专利名称：高分子量凝集素的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备高分子量凝集素组合物的方法，特别包括甘露糖结合型凝集素(MBL)，适于使用重组制备的凝集素作为起始物，高分子量凝集素组合物，及包含其的药用组合物，以及所制备的组合物在制备治疗多种疾病的药用组合物中的用途。
背景技术：
甘露糖结合型凝集素(MBL)是一种蛋白质，其可作为替换剂或替代疗法而用于具有功能性和/或临床症状的遗传性或获得性MBL缺陷的患者。
MBL是属于胶原凝集素(collectin)家族的蛋白质，其特征是亚基的低聚物结构，每一亚基都包含钙依赖性，C-型碳水化合物识别结构域(CRD)，附于胶原柱上。MBL经由相关丝氨酸蛋白酶(MASP-甘露糖结合型凝集素相关丝氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin associated serineproteases))，即通过与C1q相似的机制激活补体系统。
源自人血浆的MBL被组装成亚基的寡聚体，每一亚基都含有三个相同的多肽链。MBL分子中的亚基数量各异(Lipscombe RJ，et al由不同基因型的个体表达的人类甘露糖结合型蛋白的物化特性的差异，Immunology 85(1995)660-667.)。已有证据显示，生物活性多肽为包含三个以上亚基的寡聚体。血浆包含三个亚基以上的寡聚体以及变性和结构受损的蛋白，其在如SDS凝胶上形成的条带处在较高寡聚体相应的主要MBL条带之间。
重组来源的MBL显示出与血浆来源的MBL相似的寡聚体变化(Vorup-Jensen T等人甘露糖结合型凝集素的重组表达，Int Immunopharm1(2001)677-687)。但是，通常重组制备的MBL的低分子量形态的含量要高于血浆来源的MBL。MBL的低分子量形态包括，例如单多肽链、单亚基和亚基二聚体。
PCT申请WO00/70043公开了一种从低分子量形态中分离高寡聚体的方法，其中重组来源的MBL用特殊柱子进行分级。
本领域现有技术已经公开了含蛋白质分级组分的沉淀方法。例如在Storgaard P，Nielsen EH，Andersen O，Skriver E，Mortensen H，HojrupP，Leslie G，Holmskow U，Svehag SE.不同大小和超微结构的猪甘露糖结合型蛋白质的分离和定性。Scand J Immunol 1996；43289-96中就公开了从猪血清中分离MBL的方法，其中使用PEG沉淀方法纯化MBPs，在甘露糖琼脂糖凝胶、蛋白A-和抗猪IgM-琼脂糖凝胶进行亲和层析，随后凝胶过滤。
WO99/64453公开了通过使用乙醇沉淀对血浆进行Cohn分级。所得到的分级组分包含其它分子MBL。
发明概述从溶液快速而简便的分离凝集素，如甘露糖结合型凝集素或其衍生物和变体(在此统称为凝集素)的方法是非常重要的。
而且，控制凝集素的质量分布也是非常重要的，因为所述凝集素多肽的不同寡聚体具有不同的生物学功能和活性。
本发明公开了一种通过在溶液中加入沉淀剂导致沉淀来分离凝集素，如MBL的方法。该方法可作为所述多肽的制备、纯化和/或配方过程中的单位操作步骤。与其它方法相比，其优点在于，本发明所述方法可应用于转换所述多肽寡聚体的组合物，以便所述多肽的高分子量寡聚体从所述多肽的低分子量寡聚体中分离出来。
因此，本发明的一个方面涉及变更溶液中凝集素寡聚体分布的方法。在一个实施方案中，本发明涉及增加包含多种凝集素分子的组合物的比率R的方法，其中R为分子量高于二聚体凝集素(dimer lectin)分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含低分子量凝集素和高分子量凝集素，所述制剂的比率R＝R0，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选重悬所述沉淀部分获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
因此最终获得的组合物与起始物质相比，前者包括含量增高的高分子量凝集素寡聚体。
这一比率的增加特别地导致组合物包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素。因此，本发明的另一个方面涉及生产包含多种凝集素分子的组合物，其中所述凝集素分子基本上全部具有高于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选重悬所述沉淀部分获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
由于本发明的起始物质包含高分子量凝集素以及低分子量凝集素，本发明还涉及从包含高于二聚体凝集素分子量的高分子量凝集素分子和低于或等于二聚体凝集素分子量的低分子量凝集素分子的凝集素制剂中分离包含多种凝集素分子的组合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全都具有高于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，所述方法包括，获得所述凝集素制剂，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选重悬所述沉淀部分获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
对大多数目的来说，高分子量凝集素(high mass lectins)是必需的，但是对某些应用来说，则需要低分子量凝集素，相应的，本发明更进一步涉及生产包含多种凝集素分子的组合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有低于或等于二聚体凝集素的低分子量，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出沉淀，获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选地获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，获得含有上清部分凝集素分子的组合物。
对于上述全部方法来说，优选的，沉淀部分的比率R＝R1，其中R1至少为1，如至少为1.05，如至少为1.10，如至少为1.15，如至少为1.25，如至少为1.50，如至少为1.75，如至少为2.0，如至少为2.5，如至少为3.0，如至少为4.0，如至少为5.0，如至少为6.0，如至少为7.0，如至少为8.0，如至少为9.0，如至少为10.0，如至少为15，如至少为20，如至少为30，如至少为40，如至少为50，如至少为60，如至少为70，如至少为80，如至少为90，如至少为100，如至少为100，如至少为1000，如至少为10000。
对于上述公开的全部方法，R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，在一个优选实施方案中R为分子量高于三聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于三聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率。
根据本发明的凝集素，可为任意凝集素，其中被制成几种低聚物形式，如甘露糖结合型凝集素。特别的，本发明涉及生产MBL组合物的方法。MBL该术语意指甘露糖结合型凝集素(或者甘露糖结合型蛋白，如某些作者所称)。MBL优选为人类MBL，其具有如PCT申请WO00/70043中所示的蛋白质序列或其与MBL功能等价的衍生物或变体。本发明将在下面描述凝集素MBL的相关内容。
根据本发明的方法，其允许处于探讨中的凝集素大规模生产。因此，本发明的另一个方面涉及任何包含在生产所述MBL的过程中应用所述方法的商业化或大规模生产MBL的方法。
图1.使用抗血浆来源的MBL的HYB131-01的SDS-PAGE Western。P＝血浆来源的MBL；1＝使用本发明之前的重组来源的MBL；3＝使用本发明之后的重组来源的MBL。
图2.使用抗血浆来源的MBL的HYB131-01的SDS-PAGE Western。左免疫印迹，右印迹的光密度分析(Scion Software)。样品1＝使用本发明之前的重组来源的MBL(R＝6)；该例中主条带的分子量为(从右向左)47kDa，160kDa，230kDa，290kDa，330kDa和365kDa(肩)。
2＝使用本发明的重组来源的MBL(上清)(R＝0)；该例中主条带的分子量为(从右向左)47kDa和160kDa。3＝使用本发明的重组来源的MBL(沉淀)(R＞＞1000)；该例中主条带的分子量为(从右向左)230kDa，290kDa，330kDa和365kDa(肩)和400-600kDa。
图3.MBL在3L HyQ培养基中的沉淀。左沉淀前的培养基。中刚加入沉淀剂后的培养基。右加入沉淀剂40分钟后的培养基。
图4.使用BioAnalyzer系统计算样品的R值。左荧光染色凝胶(Agilent标准方法，L＝marker ladder)。右样品1和3的整合峰值(箭头所指为计算R的整合峰值)。样品1和2＝高分子量形态占优的重组来源的MBL(R＝19)。3和4＝低分子量形态占优的重组来源的MBL(R＝0.2)。
发明详述此处使用的比率R可通过使用任何适用的方法进行计算。在一个优选实施方案中对一个样品中R值的数值估算可通过如下方法进行将SDS-PAGE免疫印记扫描为TIFF文件格式，或另一非压缩的位图文件格式。通过使用图象处理程序，例如Scion Image for Windows 4.0(Scion公司，www.scioncorp.com上的beta版免费软件)，测定样品条带的像素密度，然后输出至数据处理程序(如Excel)。
用标记(markers)(蛋白质精度标准，BioRad)的迁移确定二聚体凝集素的相应迁移。高于参照迁移位点(对应MBL 200kDa)的全部像素信号除以低于参照迁移位点(对应MBL 200kDa)的全部像素信号而得到R值。R0被定义为起始物质的比率，而R1为沿沉淀样品相应估算线的比率。
测算比率R的另一方法为使用基于芯片的电泳系统作为BioAnalyzer系统(获自Agilent)。这里，波峰区域的整合作为标准估算步骤的一部分而完成。
沉淀剂本发明的中心方面为能够通过沉淀包含低分子量和高分子量两种形式的MBL制剂中分离低分子量和高分子量形式的MBL。术语“沉淀剂(precipitating agent)”的词义与本文中的术语“沉淀剂(precipitant)”的词义相同。沉淀剂可以是任一种基本上非变性，水溶性蛋白质沉淀剂，这类沉淀剂中的很多种在蛋白质纯化技术领域中是众所周知的。因此，沉淀剂可以是高分子量沉淀剂，例如PEG，其分子量例如为200Da、300Da、400Da、550Da、600Da、1,000Da、1,450Da、1,500Da、2,000Da、3,000Da、3,350Da、4,000Da、6,000Da、8,000Da、10,000Da、15,000Da、20,000Da和35,000Da，以及PEG与另一化合物，例如与PEG自身或蛋白质的化学结合物，其多为商业上可获得的PEG组合物。
但是优选的沉淀剂为低分子量沉淀剂。低分子量沉淀剂的实例为硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸钠和氯化钠。有效阴离子沉淀剂的实例为铵离子(NH4+)，钠离子(Na+)，钾离子(K+)和铯离子(Cs+)。有效阳离子沉淀剂的实例为硫酸根离子(SO42-)，磷酸根离子(PO43-)，和乙酸根离子(CH2COO-)。
因此在一个实施方案中，沉淀剂选自阳离子沉淀剂。沉淀剂可选自包含Ca2+的试剂，如CaCl2，氯化钙(CaCl2，CaCl2.H2O，CaCl2.2H2O，CaCl2.6H2O)，硝酸钙(Ca(NO3)2，Ca(NO3)2.3H2O，Ca(NO3)2.4H2O)，亚硝酸钙(Ca(NO2)2.H2O，Ca(NO2)2.4H2O)，碘化钙(CaI2，CaI2.6H2O)，溴化钙(CaBr2，CaBr2.6H2O)，溴酸盐(Ca(BrO3)2.H2O)，氯酸钙(Ca(ClO3)2，Ca(ClO3)2.2H2O，(Ca(ClO4)2)，铬酸钙(CaCrO4.2H2O)，高锰酸钙(Ca(MnO4)2.5H2O)，次磷酸钙(Ca(H2PO2)2)，钙铁氰化物(Ca3[Fe(CN)6]2.12H2O，Ca2Fe(CN)6.12H2O)，硫代硫酸钙(CaS2O3.6H2O)，以及如低溶解含钙剂，如甲酸钙(Ca(CHO2)2)，甲酸钙(Ca(C2H3O2)2，Ca(C2H3O2)2.H2O，Ca(C2H3O2)2.2H2O)，丙酸钙(Ca(C3H5O2)2.H2O)，乳酸钙(Ca(C3H5O3)2.5H2O)，马来酸钙(CaC4H2O4.H2O)，戊酸钙(Ca(C5H9O2)2)和枸橼酸钙(Ca3(C6H5O7)2.4H2O)。
加入的阳离子沉淀剂优选的浓度范围为0.001M至于5.0M，如0.01M至5.0M、如0.05M至2.5M、如0.01M至2.5M、例如0.1M至2.0M、如0.1M至1.0M。
在另一实施方案中沉淀剂选自阴离子沉淀剂。阴离子沉淀剂可选自阴离子，如磷酸盐、碳酸盐和硫酸盐。
沉淀剂的反离子可存在于制剂的溶剂中或在加入沉淀剂之前、同时或之后加入。关于阳离子沉淀剂，制剂优选地包含选自碳酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐，优选磷酸盐的阴离子。
从上清中分离沉淀可由任意的适用方法进行，优选过滤或离心。
制剂可包含溶剂，如选自来自培养罐的液体培养基、来自纯化过程的液体中间产物、液体方剂、任何缓冲液或纯水。在一个优选的实施方案中，溶剂是培养基，由此该方法可在培养细胞表达MBL后直接实施于液体培养基，任选地先于过滤步骤。
沉淀一经形成，即可通过任何适用的步骤，特别是适用于大规模生产的步骤从上清中分离出来。可以采用吸除样品上清随后离心的方法进行分离。因此本发明的另一优势显示了，即发酵产生的大量水可以在基本上不丢失相关MBL的情况下而被去除。而且，如上述包含低分子量分子的上清可被进一步作为样品以通过层析法获取MBL分子。
沉淀可在任何能使所形成的沉淀稳定存在的pH值下产生。pH的范围一般为2＜pH＜11，如pH＝3、如pH＝4、如pH＝5、如pH＝6、如pH＝7、如pH＝8、如pH＝9、如pH＝10。
沉淀可在任何能使所形成的沉淀稳定存在的温度下产生。温度设置范围为0℃＜温度＜80℃，如4℃、如10℃、如15℃、如20℃、如25℃、如30℃、如35℃、如40℃、如50℃、如60℃、如70℃，但是沉淀一般在室温下进行。
沉淀剂优选地选自那些能使沉淀在数日内、优选为数小时、优选为30分钟内完成的沉淀剂。
通过使用Novex系统和商业可获得的凝胶(NuPAGE 3-8％ Tris-Acetate，Invitrogen)，用SDS-PAGE测定本文所提及的分子量。使用商业可获得的MBL特异性抗体(Hyb131-01，Statens Serum Institute，Copenhagen)的免疫印记验证MBL。采用基于BioRad蛋白质精度标准(BioRad161-0362)的标准曲线插入法，通过绘制In(迁移)对分子量的图来估算Hyb131-01主条带分子量。
组合物比率R的增加度依赖于比率为R0的起始物质，该起始物质为MBL制剂。优选地，组合物中至少50摩尔％的MBL的分子量高于二聚体凝集素的分子量，优选地高于三聚体凝集素的分子量。因此，优选地，组合物中至少50摩尔％的MBL的分子量高于200kDa、如高于225kDa、如高于250kDa、如高于300kDa。
术语“摩尔％”意指组合物中MBL多肽链的相对摩尔量。但是，摩尔％还可表示每个包含三个MBL多肽的MBL亚基的相对摩尔量。或者，此处所使用的百分数可被换算为重量百分数(％(w/w))。为清楚起见，此处使用的百分数是与MBL多肽链相关的“摩尔％”，但是同一百分数无论表示为与MBL多肽链相关的“摩尔％”还是表示为重量百分数都是相同的。
通过本发明获得的MBL似乎可提供仅包含寡聚体的级分，而不包含变性和/或结构受损的MBL分子，该分子通常见于血浆MBL，因为SDS-PAGE上的条带基本上对应于如下一个或多个级别范围内的分子级别I的分子量范围为200kDa至270kDa，(优选包含二聚体和/或三聚体)，级别II的分子量范围为270kDa至300kDa，(优选包含三聚体和/或四聚体)，级别III的分子量范围为300kDa至400kDa，(优选包含四聚体和/或五聚体)，和级别IV的分子量范围为400kDa至600kDa，(优选包含五聚体和/或更高的寡聚体)，所述分子量用SDS-PAGE测定，其中级别I的MBL占组合物中MBL总量的0-20摩尔％，如0-10摩尔％、如0-5摩尔％、如0-2摩尔％、如0-1摩尔％、如0至小于0.5摩尔％、如0至小于0.1摩尔％、如0至小于0.01摩尔％、如0至小于0.001摩尔％、如0.1-20摩尔％、如0.1-10摩尔％、如0.1-5摩尔％、如0.1-2摩尔％、如0.1-1摩尔％、如0.1至小于0.5摩尔％、如0.1至小于0.4摩尔％、如0.1至小于0.3摩尔％、如0.1至小于0.2摩尔％优选地，MBL组合物包含属于至少两个级别的分子，如属于至少三个级别的分子，更优选地，属于四个级别的分子。
此处所提及的高于某优选地包含某MBL寡聚体的级别时，并非意指除外那些指特定级别的寡聚体以外的寡聚体也不能被采用。但是，并非用理论进行限制而根据一个现在优选的假说，上面列出的寡聚体被认为主要出现在描述其的级别中。
“基本上相关”意指具有高于600kDa分子量的少量MBL分子可被采用，如低于10摩尔％的较少量、如低于5摩尔％的较少量。此外，“基本上”同样是指每一级别中所述分子量的任何5％内的偏差、如2％、如1％、如0.5％、如小于0.1％。
更优选地，级别I的MBL占组合物中MBL总量的0.1-15摩尔％，如占组合物中MBL总量的0.1-12摩尔％、占组合物中MBL总量的0.1-10摩尔％、如占组合物中MBL总量的0.1-5摩尔％。
优选地，级别II的MBL占组合物中MBL总量的0-50摩尔％、如级别II的MBL占组合物中MBL总量的0-30摩尔％、如级别II的MBL占组合物中MBL总量的5-30摩尔％、如级别II的MBL占组合物中MBL总量的10-30摩尔％。
优选地，级别III的MBL占组合物中MBL总量的0-60摩尔％、如级别III的MBL占组合物中MBL总量的10-60摩尔％、如级别III的MBL占组合物中MBL总量的20-60摩尔％、如级别III的MBL占组合物中MBL总量的20-50摩尔％。
优选地，级别IV的MBL占组合物中MBL总量的0-50摩尔％、如级别IV的MBL占组合物中MBL总量的0-30摩尔％、如级别IV的MBL占组合物中MBL总量的5-30摩尔％、如级别IV的MBL占组合物中MBL总量的10-30摩尔％。
在优选实施方案中通过本发明获得的组合物包含级别I的MBL的量为0-5摩尔％，级别II的MBL的量为10-30摩尔％，级别III的MBL的量为20-50摩尔％，和级别IV的MBL的量为10-30摩尔％、如级别I的MBL的量为0-5摩尔％，级别II的MBL的量为15-30摩尔％，级别III的MBL的量为20-50摩尔％，和级别IV的MBL的量为15-30摩尔％、如级别I的MBL的量为0-5摩尔％，级别II的MBL的量为20-30摩尔％，级别III的MBL的量为20-50摩尔％，和级别IV的MBL的量为20-30摩尔％、如级别I的MBL的量为0-5摩尔％，级别II的MBL的量为20-30摩尔％，级别III的MBL的量为30-50摩尔％，和级别IV的MBL的量为20-30摩尔％。
对于上述组合物，级别I的MBL可以不存在和存在量为例如0.1摩尔％、如0.2摩尔％、如0.4摩尔％、如约1摩尔％、如约2摩尔％、如约3摩尔％、如约4摩尔％。“约”应被理解为指级别I的MBL量的任何低于5％、如2％、如1％、如0.5％、如小于0.1％的误差。
在优选实施方案中对级别的定义如下级别I的分子量范围为200kDa至260kDa，级别II的分子量范围为270kDa至300kDa，级别III的分子量范围为310kDa至390kDa，和级别IV的分子量范围为400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE测定，测定级别I至IV每一级的MBL的百分比是通过如前述测定比率R的方法进行。
本发明的另一个方面提供了一种获得包含选自高分子量MBL和低分子量MBL的组合物的方法，其中所述组合物包含少于20摩尔％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于300kDa。
因此，本发明还涉及包含高分子量MBL和低分子量MBL的组合物，其中所述组合物包含少于20摩尔％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于300kDa。
因此，本发明还提供了上述的方法和组合物，其中低分子量MBL的含量少于10摩尔％、如少于5摩尔％、如小于2摩尔％、如小于1摩尔％、如小于0.1摩尔％、如小于0.01摩尔％、如小于0.001摩尔％；以及任一前述组合物，其中所述低分子量MBL优选地具有小于300kDa的分子量、如小于290kDa、如小于285kDa、如小于280kDa、如小于275kDa、如小于270kDa、如小于265kDa、如小于260kDa、如小于255kDa、如小于250kDa、如小于245kDa、如小于240kDa、如小于235kDa、如小于230kDa、如小于225kDa、如小于220kDa、如小于215kDa、如小于210kDa、如小于205kDa、如小于200kDa。
通过按照本发明生产MBL组合物，该MBL组合物基本上不含在任何当在天然宿主生物如血浆MBL中产生时与MBL天然相关联的杂质。
本发明可用于从任何MBL来源如任何哺乳动物重组MBL中，生产高分子量MBL组合物。但是优选地，组合物的MBL为人源的，其中MBL亚基由三个肽序列构成，所述序列包含如PCT申请WO00/70043中SEQ ID NO1所示的序列或其功能等效体。
在本发明的一个更进一步的方面，高及低分子量MBL的两个纯化部分，可分别以任意每一分级组分所需比率而被合并。
重组生产虽然本方法可应用于任何含有低和高分子量MBL的MBL起始物质，但其特别适用于从重组生产的制品中生产高分子量MBL。
因此MBL制剂优选为重组制品，其中MBL制剂获自-制备编码人MBL肽或其功能等效体的基因表达构建体，-将构建体转化宿主细胞培养物，-在培养基中培养宿主细胞，从而使所述多肽表达并将其分泌到培养基中，-获得包含多种MBL分子的制剂。
根据本发明，MBL基因序列可来自人MBL基因或来自其它动物种类的MBL基因，其中该动物的免疫系统行为在这个方面与人类免疫系统相似。根据本发明的重组MBL制剂的一个优选实施方案的实例已经公开于PCT申请WO00/70043的实施方案1中，此处引用该申请作为参考。在实例中，通过利用含人MBL基因序列的表达载体来制备该重组MBL。
本发明还涉及表达载体的应用，该载体包含人MBL基因序列的功能性衍生序列。所述功能性衍生序列是指包含不导致或基本上不导致表达载体功能差异的碱基对变化的序列，并且这种方式制备的MBL的功能与用含没有变化的人MBL基因序列的表达载体所制备的MBL相当。
除了纯化方法以外，优选基因表达构建体和宿主细胞也有利于产生较高寡聚体。因此，基因表达构建体优选包含人MBL基因或其功能等效体的至少一个内含子序列。而且所述基因表达构建体可以包含人MBL基因或其功能等效体的至少两个外显子序列。更优选基因表达构建体包含人MBL基因或其功能等效体的至少三个外显子序列。当包含多于一个外显子的时候，外显子序列的排列优选与人MBL基因中的相同。
虽然优选在该序列中包含内含子序列，但表达构建体包括编码MBL亚单位或其功能等效体的cDNA序列，对于一些应用可能是方便的。
本发明的特点是在哺乳动物细胞系或转基因动物中应用MBL基因表达构建体而不是MBL cDNA构建体来表达rMBL，获得在非变性和变性条件下具有与天然人MBL基本上相似的结构特点的重组MBL。“重组人MBL”是指由基因工程化核酸表达的人MBL，而“MBL基因表达构建体”是指适合于在哺乳动物细胞系中表达的表达载体，其包含人MBL基因或其它动物MBL基因的外显子序列和至少一个内含子序列，所述其它动物包括但不限于黑像猩猩和恒河猴(rhesus monkeys)。
优选所述DNA序列编码SEQ ID NO1所示多肽序列或如上限定的其功能等效序列。SEQ ID NO1数据库登记号为P11226的MBL序列。所述等效序列可以通过修饰SEQ ID NO1所示多肽序列而获得，如具有对应于本发明上述序列的特点，但其中一或多个氨基酸已被具有相似特性的其它氨基酸替代的序列。功能性等效序列优选包括保守替代，即一个或多个氨基酸被具有相似特点的氨基酸替代，使蛋白化学领域的技术人员可以预测未改变的蛋白的二级结构和三级结构。适用于保守替代的氨基酸包括那些具有功能上相似的侧链的氨基酸。例如，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸等疏水性残基可以替代另一个这样的残基。同样，保守替代可以包括亲水性残基(例如精氨酸和赖氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，苏氨酸和丝氨酸)之间，碱性残基(赖氨酸、精氨酸和组胺酸)之间和/或酸性残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)之间的互换。只要能保持所述多肽的功能，还(或者)可以通过氨基酸的缺失或插入或者氨基酸的化学修饰对功能等效序列进行修饰。
包括MBL的任何功能等效体的分离的MBL肽，在一个实施方案中包括至少80个氨基酸残基，如至少100个氨基酸残基，如至少150个氨基酸残基，如至少200个氨基酸残基，如至少220个氨基酸残基，如至少250个氨基酸残基。
在优选的实施方案中，表达载体适合于在哺乳动物细胞系或转基因动物中表达，其包括人MBL基因或其它动物MBL基因的外显子序列和至少一个内含子序列，所述动物包括但不限于黑猩猩和恒河猴。在一个实施方案中，将宿主细胞在转基因动物中进行培养。在本文中转基因动物是指经遗传修饰而包含并表达人MBL基因或其片段或其类似物的动物。
在优选的实施方案中，本发明的表达构建体包括病毒载体，例如DNA病毒载体，RNA病毒载体或嵌合病毒载体。DNA病毒的实例包括巨细胞病毒、疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、猴病毒40、牛乳头病毒、腺伴随病毒、腺病毒、痘苗病毒和Baculo病毒。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在将腺病毒作为表达载体情况中，可以将本发明的核酸分子连接至腺病毒转录/翻译调控复合物，例如晚期启动子和三联前导序列上。然后通过体外和体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组。在病毒基因组非必须区(如E1或E2)中的插入将得到可在被感染的宿主细胞中存活并表达MASP-3基因产物的重组病毒(例如参见Logan和Shenk，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)813655-3659，1984)。为了有效翻译所插入的核酸分子，还需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及邻近序列。在将包括其本身的起始密码子及其邻近序列的整个基因和cDNA插入到表达载体的情况中，不需要额外的翻译调控信号。然而，在仅插入编码序列的情况中，必须提供包括如ATG起始子在内的外源翻译调控信号。而且，起始密码子必须于目的编码序列的阅读框相协调，以保证整个插入片段的翻译。这些外源翻译调控信号和起始密码子可以来自各种来源，既可以是天然的也可以是合成的。通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以提高表达效率(参见Bittner等，酶学方法(Methods in Enzymol).153516-544，1987)。
RNA病毒的实例包括塞姆利基(Semliki)森林病毒、新培斯(Sindbis)病毒、Poko病毒、狂犬病病毒、流感病毒、SV5、呼吸道合胞病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、Kunjin病毒、仙台病毒、水泡性口炎病毒和逆转录病毒。
嵌合病毒的实例包括腺病毒、新培斯(Sindbis)病毒和腺病毒-腺伴随病毒。
有关特异性载体参见Makrides，S.C.，“用于基因转移和哺乳动物细胞中表达的载体的组成(Components of vectors for Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells)”，在此引入作为参考。
特别利用了Epstein-Barr病毒的复制起始点或其功能衍生体和类似体，包括pREP9载体。
在一个方面，本发明提供了编码人MBL的表达构建体，其特点是包含人MBL基因包括其功能衍生序列的一个或多个内含子序列。另外，它包括选自病毒基因或真核(包括哺乳动物和昆虫)基因的启动子区。
优选启动子区与人MBL启动子不相同，并且为了使MBL产量和MBL寡聚体的大小分布最佳，优选所述启动子在所用的载体和宿主细胞中发挥最佳功能。
在优选的实施方案中，启动子区选自劳氏(Rous)肉瘤病毒长末端重复序列的启动子，巨细胞病毒即早期启动子和延伸因子1α启动子。
在另一个实施方案中，启动子区选自其它病毒、酵母和细菌等微生物的基因。
为了获得更高产量的重组MBL，启动子区可以包括增强子元件，例如小鼠血管内皮生长因子基因5′末端非翻译区的QBI SP163元件。用该构建体转化宿主细胞，获得能够表达MBL的宿主细胞培养物。宿主细胞培养优选真核细胞宿主细胞培养。在本文中真核细胞的转化是指将重组DNA引入所述细胞。在该方法中使用的表达构建体的特点使具有选自哺乳动物基因的MBL编码区，所述哺乳动物基因包括人的基因和与其非常相似的基因，例如黑猩猩的基因。所应用的表达构建体的进一步特点是启动子区选自病毒和真核(包括哺乳动物细胞和昆虫细胞)基因。
根据本发明制备重组MBL的方法的特点是，宿主细胞培养优选真核细胞培养，例如哺乳动物细胞培养。优选的宿主细胞培养物是人肾细胞，更优选的宿主细胞培养物是人胚肾细胞(HEK细胞)。本发明的特点是利用HEK293细胞系制备重组人MBL。“HEK 293细胞系“是指来自人胚肾组织的任何细胞系，例如(但不限于)在美国典型培养物保藏中心(the American TypeCulture Collection)登记号委CRL-1573和CRL-10852的细胞系。
其它细胞包括鸡胚成纤维细胞、仓鼠卵巢细胞、仓鼠幼鼠肾细胞、人宫颈癌细胞、人黑色素瘤细胞、人肾细胞、人脐带血管内皮细胞、人脑内皮细胞、人口腔肿瘤细胞、猴肾细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠肾细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠少突细胞、小鼠巨噬细胞、小鼠成纤维细胞、小鼠神经母细胞瘤细胞、小鼠前B细胞、小鼠B淋巴细胞、小鼠浆细胞瘤细胞、小鼠畸胎瘤细胞、大鼠星形细胞瘤细胞、大鼠乳腺上皮细胞、COS、CHO、BHK，、293、VERO、HeLa、MDCK、W138和NIH 3T3细胞。
另外，可以选择可调节插入序列的表达或者以所需的特殊方式修饰或加工基因产物的宿主细胞。蛋白产物的这种修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白的功能可能是重要的。不同宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白和基因产物翻译后加工和修饰机制。可以选择适当的宿主细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以应用具有对初级转录本进行正确加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。上述哺乳动物细胞类型属于那些可作为适当宿主细胞的细胞。
所述宿主细胞可以在任何适当的培养基中培养，例如添加胰岛素、转铁蛋白、硒和胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基。
纯化如前述，本发明可快速生产MBL。MBL的生产可用下述步骤进行发酵-培养表达MBL的细胞分离-进行沉淀然后分离沉淀和上清任选的纯化因此，可以通过任何适当的方式纯化所述重组MBL组合物，例如任何物理化学分离方法，包括但不限于过滤法和层析法，如以大小为基础的离子交换层析、凝胶渗透层析或亲和层析等。
优选用亲和层析的方法从分离部分中纯化重组MBL组合物，例如用甘露糖亲和层析。
功能性根据本发明获得的重组MBL组合物的功能性优选与血浆或血清MBL的功能性相似。在本文中，MBL功能性是指如上文关于功能等效体所述的激活补体系统的能力。可以用MBL的比活性，例如每ng MBL的MBL的活性单位，表示所述功能性。用比活性表示重组MBL组合物的功能性时，优选其功能性至少为从血清中纯化之MBL的比活性的25％，例如至少为从血清纯化之MBL的比活性的50％，更优选其至少为从血清纯化之MBL的比活性的75％。
MBL的功能活性通过其形成可激活补体系统的MBL/MASP复合物的能力可以得到判断。当C4被MBL/MASP切割时，活性硫醇酯被暴露并且C4与附近的亲核基团共价结合。因而相当量的C4b将与包被的塑料孔结合，并且可以用抗C4抗体进行检测。
针对MBL功能活性的定量TRIFMA由下述步骤组成1)用溶于100ml缓冲液的1mg甘露聚糖包被为微滴定孔；2)用Tween-20封闭；3)加入待测样品，例如稀释的MBL制剂；4)加入MBL缺陷型血清(这导致MBL/MASP复合物的形成)；或者可以在加入到微滴定孔之前将MBL和MBL缺陷型血清混合；5)加入5mg/ml纯化的补体因子C4；6)37℃温育1小时；7)加入Eu标记的抗C4抗体；8)加入增强溶液；和9)通过时间分辨型荧光测定法(timeresolved fluorometry)读取Eu。除了步骤8和步骤9之间以外，在每个步骤之间将平板在室温下温育并洗涤。
可以类似地用ELISA进行评估，例如在步骤7中加入生物素标记的抗C4；8)加入碱性磷酸酶标记的亲和素；9)加入底物；和10)读取颜色强度。利用一种选定的正常血清的各种稀释液。可以构建标准曲线。本发明使用了下述血清血浆库(pool)LJ 6.5728/04/97。可以用MBL比活性，例如每ng MBL的MBL活性单位，表示功能。
用于测定MBL功能等价体的另一种试验是测定与细胞上一和多种受体结合的能力。
用细胞荧光测定法，可以检测MBL与细胞上一个和多种受体的相互作用。1)将浓度50μg/ml的MBL与2×105个细胞共温育。在含有1％FCS和0.1％叠氮钠的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行结合。2)为了检测细胞结合型MBL，加入生物素化抗MBL抗体；3)随后加入链霉素亲和素-FITC和4)用荧光测定法检测混合物。
药用组合物获得的组合物可以用来制备药用组合物，或在使用之前可以对该组合物进行进一步的纯化步骤。
根据本发明获得的MBL组合物可以用于制备药用组合物，其用来预防和/或治疗各种疾病或病情。
除了MBL寡聚体，该药用组合物可以包括可药用的载体物质和/或赋形剂。
尤其可以加入稳定剂来稳定MBL蛋白质。稳定剂可以是糖醇、糖、蛋白和/或氨基酸。例如稳定剂可以是白蛋白或麦芽糖。
例如，根据给药类型，可以向药用组合物中加入其它传统的添加剂。
在一个实施方案中，该药用组合物为适合于注射的剂型。可以使用等渗盐水等传统载体物质。
在另一个实施方案中，该药用组合物为适合于经肺给药(pulmonaladministration)的途径，例如用于吸入给药的粉末状制剂，或者是适合于局部应用的霜剂(creme)或洗剂(lotion)。
所述的治疗不必是对已诊断的目前需要或可能需要治疗的疾病、障碍或病情进行治疗，而可以用来预防疾病或病情的发生。
在本文中治疗可以包括对例如人的免疫系统和生殖系统或具有与其相应功能单位的动物的相应系统的疾病进行治疗和/或预防。所治疗的病情不一定是指目前已知的需要治疗的状态，而是通常包括任何与当前需要和/或预期需要相关的状态或与正常状态的改善相关的状态。该治疗尤其是对MBL缺陷状态的治疗。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗药物的制备方法，该药物由所述MBL(包括rMBL片段或其类似物)的药物组合物组成，所述治疗包括对人的如免疫系统和生殖系统疾病或障碍或具有与其相应功能单位的动物的相应系统疾病记进行的治疗和/或预防。
需要用本发明化合物治疗的所述疾病、障碍和/或病情包括例如治疗MBL缺陷状态和与免疫抑制化疗相关的癌症和感染，尤其包括与癌症治疗期间的状态相关或与生物植入和/或移植相关的感染。本发明还包括治疗与习惯性流产相关的病情。
因而，该药用组合物尤其可以用于治疗和/或预防选自下组的临床病情感染，MBL缺陷、癌症、感染等化疗相关疾病、人免疫缺陷病毒(HIV)相关疾病、先天性或获得性免疫缺陷相关疾病等。更具体而言，包括慢性炎症性脱髓鞘性多发神经炎(C IDP)、多灶性运动神经障碍、多发性硬化症、重症肌无力、Eaton-Lambert′s综合征、视神经炎、癫痫；原发性抗磷脂综合征；类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、脉管炎、Wegner′s肉芽肿病、Sjgren′s综合征、幼稚类风湿性关节炎；自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、中性粒细胞减少症；Crohn′s病、溃疡性结肠炎、腹腔疾病；哮喘、败血性休克综合征、慢性疲劳综合征、牛皮癣、中毒性休克、糖尿病、鼻窦炎、扩张性心肌炎、心内膜炎、动脉粥样硬化。包括常见的可变性免疫缺陷的原发性低/无丙种免疫球蛋白血症、Wiskot-Aldrich综合征和重症联合免疫缺陷(SCID)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性骨髓瘤患者的次低级/无丙种免疫球蛋白血症、急性和慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)、异源骨髓移植(BTM)、Kawasaki′s病和Guillan-Barre′s综合征。
给药途径可以是任何适当的途径，例如静脉内。肌内、皮下和皮内给药。本发明还考虑了经肺或局部给药。
MBL组合物给药尤其可以用来预防和/或治疗具有与先天性或获得性MBL缺陷相关的临床症状的患者或者有出现所述症状的危险的患者的感染。在MBL缺陷个体中有各种病情可以导致增加感染的易感性，例如化疗或其它细胞毒性治疗、癌症、AIDS、遗传倾向、慢性感染和中性粒细胞减少症。
由于化疗药物治疗对免疫系统细胞的副作用，经化疗的癌症患者大都对感染易感，这是用MBL治疗这种病情的基础。观察到的低MBL血浆浓度(低于500ng/mL)是对临床显著感染的易感性增加的指征，而且通过给药重组或天然血浆来源的MBL，可以增强这些患者的免疫防御。
因而在化疗等开始之前和化疗的至少部分阶段，可以给药该药用组合物一段时间。
在化疗之前，可以将该MBL组合物作为普通的”激发剂(booster)”，或者它可以给那些仅仅有发展成MBL缺陷的危险的患者施用。可以通过在治疗前检测MBL水平确定有此危险的患者，并且只对那些MBL水平低于预定水平的患者进行治疗。对于大部分人群，确定低MBL水平的界限是低于500ng/ml。可以通过实施例9、ELISA、RIA或比浊法测定MBL水平MBL给药的另一个指征是当MBL水平低于正常水平的50％，例如低于300ng/ml、或低于200ng/ml。
该MBL组合物以适当的剂量方案给药，尤其通常以适当的间隔给药，例如化疗期间一周一次或两次。
正常情况下每剂量给药1-100mg，例如2-10mg，大部分是每剂量5-10mg。大部分情况下给药约0.1mg/kg体重。
因而本发明的一个方面涉及用MBL(包括rMBL、其片段或类似物)治疗癌症和例如免疫系统或生殖系统的疾病和障碍，该治疗包括创建、重建、增加和/或刺激补体系统的调理和/或杀细菌活性，即增加免疫防御能力来识别并杀伤微生物病原体。
而且，本发明的一个方面是应用根据本发明的重组组合物，该组合物是还包括另一种药物的试剂盒组件。所述另一种药物尤其可以是抗微生物药物，例如抗生素。
关于流产，已经报道在不明原因的习惯性流产患者中MBL低血浆水平的频率增加，这是在这些病例中通过给药重组MBL以重建MBL水平而降低流产易感性的基础。
至于本发明化合物的本性，在多个方面表明本发明涉及能够作为调理素的化合物，也就是通过该化合物和巨噬细胞之间直接相互作用或者通过介导补体沉积于靶体表面，可以提高巨噬细胞的吞噬功能。关于此点的具体实例是MBL、其片段或类似物。本发明是以公开重组人MBL的合成为基础，该MBL比过去获得的MBL更接近于天然人MBL的结构。
具体实施例方式
现在已经在各个方面并足够详细的解释和说明了本发明，但是在下面用图1-4以及优选实施方案的非限定性实施例又举例说明了本发明。
实施例1从旋转瓶培养中分离MBL包含MBL的细胞培养基取自持续200m旋转瓶培养按WO 00/70043中实施例1中的描述所制备的能产出MBL的HEK293细胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)，维生素C(ICN Biomedicals)和CytoPorel微载体(AP Biotech)的HyQ PF293培养基(HyClone)中培养。
重复取出160-175mL细胞培养基，在微孔过滤去除细胞后，对无细胞的培养基进行沉淀处理。
在pH7-8无细胞培养基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+浓度之后，得到白色重沉淀。
该沉淀可在pH3.25的含EDTA的溶液中重悬。
透析后，溶解的MBL可用MBL试验(基于甘露聚糖结合和HYB131-01识别的TRIFMA)和SDS-PAGE(使用HYB131-01的Westerns)进行分析。
对重悬沉淀的MBL特异性免疫测定显示出全部MBL的绝大多量可从沉淀中回收。而且，从沉淀中回收的MBL主要为大于约200kDa的寡聚体(图1)。
该同一试验还显示出一些MBL出现在相应上清中。而且，从上清中回收的MBL主要为小于约200kDa的寡聚体，如SDS-PAGE所示(图2)。
实施例2从培养罐中分离MBL包含MBL的细胞培养基取自持续5L罐培养按实施例1中描述所制备的能产出MBL的HEK293细胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)，维生素C(ICN Biomedicals)和HySoy(HyClone)的HyQPF293培养基(HyClone)中培养。
重复取出200mL细胞培养基，在离心去除细胞后，对无细胞的培养基进行沉淀处理。
为利于随后的沉淀，可加入磷酸钠以得到大约200mM的磷酸盐浓度。在富磷酸盐的无细胞培养基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+浓度之后，得到白色重沉淀。(参见图3)。
该沉淀可在pH3.2的含有柠檬酸盐的溶液中重悬。
实施例3从SFMII培养基中分离MBL包含MBL的细胞培养基取自持续5L罐培养按实施例1中描述所制备的能产出MBL的HEK293细胞系在含有G418(CalBiochem)，glutamax(Gibco)和维生素C(ICN Biomedicals)的293 SFMII培养基(Gibco)中培养。培养按照规律沉降和更换培养基的取充程序(draw-fill processs)进行。微载体(Microcarriers)(Cytopore 1，AP Biotech)用于支持。
重复取出2L细胞培养基，在离心去除细胞后，对无细胞的培养基进行沉淀处理。
为利于随后的沉淀，可加入磷酸钠以得到大约50mM的磷酸盐浓度。在富磷酸盐的无细胞培养基中加入CaCl2以得到0.1M的Ca2+浓度之后，得到白色重沉淀。
该沉淀可在pH3.0的含有柠檬酸盐的溶液中重悬。
实施例4从非培养基中分离MBL在含MBL的溶液(1.0mg/L)中加入磷酸钠缓冲液(pH7.4)以得到100mM的磷酸盐浓度。随后，加入氯化钙以得到100mM的钙浓度。所形成的沉淀包含大部分MBL(＞90％)，如MBL试验(基于甘露聚糖结合和HYB131-01识别的TRIFMA)和SDS-PAGE(使用HYB131-01的Westerns)所示。
实施例5MBL的产量甘露聚糖结合型MBL的产量可用MBL试验(基于甘露糖结合和HYB131-01识别的TRIFMA)。在两个随后的实验中，与起始物质相关的获自实施例1的重悬沉淀中的MBL的含量分别被测定为72％和68％。
实施例6比率R的计算以下三种样品，使用本发明前的重组来源的MBL，使用本发明后的重组来源的MBL(上清)和使用本发明后的重组来源的MBL(沉淀)用于计算R值。
进行SDS-PAGE免疫印迹(图.2)，使用MAB131-01(Statens SerumInstitute)，结合辣根过氧化物酶的兔抗小鼠抗体(P0260，Dako)和SuperSignal West Pico substrate(Pierce)，然后扫描为无压缩TIFF文件。样品条带的像素密度采用Scion Image for Windows 4.0测量，并输出至Microsoft Excel。
与200kDa相应的迁移可用标记(Precision Protein Standards，BioRad)的迁移进行确定。计算全部高于200kDa的像素信号，同样计算低于200kDa标记物的全部像素信号。每一样品中这些数据间的比率即为R-值。
在使用本发明前的重组来源的MBL的R值估测为R＝6。本发明的重组来源的MBL的上清的R-值估测为R＝0，而本发明的重组来源的的MBL的沉淀的R-值估测为R＞＞1000。
实施例7比率R的计算重组来源的MBL的R值可用BioAnalyzer系统(Agilent)及蛋白质200增强芯片检测系统(Protein 200 Plus chip detection system)(Agilent))进行测定。
样品走胶严格按照供应商的描述(除在走胶前用水稀释凝胶(1份水对2份凝胶)外)，且不在样品中加入还原剂。这样就能在凝胶上看到高分子量形式的MBL。
与200kDa相应的迁移可用较高标记(分子量为210kDa的肌球蛋白，供应商提供的内部标准)的迁移进行确定。高于200kDa的全部像素信号用整合程序进行整合，同样整合低于200kDa标记物全部像素信号。每一样品中这些数据间的比率即为R-值。
两个选定的重组来源的MBL样品的R值的计算显示于图4中。一个样品的R-值为R＝19，而另一样品的R-值为R＝0.2。
权利要求
1.一种增加包含多种凝集素分子的组合物比率R的方法，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含低分子量凝集素和高分子量凝集素，所述制剂的比率R＝R0，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出所述沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选地重悬所述沉淀部分，获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
2.一种生产包含多种凝集素分子的组合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有高于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清，从所述上清中分离出所述沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选地重悬所述沉淀部分，获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
3.一种从包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的凝集素制剂中，分离包含多种凝集素分子的组合物的方法，其中基本上所有凝集素分子全部具有高于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，所述方法包括，获得所述凝集素制剂，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清，从所述上清中分离出所述沉淀，获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，任选地获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选地重悬所述沉淀部分，获得含有沉淀部分凝集素分子的组合物。
4.一种生产包含多种凝集素分子的组合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部具有低于或等于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子，所述制剂的比率R＝R0，其中R为分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度与分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子的浓度的比率，在所述制剂中加入沉淀剂，使之产生沉淀和上清从所述上清中分离出所述沉淀，获得上清部分，其比率R＝R2，其中R2＜R0，任选地获得沉淀部分，其比率R＝R1，其中R1＞R0，获得含有上清部分凝集素分子的组合物。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中凝集素为甘露糖结合型凝集素(MBL)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物中至少50摩尔％的MBL具有高于200kDa的分子量，如高于225kDa，如高于250kDa，如高于300kDa。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述MBL包含具有如下级别分子量的MBL分子，级别I的分子量范围为200kDa至270kDa，级别II的分子量范围为270kDa至300kDa，级别III的分子量范围为300kDa至400kDa，和级别IV的分子量范围为400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE测定，其中级别I的MBL占组合物中MBL总量的0-20摩尔％。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物包含至少三个分子量级别的MBL分子，其中级别I的MBL占组合物中MBL总量的0-20摩尔％。
9.根据权利要求5所述的方法，其中在获得包含高分子量MBL的所述组合物之前重悬所述沉淀。
10.根据权利要求5所述的方法，其中低分子量MBL包含分子量低于200kDa的MBL。
11.根据权利要求5所述的方法，其中沉淀剂选自低分子量沉淀剂。
12.根据权利要求5所述的方法，其中沉淀剂选自阳离子沉淀剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中沉淀剂选自，CaCl2，氯化钙(CaCl2，CaCl2·H2O，CaCl2·2H2O，CaCl2·6H2O)，硝酸钙(Ca(NO3)2，Ca(NO3)2·3H2O，Ca(NO3)2·4H2O)，亚硝酸钙(Ca(NO2)2·H2O，Ca(NO2)2·4H2O)，碘化钙(CaI2，CaI2·6H2O)，溴化钙(CaBr2，CaBr2·6H2O)，溴酸盐(Ca(BrO3)2·H2O)，氯酸钙(Ca(ClO3)2，Ca(ClO3)2·2H2O，(Ca(ClO4)2)，铬酸钙(CaCrO4·2H2O)，高锰酸钙(Ca(MnO4)2·5H2O)，次磷酸钙(Ca(H2PO2)2)，钙铁氰化物(Ca3[Fe(CN)6]2·12H2O，Ca2Fe(CN)6·12H2O)，硫代硫酸钙(CaS2O3·6H2O)，以及如低溶解含钙剂，如甲酸钙(Ca(CHO2)2)，乙酸钙(Ca(C2H3O2)2，Ca(C2H3O2)2·H2O，Ca(C2H3O2)2·2H2O)，丙酸钙(Ca(C3H5O2)2·H2O)，乳酸钙(Ca(C3H5O3)2·5H2O)，马来酸钙(CaC4H2O4·H2O)，戊酸钙(Ca(C5H9O2)2)，和枸橼酸钙(Ca3(C6H5O7)2·4H2O)。
14.根据权利要求5所述的方法，其中沉淀剂选自阴离子沉淀剂。
15.根据权利要求5所述的方法，其中沉淀剂选自磷酸盐、碳酸盐和硫酸盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶剂包含阴离子，如选自硫酸盐(SO42-)，磷酸盐(PO43-)和乙酸盐(CH2COO-)。
17.根据权利要求5所述的方法，其中分离通过对制剂进行离心来实施。
18.根据权利要求5所述的方法，其中MBL制剂为重组MBL制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中MBL制剂获自如下步骤-制备编码人MBL肽或其功能等效体的基因表达构建体，-将构建体转化宿主细胞培养物，-在培养基中培养宿主细胞，从而使所述多肽表达并将其分泌到培养基中，-获得包含多种MBL分子的制剂。
20.根据权利要求5所述的方法，其中制剂包含溶剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述溶剂为培养基。
22.根据权利要求18所述的方法，其中基因表达构建体包含至少一个来自人MBL基因或其功能等效体的内含子序列。
23.根据权利要求22所述的方法，其中基因表达构建体包含至少两个来自人MBL基因或其功能等效体的外显子序列。
24.根据权利要求18所述的方法，其中基因表达构建体包含编码MBL亚基或其功能等效体的cDNA序列。
25.根据权利要求18所述的方法，其中宿主细胞培养物为体外培养。
26.根据权利要求18所述的方法，其中宿主细胞培养物为真核宿主细胞培养物。
27.根据权利要求18所述的方法，其中宿主细胞培养物为哺乳动物宿主细胞培养物。
28.根据通过权利要求2所述的方法获得的组合物，所述组合物包含高分子量MBL和低分子量MBL，其中所述组合物包含低于5摩尔％的低分子量MBL，所述低分子量MBL的分子量低于200kDa。
29.具有至少两个分子量级别的MBL分子的重组人类MBL组合物，所述级别选自级别I的分子量范围为200kDa至270kDa，级别II的分子量范围为270kDa至300kDa，级别III的分子量范围为300kDa至400kDa，和级别IV的分子量范围为400kDa至600kDa，所述分子量用SDS-PAGE测定，其中级别I的MBL占组合物中MBL总量的0-20摩尔％。
30.根据权利要求29所述的组合物，所述组合物包含至少三个分子量级别的MBL分子，其中级别I的MBL占组合物中MBL总量的0-20摩尔％。
31.根据权利要求29所述的组合物，所述组合物包含四个分子量级别的MBL分子。
32.根据权利要求29所述的组合物，其中基本上不含在任何当在天然宿主生物中产生时与MBL天然相关联的杂质。
33.根据权利要求29-32任一项所述的组合物，其中分子量通过SDS-PAGE和/或Western杂交测定。
34.根据权利要求29-33任一项所述的组合物，其处于非变性状态。
35.根据权利要求29-33任一项所述的组合物，其处于变性状态。
36.根据权利要求29所述的组合物，其中MBL亚基由三个相同肽序列构成。
37.包含权利要求29-36任一项所述的人类重组MBL组合物的药用组合物，任选地更进一步包含药物可接受载体物质。
38.根据权利要求37所述的组合物，其为注射适用剂型。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中载体物质为盐水、人血清白蛋白或甘露糖。
40.根据权利要求37所述的组合物，其为适用经肺施用的剂型。
41.根据权利要求40所述的组合物，其为吸入粉剂。
42.根据权利要求40所述的组合物，其为局部施用的霜剂或洗剂。
43.根据权利要求29-36所述的人类重组MBL组合物制备药用组合物的用途。
44.根据权利要求43所述的组合物，以制备用于治疗个体的临床症状的药用组合物的用途，所述临床症状选自感染、MBL缺陷状态、癌症、化疗相关症状、流产、嗜中性白血球减少症相关症状和人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
45.根据权利要求44所述的用途，其中药用组合物的施用途径为静脉内、肌内、皮下或皮内。
46.根据权利要求44所述的用途，其中药用组合物为经肺的施用途径。
47.根据权利要求44所述的用途，其中药用组合物的施用途径为局部使用。
48.根据权利要求44所述的用途，其中药用组合物的施用途径为在化疗起始或其它细胞毒性治疗前的预防性使用。
49.根据权利要求44所述的用途，其中MBL组合物的施用量为1-100mg/剂。
全文摘要
本发明涉及制备高分子量凝集素组合物的方法，特别包括甘露糖结合型凝集素(MBL)，适于使用重组制备的凝集素作为起始物，高分子量凝集素组合物，及包含其的药用组合物，以及所制备的组合物在制备治疗多种病情和疾病的药用组合物中的用途。本发明一方面提供了一种制备含有多种凝集素分子的组合物的方法，其中所述凝集素分子基本上全部都具有高于二聚体凝集素分子量的高分子量，所述方法包括，获得凝集素制剂，该制剂包含分子量高于二聚体凝集素分子量的凝集素分子和分子量低于或等于二聚体凝集素分子量的凝集素分子，所述制剂的比率R＝R
文档编号A61P37/04GK1549823SQ02817175
公开日2004年11月24日 申请日期2002年7月23日 优先权日2001年7月23日
发明者芬恩·马西森, 芬恩 马西森 申请人:纳蒂芒公司