosa通过制成吡啶盐结晶，首次获得纯的藤黄酸，1965年借助核磁共振仪确定了分子结构，以后对藤黄酸的研究工作不断深化。藤黄酸的制备方法文献报道较多，其中主要有三条。第一条路线是将藤黄碎粒加丙酮浸泡过夜，合并丙酮液，得藤黄树脂的丙酮提取液，经浓缩后，通过硅胶柱层析，收集苯-乙酸乙酯(9∶1)洗脱部分，用硅胶G制板，氯仿-甲醇-二乙胺(15∶1∶1)展开，割取Rf值0.4的亮黄色部分，硅胶用0.5％Na2CO3洗涤，过滤，滤液用稀盐酸酸化，即得亮黄色沉淀，水洗至中性，抽干得藤黄酸。第二条路线是将藤黄碎粒用丙酮浸泡过夜，合并丙酮液，减压蒸干得棕黑色胶状物，加吡啶热溶后，加水，固体物用石油醚及70％吡啶洗涤，得橙黄色藤黄酸吡啶盐，将此吡啶盐溶于乙醚，用1N HCl洗涤，乙醚层加无水硫酸钠干燥，蒸去乙醚，得藤黄酸。第三条路线将藤黄碎粒直接加吡啶热浸，合并吡啶液，加热水过夜，析出藤黄酸吡啶盐，吡啶水溶液洗涤，红外烘干，用乙醚热溶，滤过，浓缩至适量，加入等体积的石油醚(60～90℃)，室温下析出固体，将此固体物照第二条路线同法酸化，提取，干燥得藤黄酸，用上述方法提取的藤黄酸具有抗肿瘤作用，用藤黄酸制成的注射剂应用于抗肿瘤研究也有报道，目前报道的注射剂主要有直接溶解在水中的、用硼酸溶液配制的，这些注射剂需要加入大量助溶剂，稳定性差，临床使用不便。
本发明公开了一种新的藤黄酸组合物，该组合物配方改进了上述注射剂的缺陷，具有良好的溶解性和稳定性，并且经济实用，治疗效果优良。
发明内容
本发明提供一种新的藤黄酸组合物，该组合物由总藤黄酸，L-精氨酸和甘露醇组成，其中各组分所占比例按重量份计为总藤黄酸12.5-37.5，L-精氨酸10-30，甘露醇20-60，本发明还包括制备这种组合物的方法。
本发明优选的配方组成为按重量份计为总藤黄酸25，L-精氨酸20，甘露醇40。
本发明的藤黄酸药物组合物制剂可以制成各种制剂形式，包括片剂、胶囊剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服液、混悬剂、冲剂、贴剂、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂、控释制剂等，优选的是注射剂，最优选的是冻干注射剂。
本发明的藤黄酸组合物制剂可以通过如下方式制备，将三种组分按配方量混合，制成所需的制剂，本发明优选的冻干注射剂可以通过如下方法制备，取总藤黄酸，加入注射用水，加入L-精氨酸，使混合物溶解，加入甘露醇，使溶解，加入碳粉，搅拌，脱色，过滤，灌装，冷冻干燥。
本发明所用原料总藤黄酸包含多种成分，可测定的成分有近10种，总藤黄酸具有抗肿瘤作用是这多种成分共同作用的结果，本发明所用总藤黄酸可使用背景技术中的方法制备，也可使用如下方法制备将藤黄树脂剪成小粒，用粉碎机粉碎成粉(约10目)，将藤黄粉600g，置3000ml三角烧瓶中，加入1500ml吡啶，振摇、静置30分钟后，移入85℃水浴中热浸2小时，并不断振摇，趁热过滤，滤瓶用热吡啶洗涤3次，每次100ml，合并滤液及洗涤液加入60℃热水150ml，放置于冰箱中过夜。于次日取出，减压滤过，滤饼用70％吡啶洗涤两次，每次80ml，再用蒸馏水洗涤三次，每次60ml，抽干后，于红外灯下烘干，得干品75g，收率12.5％。
将上述干燥品放入1000ml圆底烧瓶中，加乙醚600ml，水浴上回流溶解，放冷，滤出不溶物，滤液浓缩至1/3体积，向烧瓶中加入同体积石油醚摇匀，放置2小时。滤出固体，用石油醚(60℃～90℃)洗涤三次，每次50ml，抽干后，红外光下烘干，得干品42g，收率56％。
将上述干品用乙醚溶解后，移置1000ml分液漏斗中，用1N盐酸1200ml，分四次洗涤，每次300ml，再用蒸馏水洗涤至水层显中性，分取乙醚层，用无水Na2SO4干燥，抽滤，于水浴上浓缩乙醚至干，得成品总藤黄酸原料35g，收率83.3％。TLC检查一个主斑点，Rf0.65[硅胶G板，展开剂苯-乙酸乙酯-甲酸(75∶24∶1.5)]。本发明的最佳配方剂量选择依据文献报道，藤黄酸剂量5mg/kg时对小鼠S-180或EC腹水癌有明显的抑制作用，我们通过药效学试验，结果也表明总藤黄酸静脉给药剂量在4mg/kg时对小鼠移植性肿瘤肉瘤S-180实体型、肝癌H-22实体型、艾氏癌实体瘤(EC)均有明显的抑制作用(抑制率＞30％)，从实验结果及文献报道的结果可知，总藤黄酸对小鼠S-180或H-22以及EC实体瘤静脉给药的有效剂量为4mg/kg左右。根据小鼠药效学剂量通常为人临床用药剂量的9-10倍之规定，可以初步推断出人临床用剂量。4mg/kg÷9＝0.44mg/kg(人用剂量)4mg/kg÷10＝0.40mg/kg(人用剂量)按一个人体重为60kg计算，一个人一次静脉用剂量为0.44mg/kg×60kg＝26.4mg0.40mg/kg×60kg＝24.0mg平均值为(26.4+24.0)/2＝25.2mg即一个60公斤的病人，一次用量应在25mg左右。因此根据临床可能用药剂量，本发明处方的剂量设计为每瓶含25mg总藤黄酸。本发明组合物配方的筛选总藤黄酸为橙黄色结晶性粉末，在乙醇、甲醇等有机溶剂中溶解，水中不溶在大碱性如氢氧化钠溶液中溶解，但是不稳定，易水解，故选择助溶剂是关键。我们选择了多种助溶剂如氢氧化钠、碳酸氢钠、吐温80、泊拉沙姆、菸酰胺、葡甲胺、L-精氨酸、L-半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸等，在0.1mol/L氢氧化钠中和碳酸氢钠中溶解最快，溶液在数小时后颜色变深，可见有降解，表面活性剂对本品增溶效果不明显，L-半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸助溶差，L-精氨酸助溶液较好，水溶液放置数天颜色基本不变，含量变化较小，所以选择L-精氨酸为本品的助溶剂，结果见下表。表1总藤黄酸选用助、增溶剂的试验结果(总藤黄酸125mg10ml)助、增溶剂 用量 定容后量(ml)溶解情况 溶液颜色变化情况氢氧化钠 0.1mol/L 8ml10 澄清 4h颜色逐渐加深碳酸氢钠 0.1mol/L 8ml10 澄清 4h颜色逐渐加深吐温80 0.2g10 混浊 橙黄色乳光泊拉沙姆 0.2g10 混浊 橙黄色混悬菸酰胺 0.2g10 部分溶解橙黄色混浊葡甲胺 0.2g10 部分溶解橙黄色混浊L-半胱氨酸 0.2g10不溶液 混悬L-精氨酸 0.1g10 澄清 3d橙黄色不变谷氨酸 0.1g10 不溶 混悬甘氨酸 0.1g10 不溶 混悬无水乙醇 2ml 10先澄清，加水后析出橙黄色混浊本制剂主药每瓶仅为25mg，如不加骨架剂，冻干后呈网状，松散，易碎，所以我们进行了骨架剂的筛选，选择的骨架剂有甘露醇、乳糖、右旋糖苷、氯化钠，葡萄糖，结果见表2。
表2骨架剂的筛选结果骨架剂 用量(mg) 外观澄清度甘露醇 40 块状 澄清氯化钠 40 块状起皮 澄清葡萄糖 40 块状 混浊乳糖 40 块状 乳光右旋粮苷 40 块状 略带乳光无 - 网状、松散、易碎 澄清本发明的25mg总藤黄酸配方的组合物经过稳定性对比实验，证明具有更加优良的稳定性。不加L-精氨酸的溶液，在经过一定时间后溶液变得浑浊，同样时间内，加入了L-精氨酸的溶液不变，另外，在高湿高热情况下，上述组合物也表现出非常的稳定性。加入了L-精氨酸大大增加了溶解度，也使稳定性提高。
本发明的藤黄酸制剂具有良好的抗肿瘤作用，以下通过实验例说明本发明的有益效果。
实验例1
注射用总藤黄酸静脉途径给药对小鼠移植性肿瘤肉瘤S-180的抑制作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支(2)阳性对照药A.名称羟基喜树碱注射液来源黄石飞云制药有限公司批号010203规格2ml5mgB.名称氟脲嘧啶注射液来源上海旭东制药有限公司批号010208规格10ml0.25g(3)实验动物品系昆明种小鼠，20～22g，雄性来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称肉瘤S-180来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组8mg/kg
中剂量组4mg/kg低剂量组2mg/kg羟基喜树碱组1mg/kg5-Fu组20mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径静脉给药(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”的有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法，取昆明小鼠60只，雄性，20-22g，正常饲养观察3天无异常，常规腋下接种小鼠肉瘤S-180后随机分组，10只/组共6组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制1.6mg/ml，0.8mg/ml和0.4mg/ml三种浓度，分别用于8mg/kg、4mg/kg和2mg/kg即高、中、低三个剂量组，静脉给药，给药体积为0.05ml/10g体重，接种次日开始给药，隔日连续给药二天，1次/天，共6次。同时设阳性药对照组二组(羟基喜树碱1mg/kg和5-FU 20mg/kg)及单纯对照组(生理盐水0.1ml/只)。末次给药后次日处死动物称体重，剥取肿瘤称瘤重，按公式[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％，计算肿瘤抑制率，并对数据进行统计学处理。
上述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果实验结果表明，注射用总藤黄酸高、中、低三个剂量组及羟基喜树碱组和5-Fu组对小鼠移植性肿瘤肉瘤S-180的抑制率平均值分别为63.8±4.1％、58.6±2.5％、47.1±4.8％、63.1±3.8％和68.4±3.7％，与生理盐水组相比，均P＜0.001。本实验重复三次，结果均表明，注射用总藤黄酸对小鼠移植性肿瘤肉瘤S-180有显著的抑制作用，高剂量时尤为突出。实验结果见表1、
图1。
表1注射用总藤黄酸静脉注射对小鼠肉瘤S-180的实验结果批次 组别动物数平均体重平均瘤重**抑瘤率 P***始 末 始末*(g) (％)第 生理盐水10 10 19.7 22.2 2.7±0.59 - -
羟基喜树碱 10 1020.1 20.90.93±0.1765.6＜0.001氟脲嘧啶 10 1019.8 21.30.74±0.2772.6＜0.001藤黄酸8mg10 1020.2 22.60.85±0.2368.5＜0.001藤黄酸4mg10 1020.4 22.21.04±0.4961.5＜0.001藤黄酸2mg10 1020.1 22.81.56±0.5642.2＜0.001生理盐水 10 1020.6 21.42.60±0.49- -羟基喜树碱 10 1019.9 20.70.91±0.4465.0＜0.001第氟脲嘧啶 10 1019.9 20.80.90±0.3265.4＜0.001二藤黄酸8mg10 1020.5 21.51.02±0.3060.8＜0.001批藤黄酸4mg10 1020.3 20.41.11±0.4057.3＜0.001藤黄酸2mg10 1020.2 22.31.25±0.2451.9＜0.001生理盐水 10 1020.3 22.22.62±0.58- -羟基喜树碱 10 1020.1 22.61.08±0.3158.8＜0.001第氟脲嘧啶 10 1020.2 21.90.86±0.2867.2＜0.001三藤黄酸8mg10 1020.2 23.20.99±0.3462.2＜0.001批藤黄酸4mg10 1020.1 22.51.13±0.4056.9＜0.001藤黄酸2mg10 1020.2 22.11.38±0.5047.3＜0.001*去瘤体重**X±SD n＝10***实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较本实验给药途径为静脉注射，为确保实验的顺利完成，给药方案设计为隔日连续给药二天，1次/天，共6次。参照注射用总藤黄酸静脉一次给药的半数致死量(LD50)为41.4mg/kg，同时预实验显示该药的安全范围较小，考虑到该药在本实验方案中每个疗程给药6次，因此高剂量定为8mg/kg(约LD50的1/5)。三次重复实验结果显示，高剂量组(8mg/kg体重)对肿瘤抑制率平均值为63.8±4.1％，最高值为68.52％(P＜0.001)，中、低剂量组(4mg、2mg/kg体重)也有显著疗效。实验过程中动物无死亡。
实验例2注射用总藤黄酸静脉给药对小鼠肝癌H-22的抑制作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支(2)阳性对照药A.名称羟基喜树碱注射液来源黄石飞云制药有限公司批号010203规格2ml5mgB.名称氟脲嘧啶注射液来源上海旭东制药有限公司批号010208规格10ml0.25g(3)实验动物品系昆明种小鼠，20～22g，雄性来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称肝癌H-22来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组8mg/kg中剂量组4mg/kg低剂量组2mg/kg羟基喜树碱组1mg/kg
5-Fu组20mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径静脉注射(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”的有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法。取昆明小鼠60只，雄性，20-22g，正常饲养观察3天无异常，常规腋下接种小鼠肝癌H-22后随机分组，10只/组共6组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制1.6mg/ml，0.8mg/ml和0.4mg/ml三种浓度，分别用于8mg/kg、4mg/kg和2mg/kg即高、中、低三个剂量组，静脉给药，给药体积为0.05ml/10g体重，接种次日开始给药，隔日连续给药二天，1次/天，共6次。同时设阳性药对照组二组(羟基喜树碱1mg/kg和5-FU 20mg/ml)及单纯对照组(生理盐水0.1ml/只)。末次给药后次日处死动物称体重，剥取肿瘤称瘤重，按公式[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％，计算肿瘤抑制率，并对数据进行统计学处理。
上述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果实验结果表明，注射用总藤黄酸高、中、低三个剂量组及羟基喜树碱组和5-Fu组对小鼠肝癌H-22肿瘤的抑制率平均值分别为56.6±5.3％、39.1±5.0％、33.3±8.9％、62.8±2.5％和57.1±1.7％，与生理盐水组相比，均P＜0.001。本实验重复三次，结果均表明，注射用总藤黄酸对小鼠移植性肿瘤肝癌H-22实体型有显著的抑制作用，高剂量时尤为突出，实验结果见表2，图2。
表2注射用总藤黄酸静脉注射对小鼠肝癌H-22的实验结果动物数平均体重平均瘤重**抑瘤率批次 组别 P***始 末 始末*(g) (％)第生理盐水10 10 20.6 22.1 3.39±0.31 --一羟基喜树碱 10 10 19.9 21.1 1.17±0.31 65.5 ＜0.001批氟脲嘧啶10 10 19.8 21.5 1.39±0.37 59.0 ＜0.001藤黄酸8mg 10 10 20.3 22.0 1.34±0.31 60.5 ＜0.001
藤黄酸4mg10 1020.322.12.25±0.4033.6＜0.001藤黄酸2mg10 1020.223.31.92±0.3143.4＜0.001生理盐水 10 1021.623.62.50±0.35- -羟基喜树碱 10 1021.824.60.94±0.1562.4＜0.001第氟脲嘧啶 10 1021.823.41.09±0.2856.4＜0.001二藤黄酸8mg10 1021.822.11.03±0.3258.8＜0.001批藤黄酸4mg10 1021.623.61.49±0.2040.4＜0.001藤黄酸2mg10 1021.823.91.75±0.3130.0＜0.001生理盐水 10 1021.523.92.97±0.50- -羟基喜树碱 10 1021.423.61.70±0.2960.6＜0.001第氟脲嘧啶 10 1021.522.71.31±0.4855.9＜0.001三藤黄酸8mg10 1021.523.81.41±0.4652.5＜0.001批藤黄酸4mg10 1021.624.51.68±0.5243.4＜0.001藤黄酸2mg10 1021.724.72.18±0.7526.6＜0.001*去瘤体重**X±SD n＝10***实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较本实验给药途径为静脉注射，为确保实验的顺利完成，给药方案设计为隔日连续给药二天，1次/天，共6次。参照注射用总藤黄酸静脉一次给药的半数致死量(LD50)为41.4mg/kg，同时预实验显示该药的安全范围较小，考虑到该药在本实验方案中每个疗程给药6次，因此高剂量定为8mg/kg(约LD50的1/5)。三次重复实验结果显示，高剂量组(8mg/kg体重)对肿瘤抑制率平均值为56.6±5.3％，最高值为60.5％(P＜0.001)，中剂量组(4mg/kg体重)也有确实疗效。实验过程中动物无死亡。
实验例3注射用总藤黄酸静脉给药对小鼠艾氏癌实体瘤的抑制作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支(2)阳性对照药A.名称羟基喜树碱注射液来源黄石飞云制药有限公司批号010203规格2ml5mgB.名称氟脲嘧啶注射液来源上海旭东制药有限公司批号010208规格10ml0.25g(3)实验动物品系昆明种小鼠，20～22g，雄性来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称艾氏癌实体瘤(EC)来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组8mg/kg中剂量组4mg/kg低剂量组2mg/kg羟基喜树碱组1mg/kg5-Fu组20mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径静脉给药
(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”的有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法，取昆明小鼠60只，雄性，18-22g，正常饲养观察3天无异常，常规腋下接种小鼠艾氏癌实体瘤后随机分组，10只/组，共6组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制1.6mg/ml，0.8mg/ml和0.4mg/ml三种浓度，分别用于8mg/kg、4mg/kg和2mg/kg即高、中、低三个剂量组，静脉给药，给药体积为0.05ml/10g体重，接种次日开始给药，隔日连续给药二天，1次/天，共6次。同时设阳性药对照组二组(羟基喜树碱1mg/kg和5-FU 20mg/kg)及单纯对照组(生理盐水0.1ml/只)。末次给药后次日处死动物，剥取肿瘤，称体重及瘤重，按公式[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％，计算肿瘤抑制率，并对数据进行统计学处理。
上述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果上述实验结果表明，注射用总藤黄酸高、中、低三个剂量组及羟基喜树碱组和5-Fu组对小鼠移植性肿瘤艾氏癌实体瘤(EC)的抑制率平均值分别为51.3±4.3％、45.6±8.9％、29.4±5.6％、52.3±5.2％和70.0±5.8％，与生理盐水组相比，均P＜0.001。本实验重复三次，结果表明，注射用总藤黄酸对小鼠移植性肿瘤艾氏癌实体瘤(EC)有显著的抑制作用，高剂量时尤为突出，实验结果见表3，图3。
表3注射用总藤黄酸静脉注射对小鼠艾氏癌实体瘤的实验结果动物数平均体重平均瘤重**抑瘤率批次组别P***始 末 始 末*(g)(％)生理盐水10 10 21.828.02.28±0.34 - -羟基喜树碱 10 10 21.626.10.95±0.32 58.3＜0.001第氟脲嘧啶10 10 21.425.10.61±0.16 73.2＜0.001一藤黄酸8mg10 9 21.524.61.00±0.37 56.1＜0.001批藤黄酸4mg10 10 21.927.11.04±0.41 54.4＜0.001藤黄酸2mg10 9 21.724.81.52±0.35 33.3＜0.001第生理盐水10 10 19.123.72.70±0.38 - -
羟基喜树碱 10 1019.322.61.39±0.3348.5＜0.001氟脲嘧啶 10 1019.420.90.99±0.2863.3＜0.001藤黄酸8mg10 1019.222.71.35±0.3950.0＜0.001藤黄酸4mg10 1019.323.01.47±0.4046.0＜0.001藤黄酸2mg10 1019.423.22.08±0.5923.0＜0.001生理盐水 10 1021.224.22.41±0.39- -羟基喜树碱 10 1021.623.61.20±0.1650.2＜0.001第氟脲嘧啶 10 1021.522.80.64±0.1673.4＜0.001三藤黄酸8mg10 1021.223.41.26±0.4047.7＜0.001批藤黄酸4mg10 1021.523.71.53±0.3336.5＜0.001藤黄酸2mg10 1021.224.71.64±0.3432.0＜0.001*去瘤体重**X±SD n＝10***实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较参照注射用总藤黄酸静脉一次给药的半数致死量(LD50)为41.4mg/kg，同时预实验显示该药的安全范围较小。考虑到该药在本实验方案中每个疗程给药6次，因此高剂量定为8mg/kg(约LD50的1/5)。三次重复实验结果显示，高剂量组(8mg/kg体重)对肿瘤抑制率平均值为51.3±4.3％，最高值为56.1％(P＜0.001)；中剂量组(4mg/kg体重)对肿瘤抑制率平均值为45.6±8.9％。实验例4注射用总藤黄酸腹腔给药对肉瘤S～180腹水型荷瘤小鼠生存期的延长作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支(2)阳性对照药名称羟基喜树碱注射液来源黄石飞云制药有限公司批号010203规格2ml5mg(3)实验动物品系昆明种小鼠，20～22g，雄性来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称肉瘤S-180来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组1.2mg/kg中剂量组0.6mg/kg低剂量组0.3mg/kg羟基喜树碱组1mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径腹腔注射(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”的有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法，取昆明小鼠50只，雄性，18-22g，下常饲养观察3天无异常，常规腹腔接种小鼠肉瘤S-180后随机分组，10只/组，共5组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制0.12mg/ml，0.06mg/ml和0.03mg/ml三种浓度，分别用于1.2mg/kg、0.6mg/kg、0.3mg/kg即高、中、低三个剂量组，同时设阳性药对照组(羟基喜树碱1mg/kg)及单纯对照组(生理盐水0.2ml/只)。腹腔给药，给药体积为0.1ml/10g体重，接种次日开始给药，1次/天，共8次。末次给药后继续观察动物死亡，记录生存天数，按公式[(实验组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100％，计算生命延长率，并对数据进行统计学处理。上 述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果实验结果表明注射用总藤黄酸高剂量组及羟基喜树碱组对肉瘤S-180腹水型荷瘤小鼠生存期延长率平均值为135.5±27.1％、62.9±3.4％，与生理盐水组相比，P＜0.001。注射用总藤黄酸中、低剂量组对肉瘤S-180腹水型荷瘤小鼠生存期延长无明显作用。重复三次实验结果见表4、图4。
表4注射用总藤黄酸腹腔注射对小鼠肉瘤S-180腹水型的实验结果动物数平均体重平均生存时间**生命延长率批次组别 P***始 末*始末*(天) (％)生理盐水10 10 20.2 29.617.6±2.4 - -羟基喜树碱 10 10 20.0 24.128.0±4.2 59.1 ＜0.001第一 藤1.2mg 10 10 19.6 23.246.9±9.3 166.5 ＜0.001批藤0.6mg 10 10 19.8 26.323.2±9.5 31.8 ＞0.05藤0.3mg 10 10 20.1 26.417.4±9.6 -1.1 ＞0.05生理盐水10 10 20.0 28.418.1±3.9 - -羟基喜树碱 10 10 19.9 23.730.0±4.8 65.7 ＜0.001第二藤1.2mg 10 10 19.9 25.539.1±11.7 116＜0.001批藤0.6mg 10 10 20.0 26.720.4±4.4 12.7 ＞0.05藤0.3mg 10 10 19.8 27.918.5±4.4 2.2＞0.05生理盐水10 10 18.9 28.820.8±3.1 - -羟基喜树碱 10 10 18.7 24.134.1±9.3 63.9 ＜0.001第三 藤1.2mg10 10 18.9 24.946.6±14.9 124＜0.001批藤0.6mg 10 10 18.9 22.722.6±5.6 8.7＞0.05藤0.3mg 10 10 18.5 27.721.0±4.4 0 ＞0.05*给药结束**X±SD n＝10***实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较参照注射用总藤黄酸腹腔一次给药的半数致死量(LD50)为6.4mg/kg(见文件一)，同时预实验显示该药的安全范围较小。考虑到该药在本实验方案中每个疗程给药8次，因此高剂量定为1.2mg/kg(约LD50的1/5)。
三次重复实验结果显示，高剂量组(1.2mg/kg体重)对荷瘤小鼠生命延长率平均值为135.5±27.1％，最高值为166.5％(P＜0.001)，其中平均20％动物生存期超过60天。
实验例5注射用总藤黄酸腹腔给药对艾氏癌腹水型荷瘤小鼠生存期的延长作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支(2)阳性对照药名称氟脲嘧啶注射液来源上海旭东制药有限公司批号010208规格10ml0.25g(3)实验动物品系昆明种小鼠，20～22g，雄性来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称艾氏癌来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组1.2mg/kg中剂量组0.6mg/kg
低剂量组0.3mg/kg5-Fu组20mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径腹腔注射(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”的有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法，取昆明小鼠50只，雄性，18-22g，正常饲养观察3天无异常，常规腹腔接种艾氏腹水癌后随机分组，10只/组，共5组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制0.12mg/ml，0.06mg/ml和0.03mg/ml三种浓度，分别用于1.2mg/kg、0.6mg/kg、0.3mg/kg即高、中、低三个剂量组，同时设阳性药对照组(5-Fu20mg/kg)及单纯对照组(生理盐水0.1ml/只)。腹腔给药，给药体积为0.1ml/10g体重，接种次日开始给药，1次/天，共8次。术次给药后继续观察动物死亡，记录生存天数，按公式[(实验组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100％，计算生命延长率，并对数据进行统计学处理。
上述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果实验结果表明注射用总藤黄酸高剂量组及5-Fu组对艾氏癌腹水型荷瘤小鼠生存期延长率平均值为116.1±16.0％、78.4±7.9％，与生理盐水组相比，P＜0.001。注射用总藤黄酸中、低剂量组对艾氏癌腹水型荷瘤小鼠生存期延长无明显作用。重复三次实验结果见表5、图6表5注射用总藤黄酸腹腔注射对小鼠艾氏腹水癌的实验结果批次组别动物数平均体重平均生存时间**生命延长率 P***—— 始 末*始末*(天)(％)生理盐水 10 10 19.4 29.3 15.9±2.9 - -5-FU 10 10 19.3 20.6 26.9±4.4 69.2 ＜0.001第一藤1.2mg10 10 19.6 23.4 33.4±8.3 110.0 ＜0.001批藤0.6mg10 10 19.0 28 219.0±5.7 19.5 ＞0.05藤0.3mg10 10 19.2 27.114.2±6.1 -10.7 ＞0.05
生理盐水10 1020.7 28.517.3±3.0- -5-FU 10 1020 5 21.931.6±5.782.7＜0.001第二藤1.2mg 10 1020.5 23.035.3±5.7104.0 ＜0.001批藤0.6mg 10 1020.5 26.819.3±3.511.6＞0.05藤0.3mg 10 1020.3 28.417.6±3.11.7 ＞0.05生理盐水 10 1019.3 25.816.1±2.2- -5-FU 10 1019.2 20.529.5±3.083.2＜0.001第三藤1.2mg 10 1019.0 22.637.7±7.2134.2 ＜0.001批藤0.6mg 10 1019.0 23.719.9±5.623.6＞0.05藤0.3mg 10 1019.2 24.519.5±4.521.1＞0.05*末次给药次日**X±SD n＝10***实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较参照注射用总藤黄酸腹腔一次给药后半数致死量(LD50)为6.4mg/kg，同时预实验显示该药的安全范围较小，考虑到该药在本实验方案中每个疗程给药8次，因此高剂量定为1.2mg/kg(约LD50的1/5)。
三次重复实验结果显示高剂量组(1.2mg/kg体重)对艾氏癌腹水型荷瘤小鼠生命延长率平均值为116.1％±16.0％，最高值为134.2％(P＜0.001)。
实验例6注射用总藤黄酸静脉给药对裸鼠人肝癌7721的实验治疗作用1.实验材料(1)实验药物名称注射用总藤黄酸性状黄色疏松块状物及粉末来源南京海光应用化学研究所批号20010105规格25mg/支阳性对照药名称羟基喜树碱注射液来源黄石飞云制药有限公司批号010203
规格2ml5mg(3)实验动物品系裸鼠，16～18g，6～8周龄来源中国医学科学院肿瘤医院实验动物室合格证号SCXK11-00-0005(4)瘤株名称裸鼠人肝癌7721来源中国医学科学院肿瘤医院2.实验方法(1)药物配制取注射用总藤黄酸内容物适量，精密称定，根据内容物含量，加入生理盐水配成所需浓度的溶液，备用。
(2)剂量设置总藤黄酸组高剂量组6mg/kg中剂量组3mg/kg低剂量组1.5mg/kg羟基喜树碱组1mg/kg5-Fu组15mg/kg生理盐水对照组0.1ml/只(3)给药途径静脉给药(4)实验方法参照中华人民共和国药政管理局《中药新药研究指南》第二部分“中药新药药理学研究指南”第三章第四十五节“治疗恶性肿瘤中药的药效学研究”中有关要求，及徐叔云等主编《药理实验方法学》第60章“动物肿瘤体内筛选法”中相关方法。取裸鼠48只，同一性别，16-18g，正常饲养观察3天无异常后，在无菌条件下腋下小块(2mm3/块，1块/只)接种裸鼠人肝癌7721后随机分组，8只/组，共6组。注射用总藤黄酸以生理盐水溶解，配制1.2mg/ml，0.6mg/ml和0.3mg/ml三种浓度，分别用于6mg/kg、3mg/kg和1.5mg/kg即高、中、低三个剂量组。静脉给药，给药体积为0.05ml/10g体重，接种后第5日开始给药，1次/3天，共10次。同时设阳性药对照二组(羟基喜树碱1mg/kg和5-FU 15mg/kg)及单纯对照组(生理盐水0.1ml/只)。末次给药后次日处死动物称体重，剥取肿瘤称瘤重，按公式[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％，计算肿瘤抑制率，并用t检验对数据进行统计学处理。
上述实验在相同条件下重复三次。
3.实验结果实验结果表明注射用总藤黄酸高、中、低剂三个剂量组及羟基喜树组及5-Fu组对裸鼠人肝癌7721抑制率分别为53.7％±6.6％、26.8％±3.4％、19.9％±10.1％、69.9％±4.9、45.6％±2.3％，与生理盐水组比较，均P＜0.001，本实验重复三次，结果均表明注射用总藤黄酸对裸鼠人肝癌7721有显著的抑制作用，高剂量时尤为突出。实验结果见表6、表6注射用总藤黄酸静脉注射对裸鼠人肝癌7721的实验结果动物数平均体重平均瘤重*抑瘤率批次组别P**始 末 始末 (g) (％)生理盐水 8 8 16.3 18.4 1.39±0.25 - -羟基喜树碱8 8 16.6 19.6 0.46±0.17 66.9 ＜0.001第氟脲嘧啶 8 8 16.3 18.7 0.76±0.18 45.3 ＜0.001一藤黄酸6mg8 8 16.3 18.8 0.54±0.09 61.1 ＜0.001批藤黄酸3mg8 8 16.6 17.7 0.98±0.25 29.5 ＜0.01藤黄酸1.5mg 8 8 16.1 18.8 1.03±0.14 25.9 ＜0.001生理盐水 8 8 16.8 19.8 1.98±0.26 - -羟基喜树碱8 8 16.8 20.5 0.65±0.14 67.2 ＜0.001第氟脲嘧啶 8 8 16.9 18.9 1.03±0.19 48.0 ＜0.001二藤黄酸6mg8 8 16.8 19.4 0.96±0.14 51.5 ＜0.001批藤黄酸3mg8 8 16.8 20.1 1.43±0.32 27.8 ＜0.001藤黄酸1.5mg 8 8 16.8 20.3 1.83±0.25 7.6 ＞0.05生理盐水8 8 16.4 20.3 2.0±0.36 - -羟基喜树碱 8 8 16.3 19.4 0.49±0.11 75.5 ＜0.001第氟脲嘧啶8 8 16.4 19.7 1.13±0.17 43.5 ＜0.001三藤黄酸6mg 8 8 16.4 18.5 1.03±0.14 48.5 ＜0.001批藤黄酸3mg 8 8 16.4 21.2 1.54±0.29 23.0 ＜0.01藤黄酸1.5mg 8 8 16.4 24.4 1.89±0.30 5.5 ＞0.05*X±SD n＝8
**实验组平均瘤重与对照组平均瘤重比较本实验给药途径为静脉注射，同时考虑到裸鼠特殊的生理特点，为确保实验的顺利完成，给药方案设计为1次/3天，共10次。参照注射用总藤黄酸小鼠静脉一次给药的半数致死量(LD50)为41.4mg/kg(见文件二)，同时预实验显示该药的安全范围较小，因此高剂量定为6mg/kg。三次重复实验结果显示，高剂量组(6mg/kg体重)对肿瘤抑制率平均值为53.7±6.6％，最高值为61.1％(P＜0.001)。实验过程中动物无死亡。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明。
取处方量总藤黄酸置适宜容器中，加适量注射用水(总体积的80％，)搅匀，加入L-精氨酸超声溶解至澄清，加入甘露醇，搅拌溶解，加入1％针用炭，搅拌30分钟，脱炭，加注射用水至足量，测定中间体含量合格后，在无菌条件下，0.22 微孔滤膜过滤，滤液灌装于10ml西林瓶中，每瓶2ml，半加塞，装盘，送入冻干箱中，插入温度传感器，关闭箱门开机并至干燥，密塞，出箱，扎盖，检查，包装即可。
取处方量总藤黄酸置适宜容器中，加适量注射用水(总体积的80％，)搅匀，加入L-精氨酸超声溶解至澄清，加入甘露醇，搅拌溶解，加入1％针用炭，搅拌30分钟，脱炭，加注射用水至足量，测定中间体含量合格后，在无菌条件下，0.22 微孔滤膜过滤，滤液灌装于10ml西林瓶中，每瓶2ml。
将上述干燥品放入1000ml圆底烧瓶中，加乙醚600ml，水浴上回流溶解，放冷，滤出不溶物，滤液浓缩至1/3体积，向烧瓶中加入同体积石油醚摇匀，放置2小时。滤出固体，用石油醚(60℃～90℃)洗涤三次，每次50ml，抽干后，红外光下烘干，得干品42g，收率56％。
将上述干品用乙醚溶解后，移置1000ml分液漏斗中，用1N盐酸1200ml，分四次洗涤，每次300ml，再用蒸馏水洗涤至水层显中性，分取乙醚层，用无水Na2SO4干燥，抽滤，于水浴上浓缩乙醚至干，得成品总藤黄酸原料35g，收率83.3％。TLC检查一个主斑点，Rf0.65[硅胶G板，展开剂苯-乙酸乙酯-甲酸(75∶24∶1.5)]。
权利要求
1.一种总藤黄酸药物组合物，其特征在于该组合物由有以下重量份的组分组成，总藤黄酸12.5-37.5，L-精氨酸10-30，甘露醇20-60。
2.权利要求1的药物组合物是片剂、胶囊剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服液、混悬剂、冲剂、贴剂、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂、控释制剂。
3.权利要求2的药物组合物是注射剂。
4.权利要求3的药物组合物是冻干注射剂。
5.权利要求4的药物组合物其中各组分重量份为总藤黄酸25，L-精氨酸20，甘露醇40。
6.权利要求5的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤a.将配方量的总藤黄酸加入注射用水；b.加入L-精氨酸；c.使混合物溶解；d.加入甘露醇，使溶解；e.加入碳粉，搅拌，脱色，过滤；f.灌装，冷冻干燥。
7.权利要求1的组合物，其中的总藤黄酸是按如下方法制备的，藤黄碎粒加吡啶热浸，合并吡啶液，加热水过夜，析出藤黄酸吡啶盐，吡啶水溶液洗涤，烘干，用乙醚热溶，滤过，浓缩至适量，加入等体积的石油醚(60～90℃)，室温下析出固体，将此固体物用盐酸酸化，提取，干燥得总藤黄酸。
8.权利要求1的组合物，其中的总藤黄酸是按如下方法制备的，藤黄碎粒用丙酮浸泡过夜，合并丙酮液，减压蒸干得棕黑色胶状物，加吡啶热溶后，加水，固体物用石油醚及70％吡啶洗涤，得橙黄色藤黄酸吡啶盐，将此吡啶盐溶于乙醚，用1N HCl洗涤，乙醚层加无水硫酸钠干燥，蒸去乙醚，得总藤黄酸。
9.权利要求1的组合物，其中的总藤黄酸是按如下方法制备的，藤黄碎粒加丙酮浸泡过夜，合并丙酮液，得藤黄树脂的丙酮提取液，经浓缩后，通过硅胶柱层析，收集苯-乙酸乙酯(9∶1)洗脱部分，用硅胶G制板，氯仿-甲醇-二乙胺(15∶1∶1)展开，割取Rf值0.4的亮黄色部分，硅胶用0.5％Na2CO3洗涤，过滤，滤液用稀盐酸酸化，即得亮黄色沉淀，水洗至中性，抽干得总藤黄酸。
10.权利要求1的组合物在制备一种抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种新的藤黄酸制剂配方，该配方由总藤黄酸，L－精氨酸和甘露醇组成，其中各组分所占比例按重量份计为总藤黄酸12.5－37.5，L－精氨酸10－30，甘露醇20－60，本发明还包括制备这种制剂的方法。
文档编号A61P35/00GK1391892SQ0212882
公开日2003年1月22日 申请日期2002年8月14日 优先权日2002年8月14日
发明者陈庆才, 赵俊 申请人:南京海光应用化学研究所