专利名称：人组织因子抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离的可与组织因子(TF)发生免疫反应、从而抑制凝血因子VIIa(FVIIa)结合的人抗体，由此涉及使用针对TF的人抗体来抑制与手术、显微手术、血管成形术或创伤相关的血栓形成或者抑制与如深部静脉血栓形成、弥散性血管内凝血(DIC)、冠状动脉疾病、脓毒症、炎症、动脉粥样硬化或癌症这样的疾病相关的异常止血状况中的血栓形成和其它TF功能的免疫疗法。本发明还公开了抗体的制备方法以及用于制备人单克隆抗体(Mabs)的细胞系。
背景技术：
血液凝固是由不同血液成分或因子之间的复杂相互作用组成的过程，该过程最终产生血纤蛋白块。一般来说，参与所谓凝固″级联″的血液成分是前酶或酶原，它们是无酶促活性的蛋白质，通过本身为活化凝血因子的激活物的作用而转化成蛋白水解酶。进行这类转化的凝血因子一般称作″活性因子″，通过添加小写的下标″a″来命名(例如因子VIIa)。
活化因子X(″Xa″)是将凝血酶原转化成凝血酶所需要的，然后该酶将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，这是形成血纤蛋白块的最终阶段。存在两种促进因子X活化的系统或途径。″内在途径″指的是通过利用仅存在于血浆中的因子使凝血酶形成的那些反应。一系列蛋白酶介导的活化最终产生因子IXa，该因子与因子VIIIa一起将因子X裂解成Xa。在血液凝固的″外在途径″中，相同的蛋白水解通过FVIIa及其辅因子TF进行。TF是膜结合蛋白，一般不以活性形式在血浆中循环。然而，在血管破裂时，TF可以与FVIIa复合，以便在有Ca2+和磷脂存在的情况下催化因子X活化或因子IX活化。尽管止血中这两种凝固途径的相对重要性尚不清楚，但是已经发现因子VII和TF在血液凝固的开始阶段中起关键作用。
选择性阻断患者体内的凝血级联通常是必不可少的。例如，可以在肾透析过程中使用诸如肝素、香豆素、香豆素衍生物、茚满二酮衍生物这样的抗凝剂或其它活性剂，或将它们用于治疗深部静脉血栓形成、弥散性血管内凝血(DIC)和宿主的其它医学疾病。例如，可以将肝素疗法或体外使用柠檬酸根离子的疗法用于透析中，以便预防治疗过程中出现的凝血。肝素也用于预防进行手术的患者体内的深部静脉血栓形成。
然而，使用肝素和其它抗凝剂的疗法存在不需要的副作用。可供利用的抗凝剂一般在全身起作用，而非特异地作用于损伤部位。例如，肝素可以导致重度出血。此外，由于半衰期为约80分钟，肝素会从血液中快速清除，因此必需频繁给药。因为肝素作为抗凝血酶III(ATIII)的辅因子起作用，且ATIII在DIC疗法中快速耗尽，所以通常难以维持合适的肝素剂量，从而必需连续监测ATIII和肝素水平。如果ATIII极度耗尽，那么肝素就会无效。此外，长期使用肝素还可能增加血小板聚集并减少血小板计数，已发现与肝素诱发的血小板减少症的发展有关。茚满二酮衍生物也可能存在毒副作用。除上面简述的抗凝剂外，已经发现几种天然出现的蛋白质具有抗凝活性。此外，已经推荐将ATIII作为治疗用抗凝剂。
国际申请WO92/15686涉及用于抑制血液凝固的失活因子VIIa。
抗体是由脊椎动物免疫系统作为对异种蛋白、糖蛋白、细胞或其它外部抗原物质攻击的反应而产生的特异性免疫球蛋白(Ig)多肽类。使生物体克服外部细胞侵害或清除异物系统的事件顺序至少部分得到理解。这一过程的重要组成部分是产生可与特定异物特异性结合的抗体。这类多肽与特定抗原的结合特异性是高度精确的，且能够由脊椎动物个体产生的众多特异性在复杂度和变异性方面都是显著的。数以百万计的抗原能够引起抗体反应，每一抗体几乎仅针对产生它的特定抗原。
目前利用两种主要来源的脊椎动物抗体，它们由哺乳动物B淋巴细胞在原位产生和由B-细胞杂合体在细胞培养物中产生。抗体的原位产生是幼B淋巴细胞分化成浆细胞的结果，该过程是对特定抗原刺激的反应。在未分化的B细胞中，编码免疫球蛋白链上的不同区的DNA部分在基因组DNA中得到分离。这些序列在表达前依次得到装配。所得的重排基因能够在成熟B淋巴细胞中表达，产生所需抗体。然而，即使在特定哺乳动物仅接触单一抗原时，也不产生均一的抗体群。对任何特定抗原的原位免疫反应由对存在于该抗原上的不同决定簇的反应多样性决定。每一同源抗体亚型由单一B细胞群所产生，因此在原位产生的抗体为″多克隆″。
在许多特定情况下，通过利用由B细胞杂交瘤在细胞培养物中产生″单克隆″抗体的杂交瘤技术已经克服了这种有限但却是固有的不均匀性。
在该过程中，使来自已经注射了抗原的哺乳动物的相对短寿命的或非无限增殖的脾细胞或淋巴细胞与无限增殖肿瘤细胞系融合，由此产生既为无限增殖又能够产生遗传编码的B细胞抗体的杂交细胞或″杂交瘤″。通过筛选、稀释和再生长，使由此形成的杂合体分离成单一遗传品系，每一品系代表单一遗传系。因此，它们产生对所需抗原而言确为均一性的抗体。按照其纯遗传家系将这些抗体称作″单克隆″。
具有单特异性的单克隆抗体对免疫学产生了显著影响，而它们的应用已经在诸如生物学、药理学、生物化学和其它学科这类科学中得到证实。已经发现这类单克隆抗体不仅可以广泛用作诊断试剂，而且可以用于治疗(例如，参见Ritz和Schlossman，《血液》(Blood)，591-11，(1982))。
尽管由杂交瘤产生的单克隆抗体如上所述在理论上有效且因其特异性而显然优于多克隆抗体，但是它们存在显著的缺陷。在许多应用中，在将单克隆抗体用于人时，非人动物产生的单克隆抗体的应用受到严重限制。给人反复注射″异种″抗体、诸如小鼠抗体，可以导致有害的过敏反应。当给人注射这类非人来源的单克隆抗体时，它们会产生抗-非人抗体反应。
已知抗TF的小鼠Mabs的治疗应用在美国专利US6,001,978和US5,223,427中有记载。
国际申请WO99/51743涉及针对人TF的人/小鼠嵌合单克隆抗体。
欧洲专利申请EP833911涉及抗人TF的CDR接枝抗体。
Presta L.等在《血栓形成与止血》(Thrombosis and Haemostasis)，第85卷(3)pp.379-389(2001)中描述了抗TF的人源化抗体。
对具有抗凝活性的、可以相对低剂量给药、且不会产生与传统抗凝剂组合物相关的不需要副作用的改进组合物仍然存在需求。本发明通过提供不具有与携带非人序列的传统抗体相关的副作用的抗凝剂而满足了这一需求，它们特异地在损伤部位起作用，且进一步提供了其它相关优点。此外，本发明提供了能够抑制与如脓毒症、炎症、动脉粥样硬化、再狭窄或癌症这样的疾病相关的TF细胞功能的化合物。
本发明的描述本发明涉及抗人TF的非免疫原性的高亲和性人抗体，它们可抑制凝血因子VII/VIIa结合，本发明还涉及治疗上有效的抗人TF的人抗体的筛选方法。
本发明在第一个方面中涉及与存在于人TF上的表位发生免疫反应的分离的人抗体。
本文所用的术语″人组织因子″或″人TF″指的是含有天然人组织因子的第1-263位所示氨基酸序列的全长多肽受体。
本文所用的术语″抗体″用以指能够与抗原(例如人TF)特异性结合的免疫球蛋白分子及其片段。全长抗体含有4条多肽链，即通过二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链。每一重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以将VH和VL区进一步细分成称作构架区(FR)的更为保守的区以及间插在其中的称作互补性决定区(CDR)的高变区。每一VH和VL由按照下列顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。因此，在抗体的定义范围内还包括保持与抗原(例如人TF)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经证实全长抗体的片段可以实施抗体的抗原结合功能。术语″抗体″中包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2和F(ab′)2片段，即含有通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂中的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)《自然》(Nature)341544-546)；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头连接它们，所述的合成接头可以使它们制成VL和VH区配对形成单价分子的单一蛋白链(称作单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等(1988)《科学》(Science)242423-426；和Huston等(1988)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855879-5883)。这类单链抗体也包括在术语″抗体″范围内。还包括其它形式的单链抗体，诸如双特异性抗体(diabodies)。双特异性抗体是二价的双特异性抗体，其中在单一多肽链上表达VH和VL结构域，但使用的接头过短而不能使同一链上的两个结构域配对，由此促使这些结构域与另一条链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(例如，参见Hol-liger，P.等(1993)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)906444-6448；POIJAK，R.J.等(1994)《结构》(Structure)21121-1123)。可以理解的是人TF可以带有一个或多个抗原决定簇，包括(1)由人TF内的单肽链组成的肽抗原决定簇；(2)由空间邻接的一个以上肽链组成的构象抗原决定簇，所述的空间邻接肽链的相应氨基酸序列在人TF多肽序列并非连续分布；和(3)整体或部分由翻译后与人TF共价连接的分子结构、诸如碳水化合物基团等组成的翻译后抗原决定簇。
本文所用的术语″人抗体″和″人TF抗体″用以包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在CDRs、特别是CDR3内。不过，本文所用的术语″人抗体″并不包括已经将来源于诸如小鼠这样的另一哺乳动物种系的CDR序列嫁接在人构架序列上的抗体，例如所谓的人源化抗体或人/小鼠嵌合抗体。
本文所用的″分离的人抗体″用以指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的人抗体(例如特异性结合人TF的分离的抗体基本上不含特异性结合非人TF的抗原的抗体)。然而，特异性结合人TF的分离的抗体与其它抗原、诸如来自其它种类的TF分子可具有交叉反应性(进一步在下面具体讨论)。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
本文所用的术语″表位″指的是抗原上抗体与之结合的任意抗原决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子基团组、诸如氨基酸或糖侧链组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
本文所用的术语″免疫反应″指的是抗体与其表位结合的解离常数Kd低于10-4M。如果合适，术语″免疫反应″与术语″特异性结合″可以互换使用。
本文所用的术语″抑制″指的是与参比物相比的任何降低。作为实例，抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的抗体指的是与没有该抗体存在情况下人凝血因子VIIa结合人TF的能力相比可降低人凝血因子VIIa与人TF结合能力的任意抗体。
本文所用的术语″亲和性″指的是抗体与表位的结合强度。抗体的亲和性由定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]的解离常数Kd确定，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka由1/Kd确定。通过竞争性抑制测定Mabs特异性和亲和性的优选方法可以在下列文献中找到Harlow等《抗体实验室指南》(AntibodiesA Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Colligan等编辑《最新免疫学方案》(Current Protocols in Immuology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley Iinterscience，N.Y.，(1992，1993)；和Muller《酶学方法》(Meth.Enzymol.)]92589-601(1983)，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。
本发明在第二个方面中涉及药物组合物，其中包括治疗有效量的与存在于人TF上的表位发生免疫反应的人抗体。
术语″治疗有效量″是可以用滴定法测量获得所需反应的剂量的有资格医师所确定的有效剂量。针对剂量所考虑的因素包括功效、生物利用度、所需的药动学/药效学分布、治疗的疾病(例如创伤、炎症、脓毒性休克)、与患者相关的因素(例如体重、健康情况、年龄等)、存在的共同给予的药物、给药时间或医师所知的其它因素。对患者给予的抗TF人抗体的剂量随所治疗疾病的类型和严重程度的不同而改变，不过一般在0.1-5.0mg/kg体重的范围。
本文所用的术语″受试者″用以指任意动物、特别是哺乳动物、诸如人，如果合适，可以与术语″患者″互换使用。
本发明在第三个方面中涉及包括与存在于人TF上的表位发生免疫反应的人抗体的组合物。
本发明在另一个方面中涉及与FVIIa/TF相关的人疾病的治疗方法，该方法包括对该人给予治疗有效量的、可与存在于人TF上的表位发生免疫反应的人抗体的步骤。
″治疗″指的是给予有效量的本发明治疗活性化合物以预防任何症状或疾病情况发生或者治愈或减轻已经发生的这类症状或疾病情况。因此术语″治疗″意味着包括预防性治疗。
本文所用的术语″FVIIa/TF相关疾病″指的是涉及TF和FVIIa的疾病或疾患。包括与血栓形成或凝血紊乱相关的疾病或疾患，包括炎症反应和与血纤蛋白形成相关的慢性血栓栓塞性疾病或疾患，包括血管疾病，诸如深部静脉血栓形成、动脉血栓形成、术后血栓形成、冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)、中风、肿瘤生长、肿瘤转移、血管发生、血栓溶解、动脉粥样硬化和血管成形术后的再狭窄；急性和慢性适应征，诸如炎症、脓毒性休克、败血症、低血压、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、弥散性血管内凝血(DIC)、肺栓塞、血小板沉积、心肌梗死；或预防性治疗具有处于血栓形成危险中的动脉粥样硬化性血管的哺乳动物；以及其它疾病或疾患。FVIIa/TF相关疾病并不限于诸如上述提及的那些体内凝血紊乱性疾病，而且包括离体FVIIa/TF相关过程，诸如可能因体外血液循环导致的凝血，所述的体外血液循环包括在诸如透析过程、血液过滤或手术过程中的血液旁路这样的过程中由患者内在线取出的血液。
术语″因子VIIa″或″FVIIa″指的是通过在Arg152-lle153肽键处的特异性裂解所裂解的″两链″活化凝血因子VII。FVIIa可以自血液纯化或通过重组方式产生。显然本文所述方法的实施并不依赖于纯化的因子VIIa如何衍生，因此应理解本发明包括适用于本文的任意因子VIIa制品的应用。优选的是人FVIIa。
术语″FVII″指的是″单链″凝血因子VII。
本发明在另一个方面中涉及人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体，并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于1nM，诸如低于500pM，优选低于200pM，优选低于100pM，优选低于50pM，优选低于10pM，更优选低于5pM；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为0.1nM的实验中)，诸如低于10nM，优选低于5nM，优选低于1nM，更优选低于0.1nM；或在FVIIa/TF酰胺裂解(amidolytic)试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解(amidolytic)活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为10nM的实验中)，诸如低于40nM，优选低于20nM，更优选低于10nM；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TFELISA试验中测试抗体并筛选结合人TF的人抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本发明在另一个方面中涉及人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-RFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选与人TF发生免疫反应的人抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本文所用的术语″TF诱导的凝固试验″用以指在包括血浆和TF的样品中测定凝固时间的任意试验。TF诱导的凝固试验的实例在实施例1的试验7中描述。
本文所用的术语″FXa产生试验″用以指在包括TF、FVIIa、FX、钙和磷脂的样品中测定FX活化的任意试验。FXa产生试验的实例在实施例1的试验5中描述。
本文所用的术语″FVIIa/TF酰胺裂解试验″用以指在有TF存在情况下测定FVIIa的酰胺裂解活性、即小肽底物裂解的任意试验。FVIIa/TF酰胺裂解试验的实例在实施例1的试验4中描述。
本文所用的术语″TF ELISA试验″用以指包括TF和抗TF的抗体的任意ELISA试验。TF ELISA试验的实例是实施例1试验1和2中所述的直接和间接TF ELISA试验。
本文所用的术语″直接TF ELISA试验″用以指包括固定化TF的任意TF ELISA试验。直接TF ELISA试验的实例在实施例1的试验1中描述。
本文所用的术语″间接TF ELISA试验″用以指TF处于溶液形式的任意TF ELISA试验。间接TF ELISA试验的实例在实施例1的试验2中描述。
本发明在另一个方面中涉及与存在于人TF上的表位发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于1nM，诸如低于500pM，优选低于200pM，优选低于100pM，优选低于50pM，优选低于10pM，更优选低于5pM；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为0.1nM的试验中)，诸如低于10nM，优选低于5nM，优选低于1nM，更优选低于0.1nM；或在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为10nM的试验中)，诸如低于40nM，优选低于20nM，更优选低于10nM；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选结合人TF的人抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本发明在另一个方面中涉及与存在于人TF上的表位发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-RFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选与人TF发生免疫反应的人抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
在本发明的一个实施方案中，产生抗人TF的人抗体的方法包括给哺乳动物免疫接种人TF并分离由免疫接种的哺乳动物产生的抗体。在优选的实施方案中，所述的哺乳动物是小鼠。应理解免疫接种的哺乳动物或小鼠能够产生人抗体。
本发明在另一个方面中涉及人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)给小鼠免疫接种人TF；b)由免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有产生的抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可结合溶液形式的人TF的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为10nM的试验中)，诸如低于40nM，优选低于20nM，更优选低于10nM；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为0.1nM的试验中)，诸如低于10nM，优选低于5nM，优选低于1nM，更优选低于0.1nM；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于1nM，诸如低于500pM，优选低于200pM，优选低于100pM，优选低于50pM，优选低于10pM，更优选低于5pM；i)步骤d-h后在适宜培养基中筛选和培养产生所筛选抗体的无限增殖细胞；j)从所筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本发明在另一个方面中涉及人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)给小鼠免疫接种人TF；b)自免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有所产生的抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可与溶液形式的人TF发生免疫反应的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；i)在步骤d-h后在适宜培养基中筛选和培养产生所筛选的抗体的无限增殖细胞；j)从所筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本文所用的术语″产生抗体的细胞″指的是能够产生抗体的任意细胞。包括杂交瘤、转染的细胞系和来自已经注射了抗原的相对短寿命的或非无限增殖的脾细胞或淋巴细胞。
本发明在另一个方面中涉及可与存在于人TF上的表位发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)给小鼠免疫接种人TF；b)自免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有所产生的抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可结合溶液形式的人TF的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为10nM的试验中)，诸如低于40nM，优选低于20nM，更优选低于10nM；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于100nM(在FVIIa浓度为0.1nM的试验中)，诸如低于10nM，优选低于5nM，优选低于1nM，更优选低于0.1nM；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于1nM，诸如低于500pM，优选低于200pM，优选低于100pM，优选低于50pM，优选低于10pM，更优选低于5pM；i)在步骤d-h后在适宜培养基中进行筛选和培养产生所筛选的抗体的无限增殖细胞；j)从具有所筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
本发明在另一个方面中涉及可与存在于人TF上的表位发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)给小鼠免疫接种人TF；b)自免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有所产生的抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可与溶液形式的人TF发生免疫反应的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；
f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-RFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；i)在步骤d-h后在适宜培养基中筛选和培养产生所筛选的抗体的无限增殖细胞；j)从具有筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
应理解在TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
在本发明的一个实施方案中，所述的无限增殖细胞是杂交瘤细胞。
本发明在另一个方面中涉及产生可与存在于人TF上的表位发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF结合的人抗体的细胞。
在一个实施方案中，所述的细胞是分离的淋巴样细胞。
在一个实施方案中，所述的细胞分离自小鼠。
在另一个实施方案中，所述的细胞是杂交瘤细胞。在一个实施方案中，通过使产生抗体的淋巴样细胞与无限增殖细胞融合可得到所述的杂交瘤细胞，从而提供产生抗体的杂交瘤细胞。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体可抑制人凝血因子VIIa与人TF结合。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是单克隆抗体。
本文所用的术语″单克隆抗体″指的是免疫球蛋白的均质群体，即除天然出现的突变外均相同的抗体群的各个分子。一般由来源于骨髓的B淋巴细胞的淋巴样细胞合成抗体。来源于相同克隆的淋巴细胞产生单种氨基酸序列的免疫球蛋白。淋巴细胞不能直接长时间培养而产生大量其特异性抗体。然而，Kohler等在1975《自然》(Nature)，256495中证实，体细胞融合，特别是淋巴细胞与骨髓瘤细胞之间的细胞融合过程，可以产生杂交瘤细胞，这样的杂交瘤细胞可在培养物中生长并产生称作″单克隆抗体″的特异性抗体。尽管已知有″非产生″株，但是骨髓瘤细胞是随细胞株的不同自身经常产生抗体的淋巴肿瘤细胞。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是重组抗体。
本文所用的术语″重组抗体″用以包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在下面的第II部分中进一步描述)；分离自重组、组合人抗体文库的抗体(在下面的第III部分中进一步描述)；分离自对人免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如小鼠)的抗体(例如，参见Taylor L.D.等(1992)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)206287-6295)；或通过包括将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列相剪接的任意其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体带有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可对这类重组人抗体进行体外诱变(或当使用对人Ig序列而言为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关、但可能在体内人抗体种系组成库中并不天然存在的序列。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是Fab片段。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是F(ab)2片段。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是F(ab′)2片段。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体是单链Fv片段。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd在10-15-10-8M的范围。应理解涉及的人抗体与人TF相结合的Kd如试验中测定，其中将人抗体固定化(参见试验6)。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd在10-15-10-10M的范围。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-8M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-9M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-20M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-11M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-12M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-13M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-14M。在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体与人TF相结合的Kd低于10-15M。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的、IC50值低于1nM的人抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于500pM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于200pM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于100pM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于50pM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于10pM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于5pM。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括下列步骤在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
应理解TF诱导的凝固试验中所涉及的特定IC50值是使用正常人血浆测定的IC50值。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FXa产生试验中测试抗体并筛选在该试验中可抑制FXa产生、IC50值低于100nM(在使用FVIIa浓度为0.1nM的试验中)的人抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于10nM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于5nM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于1nM。在本发明的另一个实施方案中，所述的IC50值低于0.1nM。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FXa产生试验中测试抗体并筛选可抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nMFVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性、IC50值低于100nM(在使用10nM FVIIa的试验中)的人抗体。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于40nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于20nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于10nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于5nM。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选可抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选可结合人TF的人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在包含固定化TF的直接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可结合固定化人TF的人抗体的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在包含处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选可结合溶液形式的人TF的人抗体的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FXa产生试验中在表达TF的细胞上测试抗体，并筛选可抑制表达TF的细胞上FXa的产生、IC50值低于500nM(在使用FVIIa的浓度为1nM的试验中)的人抗体。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于100nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于50nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于10nM。在另一个实施方案中，所述的IC50值低于5nM。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在FXa产生试验中在表达TF的细胞上测试抗体并筛选可抑制表达TF的细胞上FXa的产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+500nM(在试验中使用1nM FVIIa)，诸如低于FFR-RFVIIa的IC50值+100nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+50nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
术语″表达TF的细胞″指的是表达人TF的任意哺乳动物细胞。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在完整细胞TF结合试验中测试抗体并筛选与FVIIa竞争结合完整细胞的细胞表面上表达的人TF竞争的人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在生物传感器试验中测试抗体并筛选与人TF相结合的Kd值低于100nM的人抗体的步骤。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10nM。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于5nM。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于1nM。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于0.5nM。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-10M。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-11M。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-12M。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-13M。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-14M。在另一个实施方案中，与人TF相结合的Kd值低于10-15M。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在MAPK信号传导试验中测试抗体并筛选可抑制FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的人抗体的步骤。在一个实施方案中，所述的人抗体对FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的抑制为98％。在一个实施方案中，所述的人抗体对FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的抑制为90％。在一个实施方案中，所述的人抗体对FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的抑制为70％。在一个实施方案中，所述的人抗体对FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的抑制为50％。在一个实施方案中，所述的人抗体对FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化的抑制为30％。
术语″MAPK信号传导″用以指介导促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated-Protein-Kinase，MAPK)或其同源物响应于各种胞外刺激而发生的活化的胞内事件串联。已经在哺乳动物细胞中鉴定了三组不同的MAP激酶1)胞外调节激酶(Erk1/2或p44/42)；2)c-Jun N-末端激酶(JNK)；和3)p38激酶。Erk1/2途径包括Erk1(p44)和/或Erk2(p42)的磷酸化。活化的MAP激酶、例如p44/42 MAPK可以转位至核，在其中它们可以磷酸化并激活转录因子、包括(Elk1)和转录信号转导物和激活物(Stat)。Erk1/2还可以使细胞质或细胞核中的激酶p90RSK磷酸化，然后p90RSK可以激活几种转录因子。
术语″蛋白激酶″用以指能够使肽和/或蛋白质中的丝氨酸和/或苏氨酸和/或酪氨酸磷酸化的酶。
术语″FVIIa-诱导的MAPK信号传导活化″用以指FVIIa与哺乳动物细胞中的TF结合且由此诱导MAPK信号传导。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在基因表达分析试验(试验15)中测试抗体并筛选可抑制FVIIa诱导的基因上调的人抗体的步骤，所述基因独立地选自包括Fra-1、Id2和Cyr61在内的组。
应理解抑制TF活性的抗TF抗体可以结合存在于TF上的不同表位，有可能既可以抑制FVIIa与人TF结合、又可以抑制FX或FXa与人TF结合。本发明的一个目的是筛选可抑制FVIIa与人TF的结合、由此抑制FVIIa诱导的胞内信号传导的抗体。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在人癌症试验(试验13)中测试抗体并筛选可抑制人癌症的生长或转移的人抗体的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体可抑制FVIIa诱导的基因上调，所述基因独立地选自包括Fra-1、Id2和Cyr61在内的组。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体不抑制FX或FXa与人TF的结合。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体抑制TF的胞内活性。
在本发明的另一个实施方案中，人抗体的制备方法包括在表位作图试验中测试抗体并筛选可结合TF上的优选表位的人抗体的步骤。在一个实施方案中，优选的表位包括Trp45、Lys46和Typ94残基中的一个或多个。在一个实施方案中，优选的表位包括残基Trp45。在一个实施方案中，优选的表位包括残基Lys46。在一个实施方案中，优选的表位包括残基Tyr94。
在本发明的另一个实施方案中，分离的人抗体可结合TF与FVIIa之间界面上的表位。
根据X-射线结构确定的负责FVIIa的蛋白酶结构域与TF之间相互作用的TF内残基(Banner等1996《自然》(Nature)，38041-46)是Ser39、Gly43、Trp45、Ser47、Phe50、Arg74、Phe76、Tyr94、Pro92。这种FVIIa的蛋白酶结构域与TF之间的界面的特征为含有许多分子间氢键的复杂界面区，该分子间氢键使得TF与FVIIa之间产生良好接触而在FVIIa结合过程中获得高度特异性。
本发明还涉及针对TF的高亲和性人单克隆抗体。含有FVIIa蛋白酶结构域的接触界面的TF表面具有特定的拓扑结构，易于发生反应而产生蛋白-蛋白相互作用，其中另一种类型的蛋白-蛋白相互作用是抗体与蛋白质配体之间的复合体形成。因此，针对人TF上的这种表位的单克隆抗体提供了高亲和性Mabs。
本发明的一个方面是与FVIIa的蛋白酶结构域接触界面发生免疫反应的高亲和性人单克隆抗体。
本发明的人TF抗体可以作为TF-介导的凝固诱导的拮抗剂起作用，从而抑制凝血因子FVIIa与TF的结合，由此阻断凝血酶产生和随后的血纤蛋白沉积。人TF抗体特别可用于对人给药，以治疗包括血管内凝血在内的各种疾病。照此，人TF抗体可以用于抑制TF活性，例如导致对血液凝固、血栓形成或血小板沉积的抑制。此外，本发明起抑制TF细胞功能、TF信号传导功能的人TF抗体可以用于如脓毒症、炎症、动脉粥样硬化、再狭窄或癌症这样的疾病。
人TF抗体可以用于各种疾病。包括与血栓形成或凝血紊乱相关的疾病或疾患，包括炎症反应和与血纤蛋白形成相关的慢性血栓栓塞性疾病或疾患，包括血管疾病，诸如深部静脉血栓形成、动脉血栓形成、术后血栓形成、冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)、中风、肿瘤生长、肿瘤转移、血管发生、血栓溶解、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄；急性和慢性适应征，诸如炎症、脓毒性休克、败血症、低血压、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、系统性炎症反应综合征(SIRS)、弥散性血管内凝血(DIC)、肺栓塞、病理性血小板沉积、心肌梗死；或预防性治疗具有处于血栓形成危险中的动脉粥样硬化性血管、外周血始祖细胞(PBPC)移植后的静脉闭塞性疾病、溶血性尿毒性综合征(HUS)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)和其它疾病或疾患的哺乳动物。这种人TF抗体可以用于预防已经鉴定的高危患者中的血栓栓塞并发症发生，诸如进行手术的那些患者或患有充血性心力衰竭的那些患者。这种人TF抗体特别可以用于治疗内膜增生或因急性血管损伤导致的再狭窄。急性血管损伤是那些迅速发生(即几小时到几个月内)的血管损伤疾病与可终生发生的慢性血管损伤(例如动脉粥样硬化)相反。急性血管损伤通常因诸如血管重建这些使用血管成形术、动脉内膜切除术、动脉粥样硬化斑切除术、血管移植物放置等技术的手术导致。增生也可以作为例如对移植物放置或器官移植反应的延缓反应发生。由于人抗体比肝素更具有选择性，只结合在损伤位点暴露的TF，并且因为人抗体不会破坏或抑制其它凝固蛋白，所以当以预防方式用于预防深度静脉血栓形成时，人TF能够比肝素更有效，并且更不太可能引起出血并发症。
正如下面的实施例中所证实的，本发明的人TF抗体能够选择性结合细胞表面TF并通过抑制凝血因子FVIIa与TF的结合来抑制其功能活性。维持与TF结合的人TF抗体可通过阻断凝血酶产生和随后的血纤蛋白沉积来抑制血管损伤位点处的血小板累积。
由于人TF抗体能够阻断急性血管损伤位点处的凝血酶产生并限制血小板沉积，所以维持与TF的结合、由此抑制FVIIa结合的人TF抗体可以用于抑制血管再狭窄。
包括人TF抗体的组合物在配制成药物组合物时特别可用于治疗患者的方法中，其中可以将所述组合物对患有不同疾病情况的个体给药以治疗与凝血相关的疾病。与其它抗凝剂相比，这类能够结合TF并抑制FVIIa与TF结合的人TF抗体可能具有较长的血浆半衰期，因而具有明显更长时间的抗凝活性期。本发明组合物所针对的医学适应征是通常用抗凝剂治疗的那些适应征，诸如例如深部静脉血栓形成、肺栓塞、中风、弥散性血管内凝血(DIC)、与脓毒症相关的肺和肾中血纤蛋白沉积、抗磷脂综合征(APS)、动脉粥样硬化和心肌梗死。这些组合物可以用于抑制机械性血管损伤、诸如因手术、显微手术、球囊动脉成形术、动脉内膜切除术、复位性动脉粥样斑块切除术(reductive atherectomy)、斯滕特支架放置、激光疗法或rotablation导致的损伤后发生的或作为对血管移植物、斯滕特支架、旁道移植物或器官移植物继发性发生的血管再狭窄。因此这些组合物可以用于抑制血小板沉积和相关疾病。因此，抑制例如凝血、血管再狭窄或血小板沉积的方法包括对患者给予包括有效抑制凝血、血管再狭窄或血小板沉积的用量的人TF抗体的组合物。这些方法还可应用于治疗个体的冠状动脉急性闭合(例如急性心肌梗死)，这些方法包括给予人TF抗体与组织纤溶酶原激活物或链激酶，并且可以加速tPA诱导的血栓溶解。在给予血栓溶解剂、诸如组织纤溶酶原激活物之前、同时或之后立即给予人TF抗体。
本发明针对人TF的人单克隆抗体可以通过给携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠(获自Medarex)免疫接种人TF而产生。将来自这些转基因小鼠的脾细胞用于产生分泌所述的人单克隆抗体的杂交瘤(例如，参见Wood等国际申请WO91/00906；Kucherlapati等PCT公开申请WO91/10741；Lonberg等国际申请WO92/03918；Kay等国际申请92/03917；Lonberg，N.等1994《自然》(Nature)368856-859；Green，L.L.等1994《自然遗传学》(Nature Genet.)713-21；Morrison，S.L.等1994《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)816851-6855；Bruggeman等1993《年度免疫学》(YearImmunol)733-40；Tuaillon等1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等1991《欧洲免疫学杂志》(Eur J Immunol)211323-1326)。
针对人TF的人单克隆抗体还可以通过噬菌体展示产生。可以由免疫接种的人构建人抗体文库，并在丝状噬菌体表面上展示。已经在许多情况下使用淘选技术从这类文库中分离了高亲和性人单链Fv(ScFv)和Fab抗体片段，其中将所关注的抗原固定在固体表面、即微量滴定平板或珠表面上(Barbas C.F.，III和Burton，D.R.《生物技术趋势》(Trends.Biotechnol.)1996，14230-234；Aujame L.等《人抗体》(Hum.Antibodies)1997，8155-68)。大的原始文库的噬菌体展示还使得不经免疫接种而直接分离人抗体成为可能(DeHaard H.J.等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)1999，18218-18230)。
附图简述在实施例中参照附图进一步具体地描述本发明，其中附
图1.用于筛选抗TF的人单克隆高亲和性抗体的典型筛选试验简图。
附图2.如实施例1中所述的筛选试验1-3的详图。
附图3.如实施例1中所述的筛选试验4-7的详图。
附图4.如实施例1中所述的筛选试验8-10的详图。
附图5.使用试验4筛选抗体的实例。FFR-rFVIIa(实心圆圈)和人抗TF单克隆抗体HuTF-31 F2(空心圆圈)对sTF/FVIIa酰胺裂解活性的抑制作用。
附图6.使用试验5筛选抗体的实例。FFR-rFVIIa(实心圆圈)和人抗-TF单克隆抗体HuTF-31 F2(空心圆圈)对因子Xa产生的抑制作用。
附图7.使用试验7筛选抗体的实例。FFR-rFVIIa(实心圆圈)和人抗TF单克隆抗体HuTF-31 F2(空心圆圈)对人TF-诱导的凝血的抑制作用。
附图8.使用试验10筛选抗体的实例。仅仅防止FVIIa结合的抗-TF单克隆抗体可抑制TF/FVIIa-介导的信号传导。
附图9.人抗TF Mab抑制FVIIa诱导的p44/42 MAPK磷酸化(试验10)。将用TF转染的BHK细胞进行血清饥饿2小时，以使细胞休眠。在加入FVIIa(15nM)之前15分钟，将抗体HuMab 30F5(500nM)和HuMab31 F2(500nM)加入到所述细胞中。使细胞裂解并使蛋白质在SDS-PAGE上分离且通过电印迹转到硝酸纤维上。使用针对p44/42 MAPK的多克隆磷酸特异性抗体进行蛋白质印迹分析。二抗为与辣根过氧化物酶缀合的抗家兔IgG。使用冷却的CCD-照相机对化学发光进行检测。对数字化图像上的条带进行定量并将使用FVIIa获得的条带设定为100％。当将细胞与HuMab 30F5(500nM)一起预保温时，观察到磷酸化的条带减少了50％，而当将细胞与HuMab 31 F2(500nM)一起预保温时，观察到磷酸化的条带减少了25％。本实验最终表明抗TF的人抗体(30F5和31 F2)可部分抑制FVIIa诱导的p44/42 MAPK磷酸化。使用50nM FVIIa获得了类似结果。
附图10.使用试验16筛选抗体的实例。该附图表明了用抗TF的单克隆抗体可抑制表达TF的细胞中TF的胞内活性。抗TF Mab B抑制TF的胞内活性，而抗-TF Mab A不会抑制TF的胞内活性。
附图11.使用试验12筛选抗体的实例。使用0.5nM的FFR-rFVIIa和人抗-TF抗体HuTF-31F2获得的血栓弹力图的速率分布。
通过下面的实施例来进一步解释本发明，不过，这些实施例并不用来限定保护范围。上述描述和下面的实施例中所公开的特征无论是单独和还是以其任意组合的方式均可构成以各种形式实现本发明的实质内容。
实施例实施例1对人TF具有免疫特异性的人Mabs的制备试剂人TF可以如Rao，L.V.M.在《血栓形成研究》(ThrombosisResearch)，51373-384 1988中所述自人脑部分离。
脂化的重组人TF(Dade Innovin，Baxter)也可以用作人促凝血酶原激酶试剂。由脑部组织制备大鼠、家兔、狒狒和猪促凝血酶原激酶。向脑部组织中加入两体积的45℃ 0.9％NaCl，并用手控玻璃匀浆器匀浆组织。在45℃下保温30分钟且同时偶尔振摇后，将样品以2000xg离心20分钟。滗析沉淀并等分上清液且储存在-80℃下备用。
可以通过将重组人全长TF(American Diagnostica #4500)重建在磷脂小泡(PC/PS 75/25)中而得到再脂化的TF。
如下生产生物素化的人TF将生物素-NHS(正琥珀酰亚胺基生物素，Sigma H-1759)在DMF(二甲基甲酰胺)溶解成1.7mg/ml的浓度。将溶于0.1M NaHCO3缓冲液的1mg/ml人TF加入到60μl生物素-NHS溶液中，并使其在室温下反应4小时。将含有生物素化TF的反应溶液对PBS-缓冲液透析过夜。
所用的FVIIa为如Thim，L.等在《生物化学》(Biochem)277785-7793，1988中所述制备的重组人FVIIa。
sTF在大肠杆菌中表达的、基本上如Freskgrd，P.-O.等在《蛋白质科学》(Protein Sci.)5，1531-1540(1996)中所述纯化的重组人可溶性TF1-209。
S2288在H2O中再溶解成17.24mg/ml(Chromogenix)FX纯化的人血浆FX(HFX，Enzyme Research Laboratories Ltd.)FXa用Russel′s Viper Venom活化的纯化人血浆FX(HFXa，EnzymeResearch Laboratories Ltd.)Chromozyme X在H2O中溶解成1.25mg/ml(Boehringer Mannheim)125I-FVIIa通过标准放射性标记操作得到。
FFR-rFVIIa在活性位点上被D-Phe-L-Phe-L-Arg-氯甲基酮封闭的FVIIa。
如Sorensen B.B.等在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)27211863-11868，1997中所述中制备。
免疫接种在弗氏完全佐剂中乳化人TF。通过皮下注射对HuMab小鼠或其杂种(Medarex)给予40μg。14天和28天后使用类似注射方式给小鼠加强注射20μg溶于不完全弗氏佐剂的TF，最终以14天间隔进行多次给药。最终一次注射后10天取血样并通过TF ELISA(试验1和2)测试血清中的人TF特异性抗体。
融合通过静脉内注射给来自试验1-3中血清测试呈阳性的小鼠加强注射20μg的人TF，在3天后处死动物。经无菌方式摘除脾并使其分散成单细胞混悬液。
使狐狸骨髓瘤细胞生长在CD杂交瘤培养基(Gibco 11279-023)中。
融合脾细胞和骨髓瘤细胞(P3×63 Ag8.653，ATCC CRL-1580)，并通过PEG-法将Sp2/0(ATCC CRL-1581)骨髓瘤细胞系制成我们的融合体(Kohler，G & Milstein C.(1976)，《欧洲免疫学杂志》(European J.Immunology)，6511-19)。将细胞接种在微量滴定平板上并在37℃下保温。在接下来的2周内更换培养基三次。从每孔中取出来自杂交瘤细胞的100μl上清液并用TF ELISA(试验1和2)测试TF特异性抗体。
实施例2筛选下面描述用于血清和培养物上清液筛选中以寻求特异性选择抗体时所用的各种试验直接TF ELISA试验(试验1)在4℃下用1μg/ml溶于PBS的人sTF将Nunc免疫平板包被过夜。用封闭缓冲液(含有5mM CaCl2和2％BSA的TBS)封闭平板并用TBS+0.05％Tween 20洗涤，加入来自杂交瘤细胞的上清液。在室温下保温1小时后，洗涤平板，并加入用辣根过氧化物酶(HRPO)标记的抗-人IgG。再保温1小时后，洗涤平板并用TMB-底物(Kem-EN-Tec)如制造商所述显色。在ELISA-读出器上测定450nm处的吸光度。
间接TF ELISA试验(试验2)用0.5μg/ml溶于PBS的山羊抗人IgG(Southern BiotechnologyAssociates，CAT-#2040-1)包被Nunc免疫平板并在4℃下保温过夜。用封闭缓冲液(含有5mM CaCl2和2％ BSA的TBS)封闭平板，并用TBS+5mM CaCl2+0.05％ Tween 20洗涤。加入来自杂交瘤细胞的培养物上清液，并在室温下将平板保温1小时。再次洗涤后，加入浓度为1μg/ml的生物素化人s TF并保温1小时。洗涤后，加入100μl的链霉抗生物素蛋白-HRPO溶液并保温1小时。如试验1所述用TMB-底物使平板显色。
FVIIa竞争试验(试验3)在4℃下将Nunc免疫平板与人sTF(浓度为5μg/ml的PBS溶液)一起保温过夜。洗涤平板并用含有5mM CaCl2和2％ BSA的TBS缓冲液封闭平板。加入抗-人TF Mabs并将平板保温2小时。洗涤平板，此后加入生物素化人FVIIa(lμg/ml，溶于含有5mM CaCl2和2％ BSA的TBS缓冲液中)，并将平板保温1小时。洗涤平板，此后加入HRPO-标记的链霉抗生物素并保温45分钟。再次洗涤平板，此后用TMB-底物(Kem-EN-Tec)如制造商所述显色。
FVIIa/sTF酰胺裂解活性的抑制(试验4)使用可溶性人TF(10nM)、重组人FVIIa(10nM)和增加浓度的Mabs(0.0122-50nM)测试抗-人TF Mabs对FVIIa-TF催化的酰胺裂解活性的抑制作用。在室温下将不同浓度的抗-人TF Mabs或FFR-rFVIIa与10nM sTF和FVIIa在BSA缓冲液(pH7.4的50mM Hepes、100mM NaCl、5mM CaCl2和1mg/ml BSA)中保温60分钟，此后添加底物S2288(1.2mM，Chromogenix)。在405nm处将显色反应连续测定30分钟。将酰胺裂解活性表示为mOD/分钟。可以计算Mabs抑制FVIIa/TF酰胺裂解活性的IC50值。在本试验中FFR-rFVIIa的IC50值为7±3nM。
FXa产生的抑制(试验5).
在室温下将溶于BSA缓冲液(参见试验4)中的脂化TF(10pM)、FVIIa(100pM)和抗-TF Mabs或FFR-RFVIIa(0-50nM)保温60分钟，此后加入FX(50nM)。再经过10分钟后通过添加1/2体积的终止缓冲液(pH7.4的50mM Hepes、100mM NaCl、20mM EDTA)使该反应终止。通过加入底物S2765(0.6mM，Chromogenix)并在405nm处连续测定吸光度10分钟来测定产生的FXa的量。可以计算Mab抑制FVIIa/脂化TF-介导的FX活化的IC50值。在本试验中FFR-rFVIIa的IC50值为51+/-26pM。
生物传感器试验(试验6)在Biacore仪上使抗-人TF Mab的标准溶液通过带有针对人IgG的固定化抗体的芯片来测试抗体。随后加入不同浓度的溶于10mM hepes(pH7.4)的sTF，其中所述的10mM hepes含有150mM NaCl、10mMCaCl2和0.0003％聚山梨酸酯20。根据传感器图(sensorgrams)、通过综合Biacore评价软件计算Kd值。
TF-依赖性凝固试验(试验7)在ACL300 Research凝血仪(ILS Laboratories)上进行本试验。将溶于50mM咪唑(pH7.4)、100mM NaCl、0.1％BSA的抗-人TF Mabs稀释液与25mM CaCl2按照2∶5的比例混合并加入到凝血仪的样品杯中。将来自人、大鼠、家兔、狒狒或猪、用咪唑缓冲液稀释而在不含抗体的样品中凝固时间约30秒的凝血激酶放入试剂储器2中，并将人、大鼠、家兔、狒狒或猪血浆放入试剂储器3中。在分析过程中，将70μl的抗体和CaCl2混合物转入25μl凝血激酶试剂中并预保温900秒，此后添加60μl血浆，并测定凝固时间。将最长凝固时间定为400秒。使用凝血激酶各稀释液作为标准曲线，用于将凝固时间转化成与未加入抗-TFMabs或FFR-rFVIIa的对照相比较的TF活性。在本试验中FFR-rFVIIa的IC50值为4.4+/-0.4pM。
Mabs对FVIIa/细胞表面TF催化的FX活化的抑制(试验8)将表达人TF的单层细胞、例如人肺成纤维细胞WI-38(ATTC No.CCL-75)、人膀胱癌细胞系J82(ATTC No.HTB-1)、人角质细胞系CCD1102KerTr(ATCC no.CRL-2310)、人成胶质细胞瘤细胞U87或人乳腺癌细胞系MDA-MB231用作FVIIa/TF催化的FX活化中的TF来源。用缓冲液A(10mM Hepes(pH7.45)、150mM NaCl、4mM KCl和11mM葡萄糖)和缓冲液B(补充了1mg/ml BSA和5mM Ca2+的缓冲液A)将24-、48-或96-孔平板上的汇合细胞单层各洗涤一次。向细胞中同时加入FVIIa(1nM)、FX(135nM)和以不同浓度溶于缓冲液B的Mab(或FFR-rFVIIa)。或者，将细胞与抗-TF Mabs或FFR-rFVIIa一起预保温15分钟，此后添加rFVIIa和FX。使FXa在37℃下形成15分钟。从每孔中取出50μl等分部分并加入到50μl终止缓冲液(补充了10mM EDTA和1mg/ml BSA的缓冲液A)中。通过将50μl上述混合物转至微量滴定平板孔中并向各孔中加入25μl Chromozym X(终浓度0.6mM)来测定产生的FXa的量。在405nm处连续测定吸光度，并使用FXa标准曲线将显色反应的起始速率转化成FXa浓度。在本试验中FFR-rFVIIa的IC50值为1.5nM。
Mab对125I-FVIIa与细胞表面TF结合的抑制(试验9)使用表达人TF的细胞，例如人成纤维细胞WI-38(ATTC No.CCL-75)、人膀胱癌细胞系J82(ATTC No.HTB-1)、人角质细胞系CCD1102KerTr(ATCC no.CRL-2310)、人成胶质细胞瘤细胞系U87或人乳腺癌细胞系MDA-MB231进行结合研究。用缓冲液A(参见试验8)和缓冲液B(参见试验8)将24-孔组织培养平板上的汇合单层各洗涤一次。将所述单层与100μl冷缓冲液B一起预保温2分钟。向细胞中同时加入不同浓度的Mab(或FFR-rFVIIa)和放射性标记的FVIIa(0.5nM125I-FVIIa)(终体积200μl)。将平板在4℃下保温2小时。在保温结束时，除去未结合的物质并用冰冷的缓冲液B将细胞洗涤4次，用300μl裂解缓冲液(200mM NaOH、1％ SDS和10mM EDTA)使其裂解。用γ计数器(Cobra，Packard Instruments)测定放射性。分析结合数据并使用GraFit4(Erithacus Software，Ltd.，(U.K.)绘制曲线。在本试验中FFR-rFVIIa的IC50值为4nM。
Mab对FVIIa/TF-诱导的p44/42 MAPK活化的抑制(试验10)通过对来自蛋白质印迹分析的化学发光进行定量检测(FujifilmLAS-1000)来测定磷酸化p44/42 MAPK和/或Akt和/或p90RSK的量。将表达人TF的细胞、例如CCD1102KerTr、NHEK P166、人成胶质细胞瘤细胞系U87或人乳腺癌细胞系MDA-MB231在培养基中与0-0.1％ FCS一起培养24或48小时，此后进行使细胞休眠的实验。在实验的当天，细胞必须有70-80％的汇合度。通过在37℃下将细胞与过量Mab或FFR-rFVIIa在不含血清的培养基中一起预保温30分钟、此后添加10-100nM FVIIa并保温10分钟来进行本实验。作为细胞信号传导的阳性对照，用10％ FCS将细胞处理10分钟。用冰冷的PBS将细胞洗涤2次，此后使细胞在裂解缓冲液(含有0.1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)和1mM苄脒的20mM Tris，0.1％ Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA、50mM氟化钠、10mM β-磷酸甘油钠、5mM焦磷酸钠、150mM NaCl，pH7.5。临应用之前加入1mM原钒酸钠、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml抑酶肽)中裂解。将裂解液与SDS-样品缓冲液混合并上SDS-聚丙烯酰胺凝胶。在每一凝胶上加载标准生物素化蛋白标记。通过电印迹将在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离的蛋白质转至硝酸纤维素上，并通过使用磷酸化特异性抗体的电印迹使激酶p44/42 MAPK、Akt和p90RSK显现，并通过Fujifilm LAS1000对化学发光进行定量。
表位作图试验(试验11)可溶性TF(sTF)变体的制备使用反向PCR(QuikChange，Stratagene，La Jolla，CA，USA)、将野生型质粒(Freskgrd，P.-O.等《蛋白质科学》(Protein Sci.)5，1531-1540，1996)用作模板来构建sTF变体(I22C、W45C、K46C、Y94C、F140C、W158C、K201C)。如文献(Freskgrd，P.-O.等《蛋白质科学》(Protein Sci.)5，1531-1540，1996)中其它处所述、并经一定修改的方式在大肠杆菌中表达并纯化所述的野生型和变体。通过X-压力(Biox，Sweden)技术使细胞裂解在pH7.5的10mM Tris-HCl缓冲液中进行，此后使其重新悬浮于添加了1mg DNA酶的相同缓冲液中。在4℃下以11000×g将该溶液离心20分钟，并使包涵体75ml 6M GuHCl、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl、pH8.0中变性。在室温下保温1小时后，通过将变性蛋白质滴加到含有50mM Tris-HCl、0.25M NaCl、pH8.0的1L溶液中进行稀释、同时轻轻搅拌约2小时来进行重折叠。使用Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia，UJppsala，Sweden)和如Freskgrd等(1996)所述的FVIIa亲和色谱法进行纯化。通过SDS-PAGE验证蛋白质的均一性。在A280nm处测定并使用计算消光系数37440M-1cm-1(Gill和von Hippel，1989)确定浓度。
给MaxiSorp平板(Nunc-Immuno)包被溶于TBS中的野生型sTF和变体(10μg/ml)，并用封闭缓冲液(含有0.1％Tween 20和0.5％BSA的TBS)封闭。将平板用洗涤缓冲液(TBS和0.1％Tween 20)洗涤。施加溶于封闭缓冲液的浓度为1ng/ml的抗-人TF Mabs并保温1小时。然后使用洗涤缓冲液洗涤平板(6x)。随后使用按1∶2000在封闭缓冲液中稀释的经HRP标记的抗-人IgG(Helica Biosystems，Inc)、使用TMBplus-底物(Kem Tech Cat.4390A)检测抗体结合。用最终的ELISA信号(OD450-620)来衡量每一抗体与所有sTF变体的结合。
血栓弹性描记法(试验12)将人凝血激酶(例如，Innovin，Dade Behring，最终稀释50,000x)与CaCl2(终浓度16.7mM)和抗-TF Mabs混合并在室温下保温15分钟。向RoTEG样品杯(Pentapharm)中加入柠檬酸盐稳定化的人全血(280μl)并在37℃下预热5分钟，此后加入40μl凝血激酶/CaCl2/抗-TF Mab混合物。随后在Ro-TEG仪(Pentapharm)上进行血栓弹性描记1小时。使用CoagPro SoftwareTM(MedScience，rhus，Denmark)从血栓图(thrombograms)中得到速度分布图。
实施例3.
人肿瘤试验。研究使用人抗-TF Mabs治疗对小鼠模型中人肿瘤的生长和转移的作用(试验13)治疗通过静脉内快速浓注给予人抗-TF Mabs 10mg/kg＝0.1mg/10g；注射体积为每10g小鼠使用0.1ml的三种治疗溶液之一A.载体对照B.1mg/ml人FFR-rFVIIaC.1mg/ml抗-TF Mabs模型描述1.结肠癌的原发生长和肝转移使用7-8周龄的健康雌性无胸腺小鼠(nu/nu)。为了破坏裸鼠对人细胞移植的残留免疫耐受性，通常在进行人肿瘤植入前2天以5Gy照射小鼠(Vogel等1997)。通过如所述进行在含有15％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640中培养的LS174T人结肠癌细胞(ATCC CCL 188)的肿瘤移植攻击小鼠(Li等《人基因疗法》(Human Gene Therapy)103045-3053，1999)。简单的说，用胰蛋白酶-EDTA收集细胞、洗涤两次并重新悬浮于不含血清的补充了肝素钠溶液(1U/ml)的RPMI中。然后在麻醉状态下在小鼠的左侧肋下做小切口并将溶于50ml磷酸缓冲盐水(PBS)的33106 LS174T细胞注入脾内。3-5分钟后，连接脾血管并通过手术取出脾。该过程引起稳定的肝转移发生(95％以上)。在移植后立即开始用抗-TF Mabs治疗，并在剩余的研究期限中持续进行。在接种肿瘤细胞的第15和第30天处死小鼠，取出肝并称重，对肝表面上可见的肿瘤小结进行计数。将肝样品在AFA(5％乙酸、75％乙醇、2％福尔马林、18％水)中固定过夜、转入到100％乙醇中并包埋在石蜡中，制备5μm切片用于对转移小结进行组织学定量、免疫组织化学和编程性细胞死亡定量。
研究1-1目的为了检验静脉内对裸鼠快速浓注10mg/kg的抗-TF Mabs对LS174T结肠癌的宏观生长和肝转移的影响。
小鼠60只6周龄纯合型nu/nu雄性NMRI。
组将小鼠随机分入15只1组的4组，并用溶液A、B或C治疗。
终止在体重减轻＞20％或出现其它严重毒性的客观征兆下处死动物。
参数在生长期过程中每天用两个正交参数记录肿瘤大小。开始时记录体重，且每周记录2-3次。处死后对肝中的转移瘤形成进行测定。
II.乳腺癌的原发性生长和肺转移在补充了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231(ATCC HTB26)。将MDA-MB-231细胞(33106)经皮下注入裸鼠(7-8周龄雌性小鼠)。如上所述评价原发肿瘤生长和转移(Li等《人基因疗法》(Human Gene Therapy)12515-526，2001)研究II-1目的为了检验静脉内对裸鼠快速浓注10mg/kg的抗-TF Mabs后对MDA-MB-231乳腺肿瘤的宏观生长和肺转移的作用。
小鼠60只6周龄纯合型nu/nu雄性NMRI。
组将小鼠随机分入15只1组的4组，并用溶液A、B或C治疗。
终止在体重减轻＞20％或出现其它严重毒性的客观征兆下处死动物。
参数在生长期过程中每天使用两个正交参数记录肿瘤大小。开始时记录体重，且每周记录2-3次。处死后对肺中的转移瘤形成进行测定。
III.胶质瘤异种移植物的原发生长肿瘤细胞系MG U373是人成胶质细胞瘤多形态细胞系，它在裸鼠体内具有高度生血管活性、高血管密度且快速生长。按照标准步骤将肿瘤接种入胁腹(参见为实验计划所附的方案)。每天对小鼠的毒性征兆观察两次，且每天用两个正交参数测量肿瘤。
将肿瘤植入具有NMRI背景的nu/nu纯合型裸鼠胁腹处。小鼠为获自M&B(Ry，Denmark)的7周龄雄性小鼠。将动物保持在限菌环境中，它们接受无菌食物颗粒并可随意饮水。
使用胶质瘤模型进行三种不同研究研究III-1目的为了检验静脉内对裸鼠快速浓注10mg/kg的抗-TF Mabs对U373肿瘤的宏观生长和肺转移的影响。
小鼠60只6周龄纯合型nu/nu雄性NMRI。
组将小鼠随机分入15只1组的4组，并用溶液A、B或C治疗。
终止在体重减轻＞20％或出现其它严重毒性的客观征兆下处死动物。
参数在生长期过程中每天使用两个正交参数记录肿瘤大小。开始时记录体重，且每周记录2-3次。
研究III-2目的检验已经建立预治疗的肿瘤生长后，静脉内给予裸鼠快速浓注10mg/kg的抗-TF Mabs对U373肿瘤的宏观生长的影响。
小鼠60只6周龄纯合型nu/nu雄性NMRI。
组将小鼠随机分入15只1组的4组，并用溶液A、B或C治疗。当6次连续(每天)测量值显示Gompertzian生长时，治疗开始。它相当于100-200mm3。
终止治疗持续至肿瘤已经生长至超过约1.0cm3的最大尺寸、即没有肿瘤直径大于15mm，或直到通过6次连续测定建立了Gompertzian再生长。在试验终止时，从每组动物中切下肿瘤用于组织学和免疫化学评价。在体重减轻＞20％或出现其它严重毒性的客观征兆时处死动物。
参数在生长期过程中每天使用两个正交参数记录肿瘤大小。开始时记录体重，且每周记录2次。
研究III-3目的为了检验抗-TF Mabs对裸鼠颅内U373肿瘤生长的影响。
小鼠60只6周龄纯合型nu/nu雄性NMRI。
肿瘤按照标准步骤经原位在右侧大脑半球植入U373。
组将小鼠随机分入15只1组的4组，并用溶液A、B或C治疗。
终止对具有慢性神经损害征兆的小鼠实施安乐死。
数据通过Kaplan-Meyer统计学分析对存活率(即达到神经损害的时间)进行定量。
实施例4(试验14)在敲除了TF基因并插入了人TF基因的小鼠(mTF-KO/hTF-KI小鼠)中，将0.5ml基质胶(matrigel)塞经皮下放入腹部皮下。在该基质胶中混入b-FGF(5ng)，在1周后通过测定血红蛋白含量对凝胶中形成的显著的新血管进行定量(血管发生)。可以在单一或反复非肠道给予所述蛋白质后评价人抗-TF Mabs的抑制能力(血红蛋白含量抑制％)。
实施例5(试验15)辨别防止FVIIa与TF结合的抗体和防止FX与TF结合的抗体的基因表达分析试验在cDNA微阵列分析中，已经观察到用FVIIa处理的BHK-TF细胞中有三种基因发生特异性上调。这些基因包括Fra-1，即编码Fos调节的抗原1的基因；Id2，即编码螺旋-环-螺旋类蛋白成员的基因；和编码胞外基质信号传导蛋白的Cyr61。设计下列试验以便筛选防止FVIIa诱导的Fra-1、Id2或Cyr61上调的抗-TF Mabs。
细胞培养除非另有说明，试剂均商购自GIBCO-BRL Life Technologies。
使如Poulsen L.K.等在《生物化学杂志》(JBiol.Chem.)273，6228-6232，1998中所述产生的BHK-TF细胞生长在含有10％ FCS、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中至得到95-100％汇合、洗涤并在不含FCS的培养基中再生长16-18小时。再次洗涤细胞并使其接触不含FCS而含有100nM FVIIa的培养基。
为了克隆用于RNA印迹分析的片段，如下所述处理细胞。使细胞生长在含有10％FCS、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中至得到95-100％汇合、洗涤并在不含FCS的培养基中再生长16-18小时。再次洗涤细胞，并使其接触不含FCS而含有100nM FVIIa的培养基1小时。使CRL2091细胞(ATCC)生长在含有10％ FBS、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Iscove改进的Dulbecco培养基中至达到95-100％汇合。随后使细胞进行血清饥饿16-18小时，并用不含FBS而含有100nM FVIIa的培养基处理6小时。将鼠3T3-L1细胞(ATCC)维持在补充了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基中。使细胞生长至汇合，并用含有1μM地塞米松(Sigma)、10μg/ml人胰岛素(Novo Nordisk A/S)和1μMBRL49653(Novo Nordisk A/S)的培养基诱导1小时。
用于RNA印迹分析的片段的克隆使用superscript II试剂盒(Life Technolo-gies)、按照制造商的说明，通过反转录PCR从分离自用地塞米松、胰岛素和BRL49653处理1小时的3T3-L1细胞的RNA中克隆Fra-1。通过反转录PCR，从分离自分别用FVIIa处理1小时的BHK-TF细胞和用FVIIa处理6小时的CRL2091细胞的RNA中克隆Id2和CYR61。上游和下游引物是Fra-1，5′-GCGGCCGCCATGTACCGAGACTACGGGGAACCG-3′和5′-GCGGCCGCTCACAAAGCCAGGAGTGTAGG-3′；Id2，5′-CAGCATGAAAGCCTTCAGTC-3′和5′-CTCTGGTGATGCAGGCTGAC-3′；Cyr61，5′-CGTCACCCTTCTCCACTTGA-3′和5′-CTTGGTCTTGCTGCATTTCT-3′。PCR参数为由在94℃下变性10秒、在65℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在64℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在63℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在62℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在61℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在60℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的一个循环；由在94℃下变性10秒、在55℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟组成的40个循环。将所有片段克隆入TOPO 2.1(Invitrogen)并使用Megabase测序仪测序。
RNA印迹分析使用TriZol、按照销售商的说明从与FVIIa、FX、ASIS、1F44A1或TF8-5G9一起保温的BHK-TF细胞中分离总RNA。将20μg的RNA在含有1％琼脂糖、20mM MOPS、5mM NaOAc、6％甲醛和1mM EDTA的变性凝胶中进行大小分级分离、通过毛细管印迹转移到Hybond N+膜(Amersham)上，并通过UV交联固定。使用[α-32P]dATP(Amersham)、用Prime It试剂盒(Stratagene)标记编码Fra-1、Id2或Cyr61的cDNA，并使用Express Hyb(Clontech)、按照制造商的说明书杂交，通过放射自显影显示结果。
实施例6(试验16)通过Elk1转录因子/荧光素酶报道基因(PathDetect)进行的MAPK试验将HeLa细胞接种在T-80烧瓶中至40％汇合，1天后开始转染。用150ng pFA-ELK1(Stratagene)、3μg pFR-Luc(Stratagene)、3μg人TF/pcDNA3和3μg小鼠蛋白酶活化受体2/pcDNA3.1+使用36μl FuGene(Roche)如指南中所述转染细胞。第2天用VerseneTM(Invitrogen)使细胞脱附，并以20.000个细胞/孔的细胞密度接种在黑色96孔观察平板(Packard)上。在细胞与平板重新附着后，用160μl/孔不含血清的Dulbeccos改进的Eagle培养基(Invitrogen)替换上述培养基并保温16小时。
将细胞与20μl不含血清的培养基(对照品)、20μl 2.5μMFFR-rFVIIa(对照品)、20μl 2.5μM抗TF Mab B或20μl 2.5μM抗TF MabA之一一起预保温1小时。向半数孔中加入20μl 0.5μM FVIIa，并将培养基加入到另一半孔中。在保温4小时后，使细胞进行荧光素酶基因试验。如制造商所述向细胞中加入LucLite(Packard)试剂。在TopCountMicroplate Scintillation(Packard)上读取荧光素酶表达水平。
权利要求
1.分离的人抗体，该抗体与存在于人TF上的表位发生免疫反应。
2.权利要求1所述的分离的人抗体，该抗体抑制人凝血因子VIIa与人TF的结合。
3.权利要求1-2中任意一项所述的分离的人抗体，该抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1-3中任意一项所述的分离的人抗体，该抗体是重组抗体。
5.权利要求1-4中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述的抗体是Fab片段。
6.权利要求1-4中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述的抗体是F(ab)2片段。
7.权利要求1-4中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述的抗体是F(ab′)2片段。
8.权利要求1-4中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述的抗体是单链Fv片段。
9.权利要求1-8中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述抗体与人TF结合的Kd在10-15-10-8M的范围内。
10.权利要求1-9中任意一项所述的分离的人抗体，其中所述抗体与人TF结合的Kd在10-15-10-10M的范围内。
11.一种药物组合物，其中包括治疗有效量的与存在于人TF上的表位可发生免疫反应的人抗体。
12.一种药物组合物，其中包括治疗有效量的与存在于人TF上的表位可发生免疫反应的人抗体，其中所述的抗体是权利要求1-10中任意一项的抗体。
13.一种组合物，其中包括与存在于人TF上的表位可发生免疫反应的人抗体。
14.一种组合物，其中包括与存在于人TF上的表位可发生免疫反应的人抗体，其中所述的抗体是权利要求1-10中任意一项的抗体。
15.人中与FVIIa/TF相关的疾病的治疗方法，该方法包括对所述的人给予治疗有效量的与存在于人TF上的表位可发生免疫反应的人抗体。
16.人中与FVIIa/TF相关的疾病的治疗方法，该方法包括对所述的人给予治疗有效量的权利要求1-10中任意一项所述的抗体。
17.人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(使用0.1nMFVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选与人TF发生免疫反应的人抗体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的抗人TF的人抗体通过包括下列步骤的方法产生a)给哺乳动物免疫接种人TF；b)分离由免疫接种的哺乳动物产生的抗体。
19.权利要求18所述的方法，其中所述的哺乳动物是小鼠。
20.权利要求17-19中任意一项所述的方法，该方法包括在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
21.权利要求17-20中任意一项所述的方法，该方法包括在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nMFVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
22.权利要求17-21中任意一项所述的方法，该方法包括在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
23.权利要求17-22中任意一项所述的方法，该方法包括在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体。
24.权利要求17-23中任意一项所述的方法，该方法包括在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选与人TF发生免疫反应的人抗体。
25.与存在于人TF上的表位可发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF相结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)制备抗人TF的人抗体；b)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；或在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；或在包括TF的TF ELISA试验中测试抗体并筛选与人TF可发生免疫反应的人抗体。
26.人抗体的制备方法，该方法包括下列步骤a)给小鼠免疫接种人TF；b)自免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有所产生抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选与溶液形式的人TF发生免疫反应的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；i)步骤d-h后在适宜培养基中筛选和培养产生所筛选的抗体的无限增殖细胞；j)从所筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
27.权利要求26所述的方法，其中所述的方法进一步包括在包含固定化TF的直接TF ELISA试验中测试抗体并筛选与固定化人TF发生免疫反应的人抗体。
28.权利要求26-27中任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括在FXa产生试验中在表达TF的细胞上测试抗体，并筛选抑制表达TF的细胞上FXa的产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+500nM(在试验中使用1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+50nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值。
29.权利要求26-28中任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括在完整细胞TF结合试验中测试抗体并筛选与FVIIa竞争结合完整细胞的细胞表面上所表达的人TF的人抗体。
30.权利要求26-29中任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括在生物传感器试验中测试抗体并筛选与人TF相结合的Kd值低于100nM、诸如低于10nM、优选低于5nM、优选低于1nM、更优选低于0.5nM的人抗体。
31.权利要求26-30中任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括MAPK信号传导试验中测试抗体并筛选抑制FVIIa诱导的MAPK信号传导活化的人抗体。
32.权利要求26-31中任意一项所述的方法，其中所述的方法进一步包括在表位作图试验中测试抗体并筛选与TF上的优选表位可发生免疫反应的人抗体。
33.权利要求32所述的方法，其中所述的优选表位包括残基Trp45、Lys46和Tyr94。
34.权利要求26-33中任意一项所述的方法，其中所述的无限增殖细胞是杂交瘤细胞。
35.与存在于人TF上的表位可发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF相结合的人抗体，该抗体可通过包括下列步骤的方法得到a)给小鼠免疫接种人TF；b)自免疫接种小鼠分离产生抗体的细胞并制备分泌人抗体的无限增殖细胞；c)从含有所产生抗体的无限增殖细胞中分离培养基；d)在包括处于溶液形式的TF的间接TF ELISA试验中测试抗体并筛选与溶液形式的人TF可发生免疫反应的人抗体；e)在FVIIa竞争试验中测试抗体并筛选与FVIIa结合竞争的人抗体；f)在FVIIa/TF酰胺裂解试验中测试抗体并筛选抑制TF-诱导的FVIIa酰胺裂解活性的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用10nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+40nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+20nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；g)在FXa产生试验中测试抗体并筛选抑制FXa产生的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+100nM(在试验中使用0.1nM FVIIa)，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+10nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5nM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+0.1nM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；h)在TF诱导的凝固试验中测试抗体并筛选在该试验中抑制凝块形成的人抗体，其中所筛选的人抗体的IC50值低于FFR-rFVIIa的IC50值+1nM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+500pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+200pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+100pM，诸如低于FFR-rFVIIa的IC50值+50pM，优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+10pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值+5pM，更优选低于FFR-rFVIIa的IC50值；i)步骤d-h后在适宜培养基中筛选和培养产生所筛选的抗体的无限增殖细胞；j)从所筛选的无限增殖细胞的培养基中分离筛选的抗体。
36.与存在于人TF上的表位可发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF相结合的人抗体，其通过权利要求26-34中任意一项的方法产生。
37.一种产生人抗体的细胞，其中所述人抗体与存在于人TF上的表位可发生免疫反应并抑制人凝血因子VIIa与人TF的结合。
38.权利要求37所述的细胞，其中所述的细胞是分离的淋巴样细胞。
39.权利要求37-38中任意一项所述的细胞，其中所述的细胞分离自小鼠。
40.权利要求37所述的细胞，其中所述的细胞是杂交瘤细胞。
41.权利要求40所述的细胞，其中所述的杂交瘤细胞是通过使产生抗体的淋巴样细胞与无限增殖细胞融合、提供产生抗体的杂交瘤细胞而获得的。
42.权利要求37-41中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体可抑制人凝血因子VIIa与人TF的结合。
43.权利要求37-42中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体与涉及Trp45、Lys46和Tyr94所有这些残基的三维表面可发生免疫反应。
44.权利要求37-43中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体是Fab片段。
45.权利要求37-44中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体是F(ab)2片段。
46.权利要求37-44中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体是F(ab′)2片段。
47.权利要求37-44中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体是scFv片段。
48.权利要求37-47中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体与人TF相结合的Kd在10-15-10-8M的范围内。
49.权利要求37-48中任意一项所述的细胞，其中所述的抗体与人TF相结合的Kd在10-15-10-10M的范围内。
全文摘要
本发明涉及分离的与人组织因子(TF)可发生免疫反应的人抗体，可以抑制凝血因子VIIa(FVIIa)的结合。
文档编号A61P7/02GK1575302SQ02820846
公开日2005年2月2日 申请日期2002年9月30日 优先权日2001年10月2日
发明者P－O·弗瑞斯克加尔德, J·T·克劳森, B·B·瑟林森, M·克加尔克 申请人:诺沃挪第克公司