γ－氨基丁酸转运蛋白抑制剂在制备治疗酒精成瘾和滥用药物中的应用的制作方法

专利名称：γ－氨基丁酸转运蛋白抑制剂在制备治疗酒精成瘾和滥用药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明述及生物医药领域，具体地讲是γ-氨基丁酸(GABA)转运蛋白抑制剂在制备治疗酒精成瘾和滥用药物中的应用虽然对酒精的神经药理学作用还未有透彻地了解，但是近年的科学研究加快了这一进程。例如酒精戒断后重燃的渴望可能由γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸的受体介导[Gonzalez L.P.et al.，Alcohol Clin Exp Res，2001，25(5Suppl ISBRA)197S-201S]，酒精成瘾的记忆可能由多巴胺、鸦片和谷氨酸系统介导，压力诱导对酒精的渴望可能由5-羟色胺系统介导，或和其它机制协同作用。因而治疗酒精的成瘾性可通过不同的途径达到。
到目前为止，已经发现有一些药物可以用来治疗酒精的成瘾性。主要有以下三类第一种是戒酒硫(disulfiram)，它在40年前就已被获准在临床上使用。它的作用机制是阻断酒精代谢产物乙醛的进一步代谢，从而导致乙醛在体内的积累。这种积累会引起皮肤发红、恶心、呕吐等不良反应，因而在临床上的应用受到很大的限制。此外，也有研究表明戒酒硫的疗效并不比安慰剂好[Fuller R.K.et al.，JAMA，1986，2561449-1455]。第二类是鸦片受体拮抗剂，其中临床上应用最多的是纳曲酮(naltrexone)。1995年它被美国FDA批准用于治疗酒精的成瘾性，但是它的疗效同样受到质疑，因为有些研究结果表明纳曲酮并不能治疗严重的酒精长期成瘾性[Krystal J.H.et al.，N Engl J Med，2001，345(24)1734-1739；Kranzler H.R.et al.，Neuropsychopharmacology，2000，22493-503]。纳曲酮也有一些副作用，如恶心、腹痛、头痛等。此外，由于纳曲酮是鸦片受体的拮抗剂，因此在使用纳曲酮时，鸦片类药物如吗啡的镇痛疗效就会受到影响，这对严重急性疼痛发作时的病人会产生麻烦。第三种是acamprosate，它是牛磺酸的衍生物，主要作用于脑中的谷氨酸受体，调节谷氨酸信号的传递，对于它的疗效还需作进一步的研究。
综上所述，酒精的成瘾性与滥用是一种重大的社会问题，人们一直在努力寻找治疗酒精的成瘾与滥用的药物，但遗憾的是迄今为止尚未有疗效很理想的药物。
GABA是哺乳动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，GABA转运蛋白的生物学功能是通过摄取神经突触间隙的GABA神经递质来终止其神经抑制信息传递，进而达到调节神经信号传递的强度和时效性。GABA转运蛋白亚型I(GAT1)是GABA转运蛋白家族(GAT1、GAT2、GAT3、GAT4)中最重要的一种[Radian R.et al.，J Neurosci，1990，101319-1330]。具有专一性抑制功能的化合物已有报道，主要是3-哌啶甲酸和四氢烟酸及以这两种化合物为母核的很多衍生物。除此以外还有很多化合物是GABA转运蛋白的抑制剂，如高β-脯氨酸、四氢吡啶基异噁唑醇、五氢氮杂基异噁唑醇及其衍生物等等，有关这些化合物的合成及作为抑制剂的研究参见文献[Andersen K.E.，et al.，J.Med.Chem.，2001，442152-2163；Krogsgaard-Larsen P.，et al.，Current Pharmaceutical Design，2000，61193-1209]。本发明揭示了γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂对治疗酒精的成瘾和滥用具有潜在的临床应用价值。
本发明找到上述这类具有抑制功能的化合物能使机体降低酒精摄入量，从而达到治疗酒精的成瘾和滥用的良好效果。这类化合物的作用机理是抑制GABA转运蛋白的功能，使得机体对酒精很敏感，因而机体就会降低对酒精的摄入量，从而避免过度地饮酒，达到治疗酒精的成瘾和滥用的目的。通过以下实验可得到证实。γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂包括所有能降低γ-氨基丁酸转运蛋白摄取(转运)功能的化合物，例如上述已知化合物3-哌啶甲酸、四氢烟酸、高β-脯氨酸、四氢吡啶基异噁唑醇、五氢氮杂基异噁唑醇以及它们的衍生物等，例举化合物结构图参见

图1(上述衍生物并不限于这些例举化合物)。这些化合物可按照前述文献上报道的方法合成或从市场上购买。本发明选取其中一种竞争性抑制剂3-哌啶甲酸乙酯(是3-哌啶甲酸的衍生物)和一种非竞争性抑制剂N-(二苯基亚胺基乙醇基)-四氢烟酸(NO-711，是四氢烟酸的衍生物)为例来测定它们改变了机体对酒精的敏感性。
本发明首先用突触体GABA转运蛋白功能检测实验，揭示了急性和慢性酒精摄入导致GABA转运蛋白活性升高，接着用细胞GABA转运蛋白功能检测实验证明这种活性的改变并非由酒精与GABA转运蛋白直接发生作用，用半定量RT-PCR证明这种效应也不是改变GABA转运蛋白的表达，最后用免疫荧光技术揭示了酒精能促使GABA转运蛋白发生转位(translocation)，也就是从突触体内转移到突触体膜上，增加了细胞膜上有效的转运蛋白数量，导致GABA转运蛋白功能的增强。接着本发明用GABA转运蛋白的竞争性抑制剂(3-哌啶甲酸乙酯)和非竞争性抑制剂(N-(二苯基亚胺基乙醇基)-四氢烟酸)测试小鼠对酒精诱导的睡眠反应，结果表明两种GABA转运蛋白抑制剂预先处理后，小鼠变得对酒精很敏感。本发明进一步用过量表达GABA转运蛋白I的转基因小鼠测试它们对酒精诱导的镇静、睡眠和致死反应，结果表明GABA转运蛋白过量表达的小鼠对酒精较为耐受。最后，本发明证实了GABA转运蛋白能改变小鼠对酒精的敏感性，但并不影响酒精在体内的代谢。上述结果表明，酒精的摄入增强了中枢神经系统GABA转运蛋白的功能，而GABA转运蛋白功能的强弱又决定了小鼠对酒精的敏感程度，因此能改变GABA转运蛋白活性的药物应能改变机体对酒精的敏感性，减少机体对酒精的摄入量，从而避免过度地饮酒，达到治疗酒精的成瘾和滥用的目的。
γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂的治疗酒精的成瘾和滥用应用，可给予患者有效药量的GABA转运蛋白抑制剂药物达到治疗的目的。临床使用给药方式可以是口服或注射。口服药按常规可制成片剂、胶囊、粉末、溶液等剂型，注射可以是肌肉注射、皮下注射或静脉注射等。
使用γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂在治疗酒精的成瘾和滥用时，药物的量取决于疾病的性质和程度以及病人已接受治疗的情况。最终由处方医生决定给予病人多少剂量，临床使用的剂量为每公斤体重每日可使用0.05-1mg的GABA转运蛋白抑制剂。
在制备γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂治疗酒精的成瘾和滥用药物过程中，药物除含有GABA转运蛋白抑制剂外，还可包括药理学上可被接受的载体、溶剂、填充物、缓冲剂和稳定剂等物质。所谓“药理学上可接受的”是指不影响GABA转运蛋白抑制剂生物活性的无毒物质。载体和其它物质的选择取决于不同的给药途径。
本发明揭示了GABA转运蛋白抑制剂具有增加机体对酒精的敏感性，从而可减少机体对酒精的摄入量，避免过度地饮酒，达到治疗酒精的成瘾和滥用的目的，为GABA转运蛋白抑制剂开拓了一个新的应用领域，也为临床上治疗酒精的成瘾和滥用开辟了新的研究领域和新药筛选途径。该抑制剂包括所有能抑制GABA转运蛋白具有增加机体对酒精敏感性的化合物。由于酒精的成瘾与滥用是一种重大的社会问题，迄今为止尚未找到疗效很理想的药物，因此人们一直在努力寻找治疗酒精的成瘾与滥用的药物。本发明的这类化合物对治疗酒精的成瘾和滥用具有临床应用价值，它们的作用位点是GABA转运蛋白，经实验证实影响GABA转运蛋白的功能并不影响酒精在体内的代谢，因而可避免戒酒硫出现的副作用；本发明的这类化合物本身具有镇痛作用，且并不直接阻断鸦片受体，因而对鸦片类药物的镇痛疗效应该不会产生较大的影响。鉴于γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂具有以上优点，因此，这类化合物应用于制备治疗酒精的成瘾和滥用药物，具有广阔的开发前景。
图2显示急性酒精摄入15分钟后和长期慢性酒精摄入导致GABA转运蛋白功能的变化，结果显示急性酒精摄入15分钟后GABA转运速度加快，表明急性酒精摄入15分钟后GABA转运蛋白转运活性升高(a)，长期慢性酒精摄入后GABA转运速度也加快，表明长期慢性酒精摄入后GABA转运蛋白转运活性升高(b)，但并不导致米氏常数Km的变化(c)，其中的直线图是v对v/[s]作图法，斜率为-Km值)(n＝8，*表示p＜0.05，酒精对生理盐水，one-way ANOVA评价显著性)。
图3显示含20mM和100mM酒精时G1细胞的GABA转运速度与无酒精时的GABA转运速度一样，表明酒精的存在并不影响GABA转运蛋白的活性，这个结果证明了酒精与GABA转运蛋白I在体外并不直接相互作用。(a)时间曲线，(b)动力学曲线，其中的直线图是v对v/[s]作图法，斜率为-Km值。G1指稳定表达GABA转运蛋白I的CHO细胞。
图4中(a)显示以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为定量基准，慢性酒精摄入并没有引起GABA转运蛋白I(GAT1)在RNA水平表达的变化((a)中的第一列为DNA标准样品2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。图4中(b)显示急性和慢性酒精摄入后GABA转运蛋白I定位在突触体的一侧(箭头头部所指)，而无酒精摄入的GABA转运蛋白I定位在整个突触体(箭头所指)，说明急性和慢性酒精摄入后GABA转运蛋白I从突触体内转移到突触体膜上，标尺为1μm。
图5显示注射3-哌啶甲酸乙酯的小鼠比注射生理盐水的小鼠在注射酒精后延迟时间缩短(a)，睡眠时间延长(b)，表明3-哌啶甲酸乙酯使小鼠对酒精敏感(n＝10，*表示p＜0.05，3-哌啶甲酸乙酯对生理盐水，one-wayANOVA评价显著性)。
图6显示注射NO-711的小鼠比注射生理盐水的小鼠在注射酒精后延迟时间缩短(a)，睡眠时间延长(b)，表明NO-711使小鼠对酒精敏感(n＝10，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，NO-711对生理盐水，one-way ANOVA评价显著性)。
图7中(a)显示GABA转运蛋白I过量表达的转基因小鼠脑中GABA转运蛋白活性得到增强，慢性酒精摄入的转基因小鼠比对照转基因小鼠GABA转运蛋白功能进一步升高(n＝6，*表示p＜0.05，转基因小鼠对正常小鼠， 表示p＜0.05，慢性酒精摄入转基因小鼠对正常转基因小鼠，one-wayANOVA评价显著性)。(b)显示GABA转运蛋白活性升高后对酒精诱导的运动能力丧失作用减弱，表明GABA转运蛋白活性升高使小鼠对酒精产生一定程度的耐受。(n＝8，*表示p＜0.05，转基因小鼠和慢性酒精摄入小鼠对正常小鼠，one-way ANOVA评价显著性)。(c)显示增强GABA转运蛋白功能后延长了酒精诱导睡眠的延迟时间，(d)显示增强GABA转运蛋白功能后缩短了酒精诱导的睡眠时间，3-哌啶甲酸乙酯的使用同样能使GABA转运蛋白功能高的小鼠对酒精产生敏感，这些结果表明GABA转运蛋白活性的高低决定了小鼠对酒精的敏感性(n＝6，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，不同类型小鼠对比； 表示p＜0.05， 表示p＜0.01，同种小鼠3-哌啶甲酸乙酯对生理盐水，one-way ANOVA评价显著性)。
图8显示在GABA转运蛋白活性高的情况下，小鼠的存活时间明显延长，当用抑制剂阻断GABA转运蛋白活性后死亡迅速加快，这个结果同样表明GABA转运蛋白活性的高低决定了小鼠对酒精的敏感性。
图9显示在GABA转运蛋白活性高的情况下小鼠死亡率降低，半数致死剂量升高，这个结果表明GABA转运蛋白活性升高可以导致酒精耐受。
图10显示转基因小鼠和抑制剂预处理的正常小鼠与正常小鼠相比，在酒精注射后1小时和3小时血液中酒精含量无明显差别，表明GABA转运蛋白活性与酒精代谢无关。
实施例中的注射液配制3-哌啶甲酸乙酯、NO-711和酒精分别溶解于生理盐水，3-哌啶甲酸乙酯配成浓度为3mg/ml的溶液，NO-71l配成浓度为0.25mg/ml的溶液，酒精配成浓度为20％(v/v)的溶液。
实施例1急性与慢性酒精摄入导致中枢神经系统GABA转运蛋白活性升高的实验实验操作如下(1)在小鼠正常饮水中加入终浓度为20％(v/v)酒精，小鼠连续摄入酒精两个月，这些小鼠即为慢性酒精摄入的小鼠；急性酒精摄入小鼠是小鼠在实验前15分钟腹腔注射酒精2.4g/kg，对照则注射生理盐水。(2)断颈处死小鼠，迅速取出全脑，在匀浆缓冲液(0.32M蔗糖，10mM葡萄糖，用Tris-HCl调节PH至7.4)中匀浆12-15次，组织与匀浆缓冲液的重量比为1∶9，操作在冰浴中进行。(3)以1100g的转速在冷冻离心机中离心12分钟，取出上清液，以10000g的转速在冷冻离心机中离心20分钟，弃上清，沉淀用人工脑脊液(126.6mM NaCl，27.4mMNaHCO3，2.4mM KCl，0.49mM KH2PO4，1.2mM CaCl2，0.83mM MgCl2，0.49mM Na2HPO4，7.1mM葡萄糖，PH7.2-7.4，用95％ O2/5％ CO2饱和)悬浮，即为突触体悬液，用BCA蛋白质分析试剂盒(Perice公司)测定各样品的蛋白浓度。(4)以蛋白浓度为0.75mg/ml进行GABA转运功能测定，突触体先在37℃保温5分钟。对于时间曲线，加入浓度为40nm的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA为4nM)，在37℃反应0.5、1、2、3、4和5分钟；对于动力学曲线，加入浓度分别为40nM、100nM、400nM、1μM、4μM、10μM、20μM、30μM与40μM的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA始终保持4nM)，在37℃反应5分钟。最后用多头细胞收集仪(绍兴市卫星医疗设备制造有限公司)将突触体吸附到膜上，将膜放在闪烁液(2，5-二苯基噁唑3.6g，1，4-双-[5-苯基噁基-2]苯0.36g，300ml曲拉通X-100，600ml二甲苯)中，用液闪仪(Beckman公司)测定同位素量(CPM)(样品同位素量取100μl测定，总同位素量取4μl测定)，计算GABA转运活性，换算公式为0.053×样品同位素量×GABA浓度/总同位素量(pmol/mg protein)。
测定结果时间曲线显示急性酒精摄入15分钟后和长期慢性酒精摄入均导致GABA转运速度加快(图2中(a)及(b)，*表示p＜0.05)，表明急性酒精和长期慢性酒精摄入都能导致GABA转运蛋白的功能增强；动力学曲线表明长期慢性酒精摄入导致GABA转运速度变快，但并不导致米氏常数Km的变化(图2中(c)，*表示p＜0.05)。
实施例2证明酒精与GABA转运蛋白I(GAT1)在体外是否直接相互作用的实验实验操作如下(1)在48孔细胞培养板中培养稳定表达GABA转运蛋白I的CHO细胞(G1细胞)，实验前3小时换成无血清培养基。(2)去除培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，每孔中分别加入含20mM、100mM酒精或不含酒精的Hank’s盐缓冲液(HBSS)100μl，室温放置10分钟。(3)对于时间曲线，加入浓度为40nm的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA为4nM)，在室温反应2.5、5、10、15、20、25和30分钟；对于动力学曲线，加入浓度分别为40nM、100nM、400nM、1μM、4μM、10μM、20μM、30μM与40μM的GABA和3H-GABA混合物(3H-GABA始终保持4nM)，在室温反应30分钟。用真空泵(绍兴市卫星医疗设备制造有限公司)抽去反应液，用PBS洗涤三次。(4)每孔中加入100μl 2N的NaOH，室温裂解30分钟后将样品移入闪烁液中，用液闪仪(Beckman公司)测定同位素量，计算GABA转运活性(与实施例1类似)。
测定结果时间曲线(图3中(a))和动力学曲线(图3中(b))结果显示含20mM和100mM酒精时G1细胞的GABA转运速度与无酒精时的GABA转运速度一样，表明酒精的存在并不影响GABA转运蛋白的活性，这个结果证明了酒精与GABA转运蛋白I在体外并不直接相互作用。
实施例3急性与慢性酒精摄入促使GABA转运蛋白I从突触体内转移到突触体膜上的实验实验操作如下1.RT-PCR分析(1)断颈处死慢性酒精摄入小鼠和对照小鼠，迅速取出全脑，在Trizol试剂(GIBCO公司)中充分匀浆，按照常规的RNA抽提方法将总RNA抽提出来。(2)将总RNA样品用无RNA酶的DNA酶在37℃处理45分钟，再用酚/氯仿抽提纯化。(3)用M-MLV逆转录酶(GIBCO公司)在37℃逆转录90分钟，灭活逆转录酶，所得样品即为cDNA样品。(4)做PCR反应，GABA转运蛋白I的引物为5’ACCAAGCTTAGGCTGCAAAGCTGCTG3’，5’AGGCCTTTGAACATGGGCGCCAG3’；GAPDH的引物为5’ACGACCCCTTCATTGACC3’，5’AGACACCAGTAGACTCCACG3’。反应条件为94℃45秒，60℃45秒，72℃1分钟。(5)PCR产物进行琼脂糖电泳分析，用分子映像系统(Bio-Rad公司)定量产物量。2.免疫荧光分析(1)按实施例1所述方法将突触体抽提出来。(2)将突触体样品涂布于明胶包被的载玻片上，37℃烘干。(3)进行免疫反应，突触体先用血清室温封闭1小时，然后与抗GABA转运蛋白I抗体温育过夜(4℃)。(4)用PBS洗涤之后，样品与接生物素的二抗室温反应2小时。(5)用PBS洗涤之后，样品与FITC标记的亲合素室温反应1小时。(6)用PBS洗涤，封片剂封片，在荧光显微镜下观察，并拍照。
测定结果RT-PCR电泳结果显示以GAPDH为定量基准，慢性酒精摄入小鼠的GABA转运蛋白I的表达量与对照小鼠的GABA转运蛋白I的表达量无明显差异(图4中(a))，表明慢性酒精摄入并没有引起GABA转运蛋白I表达的变化。免疫荧光分析结果显示急性和慢性酒精摄入后GABA转运蛋白I定位在突触体的一侧(箭头头部所指)，而无酒精摄入的GABA转运蛋白I定位在整个突触体(箭头部所指)(图4中(b))，说明急性和慢性酒精摄入后GABA转运蛋白I从突触体内转移到突触体膜上。
实施例4通过睡眠实验测试GABA转运蛋白I竞争性抑制剂3-哌啶甲酸乙酯预处理后小鼠对酒精的敏感度实验操作如下(1)给小鼠腹腔注射3-哌啶甲酸乙酯60mg/kg，对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。(2)10分钟后给小鼠注射酒精3.6g/kg，立即将小鼠仰卧在“V”型槽中，记录从注射酒精到小鼠不能翻正自己的时间，称为延迟时间；记录从小鼠不能翻正自己到又能翻正自己的时间，称为睡眠时间。能否翻正的指标是30秒内能否翻正3次。
测试结果注射3-哌啶甲酸乙酯的小鼠比注射生理盐水的小鼠在注射酒精后延迟时间缩短(图5中(a)，*表示p＜0.05)，睡眠时间延长(图5中(b)，*表示p＜0.05，)，表明3-哌啶甲酸乙酯使小鼠对酒精敏感。
实施例5
通过睡眠实验测试GABA转运蛋白I非竞争性抑制剂N-(二苯基亚胺基乙醇基)-四氢烟酸预处理后小鼠对酒精的敏感度实验操作如下(1)给小鼠腹腔注射NO-711 5mg/kg，对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。(2)10分钟后给小鼠注射酒精3.6g/kg，立即将小鼠仰卧在“V”型槽中，记录从注射酒精到小鼠不能翻正自己的时间，称为延迟时间；记录从小鼠不能翻正自己到又能翻正自己的时间，称为睡眠时间。能否翻正的指标是30秒内能否翻正3次。
测试结果注射NO-711的小鼠比注射生理盐水的小鼠在注射酒精后延迟时间缩短(图6中(a)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，睡眠时间延长(图6中(b)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，表明NO-711使小鼠对酒精敏感。
实施例6通过自由运动实验和睡眠实验测试GABA转运蛋白I活性升高后的小鼠对酒精的敏感度实验操作如下1.GABA转运蛋白I过量表达的转基因小鼠在脑中GABA转运蛋白活性升高(1)慢性酒精摄入的转基因小鼠的获得同实施例1中慢性酒精摄入的正常小鼠的获得。(2)GABA转运蛋白活性的测定同实施例1。2.自由运动实验(1)将小鼠放入一个开放箱子中，箱子尺寸为50×50×30cm，底部分成10×10cm的方格，记录小鼠在5分钟内跨越的方格数。(2)给小鼠腹腔注射酒精1.75g/kg，立即放回箱子中，以酒精注射为计时起点，分别记录在2-7分钟、12-17分钟、32-37分钟和60-65分钟时间段内记录小鼠跨越的方格数。(3)计算小鼠在酒精注射后相对于酒精注射前活动的百分率。3.睡眠实验操作同实施例4。
测试结果GABA转运时间曲线显示GABA转运蛋白I过量表达的转基因小鼠脑中GABA转运速度比正常小鼠快，而慢性酒精摄入的转基因小鼠GABA转运速度比对照转基因小鼠快(图7中(a)，*表示p(0.05， 表示p＜0.05)，表明GABA转运蛋白I过量表达的转基因小鼠脑中GABA转运蛋白活性得到增强，慢性酒精摄入能进一步增强GABA转运蛋白的功能。自由运动实验结果显示GABA转运蛋白活性升高后对酒精诱导的运动能力丧失作用减弱(图7中(b)，*表示p＜0.05)，表明GABA转运蛋白活性升高使小鼠对酒精产生一定程度的耐受。睡眠实验结果显示增强GABA转运蛋白功能延长了延迟时间(图7中(c))，缩短了睡眠时间(图7中(d))，3-哌啶甲酸乙酯的使用再一次证实了实施例4的结果(图7中(c)及(d)，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01， 表示p＜0.05， 表示p＜0.01)，这些结果表明GABA转运蛋白活性的高低决定了小鼠对酒精的敏感性。
实施例7GABA转运蛋白活性与高剂量酒精致死的关系实验操作如下(1)给小鼠腹腔注射9g/kg的3-哌啶甲酸乙酯或相同体积的生理盐水，立即将小鼠放回笼中。(2)记录每只小鼠的死亡时间，以心跳停止作为评判标准。(3)统计不同时间段内同组小鼠的成活个数。
测试结果在GABA转运蛋白活性高的情况下，小鼠的存活时间明显延长，当用抑制剂阻断GABA转运蛋白活性后死亡迅速加快(图8)，这个结果同样表明GABA转运蛋白活性的高低决定了小鼠对酒精的敏感性。
实施例8GABA转运蛋白活性与酒精半数致死剂量的关系实验操作如下(1)分别给小鼠腹腔注射6.5，7.0，7.5g/kg的酒精，立即将小鼠放回笼中。(2)记录每组小鼠死亡个数，计算死亡率。(3)作图计算半数致死剂量(LD50)。
测试结果在GABA转运蛋白活性高的情况下小鼠死亡率降低，半数致死剂量升高(图9)，这个结果表明GABA转运蛋白活性升高可以导致酒精耐受。
实施例9GABA转运蛋白活性的高低与酒精代谢无关实验操作如下(1)给小鼠腹腔注射60mg/kg 3-哌啶甲酸乙酯或相同体积的生理盐水，立即将小鼠放回笼中。(2)10分钟后给这些小鼠腹腔注射3.6g/kg的酒精，立即将小鼠放回笼中。(3)酒精注射后1小时处死一半小鼠取血，另一半小鼠在酒精注射后3小时处死取血。(4)用Sigma公司酒精分析试剂盒测定每个小鼠血液中酒精的含量。
测试结果转基因小鼠和抑制剂预处理的小鼠与正常小鼠相比，在酒精注射后1小时和3小时血液中酒精含量无明显差别(图10)，表明GABA转运蛋白活性与酒精代谢无关。
实施例10治疗酒精成瘾和滥用注射液的制备将3-哌啶甲酸乙酯0.75克、1.25克、2.5克各别溶解于1升水中，混合均匀后分装成1.5mg/2ml/支、2.5mg/2ml/支、5mg/2ml/支浓度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒杀菌，制成产品，避光保藏。
实施例11 治疗酒精成瘾和滥用注射液的制备将NO-711 0.75克、1.25克、2.5克各别溶解于1升水中，混合均匀后分装成1.5mg/2ml/支、2.5mg/2ml/支、5mg/2ml/支浓度的注射液于安瓿瓶中密封，消毒杀菌，制成产品，避光保藏。
实施例12治疗酒精成瘾和滥用片剂的制备按公知的制片技术，取NO-711 10克，糊精130克，淀粉100克，羧甲基淀粉50克，一起放入粉碎机内充分混合25-30分钟，粉碎至约80-120目，再加入硬脂酸镁3克，均匀混合，经制片机制成1000片片剂，每片重量约0.3克，每片含NO-711 10mg。
权利要求
1.一种γ-氨基丁酸转运蛋白抑制剂在制备治疗酒精的成瘾和滥用药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是包括3-哌啶甲酸，四氢烟酸，高β-脯氨酸、四氢吡啶基异噁唑醇、五氢氮杂基异噁唑醇以及它们的衍生物为抑制剂在制备治疗酒精的成瘾和滥用药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征是包括但并不限于下列这些化合物3-哌啶甲酸，四氢烟酸，3-哌啶甲酸乙酯，N-(二苯基亚胺基乙醇基)-四氢烟酸，4，4-双(3-甲基噻吩基-3-丁烯基)-3-哌啶甲酸，双(三氟甲基苯基)甲氧基乙基四氢烟酸，N-(二苯基-3-丁烯基)-3-哌啶甲酸，N-(二苯基-3-丁烯基)四氢烟酸，(二苯基甲氧乙基)-3-哌啶甲酸，二苯甲叉基乙氧基胺哌啶甲酸，二苯乙烯氧基乙基哌啶甲酸，二苯氨基乙氧基乙基哌啶甲酸，二苯丙氧基乙基哌啶甲酸，4，4-二对甲苯基-3-丁烯基哌啶甲酸，6-(3，3-二苯丙基)四氢烟酸，2-(3，3-二苯丙氧基)乙基哌啶甲酸，(10，11-二氢-二苯氮杂基)乙氧基乙基哌啶甲酸，2-(9-对甲氧基苯基)芴基乙氧基哌啶甲酸，三对甲氧基苯基甲氧基乙基哌啶甲酸，高β-脯氨酸，四氢吡啶基异噁唑醇，五氢氮杂基异噁唑醇，四氢吡啶基硫代异噁唑醇，五氢-4-胺基苯并异噁唑醇，五氢-4-甲胺基苯并异噁唑醇，4，4-二苯基-3-丁烯基四氢吡啶异噁唑醇，二苯基-3-丁烯基五氢氮杂异噁唑醇，3-氮杂芴基-4-邻甲氧基苯基-吡啶醇，为抑制剂在制备治疗酒精的成瘾和滥用药物中的应用。
全文摘要
一种γ－氨基丁酸(GABA)转运蛋白抑制剂在制备治疗酒精的成瘾和滥用药物中的应用。该抑制剂包括所有能抑制GABA转运蛋白使机体对酒精敏感的化合物，例如3－哌啶甲酸，四氢烟酸，高β－脯氨酸、四氢吡啶基异噁唑醇(THPO)、五氢氮杂基异噁唑醇(THAO)以及它们的衍生物等。实验结果表明，这类抑制GABA转运蛋白的化合物具有使机体对酒精敏感的作用，从而减少机体对酒精的摄入量。因此这类化合物对治疗酒精的成瘾和滥用具有临床应用价值，可用于制备治疗酒精的成瘾和滥用药物。
文档编号A61K31/445GK1401319SQ0213633
公开日2003年3月12日 申请日期2002年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者郭礼和, 胡佳华, 马映华, 杨纳, 费俭, 张懋弧 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 上海赛达生物技术研究中心有限公司