专利名称：八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用的制作方法
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，本发明涉及有机化学领域，特别是涉及到生物化学中一种核糖体失活蛋白-八棱丝瓜蛋白-1的RNA N-糖苷酶活性及其应用。
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，从高等植物中提取的核糖体失活蛋白，根据其分子结构可以分为两类，类型I是单肽链蛋白，例如，来自葫芦科植物瓜蒌块根的天花粉蛋白(Trichosanthin，简称TCS)，苦瓜种子的苦瓜籽蛋白(Momorcharin)和来自商陆科植物的商陆抗病毒蛋白(PAP)。类型II是双肽链蛋白，例如，来自大戟科植物种籽的蓖麻毒素(Ricin)和来自豆科植物种籽的相思子毒素(Abrin)。类型I蛋白和类型II的A链都具有RNA N-糖苷酶活性，也叫做多核苷酸腺苷糖苷酶[EC 3.2.2.22]活性，都可以裂解真核生物核糖体内28S rRNA的4324位腺嘌呤和核糖间的N-C键，而使真核细胞核糖体60S亚基失活(Endo和Tsaragi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F.et al.，1988，Nacl.Acid Res.161349-1357)。关于类型I和类型II的核糖体失活蛋白已经有很多的专利和文献报道。
H.W.Yeung et al也曾从八棱丝瓜(Luffa acutangula)中分离出一种Luffaculin(H.W.Yeung et al.Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，15-19；T.B.Ng etal.Gen.Pharmac.23(4)，1992，575-590)，但他们所获得的八棱丝瓜蛋白产率低(120mg/Kg种子)活性低(只相当于Luffin-α的1/9)。中国专利CN1199738A，提供了从八棱丝瓜种子中提取到高产率、高纯度、高活性的八棱丝瓜蛋白1，并证实了其具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成活性，该蛋白分子量为28kDa(SDS-PAGE检测)N端顺序为DVSFS。
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，其发明的目的是基于上述现有技术基础，证实了八棱丝瓜蛋白-1(Luffaculin-1)，具有糖苷酶活性和抗肿瘤活性，提供了其应用的实验基础。
为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案
采用简单、温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、硫酸铵沉淀、CM-纤维素梯度洗脱、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素再次洗脱，可以从八棱丝瓜种子中分离到八棱丝瓜蛋白1，SDS-PAGE检测分子量为28kDa，IEF检测等电点为8.86，园二色谱检测其二级结构为α-螺旋，β-折叠，无序结构分别为32.0％，28.0％，40.0％，与天花粉蛋白相似。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作引产药物原料用于治疗滋养层细胞有关的肿瘤、恶性肿瘤疾病，如绒癌等，也可以作为天花粉蛋白的替代药物原料，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作抗病毒，特别是抗HIV的试剂原料，也可作为天花粉蛋白治疗艾滋病的替代药物原料，用于克服反复使用产生的免疫反应。
本发明的核糖体失活蛋白可以用作抗肿瘤试剂原料，也可以作为天花粉蛋白治疗肿瘤的替代药物原料。
本发明的核糖体失活蛋白可以作为N-糖苷酶用于分子生物学和免疫学研究。
本发明的核糖体失活蛋白可以作为免疫毒素的毒素材料，用于治疗肿瘤和病毒性疾病，特别是爱滋病。
本发明与现有技术相比，具有以下积极效果
(1).测定了八棱丝瓜蛋白-1的等电点为8.86，二级结构与天花粉蛋白相类似。
(2).测定了八棱丝瓜蛋白-1具有RNA N-糖苷酶活性
(3).测定了八棱丝瓜蛋白-1对人白血病细胞株K562的有较强的细胞毒作用。IC50为1.1×10-6mol/L
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，现在对附图作图面说明
图1.显示八棱丝瓜蛋白-1糖苷酶活性，其中1、2为天花粉蛋白，3、4为八棱丝瓜蛋白1；1、3为样品不经苯胺处理，2、4经苯胺处理后可见450nt特征片断。图2.显示八棱丝瓜蛋白-1圆二色性图谱。图3.显示八棱丝瓜蛋白-1抗肿瘤活性；其中▲为八棱丝瓜蛋白1，■为天花粉蛋白。
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，下面结合附图通过实施例来进一步描述本发明
实施例1.
本发明的八棱丝瓜蛋白1，按张祖传等的方法(生物化学与生物物理学报2000，32(5)495-498)测定其对大鼠肝核糖体RNA N-糖苷酶活性，并与天花粉蛋白比较，见图1，表明八棱丝瓜蛋白1和天花粉蛋白一样具有RNA N-糖苷酶活性。
实施例2.
本发明的八棱丝瓜蛋白1，在日本Jasco-810型圆二色谱仪上测定，见图2，按最小二乘拟合法计算出它的二级结构含量与天花粉蛋白相类似
实施例3.
本发明的八棱丝瓜蛋白1，按谢捷明等的方法(单克隆抗体通讯1995，11(1)39-42)测定其对人白血病细胞株K562有较强的细胞毒性，IC50为1.1×10-6mol/L，见图3。人白血病细胞K562在含有15％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液内，37℃，5％ CO2条件下培养，用培养液将细胞浓度调整为5×105/ml，分别加入不同浓度的luffaculin1和TCS，每孔100μl，3个复孔。阴性对照孔加入生理盐水，阳性对照孔加入细胞液，培养72h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养3-4h，离心去上清液，每孔加100μl DMSO振荡溶解后，用酶标仪测定各孔A280值。
实施例4.
本发明的八棱丝瓜蛋白1，在Genomic Solutions InvestigatorTM 5000双向电泳系统的水平等电聚焦仪上进行等电聚焦，采用Immobilne PHLASH Strips pH3～10 Linear IPG胶条，21℃，160μA恒流电泳3h后，4200V恒压电泳17h聚焦，考马斯亮蓝R-250染色，结果显示Luffaculin 1的等电点为8.86。
权利要求
1.八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，从八棱丝瓜种子中分离出八棱丝瓜蛋白1(Luffaculin 1)，其特征在于
(1)它的等电点为8.86；
(2)它的二级结构与天花粉蛋白相似；
(3)它具有RNA N-糖苷酶的活性；
(4)它具有抗肿瘤活性。
2.根据权利要求1所述的八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，其特征在于该蛋白用于治疗肿瘤和病毒性感染特别是爱滋病毒感染疾病的药物原料。
全文摘要
八棱丝瓜蛋白1的糖苷酶活性及其应用，能够从八棱丝瓜种子中分离出一种核糖体失活蛋白——八棱丝瓜蛋白－1，它的等电点为8.86；它的二级结构与天花粉蛋白相似；该蛋白显示了RNA N－糖苷酶活性和抗肿瘤活性。该蛋白具有作为抗肿瘤、抗病毒特别是抗艾滋病毒制剂的商业应用前景。
文档编号A61P31/00GK1473847SQ0212871
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月6日 优先权日2002年8月6日
发明者陈明晃, 叶晓明, 石小莉, 王梓壬 申请人:中国科学院福建物质结构研究所